DE10045123A1 - Das C. albicans TEC1 GEN(CaTEC1) und das kodierte Tec1p Protein - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleotidsequenzen, die die Virulenz pathogener Pilzstämme modulierende Proteine codieren, Vektoren, die diese Sequenzen enthalten, Wirtszellen, die diese Nukleotidsequenzen oder Vektoren aufweisen, die Virulenz pathogener Pilzstämme modulierende Proteine, Antikörper, die gegen diese virulenzmodulierenden Proteine gerichtet sind, Verfahren zur Herstellung der Proteine und Antikörper sowie diagnostische und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Nukleotidsequenzen, Proteine, Wirtszellen und/oder Antikörper enthalten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuremo­ leküle, die die Virulenz pathogener Pilzstämme mo­ dulierende Proteine kodieren, Vektoren, die diese Moleküle enthalten, Wirtzellen, die diese Nuclein­ säuremoleküle oder Vektoren aufweisen, die Virulenz pathogener Pilzstämme modulierende Proteine, Anti­ körper, die gegen diese virulenzmodulierenden Pro­ teine gerichtet sind, Verfahren zur Herstellung der Proteine und Antikörper sowie diagnostische und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Nukle­ otidsequenzen, Proteine, Wirtzellen und/oder Anti­ körper enthalten.

Bei Hefen handelt es sich um Pilze, die sich vege­ tativ durch Sprossung oder Spaltung vermehren. Ne­ ben kommerziell genutzten Hefen der Familie Saccha­ romycetaceae umfassen die Sprosspilze oder Hefen auch humanpathogene Arten, beispielsweise Candida albicans. Bei Candida albicans handelt es sich um eine dünnwandige, grampositive, kapsellose Hefe von ovaler bis rundlicher Form, die fakultativ pathogen für Mensch, Meerschweinchen, Maus, Ratte und Geflü­ gel ist. Candida albicans ist der häufigste Erreger von oberflächlichen Candida-Mykosen beim Menschen. Darüber hinaus verursacht Candida albicans häufig opportunistische Infektionen, also Infektionen durch normalerweise relativ unproblematische Keime, bei immunsupprimierten Patienten. Bei solchen immunsupprimierten Patienten können derartige Infek­ tionen einen schweren Verlauf nehmen und die Über­ lebenszeit, beispielsweise von HIV-Infizierten oder Krebspatienten, die mittels Chemo- oder Radiothera­ pie behandelt werden, entscheidend verkürzen. Durch Candida albicans hervorgerufene systemische Infek­ tionen werden derzeit hauptsächlich mit Hilfe von Azolen oder Polyenen behandelt. Während Polyene starke Nebenwirkungen aufweisen, entwickeln sich gegen Azole zunehmend Resistenzen (DiDomenico, Curr. Opin. Microbiol., 2 (1999), 509-515; Georgo­ papadakou, Curr. Opin. Microbiol., 1 (1998), 547- 557).

Es ist daher dringend erforderlich, weitere verbes­ serte Antimycotica zur Behandlung von Infektionen, die durch Vertreter der Familie Candida hervorgeru­ fen werden, zu entwickeln.

Bekanntlich wird die morphologische Entwicklung von Pilzen und höheren Eukaryonten von Transkrip­ tionsfaktoren reguliert, die die Expression von Ge­ nen kontrollieren, die spezifisch für bestimmte Entwicklungsstadien sind. Zu diesen Transkriptions­ faktoren gehört die TEA/ATTS-Transkriptionsfaktor- Familie, die bei Säugern, Vögeln, Nematoden, Insek­ ten und Pilzen nachgewiesen wurde. Alle Vertreter dieser Transkriptionsfaktor-Familie besitzen eine konservierte TEA-Domäne. Diese TEA-Domäne (Bürglin, Cell, 66 (1991), 11-12) stellt einen DNA- Bindungsbereich dar, der aus 66 bis 76 konservier­ ten Aminosäuren im N-terminalen Bereich der Protei­ ne besteht. Die TEA-Konsensussequenz (TCS) in den Zielpromotoren von pilzlichen TEA/ATTS-Transkriptionsfaktoren ist durch die Sequenz 5'-CATTCY-3' definiert (Adrianopoulos und Timberlake, Mol. Cell. Biol., 14 (1994), 2503-2515). Bei allen Vertretern dieser Transkriptionsfaktor-Familie aus unter­ schiedlichen Arten ist auffällig, dass sie bei der Entwicklung und Organogenese eine entscheidende Rolle spielen. Beispielsweise ist der Säuger- Enhancer-Faktor TEF-1 an der Myogenese und Cardio­ genese beteiligt (Jacquemin et al., J. Biol. Chem., 271 (1996), 21775-21785). Das Drosophila melano­ gaster-Protein "scalloped" ist an der Regulation der zellspezifischen Genexpression während der Ent­ wicklung der Flügel und des Nervensystems beteiligt (Campbell et al., Genes Dev., 6 (1992), 367-379). Das Regulationsprotein "abacus" (AbaAp) von Asper­ gillus nidulans ist an der Regulation der Konidien­ bildung beteiligt, das heißt seine Expression führt zur Beendigung der vegetativen Wachstumsphase. Der in trans wirkende Faktor Tec1p von Saccharomyces cerevisiae ist an der Aktivierung des Ty1- Retrotransposons beteiligt (Laloux et al., Mol. Cell. Biol., 10 (1990), 3541-3550). Ebenso ist die­ ser Faktor an der Regulation der Filament-Bildung und des invasiven Wachstums haploider und diploider Stämme der Hefe beteiligt (Baur et al., Mol. Cell. Biol., 17 (1997), 4330-4337).

Aufgrund der Bedeutung der TEA/ATTS-Transkriptions­ faktoren für die morphologische Entwicklung, das heißt die räumliche und zeitliche Entwicklung von Organismen beziehungsweise deren Organe oder Gewe­ be, und ihrer weiten Verbreitung in unterschied­ lichsten Arten erscheint es möglich, solche Trans­ kriptionsfaktoren beziehungsweise die ihnen zugrunde liegenden Gene auch in pathogenen Mikroorganis­ men, insbesondere humanpathogenen Pilzen, zu iden­ tifizieren und sie als Targets für die Identifizie­ rung von Substanzen einzusetzen, die spezifisch auf diese Transkriptionsfaktoren beziehungsweise die sie kodierenden Nukleotidsequenzen wirken.

Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht also darin, Mittel zur Entwicklung von diagnostisch und therapeutisch wirksamen Substanzen, insbesondere von Substanzen, die spezifisch gegen TEA/ATTS-Transkriptionsfak­ toren der Hefe Candida albicans gerichtet sind, so­ wie auf diesen Mitteln beruhende weitere Mittel und Verfahren bereitzustellen, die zur Diagnose und Therapie von durch Candida albicans hervorgerufenen Infektionen oder Krankheitszuständen verwendet wer­ den können.

Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende tech­ nische Problem durch die Bereitstellung von Nuc­ leinsäuremolekülen, welche für die Klonierung eines Gens für einen Transkriptionsfaktor, insbesondere für ein die Virulenz humanpathogener Pilze modifi­ zierendes Protein aus Candida, insbesondere Candida albicans, geeignet sind und/oder die die rekombi­ nante Herstellung eines solchen Proteins erlauben, wobei diese Nucleinsäuremoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:

• a) einem Nucleinsäuremolekül, definiert in SEQ ID Nr. 1, 2, 3 oder 7 und/oder eines komplementären Stranges oder Teils davon;
• b) einem Nucleinsäuremolekül, kodierend eine Amino­ säuresequenz definiert in SEQ ID Nr. 4 oder ei­ nes komplementären Stranges oder Teils davon;
• c) einem Nuclesäuremolekül, erhältlich aus einer Genbank von Candida albicans unter Verwendung der in SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 dargestell­ ten Primer mit Hilfe des PCR-Verfahrens; und
• d) einem Nucleinsäuremolekül, das aufgrund seiner Homologie mit einem der unter a) bis c) genann­ ten Nucleinsäuremoleküle unter geeigneten Bedin­ gungen hybridisiert, wobei die Homologie auf Nukleotidebene (Sequenzidentität) insbesondere mindestens 65%, vorzugsweise mindestens 70%, be­ vorzugter mindestens 80% und am bevorzugtesten mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% beträgt.

Das durch das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül der SEQ ID Nr. 1 dargestellte Gen wird im Folgenden auch als CaTEC1-Gen bezeichnet. Das erfindungsgemä­ ße CaTEC1-Gen wird in vivo sowohl in der Hefeform als auch in Myzelien von C. albicans exprimiert.

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle sind insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass sie nach Einführung in Candida albicans-catec1-Mutanten, beispielsweise mit Hilfe eines Vektors, in dem sie in Sense-Orientierung unter Kontrolle geeigneter Regulationselemente integriert sind, den Phänotyp solcher Hefe-Mutanten revertieren können.

Der Phänotyp von catec1-Mutanten, beispielsweise der der erfindungsgemäßen homozygoten ura3/ura3 ca­ tec1/catec1-Nullmutante CaAS15 (Null-mutanter Phänotyp), unterscheidet sich vom Phänotyp von Wild­ typ-Zellen insbesondere insofern, als das filamen­ töse Wachstum in vitro beeinträchtigt ist, die Bil­ dung von Keimschläuchen und echten Hyphen unter­ drückt ist, die Expression von SAP4-6-Genen nicht induziert werden kann und die Mutante in einem sys­ temischen Modell von Maus-Candida-Mykosen eine ver­ minderte Virulenz zeigt. Die vorgenannten Phänoty­ pen charakterisieren also die biologische Aktivität des CaTEC1-kodierten Proteins (CaTec1p).

Die von den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle kodierten Proteine stellen Transkriptionsfaktoren dar, die die Expression von entwicklungsspezifi­ schen Genen und damit die morphologische Entwick­ lung von Candida albicans-Zellen kontrollieren und regulieren.

Die insbesondere in pathogenen Wildtyp-Formen von Candida albicans vorkommenden Nukleotid- und Amino­ säuresequenzen stellen daher ausgezeichnete Hilfs­ mittel dar, um die Virulenz pathogener Candida al­ bicans-Stämme zu vermindern und/oder zu beseitigen. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäure- und Aminosäure­ moleküle erweisen sich daher als besonders wertvoll für die Entwicklung von Medikamenten zur Bekämpfung von Candida-Mykosen. Die erfindungsgemäßen Nuclein­ säuremoleküle und die von ihnen kodierten erfin­ dungsgemäßen Proteine können beispielsweise als Targets für die Identifizierung von Substanzen ein­ gesetzt werden, die spezifisch auf die erfindungs­ gemäßen Nukleotidsequenzen oder die erfindungsgemä­ ßen Proteine wirken. So können beispielsweise Sub­ stanzbibliotheken auf die Wechselwirkung der in diesen vorhandenen Substanzen mit den erfindungsge­ mäßen Proteinen oder ihre Wirkung auf die Expressi­ on der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle hin analysiert werden. Ebenso können gegen die erfin­ dungsgemäßen Proteine gerichtete monoclonale oder polyclonale Antikörper entwickelt werden, die ei­ nerseits zum Nachweis Candida-spezifischer Proteine und damit zum Nachweis von Candida-Infektionen ver­ wendet werden können und andererseits direkt zur Bekämpfung solcher Infektionen eingesetzt werden können, wenn sie beispielsweise unter Verwendung cytotoxischer Gruppen, wie cytotoxischer Proteine oder cytotoxischer Peptide, funktionalisiert wer­ den, so dass auf diese Weise die Zielorganismen ab­ getötet werden und eine Therapie der durch diese Organismen hervorgerufenen Krankheitszustände er­ möglicht wird.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung be­ trifft daher ein in SEQ ID Nr. 1 dargestelltes er­ findungsgemäßes Nucleinsäuremolekül, wobei dieses Nucleinsäuremolekül neben 5'- und 3'-regula­ torischen Elementen eine proteinkodierende Nukleo­ tidsequenz umfasst. Die erfindungsgemäßen Nukleo­ tidsequenzen kodieren die in SEQ ID Nr. 4 darge­ stellte Aminosäuresequenz. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle sind insofern besonders hilf­ reich bei der Entwicklung neuer Therapeutika, als sie die Herstellung der von ihnen kodierten Protei­ ne oder Derivate davon mittels DNA-Rekombi­ nationstechniken erlauben. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in Anti­ sense-Konstrukten oder als komplementäre Stränge der kodierenden Nukleotidsequenzen oder als Teile davon verwendet werden, um in Candida-Zellen die endogene Expression der erfindungsgemäßen Nukleo­ tidsequenz zu inhibieren oder zu vermindern. Auf diese Weise ist es möglich, die Virulenz solcher Candida-Zellen zu vermindern oder zu beseitigen. Candida-Zellen, die beispielsweise Antisense-Kon­ strukte der erfindungsgemäßen Nukeotidsequenzen enthalten, können beispielsweise als Lebendimpf­ stoff im Rahmen einer Schutzimpfung, beispielsweise im Rahmen einer aktiven Immunisierung, verwendet werden, um späteren Infektionen mit pathogenen Can­ dida-Arten, insbesondere Candida albicans, entge­ genzuwirken.

Ebenso ist es möglich, die erfindungsgemäßen Nuc­ leinsäuremoleküle oder Teile davon in Candida- Zellen einzuführen, um dort mittels homologen Re­ kombination endogen vorhandene CaTEC1-Gene zu mu­ tieren, insbesondere auszuschalten, und so bei­ spielsweise Nullmutanten herzustellen. Die Erfin­ dung betrifft daher die Verwendung der erfindungs­ gemäßen Nucleinsäuremoleküle zur Herstellung mutan­ ter Phänotypen von Hefepilz-Zellen, insbesondere Candida-Zellen. Ebenso betrifft die Erfindung diese mutanten Candida-Zellen selbst sowie die in diesen Zellen vorhandenen mutierten catec1- oder CaTEC1- Gene. Derartige mutierte CaTEC1- oder catec1-Gene können sich als besonders hilfreich bei der Ent­ wicklung von Pharmazeutika und Diagnostika zur Be­ kämpfung von durch Candida hervorgerufene Krankhei­ ten erweisen.

Die Erfindung betrifft auch am 6.9.2000 bei der DSMZ in Braunschweig, Deutschland, unter der Nr. DSM 13716 in Escherichia coli hinterlegte Plasmide, enthaltend das CaTEC1-Gen (SEQ ID Nr. 1).

Die Erfindung betrifft ebenfalls catec1-Mutanten, insbesondere die Candida albicans-Mutante CaAS18, hinterlegt am 6.9.2000 bei der DSMZ in Braun­ schweig, Deutschland unter der Nr. DSM 13722.

Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzug­ ten Ausführungsform die vorgenannten Nucleinsäure­ moleküle, wobei diese vorzugsweise in vollständig oder partiell isolierter und gereinigter Form vor­ liegen, in besonders bevorzugter Ausführungsform als DNA- oder RNA-Sequenzen.

Die Erfindung umfasst ebenfalls Modifikationen der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, die zu der Synthese von Proteinen mit veränderten biologischen Eigenschaften, insbesondere einer veränderten Akti­ vität zur Modulation der Virulenzeigenschaften pa­ thogener Pilze, vorzugsweise von Candida-Zellen, führen. Bei den Modifikationen oder Mutationen der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen kann es sich sowohl um natürlich vorkommende Modifikationen oder Mutationen handeln als auch um solche, die mit Hil­ fe üblicher, auf dem Fachgebiet bekannter Standard­ verfahren der Mikrobiologie/Molekularbiologie er­ zeugt wurden (vergleiche Sambrook et al., Molecular Kloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA). Bei den von der vorliegenden Erfindung erfassten Muta­ tionen oder Modifikationen kann es sich um Inserti­ onen, Deletionen, Duplikationen, Inversionen, Anla­ gerungen, Austausche oder ähnliches, insbesondere auch von ungewöhnlichen Nukleotiden, handeln. Des Weiteren umfasst die Erfindung auch Mutationen oder Abwandlungen der erfindungsgemäßen Nukleotidsequen­ zen, die durch Fusion mit Genen oder Bestandteilen von Genen aus anderen Quellen hervorgerufen werden. Die Erfindung umfasst insbesondere auch verkürzte Nukleotidseguenzen der vorgenannten Art, sofern diese Proteine oder Proteinteile kodieren, die die Virulenz von Candida-Zellen modulieren können. Die Erfindung umfasst insbesondere auch Mutationen oder Modifikationen von Nukleotidsequenzen, die zu Pro­ teinen führen, die eine veränderte Stabilität, Spe­ zifität, ein modifiziertes Temperatur-, pH-Wert- und/oder Konzentrationsprofil, eine veränderte Ak­ tivität und/oder ein verändertes Effektorenmuster aufweisen, sowie solche, deren Konformationen ver­ ändert sind, beziehungsweise solche, die andere Un­ tereinheiten beziehungsweise andere prä- und/oder posttranslationale Modifikationen aufweisen.

Die Erfindung betrifft ebenfalls Nukleotidsequen­ zen, die mit den vorstehend genannten erfindungsge­ mäßen Nukleotidsequenzen hybridisieren können. Im Zusammenhang mit der Erfindung bedeutet eine "Hybridisierung" die Aneinanderlagerung von zwei einzelsträngigen Nucleinsäuremolekülen unter Bedin­ gungen, wie sie in Sambrook et al. (Molecular Klo­ ning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) beschrie­ ben sind, wobei es sich vorzugsweise um stringente Bedingungen handelt. Der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Nucleinsäuremolekül, das mit einem Nucleinsäuremo­ lekül nach a) bis c) hybridisiert" verweist daher auf ein Nucleinsäuremolekül, das unter, vorzugswei­ se stringenten, Bedingungen mit einer Nucleinsäure nach a) bis c) hybridisiert. Eine solche Hybridi­ sierung ist dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Waschen für eine Stunde mit 1 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C, insbesondere für eine Stunde mit 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C, noch ein positi­ ves Hybridisierungssignal zu beobachten ist. Eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz ist daher eine unter derartigen Waschbedingungen mit der in den Sequenzprotokollen angegebenen Nukleotidsequenz hybridisierende Nukleotidsequenz.

Die mit den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und/oder alleli­ sche Varianten der vorstehend beschriebenen Nukleo­ tidsequenzen, die ein erfindungsgemäßes Protein ko­ dieren. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfin­ dung werden unter "Fragmenten" Teile von Nukleotid­ sequenzen verstanden, die eine ausreichende Länge besitzen, um das vorstehend beschriebene Protein oder ein äquivalentes Protein zu kodieren, das eine Aktivität zur Modulation von Virulenzeigenschaften von Candida-Zellen aufweist. Die Begriffe "Deri­ vat", "funktionelles Äquivalent" oder "Variante" bedeuten im Zusammenhang mit der vorliegenden Er­ findung, dass sich die Sequenzen dieser Moleküle von den Sequenzen der vorstehend beschriebenen Nukleotidsequenzen an mindestens einer Position un­ terscheiden, aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen auf der Nucleinsäureebene aufweisen. Homologie bedeutet insbesondere eine Sequenz­ identität von mindestens 40%, insbesondere von min­ destens 60%, vorzugsweise von über 80% und beson­ ders bevorzugt über 90%, 95%, 97% oder 99% auf Nuc­ leinsäureebene.

Die Aminosäuresequenzen der von diesen Nucleinsäu­ remolekülen kodierten Proteine sind zu der in SEQ ID Nr. 4 gezeigten Aminosäuresequenz homolog, wobei die Homologie mindestens 80%, vorzugsweise mindes­ tens 85%, und besonders bevorzugt mindestens mehr als 90%, 95%, 97% und 99% beträgt. Im Zusammen­ hang mit der Erfindung bezieht sich der Ausdruck "zu mindestens 80%, vorzugsweise zu mindestens 85 %, und besonders bevorzugt zu mindestens mehr als 90%, 95%, 97% und 99% homolog" auf eine Se­ quenzübereinstimmung auf der Aminosäuresequenz- Ebene, die mit Hilfe bekannter Verfahren, zum Bei­ spiel computergestützter Sequenzvergleiche (Basic local alignment tool, Altschul et al., J. Mol. Bi­ ol., 215 (1990), 403-410) bestimmt werden kann. Der dem Fachmann bekannte Ausdruck der "Homologie" be­ zeichnet den Grad der Verwandtschaft zwischen zwei oder mehreren Polypeptid-Molekülen, der durch die Übereinstimmung zwischen den Sequenzen bestimmt wird, wobei Übereinstimmung sowohl eine identische Übereinstimmung als auch ein konservativer Amino­ säureaustausch bedeuten kann. Der Prozentsatz der Homologie ergibt sich aus dem Prozentsatz überein­ stimmender Bereiche zwischen zwei oder mehr Sequen­ zen unter Berücksichtigung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten.

Die Unterschiede zu den erfindungsgemäßen Aminosäu­ resequenzen können beispielsweise durch Mutationen, wie zum Beispiel Deletionen, Substitutionen, Inser­ tionen, Anlagerung, Austausche und/oder Rekombina­ tionen der die Aminosäuresequenzen kodierenden Nukleotidsequenzen entstanden sein. Selbstverständ­ lich kann es sich dabei auch um natürlicherweise auftretende Sequenzvariationen handeln, beispiels­ weise um Sequenzen aus einem anderen Organismus o­ der um Sequenzen, die auf natürliche Weise mutiert wurden, oder Mutationen, die mit Hilfe üblicher, auf dem Fachgebiet bekannter Mittel, beispielsweise chemische Agenzien und/oder physikalische Agenzien, gezielt in die Sequenzen eingeführt wurden.

Die vorliegende Erfindung umfasst daher ebenfalls ein Polypeptid oder Protein mit einer biologischen Aktivität, die insbesondere in Candida albicans- Zellen in vivo das filamentöse Wachstum der Zellen und/oder die Bildung von Keimschläuchen und echten Hyphen beeinflusst, die Expression der Proteinase- Isogene SAP4-6 induziert oder hemmt und/oder die Virulenz der sie enthaltenden Candida albicans- Zellen modulieren kann. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeuten die Begriffe "die Virulenz pathogener Pilzstämme modulierendes Prote­ in oder Polypeptid" oder "Aktivität zur Modulation der Virulenz oder von Virulenzeigenschaften", dass ein Protein oder Polypeptid eine Aktivität auf­ weist, die den Grad der Aggressivität eines infek­ tiösen Mikroorganismus in einem Makroorganismus verändern, beispielsweise vermindern kann. Die Ak­ tivität der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen kann beispielsweise mit Hilfe des nachstehend beschriebenen systemischen Modells von Maus-Candida- Mykosen untersucht und quantitativ bestimmt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein, vorzugsweise isoliertes und vollständig gereinig­ tes, Protein, das durch Expression eines erfin­ dungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls oder eines Frag­ mentes davon in einer Wirtzelle erhältlich ist und die vorgenannte biologische Aktivität aufweist. Vorzugsweise besitzt das Protein die gleichen Ei­ genschaften, insbesondere die gleiche Aktivität, wie das Protein, dass von einer Nukleotidsequenz mit einer in SEQ ID Nr. 1 oder 2 dargestellten Se­ quenz kodiert wird und dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 4 gezeigt ist.

Die Erfindung betrifft ferner Vektoren, die die er­ findungsgemäßen Nukleotidsequenzen enthalten. Bei den Vektoren handelt es sich vorzugsweise um Plas­ mide. Cosmide, Viren, Bakteriophagen, Shuttle-Vek­ toren und andere in der Gentechnik üblicherweise verwendete Vektoren. Die erfindungsgemäßen Vektoren können weitere Funktionseinheiten besitzen, die ei­ ne Stabilisierung und/oder Replikation des Vektors in einem Wirtsorganismus bewirken oder zumindest dazu beitragen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform um­ fasst die vorliegende Erfindung Vektoren, bei denen die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen mit min­ destens einem regulatorischen Element funktionell verbunden sind. Im Zusammenhang mit der vorliegen­ den Erfindung werden unter dem Begriff "regulatorisches Element" solche Elemente verstanden, welche die Transkription und/oder Translation von Nucleinsäuremolekülen in prokaryotischen und/oder eukaryotischen Wirtszellen gewährleisten. Regulatorische Elemente können Promotoren, Enhan­ cer, Operatoren, Silencer und/oder Transkripti­ onsterminationssignale sein. Regulatorische Elemen­ te, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleotidse­ quenz, insbesondere den Protein-kodierenden Ab­ schnitten dieser Nukleotidsequenz, funktionell ver­ bunden sind, können Nukleotidsequenzen sein, die aus anderen Organismen oder anderen Genen stammen als die Protein-kodierende Nukleotidsequenz selbst. Beispiele dafür sind: T7, T3, SP6 und weitere ge­ bräuchliche Regulationselemente zur in vitro- Transkription; P_LAC, P_Ltet und weitere gebräuchliche Regulationselemente zur Expression in E. coli; GAL1-10, MET25; CUP1, ADH1, AFH1, GDH1, TEF1, PMA1 und andere Regulationselemente zur Expression in S. cerevisiae; GAP1, YPT1, AOX1 und weitere gebräuch­ liche Regulationselemente zur Expression in P. pastoris; Polyhedrin zur Expression in Baculovirus­ systemen sowie P_CMV, P_SV40 und weitere gebräuchliche Regulationselemente zur Expression in Säugerzellen.

Ebenso können die erfindungsgemäß eingesetzten Re­ gulationselemente auch aus Candida albicans stam­ men. Insbesondere kann es sich dabei um die regula­ torischen Elemente der erfindungsgemäßen Nukleotid­ sequenzen, die ein erfindungsgemäßes Protein kodie­ ren, handeln, dargestellt zum Beispiel in SEQ ID Nr. 3, welche das 5'-Regulationselement inclusive Promotor und Transkriptionsstartstelle des CaTEC- Gens darstellt oder in SEQ ID Nr. 7, welche den 3'- Bereich der kodierenden Region des CaTEC1-Gens dar­ stellt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz oder ein Fragment davon in dem Vektor sowohl in Antisense- Orientierung als auch in Sense-Orientierung zu dem/den regulatorischen Element(en) vorliegen. Wenn eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz in Anti­ sense-Orientierung zu dem/den regulatorischen Ele­ ment(en) vorliegt, kann der Vektor beispielsweise in eine Candida albicans-Zelle eingeführt werden und nach der Transkription der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz die Expression des/der endogenen CaTEC1-GenS/Gene von Candida albicans inhibieren oder reduzieren. Die in Antisense-Orientierung ver­ wendeten Fragmente der vorliegenden erfindungsgemä­ ßen Nukleotidsequenzen können dabei eine Länge auf­ weisen, die ausreicht, um eine Hybridisierung an die endogenen CaTEC1-Sequenzen und damit eine Translationsinhibierung zu ermöglichen, beispiels­ weise eine Länge von mindestens 100 Basenpaaren. Selbstverständlich muss dieses Fragment eine aus­ reichende Spezifität für die zu inhibierende Nukle­ otidsequenz aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Vektoren können darüber hin­ aus weitere Elemente enthalten. Hier kann es sich beispielsweise um Antibiotica-Resistenzgene, stabi­ lisierende Elemente sowie Selektionsmarker oder Af­ finitäts-Epitope, beispielsweise HA, Myc und etc., handeln.

Die Erfindung umfasst selbstverständlich auch Vek­ toren, die nicht nur eine, sondern mehrere der er­ findungsgemäßen Nukleotidsequenzen enthalten. Diese Sequenzen können dabei so angeordnet sein, dass ge­ gebenenfalls ein, zwei oder mehrere der erfindungs­ gemäßen Protein-kodierenden Bereiche der SEQ ID Nr. 1 oder 2 von einem einzigen Satz regulatorischer Elemente kontrolliert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Vek­ toren umfassen und die fähig sind, die erfindungs­ gemäßen Proteine zu exprimieren. Bei den erfin­ dungsgemäßen Wirtszellen kann es sich sowohl um prokaryotische als auch um eukaryotische Zellen handeln. Beispiele für prokaryotische Zellen sind Bakterien, wie zum Beispiel Escherichia coli oder Bacillus subtilis. Erfindungsgemäß bevorzugte Bei­ spiele für eukaryotische Wirtszellen umfassen Hefe­ zellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und Säuger­ zellen, insbesondere menschliche Zellen. Die erfin­ dungsgemäße Wirtszelle kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die eingeführte erfindungsgemäße Nukleo­ tidsequenz heterolog in Bezug auf die transformier­ te Zelle ist, das heißt, dass die eingeführte er­ findungsgemäße Nukleotidsequenz natürlicherweise nicht in diesen Zellen vorkommt oder aber an einem anderen Ort oder einer anderen Kopiezahl oder Ori­ entierung im Genom dieser Zellen lokalisiert ist, als die entsprechende natürlicherweise auftretende Sequenz.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der vorliegen­ den Erfindung handelt es sich bei der Zelle um eine gramnegative Zelle, beispielsweise um eine Escheri­ chia coli-Zelle. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann es sich aber auch um eine gram­ positive Zelle, beispielsweise Bacillus subtilis handeln. Bei Einführung der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz in eine grampositive Zelle sind die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen vorzugs­ weise mit einem Signalpeptid verbunden, das ein Ausschleußen des translatierten Genproduktes aus der Zelle in das Medium erlaubt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform han­ delt es sich bei der erfindungsgemäßen Wirtszelle um eine eukaryotische Wirtszelle. Dabei kann es sich um Zellen handeln, die bereits ein oder mehre­ re solcher Gene auf ihren Chromosomen enthalten. Eukaryotische Zellen bieten den Vorteil, dass die Transkription und Translation einer Nukleotidse­ quenz, die ein heterologens eukaryotisches Protein kodiert, so erfolgt wie in den Zellen, aus denen die eukaryotische Nukleotidsequenz stammt. Das heißt, in eukaryotischen Wirtszellen werden die Transkripte einem korrekten Splicing unterworfen und das Translationsprodukt wird den in eukaryoti­ schen Zellen typischen posttranslationalen Modifi­ kationen unterworfen, wie zum Beispiel einer Glyco­ sylierung. In einer besonders bevorzugten Ausfüh­ rungsform kann die erfindungsgemäße Wirtszelle eine Pilzzelle, zum Beispiel eine Zelle aus der Gattung Candida, insbesondere eine Candida albicans-Zelle, eine Saccharomyces-Zelle oder eine tierische Zelle, wie eine Insektenzelle, sein. Beispiele für geeignete Candida-Wirtszellen sind Abkömmlinge des Stam­ mes SC5314 (Fonzi und Irwin, Genetics, 134 (1993), 717-728). Bevorzugte Beispiele für geeignete Wirts­ zellen von Saccharomyces cerevisiae sind Abkömmlin­ ge des Stammes S1278b. Weitere bevorzugte Zellen umfassen die Insektenzelllinie IPLB-Sf21, die menschliche HeLa-Zelllinie, Jurkat-Zellen oder CHO- Zellen.

Die Erfindung betrifft daher auch Zellkulturen, die mindestens eine der erfindungsgemäßen Wirtszellen aufweisen, wobei eine erfindungsgemäße Zelllinie die Fähigkeit aufweist, ein erfindungsgemäßes Pro­ tein mit der Aktivität zur Modulation der Virulenz von Candida albicans-Zellen oder ein Fragment davon zu produzieren.

Die Erfindung betrifft insbesondere auch ein Ver­ fahren zur Herstellung eines Virulenz- modifizierenden Proteins, insbesondere eines Viru­ lenz-modifizierenden Proteins aus Candida albicans, wobei erfindungsgemäße Wirtszellen in einem geeig­ neten Kulturmedium unter solchen Bedingungen kulti­ viert werden, die die Bildung des Virulenz- modifizierenden Proteins erlauben und dieses im An­ schluss an die Kultivierung entweder aus dem Kul­ turmedium oder aus den Zellen gewonnen und isoliert werden kann.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch isolierte und vollständig gereinigte monoclonale oder poly- Klonale Antikörper oder deren Fragmente, die mit einem erfindungsgemäßen Protein so spezifisch und mit einer solchen Affinität reagieren, dass unter Verwendung dieser monoclonalen oder polyclonalen Antikörper oder deren Fragmente mit Hilfe üblicher immunologischer Verfahren beispielsweise ein Nach­ weis eines erfindungsgemäßen Proteins möglich ist. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung um­ fasst daher monoclonale und polyclonale Antikörper, die spezifisch eine Struktur eines erfindungsgemä­ ßen Virulenz-modulierenden Proteins identifizieren und/oder daran binden können. Bei dieser Struktur kann es sich um ein Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Proteoglycan und/oder einen Lipidkomplex handeln, das/der ein Teil des erfindungsgemäßen Proteins ist oder mit diesem in spezifischer Beziehung steht. Die Erfindung umfasst auch Antikörper, die gegen Strukturen gerichtet sind, die im Ergebnis posttranslationaler Modifikationen des erfindungs­ gemäßen Proteins entstanden sind. Die Erfindung um­ fasst auch Fragmente derartiger Antikörper, wie beispielsweise Fc- oder F(ab')₂- beziehungsweise Fab-Fragmente.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorlie­ genden Erfindung betrifft erfindungsgemäße Proteine oder Teile davon, gegen die Proteine gerichtete An­ tikörper oder Teile davon sowie erfindungsgemäße Nukleotidsequenzen, die in immobilisierter Form vorliegen. Die in immobilisierter Form vorliegenden erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, Proteine und/oder Antikörper lassen sich als trägergebundene Screening-Vorrichtungen verwenden, um Substanzen zu identifizieren, die mit den immobilisierten Molekü­ len in Wechselwirkung treten. Die Immobilisierung kann an ein beliebiges geeignetes Trägermaterial erfolgen, zum Beispiel an inerte oder elektrisch geladene, anorganische oder organische Trägermate­ rialien, wie zum Beispiel Glasmaterialien, Alumini­ umoxid, Cellulose, Stärke, Dextran, Polyacrylamid und so weiter. Die verwendeten Trägermaterialien können darüber hinaus funktionelle Gruppen aufwei­ sen, die beispielsweise eine kovalente Bindung er­ möglichen. Eine Immobilisierung kann derart erfol­ gen, dass die vorstehend genannten Nukleotidsequen­ zen, Proteine oder Antikörper in ein dreidimensio­ nales Netzwerk eingebunden sind.

Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform der vor­ liegenden Erfindung umfasst Verfahren zur Diagnose und/oder Therapie von durch Candida-Arten verur­ sachten Infektionen oder Krankheitszuständen, ins­ besondere durch Candida albicans verursachte Infek­ tionen, wie Candida-Mykosen, beispielsweise Candi­ dose der Körperfalten, der männlichen Urethra, der Mundschleimhaut, der Finger- oder Fussnägel (Onchymykose), der Säuglingshaut, der Vagina usw., oder Candida-Granulom. Dabei werden die zu testen­ den Organismen auf die Anwesenheit von erfindungs­ gemäßen Agenzien, insbesondere Nucleinsäuremolekü­ le, Proteinen, Wirtszellen, Vektoren, Antikörpern oder Fragmenten davon untersucht und deren Anwesen­ heit nachgewiesen. Das heißt, die Anwesenheit der erfindungsgemäßen Agenzien weist auf die Krankheit hin. Der Nachweis der vorgenannten erfindungsgemä­ ßen Agenzien kann mittels entsprechender, das heißt erfindungsgemäße Agenzien spezifisch erkennender Substanzen erfolgen. Beispielsweise kann ein Nach­ weis der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen mit Hilfe von hybridisierenden Sequenzen erfolgen, wo­ bei diese vorzugsweise markiert sind. Beispielsweise können die hybridisierenden Sequenzen Fluores­ zenz-, Enzym- oder radioaktive Marker aufweisen. Der Nachweis von erfindungsgemäßen Proteinen oder Antikörpern erfolgt vorzugsweise mit Hilfe von An­ tikörpern, die gegen die die vorgenannten Proteine gerichtet sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von erfindungsgemäßen Nucleinsäuremole­ küle, Proteinen, Wirtszellen, Vektoren, Antikörpern und/oder Teilen davon als Diagnostika. Im Zusammen­ hang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Diagnostika jedwede Stoffe verstanden, die spezi­ fisch das Vorhandensein von Zuständen, Prozessen oder Substanzen beziehungsweise deren Abwesenheit erkennen können und insbesondere Rückschlüsse auf Krankheiten geben können. Diagnostika weisen dabei häufig erkennende und markierende Funktionen auf.

Die Erfindung umfasst selbstverständlich auch Dia­ gnostik-Kits, die die erfindungsgemäßen Agenzien, das heißt Nukleotidsequenzen, Proteine, Antikörper oder Teile davon enthalten und die die Diagnose von durch Candida-Arten, insbesondere Candida albicans, verursachten Krankheiten erlauben. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Krank­ heiten insbesondere auch Zustände, wie unnatürliche Gemütszustände, Alterserscheinungen, Entwicklungs­ störungen und ähnliches verstanden.

Die Erfindung erfasst auch Verfahren zur Therapie von durch Candida-Arten, insbesondere Candida albi­ cans, verursachten Krankheiten, wobei der zu behan­ delnde Organismus mit den erfindungsgemäßen Agenzien über einen Zeitraum mit einer Dosis behandelt wird, die ausreicht, das Krankheitsbild zu stabili­ sieren oder zu verbessern oder die Krankheit zu heilen. Die Erfindung betrifft daher auch die Ver­ wendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, Proteine, Wirtszellen, Vektoren, Antibiotika und Fragmenten davon als Therapeutika. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff "Therapeutika" insbesondere solche Stoffe verstanden, die entweder prophylaktisch oder krank­ heitsbegleitend eingesetzt werden können, um Krank­ heitszustände zu vermeiden, zu lindern oder zu be­ seitigen. Dazu gehören zum Beispiel auch Impfstof­ fe. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Therapeutika auch solche Stoffe ver­ standen, die ausschließlich oder auch kosmetische Wirkungen aufweisen.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung daher auch pharmazeutische Zusammenset­ zungen, die die erfindungsgemäßen Agenzien, also die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, Protei­ ne, Wirtszellen, Vektoren, Antikörper oder Fragmen­ te davon enthalten, gegebenenfalls zusammen mit ei­ nem pharmazeutisch verträglichen Träger und gege­ benenfalls weiteren Zusatzstoffen, wie Stabilisato­ ren, Verdickungsmitteln, Trennmitteln, Gleitmit­ teln, Farbstoffen, Geruchsstoffen, Geschmacksstof­ fen, Emulgatoren oder ähnlichem.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vor­ liegenden Erfindung betrifft Verfahren zum Scree­ nen, das heißt zum Auffinden und Identifizieren von Substanzen, die für die Behandlung von durch Candida-Arten verursachten Krankheiten geeignet sind. Dabei werden die auf ihre therapeutische Wirkung hin zu testenden Substanzen in einem geeigneten Me­ dium wie beispielsweise einer Lösung, Suspension oder auch bei einer Zelle, mit einem erfindungsge­ mäßen Agens, insbesondere einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz oder einem erfindungsgemäßen Pro­ tein oder Fragment davon in Kontakt gebracht und eine gegebenenfalls stattfindende Wechselwirkung, beispielsweise eine Bindung, nachgewiesen.

Ein bevorzugtes Substanz-Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst einen Assay, der wie folgt aufgebaut ist: Die Promotoren der Isogene der sezernierten Aspartyl-Proteinase vom Typ 4, 5 und 6 (SAP5-6-Gene) enthalten eine mit Trennelementen durchsetzte "head to tail"-Anordnung von TCS- Motiven, die die Bindungsstelle für pilzliche TEA/ATTS-Transkriptionsfaktoren, insbesondere den erfindungsgemäßen CaTEC1-Faktor darstellt. Da er­ findungsgemäß gezeigt werden konnte, dass das Ca­ TEC1-Protein die Expression der SAP4-6-Gene durch Bindung an den Promotor induzieren kann, wird der Promotorbereich dieser SAP4-6-Gene mit einem Repor­ tergen kombiniert. Die Expression des Reportergens kann entweder durch die Zugabe des gereinigten Ca­ TEC1-Proteins oder durch die Expression der das Ca­ TEC1-Protein kodierenden erfindungsgemäßen Nukleo­ tidsequenzen induziert werden, wobei das CaTEC1- Protein unter geeigneten Bedingungen an den Promo­ torbereich bindet und die Expression des Reporter­ gens induziert. Die Induzierbarkeit des in dem Testsystem verwendeten Systems zur Expression des Reportergens wird dann in Ab- oder Anwesenheit von zu testenden Substanzen überprüft. Mit Hilfe von Naturstoff- und Substanzbibliotheken können somit geeignete Inhibitoren detektiert werden, die die Funktion des CaTEC1-Proteins oder die Expression der erfindungsgemäßen, das CaTEC1-Protein kodieren­ den Nukleotidsequenzen inhibieren. Auf diese Weise lassen sich also Substanzen identifizieren, die po­ tentielle Medikamente zur Bekämpfung von Candida- Infektionen darstellen.

Ebenso können die erfindungsgemäßen Proteine in Form von Hybridproteinen in herkömmlichen "Two- Hybrid-Systemen" eingesetzt werden, um mit den er­ findungsgemäßen Proteinen in Wechselwirkung treten­ de Proteine zu identifizieren, wobei ein erstes Hybridprotein aus einem erfindungsgemäßen Protein und beispielsweise einer die Transkription eines Reportergens transaktivierenden Domäne hergestellt wird und zusammen mit einem Reportergen und einem zweiten Hybridprotein aus einem ersten Anteil, der das zu untersuchende Protein darstellt und einem zweiten Anteil, der eine DNA-Bindedomäne des transkriptionsaktivierenden Anteils des ersten Hyb­ ridproteins darstellt, inkubiert wird. Bei Interak­ tionen des zu untersuchenden Proteins mit dem er­ findungsgemäßen Protein kommt es nun zu einer Asso­ ziation der transaktivierenden und der DNA- Bindedomäne, die wiederum die Expression des Repor­ tergens induziert und den Nachweis der Bindung er­ laubt. Selbstverständlich sind auch beliebige ande­ re Kombinationen möglich.

Die erfindungsgemäßen Proteine sind daher wirksame Mittel zum Screenen pharmakologisch interessanter Substanzen zur Behandlung von Krankheiten, die durch Candida-Arten verursacht werden. Die erfin­ dungsgemäßen Proteine können dabei in isolierter Form, in medizinischen Vorrichtungen, in Drug- Delivery-Vorrichtungen, Matrizen für Drug- Screening-Bibliotheken, Mikrotiterplatten, appli­ zierbaren Katalyse-Vorrichtungen oder ähnlichem An­ wendung finden.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorlie­ genden Erfindung betrifft eine mutierte Candida al­ bicans-Zelle, die dadurch gekennzeichnet ist, dass in ihr die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen o­ der deren regulatorische Bereiche so verändert sind, dass kein Transkript der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nachweisbar ist. Die erfindungsge­ mäß modifizierte Candida albicans-Zelle kann sowohl eine haploide Zelle, wobei die in nur einer Kopie vorliegende erfindungsgemäße Nukleotidsequenz ver­ ändert oder mutiert ist, als auch eine diploide Zelle sein, bei der beide Kopien der erfindungsge­ mäßen Nukleotidsequenz so verändert oder mutiert sind, dass es sich um eine homozygote Nullmutante handelt. Dabei kann es sich sowohl um eine natürli­ che Zellmutante als auch eine mit Hilfe technischer Mittel erzeugte Mutante, beispielsweise eine mit Hilfe von homologen Rekombinationen, Antisense- Verfahren oder ähnlichem hergestellte Mutante han­ deln. In einer besonders bevorzugten Ausführungs­ form betrifft die vorliegende Erfindung homozygote ura3/ura3 catec1/catec1 (pVEC)-Nullmutante CaAS18, die mittels sequentieller homologer Rekombination erzeugt wurde und bei der DSMZ in Braunschweig un­ ter der Nr. DSM 13722 am 6.9.2000 hinterlegt wurde.

Die erfindungsgemäße mutierte Candida albicans- Zelle ist dadurch gekennzeichnet, dass ihre Lebens­ fähigkeit, Koloniegröße und Verdopplungszeit im Vergleich zur Wildtyp-Zelle nicht oder nur unwe­ sentlich verändert sind. Eine erfindungsgemäß mu­ tierte Candida albicans-Zelle ist insbesondere da­ durch gekennzeichnet, dass ihr filamentöses Wachs­ tum beeinträchtigt ist, wobei insbesondere die Bil­ dung von Keimschläuchen und echten Hyphen unter­ drückt ist. Erfindungsgemäß mutierte Zellen bilden stattdessen gebogene tubuläre Strukturen, die an den Zell-Zell-Grenzen Einschnürungen aufweisen und somit morphologische Pseudohyphen darstellen. Neben den morphologischen Veränderungen sind solche mu­ tierten Candida albicans-Zellen dadurch charakteri­ siert, dass in ihnen die Expression der SAP4-6-Gene nicht induzierbar ist. Bei einer systemischen In­ fektion in einem Maus-Modell für systemische Candi­ da-Mykosen zeigt sich, dass die Virulenz der erfin­ dungsgemäßen homozygoten catec1-Zellmutante von Candida albicans im Vergleich zu Wildtyp-Zellen signifikant unterdrückt ist.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft daher die Verwendung von leben­ den mutierten oder veränderten Candida albicans- Zellen, insbesondere der catec1/catec1-Nullmutante CaAS18, mit einer Mutation in den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, so dass diese Nukleotidsequen­ zen unter Transkriptionsbedingungen kein Transkript erzeugen können und die Zellen gegenüber Wildtyp- Stämmen eine erheblich reduzierte Virulenz zeigen, als Impfstoff oder Vakzine im Rahmen einer Schutz­ impfung zur Erzeugung einer belastbaren Krankheitsimmunität gegen Infektionen von Candida-Wildtyp- Stämmen, insbesondere von Candida albicans. Dabei sind die Lebendvakzine vorzugsweise mit Hilfe wei­ terer geeigneter Mittel so abgeschwächt, dass bei­ spielsweise ihre Vermehrungsfähigkeit beseitigt ist. Die Verabreichung einer derart abgeschwächten Lebendvakzine kann beispielsweise parenteral, lo­ kal, insbesondere oral, nasal, kutan oder mittels Inhalation, erfolgen. Die Verabreichung verfolgt das Ziel einer insbesondere lokalen Infektabwehr an Schleimhäuten durch Bildung sekretorischer Antikör­ per und durch Erhöhung der Makrophagen-Aktivität.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Figuren erläutert.

Das zu dieser Lehre gehörende Sequenzprotokoll um­ fasst:
SEQ ID Nr. 1 zeigt die 4216 Nukleotide umfassende DNA-Sequenz eines genomischen Klons des CaTEC1-Gens aus Candida albicans.
SEQ ID Nr. 2 zeigt den 2229 Nukleotide umfassenden proteinkodierenden Bereich des genomischen Klons aus SEQ ID Nr. 1 (bp 953 bis 3181, bezogen auf SEQ ID Nr. 1 ATG-Start: 953-955, Stopcodon: 3182-3184).
SEQ ID Nr. 3 zeigt das 5'-Regulationselement des CaTEC1-Gens von SEQ ID Nr. 1 (bp 1 bis 952 bezogen auf SEQ ID Nr. 1).
SEQ ID Nr. 4 zeigt die aus einem offenen Leseraster (SEQ ID Nr. 2) von SEQ ID Nr. 1 abgeleitete 743 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz des erfin­ dungsgemäßen CaTEC1-Proteins.
SEQ ID Nr. 5 zeigt die Sequenz des Primers TEC1genPCR.01, der zur Isolierung der erfindungsge­ mäßen DNA-Sequenz des CaTEC1-Gens verwendet wurde.
SEQ ID Nr. 6 zeigt die Sequenz des Primers TEC1genPCR.02, der zur Isolierung der erfindungsge­ mäßen DNA-Sequenz des CaTEC1-Gens verwendet wurde.
SEQ ID Nr. 7 zeigt das 3'-Regulationselement des erfindungsgemäßen CaTEC1-Proteins von SEQ ID Nr. 1 (bp 3185-4216 bezogen auf SEQ ID Nr. 1).

Beispiel 1 Klonierung und Expression des CaTEC1-Gens

Zur Amplifizierung der CaTEC1-Gens mit Hilfe des PCR-Verfahrens wurden die Primer TEC1genPCR.01 mit der Sequenz:

5'-TTTTCTATTCTAACCACCCTCTGC-3' (SEQ ID Nr. 5)

sowie der Primer TEC1genPCR.02 mit der folgenden Sequenz:

5'-CCCGCCTTGCCCCTCTT-3' (SEQ ID Nr. 6)

verwendet. Mittels dieser Primer wurde ein 4.2 kb- Fragment aus genomischer DNA des Stammes CAl-4 (Fonzi und Irwin, Genetics (1993) 134, 717-728) un­ ter Verwendung des LongRange-PCR-Kits (Boehringer, Deutschland) gewonnen. Das PCR-Produkt wurde in die EcoRV-Stelle des Vektors pGEM-T-Easy (Promega, Deutschland) subkloniert, wobei das bei DSMZ hin­ terlegte Plasmid p275 erhalten wurde. Das NotI- Fragment des Plasmids p275, das die CaTEC1-Sequenz enthielt, wurde in die NotI-Stelle des Vektors pRS425 (Christianson et al., Gene, 110 (1992), 119- 122) kloniert, wobei der Vektor pRS425CaTEC1 zur Komplementationsanalyse in S. cerevisiae erhalten wurde.

Das BglII-EcoRV-Fragment des Plasmids p275, das den CaTEC1-ORF (offenen Leserahmen, 2229 bp Länge, SEQ ID Nr. 2) enthielt, wurde gegen das 3,5 kb BglII- SalI-Fragment einer hisG-URA3-hisG-Kassette ausge­ tauscht, die von dem Plasmid pMB7 (Fonzi und Irwin, Genetics, 134 (1993), 717-728) erhalten wurde, wo­ bei das Plasmid p277 erhalten wurde. Dieses Plasmid wurde mit NotI gespalten und in den ura^--C. albi­ cans-Stamm CAl-4 transformiert, um so den kodieren­ den Bereich eines der chromosomalen CaTEC1-Allele mit der hisG-URA3-hisG-Kassette mittels homologer Rekombination zu ersetzen. Auf einem selektiven ura^--Medium wurden Ura⁺-Tranformanten ausgewählt. Mittels Southern-Blot-Analyse wurde die Integration der Kassette in den CaTEC1-Locus bestätigt. Auf ei­ nem Medium, das 5-Fluoroorotsäure enthielt, wurden spontan entstandene ura^--Derivate selektiert. Diese Klone wurden mittels Southern-Blot-Hybridisierung durchmustert, um die Klone zu identifizieren, die das URA3-Gen mittels intrachromosomaler Rekombina­ tion verloren hatten, die durch die hisG- Wiederholungssequenzen vermittelt worden war. Die­ ses Verfahren wurde wiederholt, um das andere funk­ tionelle Allel von CaTEC1 zu deletieren. Dabei wurde die homozygote catec1::hisG/catec1::hisG-Mutante (eine dieser homozygoten Mutanten wurde als CaAS15 bezeichnet) erhalten. Die Mutante CaAS15 wurde ent­ weder mit dem Vektor pVEC transformiert, wobei der Stamm CaAS18 erhalten wurde, oder mit dem Vector pVEC-CaTEC1, der das CaTEC1-Gen enthielt, wobei der Stamm CaAS20 erhalten wurde.

Das C. albicans-Plasmid pVEC-CaTEC1 wurde kon­ struiert, indem ein NcoI-SacI-Fragment des Plasmids p275, das das CaTEC1-Gen enthält, in das Plasmid pVEC (Candida albicans, Navarro-Garcia et al., J. Med. Vet. Mycol 33 (1995), 361-366), das einen Replikationsstartpunkt von Candida albicans und ei­ nen selektierbaren CaURA3-Marker enthält und das mit den Restriktionsenzymen SmaI und SacI gespalten worden war, kloniert wurde.

Beispiel 2 Funktionsanalysen in S. cerevisiae

Hefe-tec1-Mutanten weisen einen Pseudohyphen-Defekt in diploiden und einen Invasionsdefekt in haploiden Stämmen auf. CaTEC1 wurde in den diploiden S. cere­ visiae-Stamm L6146 (tec1/tec1) eingeführt. Es wurde L6146-pRS425CaTEC1 erhalten. Dieser Stamm wurde auf pseudohyphales Wachstum auf SLAD-Agar getestet. Es konnte gezeigt werden, dass CaTEC1 den pseudohypha­ len Wachstumsdefekt von L6146 komplementieren konn­ te, wobei der Stamm L6146 das Plasmid ohne CaTEC1- Insert enthielt. Ebenso konnte der Invasionswachs­ tumsdefekt des haploiden S. cerevisiae-Stamms L6149 (tec1) auf YPD-Agar nach Transformation mit pRS425CaTEC1 komplementiert werden. Es konnte ge­ zeigt werden, dass in der Gegenwart von CaTEC1 nicht nur haploide (MATa), sondern auch diploide (MATa/α) Mutanten zur Invasion in die Oberfläche des Agars induziert werden konnten. Dies könnte auf eine Überaktivität der TEC1-reaktiven Elemente in S. cerevisiae aufgrund hoher CaTEC1-Kopienzahl zu­ rückzuführen sein. CaTEC1 ist in der Lage, die FLO11-Transkription in Abwesenheit von TEC1 in S. cerevisiae zu aktivieren. Flo11p erfordert nämlich Tec1p zur Aktivierung und ist wesentlich für das Pseudohyphen- und Invasionswachstum (Lambrechts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8419- 8424). In der Gegenwart von CaTEC1 wurde ein FLO11- lacZ Reporter (Rupp et al., EMBO J (1999) 18, 1257- 1269) sowohl in diploiden (L6146 tec1/tec1 pRS425CaTEC1) als auch in haploiden (L6149 tec1 pRS425CaTEC1) S. cerevisiae-Stämmen 7- oder 4-fach induziert. In der Gegenwart von CaTEC1 wurde ein FG::TyA-lacZ-Reporter nicht aktiviert, was darauf hindeutet, dass eine Interaktion mit Stec12p nicht stattfindet, die notwendig wäre, FRE-Elemente zu aktivieren.

Beispiel 3 Funktionsanalysen in C. albicans

Eine sequenzielle homologe Rekombinationen (Fonzi und Irwin, (1993) a. a. O.) wurden durchgeführt, um die beiden CaTEC1 Allele in C. albicans zu deletie­ ren und die homozygote ura3/ura3 catec1/catec1 Nullmutante CaAS15 zu erhalten. Die erhaltenen Ge­ notypen wurden durch Southern-Blot-Analyse bestätigt. Northern-Blots zeigten, dass das CaTEC1- Transript im Stamm CaAS18 nicht vorhanden war, der durch Transformation eines leeren Plasmids pVEC (Navarro-Garcia et al., (1995) a. a. O.) in CaAS15 erhalten wurde. CaTEC1 mRNA wurde in dem Stamm CaAS20, der durch Transformation des Plasmids pVEC- CaTEC1 in CaAS15 erhalten wurde, in Mengen detek­ tiert, die denen in Wildtypstämmen entsprechen.

Die Lebensfähigkeit, Koloniegröße und Generations­ zeit von C. albicans-Zellen in vitro wurde nicht wesentlich dadurch beeinflusst, dass entweder eines oder beide Allele von CaTEC1 deletiert wurden. Die Deletion beider CATEC1 Allele beeinflusste jedoch das filamentöse Wachstum in vitro negativ. Wenn Hyphenbildung in flüssigem Medium durch Serum bei 37°C für 1,5 oder 3 Stunden induziert wurde, konnte beobachtet werden, dass die Mutante CaAS18 eine supprimierte Bildung von Keimschläuchen und echten Hyphen aufwies. Statt dessen bildeten diese Zelle gekrümmte tubuläre Strukturen mit Einschnürungen an den Zell-Zellgrenzen aus, die auf eine pseudohypha­ le Morphologie deuten.

Die isogenen catec1/catec1 Mutanten konnten weder durch Seruminduktion noch durch Interaktion mit mu­ rinen Phagozyten zur Hyphenbildung angeregt werden.

24 Stunden nach der Induktion bildete die Mehrheit der mutanten Zellen kurze Filamente. Eine kleinere Fraktion der Zellen entwickelte sich in verzweigte Myzelien. Die gleiche Morphologie des mutanten CaAS18-Stamms wurde erhalten durch Induktion des hyphalen Wachstums in modifiziertem Lee's Medium bei neutralem pH. Diese Defekte in flüssigem Medium konnten durch Wiedereinführung des CaTEC1-Gens auf dem Plasmid pVEC-CaTEC1 in dem revertanten Stamm CaAS20 revertiert werden.

Die Interaktion der Mutanten CaAS18 und der Rever­ tanten CaAS20 Zellen mit inflammatorischen Phagozy­ ten in vitro wurde ebenfalls untersucht. Während einer 8-stündigen Interaktion mit Mϕ verlängerten sich CaAS20-Keimschläuche in hyphale Zellen, die offensichtlich dazu dienen, daß sich C. albicans durch Auswachsen der Wirkung von Phagozyten entzie­ hen kann. CaAS18 war nicht in der Lage, sich durch Auswachsen Mϕ zu entziehen, wahrscheinlich aufgrund der unterdrückten Bildung verlängerter und filamen­ töser Zellen. Cluster von CaAS18 wurden mit Mϕ co­ localisiert, wahrscheinlich aufgrund der Phagozyto­ se durch Mϕ. Nach 24 Stunden war die Zahl der C. albicans-Zellen bei den CaAS18 infizierten Mϕ von 1,8 auf 3,9 C. albicans-Zellen pro infiziertem Mϕ angestiegen. Dies deutet darauf hin, dass CaAS18 innerhalb der Wirtszellen ständig wächst. Gelegent­ lich konnten einige Myzelien in geringer Anzahl be­ obachtet werden. Die Mehrzahl der Zellen des Stam­ mes CaAS20 entwickelte sich in typische Myzelien. Hyphales Wachstum wurde durch Mϕ nicht inhibiert. CaTEC1p ist daher für das Auswachsen von C. albi­ cans von Mϕ notwendig.

Überdies konnte eine Expression der mutmaßlichen Zielgene SAP4-6 in CaAS18 Mutanten nicht induziert werden, während der Wildtypstamm SC5314 und der re­ vertante Stamm CaAS20 in vergleichbaren Mengen SAP4-6 mRNA produzierte. Ein unterschiedliches Resultat wurde erhalten, wenn eine EFG1-Sonde für ei­ ne Northern-Hybridisierung der gleichen RNA-Proben verwendet wurde. Alle drei isogenen Stämme expri­ mierten das EFG1 Gen. Dies zeigt, dass Tec1p nicht erforderlich für die EFG1-Transkription ist. Über­ dies ist die Wildtypexpression von Efg1p nicht aus­ reichend, ein normales hyphales Wachstum in Abwe­ senheit von CaTEC1p zu gewährleisten, was auf wei­ tere Funktionen von CaTec1p bei der Hyphenbildung hindeutet.

Beispiel 4 Virulenzanalysen in C. albicans

Zur Untersuchung der Bedeutung von CaTEC1 für die Virulenz von C. albicans wurden Mucosa- und systemi­ sche Modelle muriner Candidosen verwendet. BALB/c- Mäuse wurden intravaginal oder intravenös mit CaAS18- und CaAS20-C. albicans-Zellen inokuliert. Die Replikation des Pilzes auf der vaginalen Mucosa beziehungsweise die Überlebensrate wurden unter­ sucht. Die Deletion beider Allele von CaTEC1 hatte keine signifikante Auswirkung auf die Zahl der C. albicans-Kolonien-bildenden-Einheiten (CFU), die aus dem vaginalen Bereich entnommen wurden: Die Ko­ lonisation sowohl mit CaAS20- als auch mit CaAS18- Zellen führte zu vergleichbaren CFU-Werten an den Tagen 7 und 21. Eine genauere mikroskopische Unter­ suchung von mit Calcofluor-Weiß gefärbten C. albi­ cans-Zellen aus vaginalen Spülungen zeigte, dass beide Stämme in vergleichbarer filamentöser Form wuchsen. Offensichtlich ist C. albicans in Abwesenheit von CATEC1 in der Lage, auf der vaginalen Mu­ cosa der Maus zu überleben und sich zu vermehren.

In einem Mausmodell für systemische Candidose (Csank et al., Mol Biol Cell (1997) 8, 2539-2547, Csank et al., Infect Immun (1998) 66, 2713-2721, Timpel et al., J. Bacteriol (2000) 182, 3063-3071) führte die Inokulation mit CAS20-Zellen nach 13 Ta­ gen zu 100%-tiger Mortalität. Demgegenüber überleb­ ten 70% der mit den mutanten CaAS18-Zellen infi­ zierten Mäuse wenigstens 50 Tage, wobei die überle­ benden Tiere keine klinischen Krankheitssymptome zeigten. Eine statistische Untersuchung unter Ver­ wendung des log-rank-Tests der Überlebenskurven zeigte sehr hohe statistische Relevanz (p < 0, 0001). 100 × 10⁵ CaAS18-Zellen mussten injiziert werden, um einen vergleichbaren klinischen Verlauf zu er­ zeugen, wie er bei 5 × 10⁵ CaAS20-Zellen beobachtet wurde.

Der Gendefekt im CaTEC1-Gen hat also nicht nur in vitro für die Hyphenbildung, sondern auch in vivo für die Virulenz von C. albicans schwerwiegende Fol­ gen. Eine catec1/catec1-Mutante ruft bei infizier­ ten Balb/c-Mäusen bei einer Infektionsdosis von 5 × 10⁵ Zellen nur mäßige klinische Zeichen einer sys­ temischen Candidose hervor. Im Gegensatz hierzu verursacht ein isogener Wildtyp-Kontrollstamm be­ reits nach 15 Tagen eine 100%-ige Mortalität (mittlere Überlebenszeit = 10 Tage).

Ein Vergleich der Morphologie mutanter und rever­ tanter Zellen, die aus Nieren infizierter Tiere stammten und mit Calcoflour-Weiß gefärbt worden waren zeigte, dass CaAS20 und CaAS18 das gleiche Po­ tential für die Hyphenbildung in vivo aufweisen, d. h., dass Signale des Wirtes, die von C. albicans während der mucosalen oder sytemischen Infektion abgegeben werden, das filamentöse Wachstum in der Abwesenheit von CaTEC1 induzieren. Überraschender­ weise ist die Virulenz in catec1/catec1-Mutanten während der systemischen Infektion signifikant un­ terdrückt, obgleich eine Hyphenbildung zu beobach­ ten ist. Dies zeigt, dass CaTec1p wichtig für die systemische C. albicans-Infektion ist, da dieses eine Virulenz-Determinante durch einen Mechanismus reguliert, der sich an die morphologische Umwand­ lung der Hefeform in die Hyphenform anschließt.

Die Ergebnisse zeigen, dass das erfindungsgemäße Gen CaTEC1 sowohl die Hyphenbildung als auch die Virulenz von C. albicans reguliert. Die Virulenz scheint durch CaTec1p auf zwei Ebenen reguliert zu sein. Einerseits ist die Expression der Typ 4, 5 und 6-Isogene der sezernierten Aspartyl-Proteinasen (SAP 4-6) reguliert, wobei sap4-6 Tripelmutanten in vivo avirulent zu sein scheinen (Monod et al., Mol. Microbiol., 13 (1994), 357-368). Zweitens reguliert CaTec1p die Hyphenbildung in vitro und ist notwen­ dig für das schnelle Auswachsen von C. albicans vor MΦ.

Die dargestellten Experimente lassen CaTec1p als ein interessantes Zielmolekül für die Entwicklung neuer Antimycotika, insbesondere pathostatischer Medikamente, erscheinen, insbesondere in Hinblick auf die Entwicklung sytemischer und topischer fun­ gizider Chemotherapien.

Methoden 1. Nucleinsäure-Techniken

Northern-Blot-Analysen wurden, wie von Srikantha et al. (Mol. Gen. Genet. (1995) 246, 342-352) be­ schrieben, durchgeführt. 10 mg Gesamt-RNA wurde auf einem 1,1% Agarose-Gel aufgetrennt, welches 2,2 M Formaldehyd und 0,5 × MOPS, pH 7,0, enthielt. Nach Färbung mit Ethidiumbromid wurden die Gele auf Bio­ dyne B-Nylonmembranen (PALL FILTRON, Deutschland) geblottet.

Bei 62 bis 65°C wurde mit radioaktiv markierten DNA-Fragmenten hybridisiert, anschließend wurden die Membranen behandelt und wie üblich wurde eine Autoradiographie durchgeführt (Church und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984), 1991-1995). Die Northern-Blots wurden mittels einer Fuji BAS 3000 Phosphor IMAGER-Vorrichtung unter Verwendung der zugehörigen Software quantifiziert. Die Sou­ therh-Blot-Analysen wurden, wie von Schröppel et al., (J. Clin. Microbiol., 32 (1994), 2646-2654) beschrieben durchgeführt. Mit Restriktionsenzymen gespaltene genomische DNA wurde auf 0,7% Agarose- Gelen getrennt, und auf Biodyne B-Nylonmembranen geblottet. Die Hybridisierung und stringenten Waschschritte wurden, wie beschrieben (Church und Gilbert (1984), a. a. O.), durchgeführt, gefolgt von Autoradiographie.

Zum Nachweis von CaTEC1 wurde mit Zufallsprimern ein NsiI-Fragment von p275 markiert. Zum Nachweis von SAP4-6 wurde eine äquimolares Gemisch von p206, p207 und p208 markiert, die durch Subklonierung von BglII-Fragmenten der SAP4-, SAP5- und SAP6-ORFs (Monod et al., Mol. Microbiol., 13 (1994), 357-368) in die BamHI-Stelle von pGEM3Z hergestellt wurden (Längen der Inserts: 755, 677 und 660 bp). Plasmide zum Nachweis von ACT1- und EFG1-mRNA wurden freund­ licherweise von Prof. J. Ernst, Heinrich-Heine- Universität, Düsseldorf zur Verfügung gestellt.

2. Invasionstests und pseudohyphales Wachstum in S. cerevisiae

Invasive und pseudohyphale Wachstumstests wurden wie beschrieben durchgeführt (Gimeno und Fink, Mol. Cell. Biol., 14 (1994), 2100-2112, Robertson und Fink, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (1998), 13783- 13787). Das invasive Wachstum wurde getestet, indem auf selektivem Medium gewachsene Zellen auf YPD- Platten überführt wurden und anschließend nach 24- stündiger oder 48-stündiger Inkubation bei 30°C ge­ waschen wurden. Pseudohyphales Wachstum diploider Stämme wurde getestet, indem die Stämme als Einzel­ kolonien auf SLAD-Agar ausplattiert und diese Plat­ ten zwei Tage bei 30°C inkubiert wurden.

3. Herstellung von Extrakten und Enzymtests

Die Zellen für die β-Galaktosidase-Tests von FLO11::lacZ oder FG::TyA-lacZ wurden in SC flüssi­ gem Medium wachsen gelassen und gemäß Mösch et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996), 5352-5356) quantifiziert. Zellen für die Quantifizierung der FLO11::lacZ oder FG::TyA-lacZ Expression in der ex­ ponentiellen Wachstumsphase wurden aus konfluenten 20-Stunden-Kulturen 1 : 20 in frisches Medium inoku­ liert und 4-6 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen für die Quantifizierung von FLO11::lacZ und FG::TyA-lacZ Expressionen nach dem post-Diauxic­ shift wurden 48 Stunden wachsen gelassen.

4. Interaktion von C. albicans und Makrophagen (Mϕ)

Die Interaktion zwischen C. albicans und Mϕ wurde untersucht, indem aus peritonealem Exudat erhaltene Mϕ eingesetzt wurden, die im Wesentlichen wie bei Bogdan et al. (Eur. J. Immunol., 20 (1990), 1131- 1135, Gessner et al., Infect. Immun., 61 (1993), 4008-4012) beschrieben, hergestellt wurden. Mϕ wur­ de in einer Dichte von 8 × 10⁵ Zellen auf acht Ver­ tiefungen aufweisende Platten (Nung, Deutschland) ausgesät und bildeten eine Monolayer adhärenter Zellen. C. albicans wurde mit einer Infektionsmul­ tiplizität (MOI, Multiplicity of infection) von 1 : 16 (C. albicans : Mϕ-Verhältnis) hinzugegeben und die Platten wurden bei 37°C mit 5% CO₂ für 8 oder 24 Stunden inkubiert. Die Platten wurden fixiert (Histo Choice, Amresco) und mit Periodsäure- Schiffs-Reagenz (Sigma) gefärbt. Anschließend wur­ den mikroskopische Untersuchungen mittels eines Zeiss-Axiophot-Mikroskops (Zeiss, Göttingen) durch­ geführt.

5. Virulenzstudien

Acht bis zehn Wochen alte weibliche BALB/c Mäuse (Charles Rivers Breeding Laboratories, Sulzfeld, Deutschland, 5 bis 8 pro Gruppe) wurden in den in vivo Studien eingesetzt. Die Mucosa-Kolonisation des vaginalen Kanals wurde initiiert, indem BALB/c Mäuse intravaginal mit 5 × 10⁴ Blastoconidien der stationären Phase in 20 µl PBS (Fidele Jr. et al., Infect Immun (1993) 61, 1990-1995) inokuliert wur­ den. 72 Stunden vor Inokulation wurde den Mäusen subkutan 0,02 mg/pro Maus östradiolvalerat (Sigma) in 0,1 ml Sesamöl injiziert. Die Östrogen- Behandlungen wurden in wöchentlichen Intervallen fortgesetzt. An den Tagen 10 und 24 nach der Östro­ gen-Behandlung, die den Tagen 7 und 21 nach Inoku­ lation entsprachen, wurden die Tiere getötet und die Vagina jeder Maus mit 100 µl PBS gespült. Das Pilzvorkommen in der Vagina wurde mittels einer Va­ ginal-Spülkultur wie bei Fidel Jr. et al., ((1993) a. a. O.) beschrieben bestimmt und ein Teil der gewonnenen Flüssigkeit für die mikroskopische Untersuchung verwendet. Nach Inkubation bei Raum­ temperatur über 48 bis 72 Stunden wurden die kolo­ niebildenden Einheiten (CFU) bestimmt. Für systemi­ schen Infektionen wurden Gruppen von 10 Mäusen mit 5 × 10⁵ lebenden Zellen durch intravenöse Injektion inokuliert und die Überlebensrate bestimmt (Csank et. al., (1997 und 1998), a. a. O., Timpel et al., J. Bacteriol., 182 (2000), 3063-3071). Die Lebensfä­ higkeit der infizierenden Population wurde durch Ausplattieren und Zählen der CFU bestimmt. Überle­ benskurven wurden mittels der Kaplan-Meier-Methode unter Verwendung des PRISM-Programms (GraphPAD Software, San Diego, USA) erstellt und mit dem Log- Rank-Test verglichen.

Für die mikroskopische Untersuchung der zellulären Morphologie von C. albicans während der Infektion wurden die Pilzzellen aus dem vaginalen Kanal (Tag 21) oder aus den Nieren (Tag 12) isoliert. Die Pro­ ben wurden unter Verwendung einer 20%igen KOH- Lösung bei Raumtemperatur gelöst. Proben wurden 10 Minuten bei 1500 × g zentrifugiert und das Sediment wurde auf Objektträger in Gegenwart von Fluores­ zenzaufhellern (Calcofluor-Weiss, Sigma, Deutsch­ land) zur Epifluoreszens-Mikroskopie (Zeiss Axi­ ophot, Zeiss, Deutschland) aufgebracht.

Claims (27)

1. Nukleinsäuremolekül, welches für die Klonierung eines einen Transkriptionsfaktor kodierenden Gens geeignet ist und/oder ein Protein mit der biologi­ schen Aktivität eines Transkriptionsfaktors ko­ diert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

• a) einem Nukleinsäuremolekül, definiert in SEQ ID Nr. 1, 2, 3 oder 7, eines komplemen­ tären Strangs oder Teils davon,
• b) einem Nukleinsäuremolekül, kodierend die Aminosäuresequenz definiert in SEQ ID Nr. 4, eines komplementären Strangs oder Teils davon,
• c) einem Nukleinsäuremolekül, erhältlich aus einer Genbank von Candida albicans un­ ter Verwendung der in SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 dargestellten Primer mit Hilfe des PCR-Verfahrens und
• d) einem Nukleinsäuremolekül, das mit ei­ nem der unter (a), (b) oder (c) genannten Nukleinsäuremoleküle hybridisiert.

2. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, welches ein regulatorisches Element ist und in SEQ ID Nr. 3 oder 7 definiert ist.

3. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, welches ei­ ne proteinkodierende Nukleotidsequenz darstellt und in SEQ ID Nr. 4 definiert ist.

4. Nukleinsäuremolekül nach einem der vorhergehen­ den Ansprüche, das ein DNA- oder RNA-Molekül ist.

5. Nukleinsäuremolekül nach einem der vorhergehen­ den Ansprüche, das für die Klonierung und/oder Ex­ pression eines fungalen Transkriptionsfaktors ge­ eignet ist.

6. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, wobei der Pilz Candida albicans ist.

7. Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

8. Vektor nach Anspruch 7, wobei das Nukleinsäure­ molekül unter der operativen Kontrolle mindestens eines regulatorischen Elementes steht, das die Ex­ pression einer translatierbaren RNA in pro- oder eukaryotischen Zellen gewährleistet.

9. Vektor nach Anspruch 8, wobei das regulatorische Element ein Promoter, Enhancer, Silencer oder 3'- Transkriptionsterminator ist.

10. Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das regulatorische Element eine Signalsequenz zur Lokalisierung des von dem Nukleinsäuremolekül ko­ dierten Proteins innerhalb bestimmter Zellorganel­ len, Kompartimente oder im extrazellulären Raum ist.

11. Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei der Vektor ein Plasmid, Cosmid, Bakteriophage oder Virus ist.

12. Plasmid nach Anspruch 11, hinterlegt in Esche­ richia coli bei der DSMZ in Braunschweig, Deutsch­ land, unter der Nr. DSM 13716.

13. Wirtszelle, enthaltend einen Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 12.

14. Wirtszelle nach Anspruch 13, wobei die Wirts­ zelle eine pro- oder eukaryotische Wirtszelle ist.

15. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 oder 14, wobei die Wirtszelle eine Bakterienzelle, Hefezelle oder Säugerzelle ist.

16. Escherichia coli-Zellen nach Anspruch 15, ent­ haltend ein Plasmid nach Anspruch 12, hinterlegt bei der DSMZ in Braunschweig, Deutschland, unter der Nr. DSM 13716.

17. Candida albicans-Zellen, hinterlegt bei der DSMZ in Braunschweig, Deutschland, unter der Nr. DSM 13722.

18. Verfahren zur Herstellung eines Transkriptions­ faktors, wobei eine Wirtszelle nach einem der An­ sprüche 13 bis 17 in einem geeigneten Kulturmedium unter Bedingungen kultiviert wird, die eine Expres­ sion des Transkriptionsfaktors erlauben und dieser gewonnen wird.

19. Protein mit der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr. 4.

20. Protein, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 18.

21. Antikörper, der spezifisch ein Protein nach ei­ nem der Ansprüche 19 oder 20 erkennt und bindet.

22. Antikörper nach Anspruch 21, der ein monoclona­ ler, polyclonaler und/oder modifizierter Antikörper ist.

23. Antikörper, der gegen einen Antikörper nach An­ spruch 22 gerichtet ist.

24. Diagnostische Zusammensetzung, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, einen Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 12, ein Protein nach einem der Ansprüche 19 oder 20 und/oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 21 bis 23.

25. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, einen Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 12, eine Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 17, ein Protein nach einem der Ansprüche 19 oder 20 und/oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 21 bis 23, gegebenenfalls zusammen mit einem phar­ mazeutisch verträglichen Träger.

26. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach ei­ nem der Ansprüche 1 bis 6, eines Vektors nach einem der Ansprüche 7 bis 12, einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 17, eines Proteins nach einem der Ansprüche 19 oder 20 und/oder eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 21 bis 23 zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von durch Ar­ ten der Gattung Candida verursachten Krankheiten.

27. Verfahren zum Auffinden und Identifizieren the­ rapeutisch gegen durch Arten der Gattung Candida verursachten Krankheiten wirksamer Substanzen, wo­ bei eine zu testende Substanz in einem geeigneten Medium mit mindestens einem Agens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, einem Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 12, einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 17, einem Protein nach einem der Ansprüche 19 oder 20 und/oder einem Anti­ körper nach einem der Ansprüche 21 bis 23 in Kon­ takt gebracht wird und eine Interaktion zwischen den zu testenden Substanzen und einem der genannten Agenzien nachgewiesen wird.