DE10032040A1 - Antikörper gegen spezielle Formen des proPSA und deren Verwendung in Immunoassays - Google Patents
Antikörper gegen spezielle Formen des proPSA und deren Verwendung in ImmunoassaysInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Antikörper gegen spezielle Formen der enzymatisch nicht aktiven Vorstufen des prostataspezifischen Antigens (PSA), deren Herstellung, deren Verwendung in Immunoassays zur Bestimmung des [-5,-6,-7]-proPSA sowie den Einsatz der Messwerte aus diesen Assays für eine verbesserte Diagnostik im Umfeld des Prostata-Karzinoms.
Description
Die Erfindung betrifft Antikörper gegen spezielle Formen der enzymatisch nicht aktiven Vorstufen des
prostataspezifischen Antigens (PSA), deren Herstellung, deren Verwendung in Immunoassays zur
Bestimmung des [-5, -6, -7]-proPSA, sowie den Einsatz der Messwerte aus diesen Assays für eine
verbesserte Diagnostik im Umfeld des Prostata-Karzinoms.
Das Prostata-Karzinom (PCa) ist in den USA der am meisten diagnostizierte Krebs bei Männern, Parker,
S.L. et al., CA Cancer J. Clin., 46: 5-27, 1996. Das prostataspezifische Antigen, oder auch PSA genannt,
wurde als verläßlicher Prognose-Marker im großen Umfang für die Behandlung von an Prostatakrebs
erkrankten Patienten benutzt. Catalona, W.J. et al., N. Engl. J. Med., 324: 1156-1161, 1991; Osterling, J.E.,
J. Urol., 145: 907-923, 1991. Als Tumormarker hat es den großen Vorteil, dass es im Blut von gesunden
Männern nicht oder nur in ganz geringen Konzentrationen nachweisbar ist. Im fortgeschrittenen
Krankheitsstadium werden in aller Regel stark erhöhte PSA-Werte gemessen.
Eine diagnostische Frage von enormer Bedeutung ist die frühzeitige, sichere Erkennung eines PCa und die
Unterscheidung von PCa und gutartiger Prostata Hyperplasie (BPH). Es ist eines der größten Probleme
der heutigen PSA-Tests, dass diese Unterscheidung zwischen BPH und PCa nicht gewährleistet ist,
McCormack, R.T. et al., Urology, 45: 729-744, 1995. So kann bei PSA-Konzentration im Bereich von
2-15 ng/ml Serum nicht unbedingt auf das Vorliegen einer malignen Erkrankung geschlossen werden, da
solche PSA Werte auch durch eine BPH verursacht sein können. Es sind daher zusätzlich zu der PSA-
Bestimmung weitere, z. T. aufwendige und schmerzhafte Untersuchungen (z. B. rektale Biopsien)
notwendig, um das Vorliegen eines PCa abzuklären.
Um die diagnostische Genauigkeit des PSA-Nachweises aus Serum zu verbessern, wurden verschiedene
alternative Vorgehensweisen vorgeschlagen, wie z. B. PSA-Dichte, PSA-Geschwindigkeit, Verhältnis
zwischen freiem und gesamtem PSA oder zwischen komplexiertem und gesamtem PSA, Benson, M.C. et
al., J. Urol., 147 : 815-816, 1992; Carter, H.B. et al., J. Am. Med. Assoc., 267: 2215-2220, 1992; Oesterling,
J.E. et al., J. Am. Med. Assoc., 270: 860-864, 1993.
PSA gehört zu einer als "Kallikreine" bekannten Gruppe von Proteinen/Enzymen. Die menschliche
Kallikrein-Familie besteht aus drei Mitgliedern, beschrieben als hK1, hK2 und hK3 (PSA). Clements, J.A.,
Endocr. Rev., 10: 393-419, 1989; Carbini, L.A. et al., J. Hypertens., 11: 893-898, 1993.
hK1 wird hauptsächlich in den Nieren, der Bauchspeicheldrüse und den submandibularen Speicheldrüsen
produziert. Fukushima, D. et al., Biochemistry, 24 : 8037-8043, 1985.
hK2, wie PSA, wird vorherrschend im Prostata Epithelium produziert (Morris, B.J., Clin. Exp. Pharm.
Phys., 16: 345-351, 1989) und hat 78% Homologie mit PSA (Schedlich, L.J. et al., DNA, 6: 429-437, 1987;
Lilja, H., World J. Urol., 11: 188-191, 1993). Die Eigenschaften des hK2 als potenzieller Prostatakrebs-
Marker wurde im Rahmen eines Übersichtsartikels diskutiert, Young, C.Y.F. et al., The Prostata
Supplement, 7: 17-24, 1996.
Das Prostata spezifische Antigen (PSA) oder hK3 ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von
ca. 29 kDa. Es wird in den Prostata-Epithelzellen gebildet und ist ein Bestandteil der Samenflüssigkeit.
PSA hat die enzymatische Aktivität einer neutralen Serinprotease. Seine Hauptfunktion besteht in der
Spaltung der Seminogeline I und II sowie des Fibronektins, die als wesentliche Komponenten des
Ejakulats die Beweglichkeit der Spermien blockieren. Durch die Hydrolyse dieser Proteine bewirkt PSA
die Verflüssigung des Samenkoagulums und ermöglicht so die Mobilität der Spermien.
PSA ist eine Chymotrypsin-ähnliche Protease, wogegen hK2 eine Trypsin-ähnliche Protease ist.
Es ist bekannt, dass das PSA in unterschiedlichen molekularen Formen im Serum vorkommt. Der bei
weitem größte Anteil des PSA liegt in Form inaktiver Komplexe vor, wobei vor allem das α1-Anti-
Chymotrypsin das PSA komplexiert und dadurch auch dessen enzymatische Aktivität inhibiert.
Weitere Komplexe können mit anderen Serin-Protease-Inhibitoren (Serpine), wie α1-Antitrypsin und
Protein C-Inhibitor gebildet werden, die aber im Vergleich zu PSA-ACT nur in sehr untergeordnetem
Maße im Serum vorhanden sind. Darüberhinaus bildet PSA auch noch mit einem anderen Typ von
Protease-Inhibitor, nämlich dem α2-Makroglobulin (α2-M) einen Komplex, über dessen Gehalt im
Serum in der Literatur unterschiedliche Angaben gemacht werden, vor allem da das PSA in diesem
Komplex immunologisch nicht zugänglich ist. Unter der Bezeichnung Gesamt-PSA ist nachfolgend die
Summe von freiem und mit Serpinen komplexiertem PSA gemeint, da der PSA Komplex mit α2-M in
allen bisherigen immunologischen Bestimmungen nicht erfaßt wird (Tewari und Bluestein, J. Clin. Ligand
Assay 1995, Vol. 18, S. 186-196). Neben der Bezeichnung Gesamt-PSA wird oft auch der Begriff PSA total
mit gleicher Bedeutung verwendet.
In Analogie hierzu gilt auch für die anderen beiden Kallikreine hK1 und hK2 die gleiche Definition für
Gesamt-Kallikreine, welche oft ebenso als Kallikrein (total) oder PSA (total) bezeichnet wird.
Neben komplexiertem PSA kommt im Serum noch enzymatisch inaktives, freies PSA vor, das keine
Komplexe eingehen kann. Petterson et al., Clin. Chem. Vol. 41, (No. 10), Seite 1480-1488, (1995),
beschreiben, dass etwa 15% bis 20% des Gesamt-PSA in freier (nicht komplexierter) Form im Serum
vorliegen. Es wurde deshalb von Petterson et al. und anderen Arbeitsgruppen diskutiert, dass dieses freie,
enzymatisch nicht aktive PSA, eventuell eine pro-Enzymform darstellt oder vielleicht durch interne
Spaltung der Lys-Lys-Verbindungen zwischen den Aminosäuren 145 und 146 des PSA, inaktiviert worden
sein könnte.
Das PSA-Molekül wird als prä-pro-Form bestehend aus insgesamt 261 Aminosäuren synthetisiert. Das 17
Aminosäuren lange Signal-Peptid wird bereits im endoplasmatischen Retikulum abgespalten. Das
enzymatisch nicht aktive proPSA (Zymogen) ist demnach noch 244 Aminosäuren lang.
Durch Abspaltung des proPeptids (7 Aminosäuren) entsteht das enzymatisch aktive "reife" PSA (z. B.
Melegos + Diamandis, Clin. Biochem., 29 (3), 193-200, 1996).
Das proPSA-Molekül mit den 7 N-terminalen Aminosäuren des PSA-propeptids wird auch als [-7]
proPSA bezeichnet. proPSA-Moleküle mit N-terminal verkürzter Sequenz werden entsprechend der
Länge des proPeptid-Anteils als [-6], [-5], [-4] etc. proPSA bezeichnet.
Die in menschlichem Serum vorkommenden PSA-Formen sind in ihrer genauen Struktur bisher im
Detail nicht bestimmt oder analysiert worden. So ist vor allem nicht geklärt, wie die genaue Struktur des
in Serum frei, d. h. also nicht in Komplexen vorliegenden PSA aussieht (Paus et al., (1998) J. of Urology
159, 1599-1605). Der Grund dafür ist vor allem, dass die Konzentration des freien PSA in Serum so
niedrig ist, dass es sehr schwierig ist, genügend Material zu isolieren und es einer Analytik zugänglich zu
machen. Noldus et al. J. of Urology 158, 1606-1609 (1997) hatten aus 230 ml eines Gemisches von
hochtitrigen PSA Seren (PSA total < 2000 ng/ml) mit einer Ausbeute von ca. 25% freies PSA in unreiner
Form isoliert und es durch N-terminale Sequenzierung analysiert. Sie fanden Hinweise auf das Vorliegen
eines normalen N-Terminus sowie auf eine Spaltung der PSA-Kette zwischen den Aminosäuren 145 und
146, welche erklären könnte, dass dieses PSA in nicht komplexierter Form vorliegt. Hinweise auf proPSA-
Formen, d. h. auf PSA-Moleküle mit zusätzlichen Aminosäuren am N-terminalen Ende wurden von
ihnen nicht gefunden.
In WO 98/49323 wurden Antikörper gegen PSA eingesetzt, um die in biologischen Proben vorhandenen
molekularen Formen des freien PSA zu identifizieren und molekular zu charakterisieren. Dort konnte
gezeigt werden, dass ein signifikanter Anteil des freien PSA als [-4]-proPSA, d. h. als ein N-terminal um 4
Aminosäuren der proPSA-Sequenz verlängertes PSA-Molekül im Serum vorkommt.
Im Stand der Technik sind keine spezifischen diagnostischen Verfahren für freie PSA-Moleküle, die noch
Anteile des proPeptids enthalten, gezeigt. Eben so wenig ist bekannt, ob außer dem in WO 98/4932 3
beschriebenen [-4]proPSA noch andere proPSA-Formen in Probenflüssigkeiten humanen Ursprungs
vorkommen.
Im Stand der Technik finden sich zudem keinerlei Daten zur diagnostischen Wertigkeit von freiem PSA
mit unterschiedlich langen proPSA-Sequenzanteilen.
Aufgabe der Erfindung war es daher, diagnostische Werkzeuge herzustellen, die einen spezifischen
Nachweis bestimmter proPSA-Formen ermöglichen und zu überprüfen, ob diese neuartigen Tests zu
einer verbesserten Diagnostik im Umfeld des Prostata-Karzinoms, insbesondere bei der Unterscheidung
von BPH und PCa beitragen können.
In einem ersten Schritt wurde deshalb untersucht, ob sich durch den Einsatz modernster analytischer
Methoden Hinweise auf andere proPSA-Formen, welche nicht dem [-4]-proPSA aus WO 98/49323
entsprechen, finden lassen. Es konnte überraschenderweise Hinweise auf mindestens drei zusätzliche
proPSA-Formen [-2, -5, -7]-proPSA gefunden werden. Aufgrund dieser Voruntersuchungen wurde die
Frage der diagnostischen Relevanz dieser proPSA-Formen untersucht.
Um die erfindungsgemäße Aufgabenstellung zu bearbeiten, wurden Antikörper hergestellt und gezielt
ausgewählt, welche mit [-5, -6, -7]-proPSA reagieren, aber kürzere proPSA-Formen [-4], [-3], usw. nicht
signifikant erkennen.
Synthetische Peptide, welche den N-terminalen Sequenzen der verschieden langen proPSA-Formen
entsprechen, wurden hergestellt und sowohl für Immunisierungs-, wie auch für Screening- und
Charakterisierungszwecke eingesetzt.
Es wurden Antikörper entwickelt und isoliert, welche die erfindungsrelevanten Spezifitäten aufweisen.
Solche Antikörper reagieren mit [-5, -6, -7]-proPSA, zeigen aber keine signifikanten Bindeeigenschaften
gegen Peptide des [-4]-proPSA oder kürzere proPSA-Peptide.
Eine bevorzugte Ausführungsform stellen deshalb Antikörper gegen proPSA dar, welche dadurch
gekennzeichnet sind, dass sie an [-5, -6, -7]-proPSA binden, aber mit [-4]-proPSA oder weiter verkürzten
pro-PSA-Formen, im Wesentlichen keine Reaktion zeigen.
Diese Antikörper wurden zudem nach üblichen Verfahren gereinigt, modifiziert, derivatisiert und in
Immunoassays zum Nachweis von [-5, -6, -7]-proPSA eingesetzt.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass native Proben einen messbaren Anteil an
[-5, -6, -7]-proPSA enthalten. Darüber hinaus konnte weiterhin überraschend beobachtet und festgestellt
werden, dass diese speziellen proPSA-Formen relativ stabil sind und sogar in solch signifikanter
Konzentration in den untersuchten Proben vorkommen, dass diese über Immunoassays gemessen werden
können.
Die über die erfindungsgemäßen Methoden ermittelten [-5, -6, -7]-proPSA-Werte wurden bezüglich der
klinisch/diagnostischen Relevanz mit anderen aus dem Stand der Technik bekannten PSA-Assays
verglichen.
Wie eingangs erwähnt, ist eines der Hauptprobleme bei der Verwendung von PSA-Messungen in der
klinischen Diagnostik der Bereich mit niedrigen, schwach erhöhten PSA-Werten. Die Unterscheidung
zwischen PBH und PCa ist mit Gesamt-PSA-Werten nicht möglich. Der erfindungsgemäße Test auf
spezielle Formen des proPSA liefert in diesem klinisch besonders kritischen Entscheidungsbereich, d. h.
bei Gesamt-PSA-Konzentration unter 20 ng/ml (z. B. bestimmt mit Elecsys®-Test auf Gesamt-PSA der
Fa. Roche Diagnostics) wichtige und diagnostisch relevante Zusatzinformationen und trägt damit zu
einer besseren Unterscheidung zwischen PCa und BPH bei.
Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung ist deshalb die Verwendung der [-5, -6, -7]-proPSA-
Werte für diagnostische Fragestellungen im Umfeld des Prostata-Korzinoms.
Mit den erfindungsgemäßen Antikörpern und den damit etablierten immunologischen Verfahren ist es
erstmals möglich, Quotienten aus der Gesamtmenge an freiem PSA und [-5, -6, -7]-proPSA zu bilden. Da
sich überraschend erwiesen hat, dass dieser Quotient die klinisch/diagnostische Aussage erheblich
verbessert, stellt die Verwendung eines Quotienten aus freiem PSA zu [-5, -6, -7]-proPSA eine weitere
besonders bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung dar.
Das freie PSA aus einem PCa Plasma wurde mit Hilfe von Immunsorption isoliert, auf einem SDS Gel
aufgetrennt und die freie PSA Bande mit Endo Lys C verdaut. 0,5 µl dieser Probe wurden auf dem
MALDI Probenteller mit 0,5 mL Matrix (10 mg/ml Sinapinsäure in 0,1% TFA : Acetonitril, 7 : 3, v : v)
gemischt und das Massenspektrum ermittelt. Die Bezeichnungen der Peptide oberhalb der Massenzahlen
(z. B. 114-145 geben den Bereich der Aminosäuresequenz von PSA an. Das dem [M+H]+-Ionenpeak
1939.10 entsprechende Peptid ist das unvollständig gespaltene Peptid mit dem Aminosäurebereich 222-
237 von PSA. Die pro Sequenz des PSA reicht von der Aminosäureposition -7 bis -1.
ProPSA aus einem PCa Plasma wurde über einen biotinylierten Antikörper gegen freies PSA an eine mit
Streptavidin beschichteten Festphase gebunden. Die Bindung bzw. die Verdrängung des MAK 1.023.6
durch unterschiedlich lange proPSA-Peptide wurde ermittelt und ist in dieser Abbildung wiedergegeben.
Die Abbildung zeigt die über ROC-Analyse berechneten AUC-Werte (AUC = area under the curve). Je
größer der AUC-Wert, desto besser ist ein Parameter (oder das Verhältnis von Parametern) bezüglich
klinischer Genauigkeit und Aussagekraft im Hinblick auf Sensitivität und Spezifität.
Der Vorläufer des PSA-Moleküls ist das sogenannte prä-pro-PSA, welches aus insgesamt 261
Aminosäuren besteht. Das Signal-Peptid ist 17 Aminosäuren lang und wird im endoplasmatischen
Retikulum abgespalten, sobald das prä-pro-PSA in die sekretorischen Drüsen übertritt. Das dabei
entstehende enzymatisch inaktive proPSA (diese inaktive Vorstufe des PSA wird auch als Zymogen
bezeichnet) wird durch Freisetzung (Abspaltung) der sieben N-terminalen Aminosäuren des Pro-Peptids
in das enzymatisch aktive, "reife" PSA überführt. Diese reife, enzymatisch aktive Form hat insgesamt 237
Aminosäuren und ein Molekulargewicht von ca. 29 kD.
Es ist bekannt, dass das PSA, aber auch die beiden anderen Kallikreine hK1 und hK2 in der Zirkulation
zum größten Teil in Form inaktiver Komplexe, d. h. gebunden an verschiedene Protease-Inhibitoren,
vorliegen. Der bei weitem größte Teil ist komplexiert mit α1-Anti-Chymotrypsin.
Das proPeptid des [-7]-proPSA ist 7 Aminosäuren - wie oben ausgeführt - lang. Es hat die
Aminosäuresequenz Alanin-Prolin-Leucin-Isoleucin-Leucin-Serin-Arginin (APLILSR). Für hK2 lautet die
proPeptid-Sequenz Valin-Prolin-Leucin-Isoleucin-Glutamin-Serin-Arginin (VPLIQSR). Die erste N-
terminale Aminosäure des PSA ist ein Isoleucin. Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass
Antikörper mit dem erfindungsgemäßen Reaktionsspektrum, d. h. guter Bindung an die proPSA-Formen
[-5], [-6] und [-7] erhalten werden können, wenn zur Immunisierung ein synthetisches Peptid, welches
dem [6]-proPSA entspricht, eingesetzt wird. Das konkret verwendete Peptid enthielt zudem noch die erste
Aminosäure aus dem reifen PSA. Seine Sequenz lautet somit PLILSRI.
Bekanntermaßen sind kurze Peptide per se wenig oder nicht immunogen. Zum Zwecke der
Immunisierung ist es deshalb meist erforderlich, dass Peptide an geeignete Trägerstrukturen, z. B.
Rinderserumalbumin oder keyhole limpet hemocyanine gekoppelt werden. Gegebenenfalls wird die
Immunantwort zusätzlich durch Zugabe sogenannter adjuvanter Reagenzien verstärkt. Eine bevorzugte
Ausgestaltung der Erfindung sind deshalb Immunogene, die [-5, -6, -7] proPeptide des PSA enthalten.
Besonders bevorzugt sind Immunogene, die durch Verwendung des Peptids der SEQ ID No: 2 erhältlich
sind.
Durch geeignete Kombination von anderen Immunogenen, wie z. B. einem [-7]-proPSA-Peptid oder von
Mimetopen, z. B. des [-6]-proPSA mit den untenstehenden Screening-Kriterien können die
erfindungsgemäßen Antikörper ebenfalls erhalten werden.
Ein Gegenstand der Erfindung sind somit Antikörper mit Spezifität für [-5, -6, -7]-proPSA, die mit
[-4]-proPSA und kürzeren proPSA-Formen im Wesentlichen nicht reaktiv sind. Die unterschiedlichen
proPSA-Formen [-7], [-6] und [-5]-proPSA werden von solchen Antikörpern effizient gebunden, während
das [-4]-proPSA im Wesentlichen nicht reaktiv ist.
Das PLILSRI-Peptid wurde nach Standardmethoden synthetisch hergestellt (Peptide, Hans-Dieter
Jakubke, Spektrum Verlag, Heidelberg, 1996). Erfahrungsgemäß sind kurze Peptide als solche wenig
immunogen. Zur Immunisierung wird deshalb das synthetische PLILSRI-Peptid an ein geeignetes
Trägerprotein, wie z. B. Keyhole Limpet Hemocyanine, Rinderserum Albumin oder Edestin gebunden.
Die Immunisierung erfolgt in den hierfür üblicherweise verwendeten Laboratoriumstieren, vorzugsweise
werden Mäuse, Ratten, Kaninchen oder Schafe immunisiert. Zur Steigerung der Immunantwort können
die üblicherweise verwendeten adjuvanten Substanzen (z. B. Freunds Adjuvants) eingesetzt werden.
Zur Herstellung monoklonaler Antikörper werden Milzzellen, vorzugsweise aus Mäusen, der
entsprechend immunisierten Tiere, nach Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, immortalisiert.
Besonders bevorzugte Verfahren sind hierbei die Hybridomtechnik (Köhler und Milstein, Nature 256
(1975), 495-497) oder die Transformation mit Eppstein-Barr-Virus (EBV-Transformation [Monoclonal
Antibody Production Techiques and Application, Lawrence B. Schook, ed., Marcel Dekker Verlag, 1987]).
Die Qualität der Immunantwort schwankt stark von Tier zu Tier, sowie von Spezies zu Spezies. Aus
diesem Grund ist es notwendig, geeignete Screeningverfahren einzusetzen, welche sicherstellen, dass die
gewonnenen Antikörper auch die erforderlichen Eigenschaften aufweisen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Herstellungsverfahren für Antikörper, welches ein
geeignetes Screeningsystem umfasst. Dieses Screeningsystem stellt sicher, dass die durch obige
Immunisierung gewonnenen Antikörper geeignete Bindeeigenschaften an [-5, -6, -7]-proPSA zeigen und
mit [-4]-proPSA und kürzeren proPSA-Formen im Wesentlichen nicht reaktiv sind.
Ein besonders geeignetes Screeningsystem enthält das 7 Aminosäure lange PLILSRI-Peptid, welches
besonders bevorzugt in biotinylierter Form an Streptavidin-Festphasen beschichtet ist. Alternativ kann
das PSA-pro-Peptid auch an Proteine gebunden und über diese auf Festphasen adsorbiert werden. In all
diesen Screeningsystemen werden besonders bevorzugt solche Varianten eingesetzt, welche sicherstellen,
dass sowohl das Trägerprotein, wie auch die Kopplungschemie sich von der zur Immunogenherstellung
verwendeten Einsatzstoffen unterscheiden, d. h. besonders bevorzugt werden alternative Trägerproteine
und andersartige Linkerstrukturen eingesetzt.
Ein weiteres besonders geeignetes Screeningsystem ist ein kompetitiver Immunoassay mit biotinyliertem
PSA-[-6 bis +1]-pro-Peptid [PLILSRI-Bi] als Antigen. In diesem Testsystem wird das biotinylierte Peptid
über Streptavidin an die Festphase beschichtet. Es wird dann geprüft, inwieweit andere/verkürzte Peptide
aus dem pro-Peptid-Bereich des PSA in diesem Test die erfindungsgemäßen Antikörper verdrängen
können. Es werden Antikörper ausgewählt, welche mit [-5, -6, -7]-proPSA reagieren, [-4]-proPSA aber
im Wesentlichen nicht erkennen.
Ein alternatives Screening-System, welches in abgewandelter Form (siehe weiter unten) ebenfalls zum
Nachweis von proPSA eingesetzt werden kann, ist ein sogenannter Sandwich-Test. In diesem Test werden
PSA (z. B. aus Spermien) sowie proPSA und PSA aus PCa-Plasma als Antigene ausgetestet.
Die Anbindung des (pro)-PSA an die Streptavidin beschichtete Festphase erfolgt über die F(ab)-
Fragmente, eines Antikörpers gegen freies PSA. Nachweisseitig werden die zu testenden neuen Antikörper
gegen proPSA eingesetzt. In einem ersten Screening werden Antikörper ausgewählt, welche mit dem
proPSA aus dem PCa-Serum reaktiv sind und mit dem PSA aus Sperma nicht reagieren.
Das obige System kann weiterhin eingesetzt werden, um die erfindungsgemäßen Antikörper über
geeignete Verdrängungsreaktionen herauszuselektieren. Zu diesem Zweck wird proPSA aus PCa-Serum
wie oben an die Festphase gebunden. Die weitere Spezifitätsprüfung erfolgt dann wie weiter oben für Tests
mit biotinyliertem proPSA-Peptid als Antigen schon beschrieben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Antikörper, welche im obigen Kompetitionstest eine
gute Kompetition mit dem [-7]-PSA-pro-Peptid, sowie mit dem [-6]-PSA-pro-Peptid und mit dem [-5]-
PSA-pro-Peptid aber im wesentlichen keine Kompetition mit dem [-4]-PSA-pro-Peptid zeigen. Unter
Kompetition wird hierbei verstanden, dass die [-5, -6, -7]-proPSA-Peptide, effizient mit dem
untersuchten Antikörper um die Bindung an das PLILSRI-Peptid auf der Festphase konkurrieren. Im
Wesentlichen nicht reaktive Antikörper gegen [-4]-proPSA und kürzere proPSA-Sequenzen sind solche
Antikörper, die im Kompetitionstest weniger als 10% der Verdrängungswirkung, besonders bevorzugt
weniger als 5% und ganz besonders bevorzugt weniger als 3% der Verdrängungswirkung verglichen zum
einem [-5]-proPSA-Peptid zeigen.
Unter dem Begriff "Antikörper" sind im Sinne der Erfindung neben den intakten Immunoglobulinen
auch sämtliche Antikörperfragmente zu verstehen. Hierzu gehören beispielsweise Fab, Fab' oder F(ab)'2-
Fragmente. Der Begriff Antikörper ohne Zusatz "monoklonal" oder "polyklonal" umfaßt immer beide
Arten von Antikörpern, sowie eventuelle chimäre Konstrukte und alle oben angeführten Fragmente.
Unter Antikörpern, die im Wesentlichen gleiche Bindeeigenschaften zeigen, werden solche Antikörper
verstanden, die mit dem am 16. Mai 2000 unter ACC 2456 bei der Deutschen Sammlung für
Mikroorganismus und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig, hinterlegten Klon um die Bindung an
[-5, -6, -7]-proPSA immunologisch konkurrieren.
Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung sind Antikörper, welche im Wesentlichen die
gleichen Bindeeigenschaften aufweisen, wie der unter ACC 2456 bei der DSMZ hinterlegte Klon.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können eingesetzt werden, um [-5, -6, -7]-proPSA spezifisch
nachzuweisen. Besonders bevorzugt sind hierbei immunologische Verfahren, welche auf dem
Kompetitionsprinzip oder dem sogenannten "Sandwich-Prinzip" beruhen. Die vielfältigen
Ausgestaltungsmöglichkeiten für Immunoassays sind dem Fachmann bekannt, so dass hier auf eine
detaillierte Schilderung verzichtet werden kann.
Ein weiteren Gegenstand der Erfindung sind daher immunologische Testverfahren, welche zur
Quantifizierung/zum Nachweis des [-5, -6, -7]-proPSA aus einer Probe geeignet sind.
Als Proben können erfindungsgemäß alle dem Fachmann geläufigen biologischen Flüssigkeiten verwendet
werden. Bevorzugt werden als Probe Körperflüssigkeiten wie Vollblut, Blutserum, Blutplasma oder Urin
eingesetzt.
Besonders bevorzugt wird das [-5, -6, -7]-proPSA in einem Sandwich-Test nachgewiesen. Als besonders
vorteilhaft hat sich dabei erwiesen, den spezifischen Antikörper gegen [-5, -6, -7]-proPSA als spezifischen
Fangantikörper einzusetzen. Unter spezifisch wird hierbei verstanden, dass der Fangantikörper die im
Screeningteil beschriebenen Spezifitätsanforderungen erfüllt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung von Antikörpern gegen [-5, -6, -7]-
proPSA in Immunoassays zum Nachweis dieser Moleküle.
Es hat sich ferner als besonders vorteilhaft erwiesen, beim Nachweis des [-5, -6, -7]-proPSA nachweisseitig
einen Antikörper einzusetzen, welcher seinerseits spezifisch mit dem sogenannten freien PSA reagiert.
Unter einem Antikörper mit Spezifität für freies PSA ist dabei zu verstehen, dass ein solcher Antikörper
PSA-Moleküle, welche mit dem α1-Anti-Chymotrypsin (ACT) komplexiert sind, nicht erkennt.
Der Spiegel an [-5, -6, -7]-proPSA erwies sich als gut meßbar. Mit Hilfe des obigen Testsystems wurden
deshalb kritische Humanseren, d. h. Humanseren mit ca. 4 bis ca. 10 ng/ml Gesamt-PSA untersucht. Eine
Analyse der Meßwerte ergab, dass [-5, -6, -7]-proPSA-Werte wertvolle Zusatzinformationen im klinisch
relevanten und kritischen Entscheidungsbereich liefern. Die (-5, -6, -7)-proPSA-Werte können
herangezogen werden, um das Vorhandensein eines Prostata-Karzinoms zu diagnostizieren bzw.
auszuschließen.
Wie eingangs schon erwähnt, ist ein deutlich erhöhter PSA-Wert von <20 ng/ml von sehr hoher
klinischer/diagnostischer Aussagekraft. Ein solcher Wert ist ein vergleichsweise sicheres diagnostisches
Indiz für das Vorliegen eines PCa. Für Werte unter 20 ng/ml läßt die Aussagekraft stark nach. Ein Wert
unter 10 ng/ml kann ebensogut durch BPH, wie durch ein PCa bedingt sein. Gerade in diesem Bereich
wäre es jedoch besonders wichtig, eine gutartige Prostatahyperplasie von einem PCa im Frühstadium zu
unterscheiden.
Einschlußkriterium für die ausgewählten Seren waren ein PSA (total)-Wert von 4-10 ng/ml, welcher mit
den entsprechenden Elecsys®-Test der Firma Roche Diagnostics ermittelt worden war. Neben PSA (total)
wurde freies PSA (ebenfalls mit dem entsprechenden Elecsys©-Test von Roche Diagnostics) bestimmt.
Im klinisch besonders relevanten Bereich (4-10 ng/ml) wurde die Aussagekraft der getesteten PSA-
Marker einzeln und im Verhältnis zueinander über sogenannte ROC-Analysen untersucht.
Unter einer ROC-Analyse (ROC = receiver operator curve) versteht man die Berechnung und Erstellung
eines sogenannten Sensitivitäts-Spezifizitäts-Diagramms. Ein Test mit einer guten diagnostischen
Trennschärfe zeichnet sich durch einen möglichst großen AUC-Wert (AUC = area under the curve) aus.
Je höher dieser Wert, desto besser die Leiitungsmerkmale des bewerteten Tests bezüglich seiner Spezifität
und Sensitivität.
Das Verhältnis von [-5, -6, -7]-proPSA zu freiem PSA konnte aufgrund des neu entwickelten
Immunoassays erstmals gebildet und ausgewertet werden. Erstaunlicherweise hat sich dieses Verhältnis in
den durchgeführten ROC-Analysen als besonders aussagekräftig erwiesen, d. h. mit dem Verhältnis von
[-5, -6, -7]-proPSA zu freiem PSA ist eine bessere Differenzierung zwischen PHB und PCa möglich, als
mit den aus dem Stand der Technik bekannten Parametern. Dieser Vorteil wird bei Betrachtung von
Abb. 3 offenkundig.
Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung ist daher die vertiefende Analyse von kritischen
PSA-Seren, d. h. von Seren mit einem Gesamt-PSA unter ca. 20 ng/ml, besonders bevorzugt mit einer PSA
von 2-15 ng/ml und insbesondere von 4-10 ng/ml durch Auswertung des Quotienten von [-5, -6, -7]-
proPSA zu freiem PSA oder des inversen Quotienten.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können zudem eingesetzt werden, um die drei verschiedenen
proPSA-Formen [-5]-proPSA, [6]-proPSA und/oder [-7]-proPSA einzeln zu bestimmen. Zu diesem
Zweck wird ein erfindungsgemäßer Antikörper eingesetzt, um die [-5], [-6] und [-7]-proPSA-Moleküle
aus der Probe anzureichern und diese einer weiteren Analyse zugänglich zu machen. Besonders bevorzugt
erfolgt die Anreicherung über Immunaffinitätschromatographie oder selektive Immunsorption und der
Einzelnachweis der obigen drei proPSA-Formen über massenspektrometrische (MS) Verfahren.
Während das erfindungsgemäße immunologische Verfahren die drei proPSA Formen [-5, -6, -7] als
Summe erfaßt, ist es über die MS möglich, die drei proPSA Formen einzeln zu quantifizieren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die separate Quantifizierung von [-5], [-6] und [-7]-
proPSA und die Verwendung dieser Einzelwerte zur Diagnose oder zum Ausschluß eines Prostata
Karzinoms.
Die erfindungsgemäßen Antikörper reagieren ebenfalls mit dem [-6]-prohK2, mit der
Aminosäuresequenz Prolin-Leucin-Isoleucin-Glutamin-Serin-Arginin (PLIQSR). In Analogie zu den
oben beschriebenen Nachweisverfahren und Analyse kann mit den erfindungsgemäßen Antikörpern auch
prohK2 bestimmt und zur Diagnose herangezogen werden.
Die Menge an den drei proPSA-Formen [-5], [-6] und [-7] kann zudem mit den zugrundeliegenden
Erkrankungen und Verläufen verglichen werden, um damit ein aggressiver Krankheitsverlauf von einem
eher langsamen Krankheitsverlauf zu unterscheiden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:
Zu 28.7 mg magnetischen Streptavidinbeads wurden in einem 10 ml Röhrchen 4 ml einer Lösung des
Antikörpers MAK<PSA<-M-30-IgG-Biotin (c = 25 µg/ml) in PBS pH 7 +1% RSA + 0.1% Tween20
gegeben und für eine Stunde inkubiert. Die Beads wurden anschließend durch einen Magneten
präzipitiert, der Überstand abpipettiert und die Beads dreimal mit jeweils 3 ml Waschlösung (PBS
pH 7 + 20 mM Octylglucosid) gewaschen. Nach Zugabe von 8 ml Plasma (Gehalt an freiem PSA:
180 ng/ml) wurde wieder für 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Plasma wurde dann
abpipettiert und die Beads 4 × mit je 1 ml Waschlösung gewaschen. Anschließend wurden die Beads
mit 500 µl Propionsäure 1 M versetzt und die Suspension wieder für eine Stunde geschüttelt. Der
Überstand wurde nach Präzipitation der Beads abgenommen, lyophilisiert und dann in 10 µl Aqua
dest. aufgenommen. PSA aus Spermien wurde von der Fa. Scripps Laboratories, San Diego, bezogen.
Ein erster Hinweis, dass das immunsorptiv gereinigte, freie PSA aus dem Plasma sich in seiner Größe
von dem aus Sperma unterscheidet zeigte sich in der MALDI-TOF MS. Dort wurde festgestellt, dass
das freie PSA aus dem PCa Plasma mit 29 100 Da ein um ca. 600 da höheres Molekulargewicht zeigte
als freies PSA aus Sperma (28 500 Da).
Nach Auftrennung des freien PSA aus PCa-Plasma und Sperma durch SDS-PAGE, reduktiver Alkylierung
der Banden und Verdau mit Endoprotease Lys-C ergaben sich die in Abb. 1 gezeigten Peptidmuster. Zur
Verdeutlichung sind die aus den jeweiligen PSA Formen nachgewiesenen Peptide in Tabelle 1
zusammengefaßt.
Wie aus Abb. 1 sowie Tabelle 1 zu erkennen ist, enthält freies PSA aus PCa-Plasma, vier Peptide, die in
PSA aus Sperma nicht vorhanden sind. Es handelt sich dabei um Peptide, die um 2, 4, 5 oder 7
Aminosäuren am N-Terminus des PSA verlängert sind und somit proPSA Formen darstellen.
12 Wochen alte, weibliche Balb/C Mäuse wurden mit 100 µg des Peptids P-L-I-L-S-R-I-C (im weiteren als
proPSA Peptid bezeichnet), welches an dem Cystein über einen Spacer an KLH (keyhole limpet
hemocyanine) gekoppelt war, zusammen mit dem Adjuvans CFA (Komplettes Freund'sches Adjuvans)
intraperitoneal erststimuliert. Nach 6 Wochen und danach in monatlichem Abstand, folgten drei weitere
Immunisierungen intraperitoneal. Dabei wurde jeder Maus 100 µg des obigen Immunogens zusammen
mit IFA (Inkomplettes Freund'sches Adjuvans) verabreicht. Anschließend erfolgten die letzten
Immunisierungen intravenös mit je 100 µg des Immunogens in PBS-Puffer am 3. und 2. und letzten Tag
vor der Fusion.
Die Fusion von Milzzellen der gemäß a) immunisierten Mäuse mit Myelomzellen erfolgt in Anlehnung an
Galfré, Methods in Enzymology 73, 1981, 3. Dabei werden ca. 1 × 108 Milzzellen der immunisierten Maus
mit 2 × 107 Myelomzellen (P3X63-Ag8-653, ATCC CRL 1580) gemischt und abzentrifugiert (10 min bei
300 g und 4°C). Die Zellen werden dann einmal mit RPMI-1640-Medium ohne fötalem Kälberserum
(FKS) gewaschen und bei 400 g in einem 50 ml Spitzröhrchen erneut abzentrifugiert, 1 ml PEG
(Polyethylenglykol) (Molekulargewicht 4000, Merck, Darmstadt) dazugegeben, und durch Pipettieren
gemischt. Nach 1 min im Wasserbad bei 37°C werden 5 ml RPMI 1640 ohne FKS zugetropft,
durchmischt, auf 50 ml mit Medium (RPMI 1640 + 10% FKS) aufgefüllt und anschließend zentrifugiert.
Die sedimentierten Zellen werden in RPMI 1640 Medium mit 10% FKS aufgenommen und in
Hypoxanthin-Azaserin-Selektions-Medium (100 mmol/l Hypoxanthin, 1 µg/ml Azaserin in RPMI 1640 +
10% FKS) eingesät. Als Wachstumsfaktor wird dem Medium Interleukin 6 (100 U/ml) zugegeben. Nach
ca. 10 Tagen wurden die Primärkulturen auf spezifische Antikörpersynthese getestet.
Für das Screening der Mausseren, der Primärkulturen sowie der klonierten MAKs wurden mit
rekombinantem Streptavidin beschichtete MTP (Fa. MicroCoat, Penzberg, Best.-Nr. 12-K 96 N,
Charge MC 289) mit 1 µg/ml biotinyliertem proPSA Peptid in PBS plus 0,5% Crotein C beschichtet
(100 µl pro well, 10 min Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln) und anschließend 3 × mit
0,9% NaCl/0,05% Tween 20 gewaschen. Das proPSA Peptid (PLILSRIC-Bi) war in diesem Konjugat
mit einem anderen Spacer mit dem Biotin verbunden, als er bei dem oben beschriebenen Immunogen
zur Immunisierung der Mäuse verwendet worden war, um Spacer spezifische Antikörper zu
vermeiden. Danach wurden 100 µl der zu untersuchenden Antikörper-Lösung in ein beschichtetes
well gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach 3-maligem Waschen
mit 0,9% Natriumchlorid/0,05% Tween 20 wurde zum Nachweis von gebundenem Antikörper aus
der Probe jeweils 100 µl eines POD-markierten Fab-Fragments eines polyklonalen Antikörpers aus
dem Schaf gegen Maus-Fcy (Roche Diagnostics GmbH, Ident.-Nr. 1431323, entsprechend 25 mU/ml)
zugegeben, 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert und anschließend 3 × mit
0,9% Natriumchlorid/0,05% Tween® 20 gewaschen.
Schließlich wurden jeweils 100 µl/well ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, Kat.-Nr. 1204521 und
1204530) zugegeben und nach 30 min bei Raumtemperatur die Extinktion bei 405/492 nm in einem
MR700 Microplate Reader der Firma Dynatech gemessen.
Für das Screening der Mausseren, der Primärkulturen sowie der klonierten MAKs auf Reaktion mit
proPSA-Formen in PCa-Serum wurden mit rekombinantem Streptavidin beschichtete MTP (Fa.
MicroCoat, Penzberg, Best.-Nr. 12-K 96 N, Charge MC 289) mit 1 µg/ml biotinyliertem Fab
Fragment des monklonalen Antikörpers M-30, der nur freies PSA erkennt, in PBS plus 0,5% Crotein
C beschichtet (100 µl pro well, 10 min Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln) und
anschließend 3 × mit 0,9% NaCl/0,05% Tween 20 gewaschen. Danach wird mit 100 µl des
unverdünnten oder 1 : 10 mit PBS verdünnten PCa-Serums für 1 h unter Schütteln bei
Raumtemperatur inkubiert. Im nächsten Schritt wurden 100 µl der zu untersuchenden Antikörper-
Lösung in ein beschichtetes well gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln
inkubiert. Nach 3-maligem Waschen mit 0,9% Natriumchlorid/0,05% Tween 20 wurde zum
Nachweis von gebundenem Antikörper aus der Probe jeweils 100 µl eines POD-markierten Fab-
Fragments eines polyklonalen Antikörpers aus dem Schafgegen Maus-Fcy (Roche Diagnostics
GmbH, Ident.-Nr. 1431323, ensprechend 25 mU/ml) zugegeben, 1 Stunde bei Raumtemperatur
unter Schütteln inkubiert und anschließend 3 × mit 0,9% Natriumchlorid/0,05% Tween® 20
gewaschen.
Schließlich wurden jeweils 100 µl/well ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, Kat.-Nr. 1204521 und
1204530) zugegeben und nach 20 min bei Raumtemperatur die Extinktion bei 405/492 nm in einem
MR700 Microplate Reader der Firma Dynatech gemessen. Als Kontrolle wurde PSA-freies
Frauenserum eingesetzt.
Zur Überprüfung, dass die hergestellten Antikörper keine Reaktion mit freiem PSA aus Sperma
zeigten, wurde als Antigen anstatt des PCa-Serums, freies PSA der Fa. Scripps, San Diego, Kat. Nr. P
0714, Charge 98 43 649, 1 µg/ml, gelöst in PBS plus 0,5% Crotein C, eingesetzt. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Das Ergebnis zeigt zum einen, dass die meisten der untersuchten Seren aus gemäß 1a immunisierten
Mäusen spezifisch mit dem PSA-haltigen PCa-Serum reagieren. Da sie zum anderen nicht mit freiem PSA
aus Sperma, welches einen normalen N-Terminus des reifen PSA besitzt, reagieren, belegen diese
Resultate zudem, dass in diesem PCa-Serum proPSA-Formen vorliegen müssen.
Primärkulturen wurden in analoger Weise getestet und Kulturen, die mit proPSA Peptid sowie dem
proPSA-haltigem Serum eine positive Reaktion zeigten aber mit (Sperma-) PSA keine Reaktion aufwiesen,
wurden mittels fluoreszenzaktiviertem Zellsorter in 96er-Zellkulturplatten kloniert. Hierbei wurde dem
Medium als Wachstumszusatz Interleukin-6 (100 U/l) zugegeben. Auf diese Weise wurden die Klone der
Tabelle 3 erhalten:
Die erhaltenen Hybridomzellen wurden in einem Standardverfahren zur Produktion von IgG durch
Ascitesbildung bei Mäusen eingesetzt. Die Reinigung dieser Antikörper aus dem Ascites erfolgte nach
proteinchemisch üblichen Methoden (z. B. gemäß Methods in Enzymology 121 (1986), 587-695).
Wie im Beispiel 1d) beschrieben, wurde proPSA aus PCa-Serum in mit Streptavidin vorbeschichteten
Näpfen von Mikrotiterplatten gebunden. Anschließend wurden die anti-proPSA-Antikörper zusammen
mit den unterschiedlich langen proPSA-Peptiden für 1 Stunde gemeinsam inkubiert. Die zugesetzten
freien Peptide können in diesem Schritt mit proPSA aus dem PCa-Serum auf der Festphase um die
Bindung an die Antikörper konkurrieren. Peptide, welche gut erkannt werden, führen zu einer
Verdrängungsreaktion und damit letztendlich zu einer Signalerniedrigung, weil weniger spezifische
Antikörper und damit auch weniger Nachweisantikörper gebunden wurden. Wie aus Abb. 2
hervorgeht, führen nur die Peptide [-6]-proPSA und [-5]-proPSA zu einer starken Verdrängungsreaktion.
Das [-7)-proPSA wurde in diesem Experiment nicht mitgeführt. In anderen Experimenten zeigte das
[-7]-proPSA-Peptid eine ähnlich gute Kompetition, wie das [-5] oder das [-6]-proPSA-Peptid.
Der Nachweis von [-5, -6, -7]-proPSA erfolgte in einem sogenannten Sandwich-ELISA mit dem proPSA-
MAK als Fangantikörper und einem POD-markierten MAK gegen freies PSA als Nachweisreagenz. Der
MAK 1.023.6 wurde über Standardverfahren biotinyliert und in einer Konzentration von 2,5 µg /ml
eingesetzt. Dieser Test erfolgte analog zum EnzymunR-Test auf freies PSA, mit dem wichtigen
Unterschied, dass als Fangreagenz der erfindungsgemäße (biotinylierte) MAK 1.023.6 eingesetzt wurde.
In insgesamt 41 Proben mit einem Gesamt-PSA-Wert zwischen 4-10 ng/ml, aber hinsichtlich BPH, bzw.
PCa abgesicherter Diagnose, wurden die Parameter freies PSA und gesamt-PSA mit dem automatischen
Immunanalyzer ELECSYS® (Roche Diagnostics), und proPSA entsprechend Beispiel 4 bestimmt. Die
Quotienten aus freiem PSA zu gesamt-PSA, proPSA zu gesamt-PSA und freiem PSA zu proPSA wurden
errechnet und ebenso wie die Einzelparameter einer ROC-Analyse unterworfen. Wie aus Abb. 3 klar
hervorgeht, ergibt sich für das Verhältnis von freiem PSA zu proPSA der größte AUC-Wert. Somit trägt
dieser "Parameter" wesentlich besser zur Unterscheidung zwischen BPH und PCa bei als die beiden
anderen Relativwerte oder die jeweiligen Einzelwerte.
Claims (18)
1. Antikörper mit Spezifität für [-5, -6, -7] proPSA,
dadurch gekennzeichnet, dass
diese Antikörper mit [-4]-proPSA und kürzeren Formen des proPSA im Wesentlichen nicht reaktiv
sind.
2. Antikörper nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, dass
es sich bei diesen Antikörpern um monoklonale Antikörper handelt.
3. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, dass
es sich dabei um Antikörper handelt, welche im Wesentlichen die gleiche Bindeeigenschaften
aufweisen, wie monoklonale Antikörper, welche von dem unter ACC 2456 bei der DSMZ hinterlegten
Klon sezerniert werden.
4. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen [-5, -6, -7] proPSA unter Verwendung
synthetischer trägergebundener Peptide, welche der proPeptid-Sequenz des [-5], [-6] und/oder
[-7]proPSA entsprechen,
dadurch gekennzeichnet, dass
über das Screening-Verfahren Antikörper erhalten werden, welche im Wesentlichen nicht reaktiv sind
mit [-4] proPSA oder kürzeren Formen des proPSA.
5. Methode zum Nachweis von [-5, -6, -7]-proPSA in einer Probe,
dadurch gekennzeichnet, dass
ein spezifischer Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1-3 zum Nachweis eingesetzt wird.
6. Methode nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, dass
als spezifischer Fangantikörper ein Antikörper gemäß Anspruch 1-3 eingesetzt wird.
7. Methode nach einem der Ansprüche 5 oder 6,
dadurch gekennzeichnet, dass
ein Fangantikörper mit Spezifität für (-5, -6, -7]-proPSA, sowie ein Nachweisantikörper mit Spezifität
für freies PSA eingesetzt wird.
8. Methode nach einem der Ansprüche 5, 6, 7,
dadurch gekennzeichnet, dass
der spezifische Fangantikörper biotinyliert vorliegt.
9. Diagnostische Testzusammensetzung zum Nachweis von [-5, -6, -7]-proPSA
welche Antikörper mit Spezifität für [-5, -6, -7]-proPSA, welche im Wesentlichen nicht mit kürzeren
proPSA Formen reaktiv sind, enthält.
10. Verfahren zum Nachweis oder Ausschluß eines Prostata-Karzinoms in einer Probe,
dadurch gekennzeichnet, dass
[-5, -6, -7]-proPSA bestimmt wird.
11. Verfahren zum Nachweis oder Ausschluß eines Prostata-Karzinoms in einer Probe,
dadurch gekennzeichnet, dass
[-5, -6, -7]-proPSA bestimmt und zu anderen Kallikrein-Fraktionen oder zur Gesamtmenge eines
oder mehrerer Kallikreine ins Verhältnis gesetzt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Kallikrein PSA ist.
13. Verfahren zum Nachweis oder Ausschluß eines Prostata-Karzinoms in einer Probe,
dadurch gekennzeichnet, dass
ein Quotient aus proPSA und freiem PSA gebildet wird.
14. Verfahren zum Nachweis oder Ausschluß eines Prostata-Karzinoms gemäß Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet, dass
als proPSA [-5, -6, -7]-proPSA bestimmt wird.
15. Verfahren zum Nachweis oder Ausschluß eines Prostata-Karzinoms,
dadurch gekennzeichnet, dass
[-5, -6, -7]-proPSA unter Verwendung der Antikörper gemäß Anspruch 1-3 aufgereinigt und jede
dieser drei proPSA-Formen einzeln quantifiziert wird.
16. Verwendung von Antikörpern gemäß einem der Ansprüche 1-3 in einem Test
zum Nachweis oder Ausschluss eines Prostata-Karzinoms.
17. Peptid-haltiges Immunogen zur Herstellung von Antikörpern gegen [-5, -6, -7)-proPSA,
dadurch gekennzeichnet, dass
das synthetische Peptid der SEQ ID No: 1; 2 und/oder 3 verwendet wird.
18. Peptid-haltiges Immunogen gemäß Anspruch 17,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Peptid der SEQ ID No: 2 verwendet wird.
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DE10032040A DE10032040A1 (de) | 2000-05-24 | 2000-07-05 | Antikörper gegen spezielle Formen des proPSA und deren Verwendung in Immunoassays |
AT01960241T ATE335765T1 (de) | 2000-05-24 | 2001-05-23 | Antikörper gegen spezielle formen des propsa und deren verwendung in immunoassays |
PCT/EP2001/005943 WO2001090194A2 (de) | 2000-05-24 | 2001-05-23 | Antikörper gegen spezielle formen des propsa und deren verwendung in immunoassays |
JP2001587005A JP2003534001A (ja) | 2000-05-24 | 2001-05-23 | プロpsaの特定形態に対する抗体およびそのイムノアッセイにおける使用 |
ES01960241T ES2269440T3 (es) | 2000-05-24 | 2001-05-23 | Anticuerpos contra formas especiales de propsa y su utilizacion en inmunoensayos. |
DE50110712T DE50110712D1 (de) | 2000-05-24 | 2001-05-23 | Antikörper gegen spezielle formen des propsa und deren verwendung in immunoassays |
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