DE10009143A1 - Nachweis von Humanen Papillomviren - Google Patents

Nachweis von Humanen Papillomviren

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Abstract

Es wird ein Verfahren zum Nachweis von Humanen Papillomviren (HPV) in biologischem Material beschrieben, bei dem eine Extraktion/Isolation von Nukleinsäuren aus biologischem Material und der Nachweis HPV-spezifischer DNA aus den isolierten Nukleinsäuren erfolgt. Dazu wird zumindest eine der Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 aus dem beiligenden Sequenzprotokoll oder Sequenzen, die an Sequenzen binden, an die eine der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 binden oder Sequenzen, die zu den vorstehenden Sequenzen komplementär sind, verwendet.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Humanen Papillomviren (HPV) in biologischem Material sowie in dem Verfahren verwendete Nukleotidsequenzen.
Das Verfahren umfaßt dabei die Schritte:
  • a) Extraktion/Isolation von Nukleinsäuren aus biologischem Material, und
  • b) Nachweis HPV-spezifischer DNA aus den isolierten Nuklein­ säuren.
Ein derartiges Verfahren ist aus verschiedenen Veröffentlichun­ gen bekannt.
Infektionen mit dem HPV stehen in Verbindung mit einer Vielzahl von Erkrankungen der Haut und der Schleimhaut. Meist handelt es sich dabei um benigne Tumoren, die sich als Kondylome, Warzen oder Papillome darstellen, die in der Regel nach Monaten bis Jahren spontan abheilen. Mit Hilfe der Molekularbiologie und Gentechnologie konnte auch der Zusammenhang von verschiedenen Krebserkrankungen mit Papillomvirusinfektionen nachgewiesen werden. Bei diesen Tumoren handelt es sich vor allem um Karzi­ nome der Anogenitalregion, insbesondere um Gebärmutterhals­ karzinome, aber auch um Hautkarzinome bei immunsupprimierten Patienten oder Patienten mit der seltenen Erkrankung Epidermo­ dysplasia verruciformis (EV). Die kausale Beteiligung der HPV bei den Krebserkrankungen im Bereich des Anogenitaltraktes gilt mittlerweile als allgemein akzeptiert. Weltweit wird in prak­ tisch allen Gebärmutterhalskarzinomen und Vorläuferläsionen DNA des HPV nachgewiesen.
Mittlerweile wurden mehr als 100 HPV-Genotypen identifiziert, wobei die klinischen Krankheitsbilder, die durch die Infektion verursacht werden können, häufig charakteristisch für einen be­ stimmten HPV-Typ sind. Vulgäre Warzen der Extremitäten und Plantarwarzen werden vor allem durch die HPV-Typen 1, 2, 4, 10, 27, 28, 57 und 65 verursacht. Die HPV, die im Zusammenhang mit Krebserkrankungen im Anogenitalbereich stehen, werden entspre­ chend ihres onkogenen Potentials in sogenannte "low risk"- (z. B. 6, 11, 40) und "high risk"-HPV-Typen (z. B. 16, 18, 45 und 56) unterteilt. Low risk-HPV-Typen verursachen hautsächlich gutartige Tumoren des äußeren Genitalbereichs (Kondylome) sowie niedriggradige intraepitheliale Neoplasien und sind nur selten mit Karzinomen assoziiert. Die Anwesenheit von high risk-Viren in Epithelzellen des Anogenitaltraktes stellt hingegen einen hohen Risikofaktor für die Entstehung eines Karzinoms dar. Bei der Entstehung von Hautkarzinomen bei EV-Patienten gilt die Be­ teiligung der HPV-Typen 5 und 8 als weitgehend gesichert.
Sowohl beim Gebärmutterhalskrebs als auch bei bestimmten Formen des Hautkrebs handelt es sich um vermeidbare Erkrankungen, wenn frühzeitige Erkennung und Behandlung gesichert sind. Eine zu­ verlässige Methode zum Nachweis einer vorliegenden HPV- Infektion, durch die sämtliche HPV-Typen erfaßt werden und die darüber hinaus eine Typisierung ermöglicht, ist deshalb Voraus­ setzung für eine zielgerichtete Therapie.
Der Nachweis präkanzeröser Läsionen und frühinvasiver Karzinome erfolgt bereits seit den 50er Jahren mittels histologischer Me­ thoden (Zytologie-Screening). Die Anwendung dieser Methoden hatte zur Folge, daß die Inzidenz von Gebärmutterhalskrebs zu­ rückging. Trotzdem ist die Zytologie methodologisch unzuläng­ lich, was sowohl zu falsch negativen (invasive Karzinome 15% bis 55%, frühinvasive Karzinome 20% bis 70%) als auch falsch positiven Ergebnissen führt (5% bis 15% mit der Folge unnöti­ ger Verängstigung der Patientinnen). Diese Unzulänglichkeiten sind:
  • - Subjektive Fehler - die Zytologie ist komplex, sie erfor­ dert intensive visuelle Überprüfung von Zellen. Diese Technik ist weder objektiv noch geographisch standardi­ siert.
  • - Fehlerhafte oder mangelhafte Probengewinnung kann zu falsch negativen oder unklaren Ergebnissen führen.
  • - Durch histologische Verfahren wird generell nur der momen­ tane Zustand eines Gewebes erfaßt, so daß der prognosti­ sche Wert dieser Methode fehlt.
Durch verbesserte Nachweismethoden ist es inzwischen gelungen, in infizierten Geweben direkt das Vorhandensein des Papillomvi­ rus nachzuweisen:
Bei der sogenannten HCM-Methode (Hybride Capture Microplate), einem von der Firma Digene kommerziell zu beziehendem Test, handelt es sich um ein signalverstärkendes Hybridisierungsver­ fahren. Damit gelingt der qualitative Nachweis von 18 HPV-Typen in Gewebeproben des Gebärmutterhales. Als Hybridisierungssonden werden HPV-spezifische RNA-Sequenzen verwendet, die das voll­ ständige Virusgenom abdecken.
Nach Inkubation dieser Sonden mit denaturierter HPV-DNA aus dem infizierten Gewebe bilden sich RNA/DNA-Hybride, die mittels ei­ nes spezifischen Antikörpers detektiert werden können. Über das Enzym Alkalische Phosphatase, das mit dem Antikörper konjugiert ist, erfolgt nach Zugabe eines entsprechenden Substrates der Nachweis mittels Chemilumineszenz.
Die HCM-Methode ermöglicht die Differenzierung zwischen zwei HPV-DNA-Gruppen: den HPV-Typen 6, 11, 42, 43, 44 mit niedrigem kanzerogenem Potential und den HPV-Typen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 mit mittlerem bis hohem kanzero­ genem Potential.
Eine genaue Typisierung der Papillomviren ist mit dieser Metho­ de nicht möglich. Nachteilig ist bei dieser Testmethode des weiteren, daß es aufgrund der Verwendung eines RNA-Gemisches häufig zu Kreuzreaktionen zwischen beiden HPV-Klassen kommt. Dies kann dann zu falsch negativen oder falsch positiven Ergeb­ nissen führen. Nachteilig ist auch, daß die Papillomviren HPV 5 und 8 mit dieser Methode nicht erfaßt werden.
Surentheran et al., "Detection and typing of Human Papilloma Viruses in mucosal and cutaneous biopsis from immunosuppressed and immunocompetent patients and patients with Epidermodyspla­ sia verruciformis: A unified diagnostic approach", Journal of Clinical Pathology" 1998; 51: 606-610, beschreiben ein Polymera­ se-Kettenreaktion (PCR)-gestütztes Verfahren zum Nachweis von HPV-DNA in Haut- und Schleimhautbiopsien aus immunsupprimierten und immunkompetenten und EV-Patienten. Die Autoren verwenden hierzu verschiedene PCR-Primer-Paare, die alle innerhalb des offenen Leserasters des viralen Gens für das Strukturprotein L1 liegen.
Eine Typisierung der Papillomviren erfolgt durch anschließende Sequenzanalyse des amplifizierten Genfragments. Neuere Untersu­ chungen haben ergeben, daß das L1-Gen über alle bekannten HPV- Typen weniger konserviert ist als ursprünglich angenommen. Des­ halb gelingt mit dieser Methode lediglich der Nachweis einer begrenzten Anzahl von HPV-Typen (HPV 2-6, 8, 10, 11, 16, 31, 41, 57). Ob der Nachweis der high risk-HPV-Typen 18, 45 und 56 mit dieser Methode möglich ist, ist nicht beschrieben.
Tieben et al., "Detection of Epidermodysplasia verruciformis­ like human papillomavirus types in malignant and premalignant skin lesions of renal transplant recipients", British Journal of Dermatology 1994; 131, 226-230, beschreiben eine ebenfalls PCR-gestützte Nachweismethode von HPV-DNA in Hauttumoren von Patienten nach einer Nierentransplantation. Die hier verwende­ ten, verschiedenen PCR-Primer-Paare liegen innerhalb des kon­ servierten Virus-spezifischen E1-Gens, das für eine ATP- abhängige DNA-Helikase kodiert. Durch die Verwendung von vier verschiedenen PCR-Primer-Paaren gelingt den Autoren ein Erfas­ sen folgender HPV-Typen: HPV 1-5, 6b, 7-9, 10a, 11, 12, 14a, 15, 16-22, 24, 25, 31, 33, 36-38, 46, 49, 50, 65. Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat allerdings herausgefun­ den, daß das Primer-Paar CP4/CP5 nicht zur Amplifikation geeig­ net ist.
Eine Typisierung erfolgt bei dieser Veröffentlichung über die Sequenzierung des Amplifikates. Bemerkenswert ist hier, daß le­ diglich drei der obigen Primer-Paare verwendet werden können, wenn sich solch eine Typisierung an die PCR anschließen soll. Nicht verwendet werden kann das oben erwähnte Primer-Paar CP4/CP5. Mit dieser Methode gelingt Tieben et al. durch Typi­ sierung der spezifische Nachweis der HPV-Typen 1a, 2a, 3-5, 6b, 8, 10a, 11-13, 14a, 15-18, 20-22, 24, 25, 31, 33, 36, 39, 41, 42, 46, 47, 49, 50, 57, 58, 63 und 65.
Der Vorteil gegenüber der von Surentheran et al. beschriebenen Methode liegt darin, daß hier mit einem Primer-Paar eine größe­ re Anzahl an verschiedenen HPV-Typen bestimmt werden kann. Trotz dieser verbesserten Spezifität ist die Typisierung vieler HPV, insbesondere der high risk-Papillomviren HPV 45 und 56 so­ wie der HPV-Typen mit mittlerem onkogenem Potential 35, 51 und 52 mit dieser Methode nicht möglich.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfin­ dung, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, das einen zuverlässigen Nachweis von allen derzeit im Zusammenhang mit der Tumorinduktion in Frage kommenden HPV-Viren ermöglicht, sowie Hybridisierungs-Sequenzen für selbiges Verfahren bereit­ zustellen.
Bei dem eingangs genannten Verfahren wird diese Aufgabe erfin­ dungsgemäß dadurch gelöst, daß der Nachweis über spezifische HPV-DNA-Abschnitte unter Verwendung zumindest einer der folgen­ den Nukleotidsequenzen erfolgt: SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder Sequen­ zen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die mindestens eine der Sequenzen SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 binden oder Sequenzen, die zu den vorstehenden Sequenzen kom­ plementär sind.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Wei­ se vollkommen gelöst. Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat nämlich erkannt, daß durch den Einsatz der hier erstmals beschriebenen Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1, 2 und 3 aufgrund ihrer sehr hohen Spezifität und Sensitivität der Nachweis aller bisher bekannten HPV-Typen gelingt. Alle drei Sequenzen stammen aus dem hochkonservierten viralen E1-Gen. Der Einsatz der Se­ quenzen SEQ ID Nr. 1, 2 und 3, z. B. als Hybridisierungssonden (DNA-Marker) oder im Rahmen einer DNA-Amplifizierungsmethode eignet sich deshalb besonders für den Nachweis einer allgemei­ nen HPV-Infektion.
Das beschriebene Verfahren führt zu besonders guten Ergebnis­ sen, wenn der Nachweis einer HPV-Infektion über eine Amplifika­ tion der spezifischen HPV-DNA-Abschnitte mittels Polymerase- Kettenreaktion (PCR) erfolgt.
Hierzu werden z. B. die Nukleotidseguenzen SEQ ID Nr. 1 und 2 als PCR-Primer-Paar verwendet. Dabei entsteht ein Amplifikati­ onsprodukt von ca. 220 bp, das mittels einfacher Standardmetho­ den, z. B. Ethidiumbromidanfärbung nach gelelektrophoretischer Auftrennung, nachgewiesen werden kann.
Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Amplifikation der spezifischen HPV-DNA- Abschnitte mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erfolgt, die durch folgendes Temperaturprofil charakterisiert ist:
Aufheizen: 5-15 min., 90-100°C;
Hitzedenaturierung: 30-90 sec., 90-100°C;
Hybridisierung: 30-90 sec., 50-60°C;
Polymerisierung: 30-180 sec., 67-77°C;
Abkühlen: 2-10 min., 67-77°C.
Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat erkannt, daß dieses Temperaturprofil, das von anderen publizierten Profilen ab­ weicht, für eine effiziente Amplifizierungsreaktion und damit zuverlässige Typisierung wesentlich ist. Eine besonders effizi­ ente PCR-Reaktion wird nach Erkenntnissen des Erfinders bei folgenden Bedingungen erreicht:
Aufheizen: 10 min., 95°C;
Hitzedenaturierung: 30 sec., 95°C;
Hybridisierung: 30 sec., 55°C;
Polymerisierung: 1 min., 72°C;
Abkühlen: 5 min., 72°C;
Aufheizrate: 1°C/sec;
Zyklen: 40.
Der Einsatz der Sequenz SEQ ID Nr. 1 zusammen mit der Sequenz SEQ ID Nr. 3 als PCR-Primer-Paar liefert ein Amplifikations­ produkt des viralen E1-Gens von ca. 280 bp Länge. Dies ermög­ licht aufgrund der Länge des Amplifikats (im Vergleich zum 220 bp-Amplifikat bei Verwendung von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 als PCR-Primer-Paar) eine noch sicherere Typisierung, z. B. durch anschließende Sequenzierung oder Temperaturgradienten­ gelelektrophorese, als bei Verwendung des Primer-Paares SEQ ID Nr. 1 und 2.
Ein weiterer Vorteil ist darin zu sehen, daß durch die Beschaf­ fenheit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, die in keiner Posi­ tion degeneriert ist, eine eventuelle Sequenzierung des Ampli­ fikationsproduktes erleichtert wird. Die von Tieben et al. ver­ wendeten Primer sind dagegen in zwei bzw. drei Positionen dege­ neriert. Das hat zur Folge, daß in der PCR sehr hohe Primermen­ gen eingesetzt werden müssen und bei eventuell anschließendem Sequenzieren erhöht Probleme auftreten.
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ferner die Ver­ wendung der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 und 3 als PCR-Primer-Paar in dem beschriebenen Verfahren.
Eine besonders zuverlässige Typisierung der HPV wird durch Se­ quenzierung der amplifizierten HPV-DNA-Abschnitte erzielt. Das Amplifikationsprodukt ist nämlich durch geringe Sequenzvaria­ tionen zwischen den verschiedenen HPV-Typen charakterisiert, was die Zuordnung des Typs ermöglicht.
Das beschriebene Verfahren wird bevorzugt als Teil eines Ver­ fahrens zur Diagnose und/oder Früherkennung eingesetzt, insbe­ sondere im Zusammenhang mit Krebserkrankungen, beispielsweise dem Gebärmutterhalskrebs.
Der Erfinder hat hier herausgefunden, daß diese Methode, deren Bestandteile in anderen Zusammenhängen bisher überwiegend im Forschungsbereich eingesetzt wurden, ein zuverlässiges Diagno­ severfahren darstellt.
Das neue Verfahren ist ebenfalls dazu geeignet, im Rahmen einer Früherkennungsuntersuchung von Krebserkrankungen eingesetzt zu werden. Nur ein gesicherter positiver Befund hinsichtlich einer HPV-Infektion kann nämlich Ausgangspunkt für eine zielgerichte­ te Therapie sein.
Gegenstand der Erfindung sind auch die in dem Verfahren verwen­ deten Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1, 2 und 3 gemäß beigefüg­ tem Sequenzprotokoll, sowie Nukleotidsequenzen, die an Sequen­ zen hybridisieren, an die die Sequenzen SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 binden.
Es ist nämlich so, daß durch Verkürzung, Verlängerung, Substi­ tution, Insertion und/oder Deletion die erfindungsgemäßen Nu­ kleotidsequenzen verändert werden können, jedoch immer noch funktionell vergleichbar sind. Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung auch derart veränderte Nukleotidsequenzen.
Selbiges gilt für Nukleotidsequenzen, die mindestens zu einer der vorstehenden Sequenzen komplementär sind.
Der Erfinder hat nämlich erkannt, daß die Verwendung komplemen­ tärer Nukleotidsequenzen, die entsprechend am Gegenstrang der HPV-DNA hybridisieren, in dem oben beschriebenen Verfahren zu gleichen Resultaten führen kann. Deshalb sind solche Sequenzen ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
Eine besondere Leistung des Erfinders liegt in der Erkenntnis, daß eine Nukleotidsequenz aus dem offenen Leseraster E1 des HPV zum Nachweis und sogar zur Typisierung von HPV im Anogenitalbe­ reich, insbesondere im Zusammenhang mit einer Gebärmutter­ halserkrankung, verwendet werden kann, weil die E1-Region im Vergleich zur L1-Region über sämtliche bekannten HPV-Typen eine höhere Konservierung zeigt.
Die hohe Konservierung des viralen E1-Gens gegenüber dem vira­ len L1-Gens sichert die Erfassung möglichst vieler HPV-Typen. Trotz allem vorhandene, geringfügige Sequenzvariationen zwi­ schen den verschiedenen HPV-Typen gewährleisten wider Erwarten auch eine zuverlässige Typisierung.
Es versteht sich, daß die vorstehend erwähnten Merkmale nicht nur in der angegebenen Kombination, sondern auch einzeln oder in anderer Kombination verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen erläutert, aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile ergeben.
Beispiel 1 DNA-Extraktion
Für den Nachweis von HPV ist es zunächst erforderlich, Biopsie- oder Abstrichmaterial zu entnehmen. Dieses wird in 500 µl Mel­ ting-Puffer (0,1 M EDTA; 0,05 M Tris pH 8,0; 0,5% SDS) aufge­ nommen. Dazu werden 2,5 µl Proteinase K (20 mg/ml) gegeben und die Lösung für 24 bis 48 Stunden bei 55°C inkubiert.
Daran schließt sich eine zweimalige Phenol-Extraktion (Phenol : CHCl3 : Isoamylalkohol = 25 : 24 : 1) an. Der Ansatz wird ge­ mischt, nicht gevortext, für 2-5 min. inkubiert (über Kopf rotiert), danach bei 14000 rpm für 5 min. abzentrifugiert. Es folgt eine Extraktion mit CHCl3/Isoamylalkohol (24 : 1), Inkuba­ tion für 2-5 min., danach 5 min. bei 14000 rpm zentrifugie­ ren.
Es folgt die Zugabe von 1/10 des Ansatzvolumens an 7,5 M Ammo­ niumacetat, der Ansatz wird gemischt und 2 bis 4 Std. bei 55°C inkubiert.
Der Ansatz wird dann über Nacht bei -20°C ethanolgefällt.
Die so extrahierte DNA wird anschließend in eine PCR-Reaktion eingesetzt.
Beispiel 2 PCR-Reaktion
Die PCR dient der gezielten Amplifikation viraler DNA- Abschnitte.
Hierzu werden 0,25 µl, 1 µl, 2,5 µl und 5 µl der extrahierten DNA-Menge eingesetzt (ohne Konzentrationsbestimmung); Zusatz Primer 1 : 100 ng, Primer 2 : 100 bzw. 200 ng, dNTPs: je 10 mM; 5 µl Taq-Polymerase-Puffer (10-fach, ohne MgCl2); 7 µl MgCl2 (25 mM Stammlösung, entspricht 3,6 mM); 0,4 µl Taq-Gold- Polymerase (entspricht 2 units). Der Ansatz wird auf ein Ge­ samtvolumen von 50 µl aufgefüllt. Die Durchführung der PCR er­ folgt in einem MJ-Research Thermocycler (PTC 200); eingestellte Aufheizrate: 1°C/sec. Die PCR-Amplifikation läuft über 40 Zy­ klen [10 min. 95°C (Aufheizen, nur im ersten Zyklus); 30 sec. 95°C; 30 sec. 55°C; 1 min. 72°C; 5 min. 72°C (Abkühlen, nur im letzten Zyklus)].
Zum unspezifischen Nachweis einer HPV-Infektion (Screening) werden bevorzugt die Sequenzen SEQ ID Nr. 1 (Vorwärts) und SEQ ID Nr. 2 (Rückwärts) als Primer-Paar (je 100 ng) verwendet. Die Nukleotidsequenzen dieser Primer und die Lage im HPV-Genom (HPV16 als Beispiel) sind:
SEQ ID Nr. 1: 5'-(nt2082)-AAC-AAT-GTG-TAG-ACA-TTA-TAA- ACG-AGC-(nt2108)-3'
SEQ ID Nr. 2: 5'-(nt2336)-ATT-AAA-CTC-ATT-CCA-AAA-TAT- GA-(nt2314)-3'
Durch dieses Screening-Verfahren werden derzeit alle bekannten HPV-Typen erfaßt.
Soll sich eine Typisierung, z. B. mittels DNA-Sequenzierung, an­ schließen, verwendet man bevorzugt die Sequenzen SEQ ID Nr. 1 (Vorwärts) und SEQ ID Nr. 3 (Rückwärts; 200 ng) als Primer- Paar:
SEQ ID Nr. 3: 5'-(nt2401)-GAG-GYT-GCA-ACC-AAA-AMT-GRC- T-(nt2380)-3',
wobei Y für ein Pyrimidin steht (T oder C), M Amino bedeutet (A oder C) und R für ein Purin steht (G oder A).
Bei den Rückwärts-Primern SEQ ID Nr. 2 und 3 sind die Positio­ nen des antikodierenden DNA-Stranges angegeben, zu dem diese Primer reverse und komplementär sind.
Beispiel 3 DNA-Sequenzierung (Typisierung)
Die Sequenzierung des Amplifikats aus Beispiel 2 zur Bestimmung des HPV-Typs wird mit dem Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit mit Ampli-Taq von der Firma ABI unter Ver­ wendung von 200 ng Primer SEQ ID Nr. 1 oder 3 und des PCR- Amplifikationsansatzes durchgeführt. Dieser wird zuvor über Microcon 100 Säulen (Millipore) eingeengt und aufgereinigt. Von dem aufgereinigten Ansatz werden ca. 50% für die Sequenzierung eingesetzt.
Die Sequenzier-PCR-Reaktion wird nach den folgenden Bedingungen durchgeführt: 10 sec. 96°C, 5 sec. 55°C, 4 min. 60°C, 30 Zyklen, mit einer Aufheizrate von 1°C/sec.
Gefällt wird anschließend mit 0,3 M Natriumacetat und 2,5- fachem Volumen Ethanol.
Das Pellet wird in 25 µl TSR (Template Suppression Reagent von ABI) aufgenommen, für 2 min. bei 90°C inkubiert, danach für 2 min. auf 4°C gebracht, und anschließend auf Raumtemperatur ge­ halten.
Die Kapillarelektrophorese mit Hilfe des ABI-Prism 310 Sequen­ zierautomaten wird mit einer 47 cm Kapillare (Durchmesser 50 µm) durchgeführt, und mit dem 310 Genetic Analyser-Programm von ABI ausgewertet. Als Polymer wird das Polymer POP 6 (Per­ formance Optimize Polymer 6) von ABI verwendet.
Durch diese Typisierung können bei Verwendung der Primer SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 folgende HPV-Typen identifiziert werden:
HPV1 bis HPV8
HPV10 bis HPV19
HPV21 bis HPV28
HPV30 bis HPV38
HPV40
HPV42
HPV44 bis HPV47
HPV51 bis HPV54
HPV56 bis HPV60
HPV65 bis HPV67
HPV70
HPV72 bis HPV73
HPV83 bis HPV83
Bei Verwendung der PCR-Primer-Paare SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 werden analoge Ergebnisse erzielt. Aufgrund des kleineren Amplifikationsproduktes sind folgende HPV-Typen nicht zu diffe­ renzieren:
HPV51/HPV31
HPV31/HPV70
HPV18/HPV6
HPV18/HPV2a
HPV33/HPV1
HPV31/HPV83
HPV31/HPV57
Beispiel 4 Verwendung einer Nukleotidsequenz aus dem offe­ nen Leseraster E1 des HPV
Das Genom des HPV ist in der Fig. 1 beispielhaft anhand des 7.905 bp langen HPV16-Genoms dargestellt. Das Genom gliedert sich in drei Abschnitte: eine nicht kodierende Region (LCR, Long Control Region), eine E-(early-)Region, die für die "frühen Gene" kodiert und eine L-(late-)Region, die für die "späten Gene" kodiert. Die Lage der offenen Leseraster ist an­ hand der Positionsangaben ersichtlich.
Aus dem offenen Leseraster E1, das für eine ATP-abhängige DNA- Helikase kodiert, werden erfindungsgemäß eine oder mehrere Nu­ kleotidsequenzen zum Nachweis von HPV in der Art verwendet, daß hiermit sämtliche HPV-Typen erfaßt werden. Der Einsatz solcher Sequenzen ist in Form von Hybridisierungssonden oder auch von PCR-Primern etc. möglich. Hier kommt besonders eine HPV- Infektion im Anogenitalbereich, insbesondere im Zusammenhang mit einer Gebärmutterhalserkrankung, in Betracht.
Die E1-Region ist durch eine hohe Konservierung innerhalb der bekannten HPV-Typen gekennzeichnet. Deshalb ist die E1-Region besonders geeignet, eine allgemeine HPV-Infektion nachzuweisen. Es hat sich herausgestellt, daß es bei einer Verwendung des of­ fenen Leserasters L1 zum Nachweis von HPV aufgrund von größeren Sequenzvariationen zwischen den verschiedenen HPV-Typen zu falsch negativen Ergebnissen kommen kann. Dieses Risiko des fehlerhaften Nachweises wird durch die Verwendung der E1-Region minimiert.
Dennoch kann die E1-Region auch zur Typisierung des HPV einge­ setzt werden, die geringen Sequenzunterschiede reichen dann nach Erkenntnis des Erfinders überraschenderweise aus.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (16)

1. Verfahren zum Nachweis von Humanen Papillomviren (HPV) in biologischem Material, mit den Schritten:
  • a) Extraktion/Isolation von Nukleinsäuren aus dem bio­ logischen Material, und
  • b) Nachweis HPV-spezifischer DNA aus den isolierten Nu­ kleinsäuren,
dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis über spezifische HPV-DNA-Abschnitte unter Verwendung zumindest einer der folgenden Nukleotidsequenzen erfolgt:
SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 aus dem bei­ liegenden Sequenzprotokoll oder Sequenzen, die an Sequen­ zen binden (hybridisieren), an die eine der Sequenzen SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 binden oder Se­ quenzen, die zu den vorstehenden Sequenzen komplementär sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis über eine Amplifikation der spezifischen HPV-DNA- Abschnitte mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) er­ folgt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die PCR durch folgendes Temperaturprofil charakterisiert ist:
Aufheizen: 5-15 min., 90-100°C;
Hitzedenaturierung: 30-90 sec., 90-100°C;
Hybridisierung: 30-90 sec., 50-60°C;
Polymerisierung: 30-180 sec., 67-77°C;
Abkühlen: 2-10 min., 67-77°C.
4. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR die Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 bzw. SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll verwendet wer­ den.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, daß eine Typisierung der HPV durch Sequen­ zierung der amplifizierten HPV-DNA-Abschnitte erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß dieses Teil eines diagnostischen Verfah­ rens und/oder Früherkennungsverfahrens ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Teil eines Verfahrens zur Diagnose und/oder Früh­ erkennung von Krebserkrankungen, insbesondere von Gebär­ mutterhalskrebs, ist.
8. Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 gemäß dem beigefügten Se­ quenzprotokoll.
9. Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 gemäß dem beigefügten Se­ quenzprotokoll.
10. Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 gemäß dem beigefügten Se­ quenzprotokoll.
11. Nukleotidsequenz, die an Nukleotidsequenzen bindet (hybri­ disiert), an die die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 bindet.
12. Nukleotidsequenz, die an Sequenzen bindet (hybridisiert), an die die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 bindet.
13. Nukleotidsequenz, die an Sequenzen bindet (hybridisiert), an die die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 bindet.
14. Nukleotidsequenzen, die zu einer Nukleotidsequenz aus ei­ nem der Ansprüche 8 bis 13 komplementär sind.
15. Verwendung zumindest einer der Nukleotidsequenzen aus einem der Ansprüche 8 bis 14 zum Nachweis von HPV, insbe­ sondere im Anogenitalbereich.
16. Verwendung einer oder mehrerer Nukleotidsequenzen aus dem offenen Leseraster E1 des HPV zum Nachweis, vorzugsweise zur Typisierung von HPV im Anogenitalbereich, insbesondere im Zusammenhang mit einer Gebärmutterhalskrebserkrankung.
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