DD290219A5 - Verfahren zur herstellung von ungesaettigten 11b, 17alpha, 21-trihydroxypregnan-3,20-dion-verbindungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ungesaettigten 11b,17a,21-Trihydroxypregnan-3,20-dion-Verbindungen. Sie verfolgt das Ziel, diese Glukokortikoide in verbesserter Weise herzustellen. Die diesem Ziel zugeordnete Aufgabe wird durch mikrobielle Transformation der entsprechenden 11-Desoxy-Steroide (Substrat), d. h. der 17a,21-Dihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-Verbindungen sowie der zugehoerigen 1,4-Dien-Verbindungen in der Weise geloest, dasz ein zur 11b-Hydroxylierung befaehigter Mikroorganismus in einem Medium, dem vor oder mit der Substratzugabe ein Induktor vom Typ einer ungesaettigten Bisnorcholan-22-carbonsaeure und/oder eines analogen C22-Alkohols beigefuegt worden ist, fermentiert wird. Bei verfahrensgemaeszem Vorgehen koennen konzentriertere Steroid-Einsaetze umgesetzt sowie mehrfach hoehere Glukokotikoid-Ausbeuten erreicht werden.{11b-Hydroxylierung; mikrobielle Transformation; Curvularia; Cochliobolus; aerobe Fermentation; Hydroxylierung von Pregnanderivaten; Substratkonzentration; Induktion mit C22-Steroiden; Induktorkonzentration 1-20% der Substratkonzentration; Kortikoide}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ungesättigten 11 ß,17a,21 -Trihydroxy-pregnan-S^O-dion-Verbindungen, d.h. von Glukokortikoiden und von Glukokortikoid-Derivaten, durch mikrobielle 11 ß-Hydroxylierung des entsprechenden 11-Desoxy-Steroids der allgemeinen Formel

wobei die Bindung eine Einfach- oder Doppelbindung bedeutet. A, B und C außer H auch OH, Cl, F oder CH₃ sein

können und R folgende Strukturen la oder Ib besitzen kann,

H₂C-O-X H₂C-O₄ 0-Y

c-0 c^o c⁷

Ж-0-х ^⁰' \

worin X ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe, Y eine Alkylgruppe sowie Z ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe bedeuten.

Diese 1-Desoxy-Verbindungen sind aus Produkten des mikrobiellen Seitenkettenabbaues von Sterolen zugängig. Die mikrobiell gewonnenen Vorstufen besitzen häufig schon die für die pharmakologische Wirkung der Glukokortikoide wichtige

I (2)-Doppelbindung. Glukokortikoide sind als Wirkstoffe mit antiinflammatorischer, antirheumatischer und antiallergischer Wirkung in der Humanmedizin eingeführt, so zum Beispiel das unter dem Namen Prednisolon bekannte 11 ß,17a,21 -Trihydroxypregna-1,4-dien-3,20-dion.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der pharmazeutischen Forschung und Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Bekannt ist, daß Glukokortikoide vom Typ der 11ß-Hydroxy-1,4-dien-3-oxo-Verbindungen allgemein durch mikrobielle Hydroxylierung aus den entsprechenden 4-En-3-oxo-Steroiden herstellbar sind, wobei wegen der Schwierigkeit der

I1 ß-Hydroxylierung in Gegenwart der 1,4-Dien-Struktur diel (2)-Doppelbindung im Verlauf der Synthese in einer weiteren mikrobiellen Reaktion als letzter Schritt eingeführt wird.

Für den Fall, daß bei der 11 ß-Hydroxylierung von 1,4-Dien-Verbindungen ausgegangen wurde, konnte die Ausbeute durch die Wahl spezieller 17,21-Derivate als Ausgangsmaterial verbessert werden (vgl. Patentschrift DE 2901 561 bzw. DD 151947). Diese technische Lösung, bei der wie in dem vorangehenden Verfahren (vgl. Patentschrift DE 1618599) die 11 ß-Hydroxylierung mit Hilfe eines Pilzes der Art Curvularia lunata durchgeführt wurde, besitzt jedoch den Nachteil, daß gute Ausbeuten nur bei niedrigen Substratkonzentrationen (nicht höher als 0,5g/l) erreichbar sind.

Es wurden kürzlich auch mikrobielle Verfahren zur Herstellung der 11ß,17a,21-Trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion-Derivate Prednisolon (vgl. WPC 12 P/281607) und Prednisolon-17-acetat (vgl. WP C 12 P/281608) aus den zugehörigen 11-Desoxy-

Verbindungen vorgeschlagen, in welchen die 11 ß-Hydroxylierung unter Einsatz von Pilzen der Gattungen Cochliobolus bzw. Absidia realisiert und die Fermentation nach vollendeter Hydroxylierung im Bereich von pH 7,0 bis pH 9,0 durchgeführt wird. Diese Verfahren haben jedoch gleichfalls den Nachteil, daß in ihnen höhere Ausbeuten nur bei geringen Substrateinsatzkonzentrationen erreichbar sind.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, ungesättigte 11 ß,17a,21 -Trihydroxy-pregnan-S^O-dion-Verbindungen, wie z. B. die 1,4-Dehydro-Verbindung Prednisolon, aus den entsprechenden 11 -Desoxy-Verbindungen (Glukokortikoid-Vorstufen) der Formeln I, I a und I b in verbesserter Weise zu gewinnen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technisch einfaches fermentatives Verfahren anzugeben, das es gestattet, ungesättigte 11ß,17a,21-Trihydroxy-pregnan-3,20-dion-Verbindungen durch mikrobielle Hydroxylierung von 11-Desoxy-Verbindungen der Formeln I, I a und I b, wie sie z. B. aus dem mikrobiellen Sterolabbau zugänglich sind, in ökonomisch günstiger Weise zu gewinnen.

Erfindungsgemäß wird die mikrobielle 11 ß-Hydroxylierung von 11-Desoxy-Verbindungen (Glukokortikoid-Vorstufen) der Formel I, I a und I b unter Zusatz eines C₂2-Steroids vom Typ einer ungesättigten 3-Oxo-bisnorcholan-22-carbonsäure insbesondere eines entsprechenden Alkohols durchgeführt. Dabei wird eine signifikante Erhöhung der Zielprodukt-Ausbeute erzielt.

Die genannten C₂rSteroide weisen in dieser Transformation hinsichtlich der 11ß-Hydroxylase-Aktivität ein stärkeres Induktionsvermögen auf als die umzuwandelnden 11-Desoxy-Substrate selbst.

Im Ergebnis dieses Befundes wird die Erfindungsaufgabe wie folgt gelöst: Einem Fermentationsansatz, wie er für einen 11 ß-hydroxylierenden Mikroorganismus in an sich bekannter Weise bereitet wird, wird vor bzw. spätestens mit der Einbringung des Substrates, d.h. der Einbringung eines 11-Desoxy-Steroids der Formel I, la und Ib als Indukator ein C₂2-Steroid der allgemeinen Formel Il

M,

worin R = COOH oder CH₂OH, also eine ungesättigte 3-Oxo-bisnorcholan-22-carbonsäure oder ein entsprechender C₂₂-Alkohol in einer Konzentration, die im Bereich von 1 % bis 20% der Substrat-Konzentration liegt, zugesetzt. Hierbei erfolgt die Induktorzugabe entweder in einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in Aceton, Methanol bzw. Dimethylformamid oder in einer in der Steroidfermentation gebräuchlichen Suspension.

Induktoren des genannten Typs sind 3-Oxo-bisnorchol-4-en-22-carbonsäure (Kurzbezeichnung: A⁴-C₂₂-Säure) oder 3-Oxobisnorchola-1,4-dien-22-carbonsäure (Kurzbezeichnung: A^1-4-C₂₂-Säure) bzw. 22-Hydroxy-bisnorchol-4-en-3-on (Kurzbezeichnung: A⁴-C₂2-Alkohol) oder22-Hydroxy-bisnorchola-1,4-dien-3-on (Kurzbezeichnung: A^1l4-C₂2-Alkohol). Diese C₂2-Steroide fallen beim mikrobiellen Abbau von Sterolen beispielsweise zu 1,4-Androsta-dien-3,17-dion (ADD) als Nebenprodukten, während das ADD seinerseitsprimär als Vorstufe eines 11-Desoxy-Steroids der Formel I, la und Ib benötigt wird.

Für die verfahrensgemäße mikrobielle Steroidtransformation kann ein beliebiger 11 ß-hydroxylierender Mikroorganismus eingesetzt werden. In erster Linie wird im Verfahren jeweils ein 11 ß-hydroxylierender Stamm aus einer der nachstehenden Mikroorganismengattungen bzw. -arten herangezogen:

Cochliobolus, vorzugsweise C. lunatus

Curvularia, vorzugsweise Curv. lunata

oder Curv. genticulata

Absidia, vorzugsweise A. orchidis

oder A.coerulea

Cunninghamella, vorzugsweise Cunn. blakesleeana

Tieghemella, vorzugsweise T. orchidis.

Einige Stämme aus den oben bevorzugt genannten Arten sind im Zusammenhang mit früheren Patentanmeldungen in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen des Zentralinstitutes für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR - 6900 Jena, Beutenbergstr. 11 hinterlegt worden, so unter anderem

Stamm C. lunatus m 118 unter Reg.-Nr. ZIMET 43 797 Stamm A. orchidis 409 unter Reg.-Nr. ZIMET 43 795

Stamm A. coerulea 468 unter Reg.-Nr. ZIMET43 796;

weiterhin ist der Stamm Curv. lunata NRRL 2380 ein häufig zur 11 ß-Hydroxylierung verwendeter Mikroorganismus.

Die Fermentation des jeweils gewählten 11ß-hydroxylierenden Mikroorganismus erfolgt unter aeroben Kulturbedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, welches neben dem Substrat eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle - gegebenenfalls auch in Form einer komplexen Quelle-sowie Mineralsalze enthält. Für diese Fermentation wird der gewählte Mikroorganismus, ausgehend von einer Lyophilkonserve, in einer Vorkultivierung angezogen. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, die Vorkultivierung über eine emerse und zwei submerse Stufen zu erstrecken. Mit der Zugabe des Substrates, d.h. eines 11-Desoxy-Steroids der Formel I, la und Ib, wird bis zu 12 Stunden nach dem Start der Hauptkultivierung begonnen, wobei das Substrat in einer Einsatzkonzentration von 0,5g/l bis 5,0g/l dem Fermentationsmedium zugefügt wird. Die Substrateinbringung erfolgt entweder in Lösung (in einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel) oder in Suspension bzw. in feinkristalliner Form.

Bei Fermentationen mit Substrat-Einsatzkonzentrationen > 1 ,Og/I wird eine gestaffelte Zugabe in der Weise angewandt, daß gleichzeitig mit jeder Substrat-Teilzugabe im oben angegebenen Konzentrationsverhältnis ein weiteres Quantum Induktor zugegeben wird. Aus der Gesamtheit der 11-Desoxy-Steroide gemäß Formel I, I a, I b wird in der vorliegenden mikrobiellen Transformation vorzugsweise jeweils eine der nachstehenden Verbindungen als Substrat herangezogen:

17a,21 -Dihydroxy-pregn^-en-a^O-dion (RSS),

17a,21-Dihydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion(1-Dehydro-RSS),

17a-Acetoxy-21-hydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion (1-Dehydro-RSS-i 7-Ac),

17a,21 -Diacetoxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion (1 -Dehydro-RSS-17,21-Diac),

17a,21-(1-Ethoxy-^thyliden-dioxy)-pregna-1,4-dien-3,20-dion(1-Dehydro-RSS-OEE), 17a,21 -(1 -Ethoxy-1 -propyliden-dioxy)-pregna-1,4-dien-3,20-dion (1 -Dehydro-RSS-OPE),

17a,21 -Dihydroxy-1 ба-methyl-pregna-i ,4-dien-3,20-dion,

6a,-Fluor-16a,17a,21-Trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion und

6a,-Fluor-16a,17a,21 -Trihydroxy-pregna-1 Adien-S^O-dion.

Die Fermentation erfolgt bei Temperaturen von 24°C bis 33°C; sie wird über eine Dauer von 48 Stunden bis 72 Stunden erstreckt und kann in Rundkolben sowie Steilbrustflaschen, in gerührten Glasfermentem und in V2A-Stahltanks durchgeführt werden. Die Fermentation wird spätestens dann beendet, wenn der Substrat-Gehalt auf einen Restwert ä 1,0% der Einsatzkonzentration abgesunken ist.

Zur Isolierung der in der Fermentation in Abhängigkeit vom eingesetzten 11-Desoxy-Steroid gemäß Formel I, la, Ib jeweils entstandenen ungesättigten 11ß,17a,21-Trihydroxy-pregnan-3,20-dion-Verbindung wird die Kulturflüssigkeit in an sich bekannter Weise, vorzugsweise durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel nebst anschließender Kristallisation, aufgearbeitet.

Die beigefügte Tabelle gibt eine Übersicht über ausgewählte, jeweils im Labormaßstab realisierte Varianten des voranstehend beschriebenen mikrobiellen Herstellungsverfahrens. Sie enthält gleichzeitig Angaben über die aus dem verfahrensgemäßen Induktor-Einsatz jeweils resultierende Steigerung in der Ausbeute in Glukokortikoid, d.h. an ungesättigter 11 ß,17a,21-Trihydroxy-pregnan-3,20-dion-Verbindung und offenbart damit den Hauptvorteil dieser als Einstufenverfahren vorliegenden Erfindung (die Ausbeute-Steigerung kann mehr als das Vierfache erreichen).

Weitere Vorteile der Erfindung werden darin gesehen, daß

- nunmehr auch Substrat-Einsätze höherer Konzentration nach vergleichsweise kurzen Fermentationszeiten in guten Ausbeuten in die jeweilige ungesättigte 11ß,17a,21-Trihydroxypregnan-3,20-dion-Verbindung überführt werden können und daß

- die verfahrensgemäßen Induktoren im Laufe der Fermentation zu Produkten abgebaut werden, welche die Aufarbeitung der Zielsubstanz nicht stören.

Ausführungsbeispiele

Die nachfolgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren erläutern, ohne es in irgendeiner Weise einzuschränken:

Beispiel 1

Herstellung von Prednisolon aus 1-Dehydro-RSS-17-Ac in Schüttelkulturen.

Mit einer Lyophilkonserve des Stammes Cochliobolus lunatus ZIMET43 797, gelöst in 1,5 ml Aqua dest., werden Hafermehlagar-Eprouvetten beimpft (Hafermehl 2,0%, Agar 2,0%; pH natursauer) und 11 Tage bis 14 Tage bei 29⁰C inkubiert. Mit 5 ml Aqua dest. wird das versporte Mycel einer Eprouvette abgeschwemmt und zur Beimpfung von 500-ml-Rundkolben a 50ml Vorkulturmedium I (30g Glucose, 5g Maisquellenwasser lyophilisiert, 2g Natriumnitrat, 1g Kaliumdihydrogenphosphat, 2g Dikaliumhydrogenphosphat, 0,5g Magnesiumsulfat, 0,02g Eisensulfat und 0,5g Kaliumchlorid pro Liter (pH 6,7) benutzt. Die Anzucht der submersen Kulturen erfolgtauf einer Rotationsschüttelmaschine mit 240 U/min während 70 Stunden bei 28°C. Mit 10% dieser ersten submersen Vorzuchtstufe werden 500-ml-Rundkolben ä50ml bzw. 2-l-Steilbrustflaschen mit Impfstutzen a 200ml Vorkulturmedium Il (VK II) Glucose 2%, Maisquellwasser lyophilisiert 2%; pH 6,5 bis 6,7) beimpft und 24 Stunden auf einer Rotationsschüttelmaschine (240U/min) bei 28^CC geschüttelt.

Danach erfolgt die Beimpfung des Fermentationsmediums (Glucose 0,7%, Maisquellwasser lyophilisiert 3%, FeSO₄ · 7H₂O 0,002%; pH 6,0) mit dieser zweiten submersen Vorzuchtstufe im Verhältnis 1:10. Mit je 5 ml der zweiten submersen Vorzuchtstufe werden 40 50-ml-Rundkolben mit je 50 ml Fermentationsmedium beimpft. Sofort danach werden je 10mgA^1>4-C₂2-Alkohol, gelöst in 0,25ml Methanol pro Rundkolben zugegeben. Nach 6stündigem Schütteln bei 28°C (240U/min) erfolgt pro Rundkolben die Zugabe von 100 mg 1 -Dehydro-RSS-17-Ac, gelöst in 0,75 ml Methanol/Aceton im Volumenverhältnis 1:1 (v: v). Nach 48stündiger Fermentation unter Schütteln bei 28°C wird mit Ethylacetat extrahiert, alkalisch gewaschen und bis zur Kristallisation eingeengt, wobei 2,98g Prednisolon erhalten werden (79,9% d.ThO.

Ohne den Einsatz des C₂₂-AIkOhOIs werden unter sonst gleichen Bedingungen (Einsatz von 2g 1-Dehydro-RSS-17-Ac pro Liter Kultur; 48 Stunden) weniger als 0,9g/l Prednisolon gebildet.

Beispiel 2

Herstellung von Prednisolon aus i-Dehydro-RSS-17-Ac im Laborfermentor.

Eine Vorkultur von C. lunatus ZIMET 43797 wird unter den Bedingungen des Beispiels 1 angezüchtet. Zur Fermentation wird ein Laborfermentor mit einer Füllung von 21 Fermentationsmedium gemäß Beispiel 1 benutzt. Die Beimpfung geschieht mit 200ml VK Il aus einer 2-l-Steilbrustflasche. Induktion mit A¹⁴-C₂₂-Alkohol und Substratzugabe erfolgen gestaffelt:

0,2 g Induktor, gelöst in 5 ml Methanol und 2g i-Dehydro-RSS-17-Ac (trocken sterilisiert) werden unmittelbar nach der Beimpfung

und die gleichen Mengen noch einmal nach 24 Stunden zugegeben.

Die Fermentation wird bei 30⁰C, 620U/min und einer Belüftung von 11 Luft/l Kulturlösung insgesamt 56 Stunden durchgeführt.

Die Kulturlösung wird anschließend dreimal mit Chloroform extrahiert, die Extrakte eingeengt und aus Ethylacetat kristallisiert.

Man erhält 2,8g Prednisolon (75% d.Th.).

Unter sonst gleichen Bedingungen kann ohne Induktor nur die Hälfte, nämlich 1 g/l 1-Dehydro-RSS-i 7-Ac zu 70% in Prednisolon

umgewandelt werden.

Tabelle

Zum Induktionseffekt von Си-Alkoholen (C₂₂A) und C^-Säuren (C₂₂S) gemäß Formel Il gegenüber ausgewählten 11-Desoxy-Verbindungen in Schüttelkulturfermentationen (Induktorkonzentration·. 1:10 der Substratkonzentration)

Variante

Mikroorg.

Substrat (Konz.)

Induktor

Fermentationszeit (Std.)

11ß-0H-

Prod.

(%d.Th.l

Induktionseffekt (als Faktor)

Zu 1/2	Cochl.	1-Dehydro-	—	72	19,1	(D
	lunatus	RSS-17-ac
1	ZIMET	(2 g/l)	Дм-С22-А	72	78,3	4,1
	43797
2		Д4-С22А	72	83,5	4,4

Zu3	dito	1-Dehydro-	—	72	21,4	(D
		RSS-17,21
3		Diac.	Д14-С22А	72	56,8	2,7
		(1 g/l)
Zu 4/5	dito	1-Dehydro-	—	48	14,7	(1)
4		RSS-OEE	Д1'4-С22А	48	32,5	2,2
5		(1,5g/l)	A1'4-C22S	48	27,5	1,9
Zu 6	dito	1-Dehydro	—	48	8,7	(D
		RSS-OPE+
6		(1,5 g/l)	A1^-C22A	48	17,5	2,0
Zu 7	dito	RSS	_	66	30,0	(D
7		(0,8 g)	Д1-4-С22А	66	50,0	1,7
Zu 8	Curv.	1 -Dehydro-	—	72	20,0	(D
	lunata	RSS-17-ac
8	NRRL	(2 g/l)	Д1-4-С22А	72	54,0	2,7
	2380
Zu 9	dito	1-Dehydro-	—	72	18,8	(D
		RSS-OEE
9		(2 g/l)	Д1-4-С22А	72	29,3	1,6

⁺ OPE: Orthopropionsäureethylester OEE: OrthoessigsSureethylester

Claims (11)

1. Patentansprüche:

   Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Hß^a^i-Trihydroxy-pregnan-S^O-dion-Verbindungen auf mikrobiologischem Wege, gekennzeichnet dadurch, daß man dem Fermentationsansatz für einen Hß-hydroxylierenden Mikroorganismus neben einem 11-Desoxy-Steroid der Formel

   . eine Einfach- oder Doppelbindung bedeutet, A, B und C außer H

   wobei die Bindung

   auch OH, Cl, F oder CH₃ sein können und R folgende Strukturen I a oder I b besitzen kann.

   Ia

   Ib.

   C=O С

   c-V

   worin X ein Wasserstoffatom oder ein Acylgruppe, Y eine Alkylgruppe sowie Z ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe bedeuten, vor bzw. spätestens mit der Einbringung dieses Substrats ein C₂2-Steroid der Formel

   worin R = COOH oder CH₂OH, als Induktor zusetzt, anschließend bei Temperaturen von 24^CC bis 33⁰C für 48 Stunden bis 72 Stunden fermentiert und aus der Kulturflüssigkeit die in Abhängigkeit vom jeweils eingesetzten 11-Desoxy-Steroid entstandene 11ß,17a, 21-Trihydroxy-pregnan-3,20-dion-Verbindung isoliert.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man eine ungesättigte 3-Oxo-bisnorcholan-22-carbonsäure bzw. einen entsprechenden Alkohol als Induktor zusetzt.
3. 3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man З-Охо-ЬіэпогспоІ^-еп^- carbonsäure als Induktor zusetzt.
4. 4. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man 3-Oxo-bisnorchoia-i ,4-dien-22-carbonsäure als Induktor zusetzt.
5. 5. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man 22-Hydroxy-bisnorchol-4-en-3-on als Induktor zusetzt.
6. 6. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man 22-Hydroxy-bisnorchola-1,4-dien-3-on als Induktor zusetzt.
7. 7. Verfahren nach Punkt 1-6, gekennzeichnet dadurch, daß man die Substrat-Einsatzkonzentration im Bereich von 0,5g/l bis 5,0g/l Fermentationsmedium und die Induktor-Einsatzkonzentration im Bereich von 1 % bis 20% der Substrat-Einsatzkonzentration wählt.
8. 8. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß man das Substrat in Lösung, in Suspension oder in feinkristalliner Form sowie den Induktor in Lösung oder in Suspension in das Fermentationsmedium einbringt.
9. 9. Verfahren nach Punkt 7 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß man bei Substrat-Einsatzkonzentrationen größer 1,0g/l eine über mehrere Portionen gestaffelte Zugabe von Substrat und Induktor vornimmt.
10. 10. Verfahren nach Punkt 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß man im Verfahren einen

    11 ß-hydroxylierenden Mikroorganismus aus einer der Gattungen Cochliobolus, Curvularia, Absidia, Cunninghamella oderTieghemella einsetzt.
11. 11. Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß man im Verfahren einen

    11 ß-hydroxylierenden Mikroorganismus aus einer der Arten Cochliobolus lunatus, Curvularia lunata oder Curvularia genticulata, Absidia orchidis oder Absidia coerulea, Cunninghamella blakesleeana oder Tieghemella orchidis einsetzt.