DE1059906B - Verfahren zur Herstellung von 1, 4-Pregnadienen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von 1, 4-Pregnadienen

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DE1059906B
DE1059906B DESCH18481A DESC018481A DE1059906B DE 1059906 B DE1059906 B DE 1059906B DE SCH18481 A DESCH18481 A DE SCH18481A DE SC018481 A DESC018481 A DE SC018481A DE 1059906 B DE1059906 B DE 1059906B
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dione
acetate
dehydro
acid
pregnadiene
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William Charney
David Huntington Gould
Hershel Leon Herzog
Arthur Nobile
Eugene Paul Oliveto
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Scherico Ltd
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J5/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond

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Description

  • Verfahren zur Herstellung von 1, 4-Pregnadienen Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 1,4-Pregnadien-3,20-dionen, die zusätzlich Sauerstoffunktionen in 11-, 17a- und/oder 21-Stellung sowie ein 9a-Halogenatom enthalten können, und von Zwischenprodukten, die in solche 1,4-Pregnadienderivate umgewandelt werden können.
  • Es wurde gefunden, daß die neuen Verbindungen, insbesondere 1-Dehydro-cortison und 1-Dehydro-cortisol (1-Dehydro-hydrocortison) sowie deren 21-Ester, große therapeutische Bedeutung besitzen. Im Formelschema I sind einige der wichtigsten neuen 1,4-Pregnadienderivate aufgezeichnet. Die Formeln bedeuten: I. Pregnan-Skelett mit Bezifferung der C-Atome, II. 1-Dehydro-cortison und seine 21-Ester, III. 1-Dehydro-cortisol und seine 21-Ester, IV. 9a-Halogen-l-dehydro-cortison und seine 21-Ester, V. 9a-Halogen-l-dehydro-cortisol und seine 21-Ester, VI. Allgemeine Formel für Verbindungen II bis V, VII. 11-epi-l-Dehydro-cortisol und seine 21-Ester.
  • Ferner wurde gefunden, daß man die neuen Verbindungen aus den verschiedensten gesättigten und ungesättigten Pregnanderivaten herstellen kann. Je nach der Natur des verwendeten Ausgangssteroids werden nach der Erfindung eines oder mehrere der folgenden Merkmale in das als Ausgangsmaterial verwendete Pregnanderivat eingeführt a) die 1,2-Doppelbindung, b) die 4,5-Doppelbindung, c) eine 11-Sauerstoffunktion, d) eine 17a-Sauerstoffunktion, e) eine 21-Sauerstoffunktion, f) ein 9a-Halogenatom. Die Methoden, mit denen es gelingt, die obigen Merkmale a) bis e) in das Ausgangssteroid einzuführen, können chemische oder mikrobiologische oder Kombinationen von chemischen und mikrobiologischen Verfahren sein.
  • Ein wesentliches Erfindungsmerkmal ist die Einführung einer 1,2-Doppelbindung in ein Pregnanderivat mit Hilfe dehydrierend wirkender Mikroorganismen. Die nach der Erfindung verwendeten Mikroorganismen besitzen die spezifische Eigenschaft, eine 1,2-Doppelbindung in ein Pregnanderivat einzuführen, ohne dabei gleichzeitig das Pregnan-Kohlenstoff-Skelett anzugreifen (z. B. durch Abspaltung der 17-Seitenkette oder Offnung des D-Ringes). Außerdem sind diese Mikroorganismen fähig, Estergruppen zu hydrolysieren, gewöhnlich in 3- und 21-Stellung; darüber hinaus bewirken sie mit verschiedener Geschwindigkeit und Vollständigkeit die Oxydation von in 3- und/oder 20-Stellung befindlichen Hydroxylgruppen. In besonders hoher Ausbeute führen die dehydrierend wirkenden Mikroorganismen nach der Erfindung die 1,2-Doppelbindung in solche Pregnanderivate ein, die bereits eine Doppelbindung in 4,5- oder 5,6-Stellung besitzen.
  • Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung von Pregnadienen der allzemeinen Formel worin X = O oder H (a oder ß), OH oder H (a oder ß), Acyloxy, R = H oder Acyl und W = H, F, Cl oder Br ist, welches darin besteht, daß man ein im Ring A gesättigtes Pregnanderivat mit Sauerstoffunktionen in 3- und 20-Stellung durch Behandlung mit dehydrierenden Mikroorganismen oder bekannten chemischen Dehydrierungsmitteln in das entsprechende 1,4-Pregnadien überführt und gegebenenfalls in dieses in bekannter Weise eine 11-X- und/oder 17a-OH- und/oder 21-OR-und/oder 9a-`@'-Gruppe einführt und zusätzlich, soweit das Ausgangssteroid außerhalb des Ringes A Doppelbindungen aufweist, diese nach bekannten Methoden in gesättigte Bindungen überführt, oder daß man ein in 1- und/oder 4-Stellung ungesättigtes Steroid der Pregnanreihe in entsprechender Weise behandelt.
  • Zweckmäßigerweise verwendet man als Ausgangsmaterial ein Steroid, welches eine Doppelbindung an zumindest einer, aber nicht mehr als drei der 1-, 4-, 6-, 9(11)- und 16-Stellungen besitzt.
  • Als Ausgangsmaterial verwendbar sind auch solche Pregnanderivate, die bereits in 11- und/oder 17a- und/ oder 21-Stellung eine Sauerstoffunktion besitzen.
  • Die Dehydrierung in 1,2-Stellung kann außer auf mikrobiologischem Wege auch rein chemisch durch Einführung einer Sauerstoffunktion in Stellung 1 oder 2 und nachträgliche Abspaltung dieser Sauerstoffunktion vorgenommen «-erden.
  • Man kann zur Dehydrierung in 1,2- und/oder 4,5-Stellung auch 1 oder 2 Bromatome in den Ring A einführen und im weiteren Verlauf der Synthese die Bromatome in Form von HBr wieder abspalten.
  • Als in 1,2-Stellung dehydrierend wirkende Mikroorganismen kann man z. B. Corynebacterien, wie z. B. Corynebacterium simpler oder Corynebakterium hoagii oder auch Bazillus sphaericus var. fusiformis, verwenden.
  • Eine spezielle Ausführungsform der Erfindung ist beispielsweise die Hydroxylierung von Progesteron in 11-, 17a- und 21-Stellung mit folgender Dehydrierung in 1,2-Stellung.
  • Eine weitere Variante des Verfahrens nach der Erfindung besteht darin, daß ein 16,17-ungesättigtes Pregnadien oder Pregnatrien mit einer Persäure oder mit Wasserstoffperoxyd umgesetzt wird unter Bildung eines 16,17-Oxidoderivates, das anschließend hydrolysiert wird.
  • Zur Herstellung der neuen therapeutisch wirksamen Pregnadienderivate gibt es somit eine Vielzahl möglicher Kombinationen einzelner Verfahrensschritte, von denen einzelne Verfahrensstufen sich an sich bekannter Methoden bedienen. So kann man z. B. Pregnan-11a,17a-21-triol-3,20-dion-21-acetat mit Brom umsetzen, das gebildete 2,4-Dibromid dehydrobromieren und in der erhaltenen 1,4-Pregnadienverbindung die 11a-Hydroxylgruppe zur 11-Ketogruppe oxydieren. (Man erhält auf diese Weise 1-Dehydro-cortison.) Die Einführung eines Fluor-, Chlor- oder Bromatoms in die 9a-Stellung der 1,4-Pregnadiene nach der Erfindung oder der zur Herstellung der letzteren benötigten Zwischenprodukte gelingt z. B. durch Epoxydation eines in 9,11-Stellung ungesättigten Pregnanderivates mit folgender Behandlung mit Halogenwasserstoff, vorzugsweise Fluorwasserstoff, unter Bildung der entsprechenden 9a-Halogen-llß-OH-Verbindung. Die Tatsache, daß Epoxyde immer trans-ständig aufgespalten werden, bedingt, daß bei den nach dem Verfahren der Erfindung erhaltenen Verbindungen die Hydroxylfunktion in 11-Stellung stets ß-ständig ist, sofern sich in der 9a-Stellung ein Halogenatom befindet.
  • Die 1,4-Pregnadienderivate nach der Erfindung zeigen nach klinischem Test eine außerordentlich verbesserte physiologische Wirkung gegenüber den entsprechenden, einfach ungesättigten Verbindungen. Sie besitzen die mehrfache Wirksamkeit der entsprechenden bekannten Hormone, wie Cortison und Hydrocortison, in der Behandlung von rheumatischer Arthritis. Darüber hinaus treten die unerwünschten Nebenwirkungen der bekannten Hormone in verringertem Maße bei Benutzung der neuen Verbindungen auf; die Intensität dieser Nebenwirkungen wird noch weiter dadurch reduziert, daß viel geringere Dosen der neuen Verbindungen im Vergleich zu den entsprechenden, einfach ungesättigten, bekannten Verbindungen angewendet werden können. Sowohl die Anfangsdosen als auch die dauernde Dosierung bei der Behandlung von rheumatischer Arthritis kann stark durch die Verwendung der neuen Substanzen reduziert werden. Selbst bei den verringerten Dosen ist bei den neuen Verbindungen die gleichzeitige Benutzung von Codein oder anderen Analgetika nicht erforderlich, während j a solche Analgetika häufig zusammen mit den bisherbekannten Chemotherapeutika benutzt worden sind.
  • Die therapeutisch wirksamen Diene nach vorliegender Erfindung werden vorzugsweise per os in Form von Tabletten gegeben, die eine ganze Tagesdosis, z. B. 50 mg, oder ein kleineres Vielfaches solcher Dosis, z. B. 25 oder 20 mg oder selbst 10 mg, in Gemisch mit einem festen pharmazeutischen Träger enthalten, der eine oder mehr der üblichen Beimischungen, wie Stärke, Zucker, Gummi, Ton u. ä., enthält. Sie können auch durch intravenöse und intramuskuläre Injektionen gegeben werden, gelöst oder suspendiert in einem geeigneten, nichttoxischen, flüssigen Träger. Oder sie können in fester Form durch subkutane Implantation oder in Form von Zäpfchen gegeben werden, gelöst oder suspendiert in einem Fett- oder Wachsträger, der bei nahezu Körpertemperatur schmilzt. Die neuen 1,4-Pregnadiene können örtlich gegeben werden in der Form einer Salbe oder einer Creme, gelöst in einer Salben- oder Cremegrundlage von bekannter Zusammensetzung.
  • Die Einführung einer zweiten Doppelbindung in einfach ungesättigte Zwischenprodukte mit bekannter therapeutischer Wirksamkeit hat ebenfalls Verbindungen ergeben, deren physiologische Aktivität gegenüber den einfach ungesättigten Verbindungen (wie z. B. Corticosteron und 11-Dehydro-corticosteron) gesteigert ist.
  • Die eingangs kurz geschilderten Verfahren nach der Erfindung werden im folgenden detaillierter erklärt: A.
  • Einführung einer 1,2-Doppelbindung mit einer Kultur eines dehydrierenden Mikroorganismus Ein wesentlicher Kern der Erfindung ist die mikrobiologische Einführung einer 1,2-Doppelbindung in ein vorzugsweise bereits ungesättigtes Pregnenderivat durch Inkubation oder Fermentation des Ausgangssteroids mit einem Kulturmedium, das einen dehydrierenden Mikroorganismus enthält, der die Ausgangsverbindung nicht gleichzeitig angreift oder spaltet. Geeignete Mikroorganismen dieses Typs gehören zur Familie Corynebacteriaceae, wobei die Spezies Corynebacterium simpler (amerikanische Kultur Typensammlung 6946) und Corynebacterium hoagii (ATCC 7005) sehr befriedigende Ergebnisse geliefert haben. Das erste dieser Bakterien ist ein Bodenbakterium, während das zweite in der menschlichen Kehle gefunden wird (wo es offenbar keine pathologischen Verhältnisse bewirkt) und manchmal als Bestandteil von der Luft ausgesetzten Kulturen. (Sein wirklicher und ihm gemäßer Aufenthalt ist nicht bekannt.) Die Ausgangsverbindungen können Hydroxyl-, Keto-, Halogen- und Estergruppen in verschiedener Stellung von Kern oder Seitenkette besitzen. So können Hydroxylgruppen in einer oder mehreren der 3-, 11-, 17-, 20- und 21-Stellungen vorliegen. Ketogruppen können eine oder mehrere der 3-, 11- und 20-Stellung einnehmen, während Halogen, wie Fluor oder Brom, am 9-Kohlenstoff oder an anderen Stellen des Kernes oder der Seitenkette stehen können. Die Gegenwart einer freien Hydroxylgruppe beschleunigt offenbar die chemische Umwandlung. Estergruppen von großer Verschiedenheit und vorzugsweise die Ester der Säuren, die gewöhnlich bei Steroidsynthesen und besonders bei der Herstellung von Steroidhormonen für therapeutische Zwecke angewandt werden, insbesondere die der niedrigen Alkansäuren, wie das Acetat, können in einer oder mehreren der 3-, 11-, 17-, 20- und 21-Stellungen stehen. Der spezielle Charakter der Ester ist bei dem Verfahren der Erfindung nicht entscheidend, sondern es können auch andere Ester organischer und anorganischer Säuren benutzt werden, wie z. B. Cyclopentyl- und Cyclohexylacetate, Propionate, Butyrate, Phosphate, Polyphosphate und Sulfate. Es ist nur notwendig, daß die Ester gegenüber dem Mikroorganismus nicht toxisch sind. Die hydroxylierten Produkte des erfindungsgemäßen Verfahrens können gegebenenfalls nach bekannten Verfahren in die entsprechenden Ester umgewandelt werden, beispielsweise in die niederen Acyl- und insbesondere in die Essigsäureester. Die Hydroxylgruppen in den 3- und 11-Stellungen können a- oder ß-ständig sein. Wie im nachfolgenden beschrieben, kann besonders der Ester in 21-Stellung einen solchen Säurerest enthalten, der die Dauer der therapeutischen Wirksamkeit der Verbindungen verlängert.
  • Bei Benutzung eines dehydrierenden Mikroorganismus nach der Erfindung kann man beispielsweise folgende Umwandlungen erreichen 4-Pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion (Cortison) in 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion (1-Dehydro-cortison) ; 4-Pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion (Hydrocortison oder Cortisol) in 1,4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion (1-Dehydro-cortisol) ; 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion (Reichsteins-Substanz-S) in 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dionund 1,4-Pregnadien-17a,20ß,21-triol-3-on; 5-Pregnen-3ß,20-diol in 1,4-Pregnadien-3,20-dion; 4-Pregnen-llß,21-diol-3,20-dion (Corticosteron) in 1,4-Pregnadien-11ß,21-diol-3,20-dion ; 4-Pregnen-21-ol-3,20-dion (Desoxycorticosteron) in 1,4-Pregnadien-21-ol-3,20-dion; 4 - Pregnen - 21- o1 - 3,11,20 - trion (Kendalls Verbindung A) in 1,4-Pregnadien-21-ol-3,11,20-trion; 9a-Fluor-4-pregnen-llß,17a,21-triol-3,20-dion (Fluorverbindung F) in 9a-Fluor-1,4-pregnadienl lß,17a,21-triol-3,20-dion; 5-Pregnen-3ß,17a,21-triol-20-on-3,21-diacetat in 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion und 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat; 4-Pregnen-20-ol-3-on in 1,4-Pregnadien-3,20-dion; 5-Pregnen-3,17a,20,21-tetrol-11-on und seine 3- und/ oder 21-Ester in 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion und seine 21-Ester; 5-Pregnen-3,11a,17a,20,21-pentol und seine 3- und/ oder 21-Ester in 1,4-Pregnadien-11a,17a,21-triol-3,20-dion und seine 21-Ester.
  • An Stelle der 3-Keto -Ausgangsverbindungen können die entsprechenden 3-Hydroxyverbindungen und ihre 3-Ester benutzt werden, wie 5-Pregnen-3,11ß,17a,21-tetrol-20-on und 5-Pregnen-3,17a,21-triol-11,20-dion und ihre 3-Acetate oder 3,21-Diacetate, um die gleichen 3-Keto-1,4-dien-Endprodukte herzustellen, wobei die 3-Estergruppe hydrolysiert wird und die gebildete 3-Hydroxylgruppe zum Ketonsauerstoff oxydiert wird. Estergruppen in den 11- und 17-Stellungen werden im allgemeinen nicht hydrolysiert, zum mindesten nicht in bedeutendem Umfang, während eine Estergruppe in der 21-Stellung je nach den Reaktionsbedingungen hydrolysiert oder nicht hydrolysiert werden kann. Wenn daher die Ausgangsverbindung ein 3,21-Diester ist, kann das Reaktionsprodukt eine 3-Keto-21-esterverbindung oder eine 3-Keto-21-hydroxyverbindung sein. Ein 20-Hydroxyl wird häufig zusammen mit 3-Hydroxyl zu einer Ketogruppe oxydiert. Es ist daraus ersichtlich, daß die dehydrierenden Mikroorganismen nach vorliegender Erfindung praktisch nur in 3- und 20-Stellung oxydierend wirken; im Gegensatz dazu kann die Hydrolyse auf die 3-Estergruppen beschränkt werden.
  • Das Verfahren nach der Erfindung ist auch auf lla-Hydroxyepimere der obenerwähnten 11ß-Hydroxysteroide anwendbar, wie z. B. auf 4-Pregnen-11a,17a,21-triol-3,20-dion, 4-Pregnen-11a,17a,20,21-tetrol-3-on, 5 - Pregnen - 3,11a,17a,21- tetrol - 20 - on, 5 - Pregnen-3,11a,17a,20,21-pentol und ihre Mono- und Polyester, wie z. B. die 3-Acetate, 3,21-Diacetate und 3,17a,21-Triacetate, wobei aus diesen Ausgangsprodukten 1,4-Pregnadien-11a,17a,21-triol-3,20-dion oder deren Ester entstehen. Das lla-Epimere von 1-Dehydro-cortisol sowie dessen Ester können in 1-Dehydro-cortison und dessen Ester durch Oxydation der 11a-Hydroxylgruppe in bekannter Weise umgewandelt werden, z. B. mit Chromsäure (mit oder ohne Pyridin oder Essigsäure und bei Zimmertemperatur oder darunter [5 bis 15°C]), vorzugsweise nachdem gegebenenfalls die 21-Hydroxylgruppe verestert worden ist. Die 11a-Hydroxy-Ausgangsverbindungen können relativ leicht in hoher Ausbeute erhalten werden, wie aus der Literatur bekannt ist, und stellen daher erwünschte Ausgangsprodukte zur Herstellung des 1-Dehydro-cortisons und des 1-Dehydrocortisols dar.
  • Zusätzlich umfassen die Umwandlungen, die mit den dehydrierenden Mikroorganismen durchgeführt werden können, die Überführung von 5-Pregnen-3,17a,21-triol-20-on-3,21-diacetat in eine Mischung von 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dionund4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat. Durch Änderung des Fermentationsmediums kann aus Reichsteins-Substanz-S nicht nur 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion, sondern auch 1,4-Pregnadien-17a,20ß,21-triol-3-on hergestellt werden. (Die 20-Ketogruppe wird reduziert.) Wie bereits angegeben, können die Mikroorganismen auch die Oxydation einer 20sekundären Hydroxylgruppe bewirken, z. B. bei der Umwandlung von 5-Pregnen-3,20-diol in 1,4-Pregnadien-3,20-dion.
  • Das Verfahren nach der Erfindung ist auch auf 9a-Fluor-, 9a-Chlor- und 9a-Bromsteroide anwendbar. Verschiedene diesbezügliche Umwandlungen sind durch die Gleichungen (1), (2) und (3) des Formelschemas I dargestellt.
  • Um das Wachsen der dehydrierenden Mikroorganismen wie Corynebacterium simplex und C. hoagii zu erreichen, wird ein Nährmedium verwendet, das Kohlenhydrat, organischen Stickstoff, natürliche Wachstumsfaktoren und anorganische Salze enthält. Es ist möglich, das Kohlenhydrat wegzulassen, ohne daß das Wachstum des Organismus beeinträchtigt wird. Nach Kultivierung des Mikroorganismus im Nährmedium kann die Zellmasse durch Zentrifugierung der Nährbrühe gesammelt werden, die darüber befindliche Flüssigkeit dekantiert und die Zellmasse in einer Salzlösung suspendiert werden. Ein bestimmtes Volumen der Zensuspension wird dann in einem geeigneten Nährmedium zur Unterstützung des Wachstums des Mikroorganismus ausgesät. Das benutzte Nährmedium kann ein Hefeextrakt (bekannt unter dem Handelsnamen »Difco«), Kaseinhydrolysat (bekannt unter dem Handelsnamen »N-Z-Anvn, Typ B Sheffield;), Kornkeimflüssigkeit, ein Wasserextrakt von Sojabohnenmehl-Öl, Lactalbuminhydrolysat (bekannt unter dem Handelsnamen vEdamine-Sheffield Enzymatic,. ), Fischlösungen u. ä. sein.
  • Die Steroidverbindung wird unter sterilen Bedingungen fest, gelöst oder in Äthanol, Aceton oder anderen mit Wasser mischbaren physiologisch unbedenklichen Lösungsmitteln suspendiert zu dem kultivierten Mikroorganismus in der Nährbrühe gegeben. Diese Kultur wird dann geschüttelt, belüftet oder gleichzeitig belüftet und gerührt, um das Wachstum des Mikroorganismus und die biochemische Umwandlung des Steroidsubstrates zu beschleunigen. Das Steroid kann der Nährbrühe zugegeben werden und dann mit dem Bakterium geimpft werden, oder der kultivierte :Mikroorganismus kann dem Steroid in der Nährbrühe zugesetzt werden. In gewissen Fällen kann es günstiger sein, vor dem Zusatz des Steroids das maximale Wachstum des Mikroorganismus zu erreichen. Wahlweise können auch in bekannter Weise erhaltene Enzympräparate aus Kulturen der Mikroorganismen benutzt werden.
  • Die Benutzung anorganischer Salze ist erwünscht, um in dem Reaktionsmedium einen pH-Wert zwischen 6,8 und 7,2 aufrechtzuerhalten, sie kann aber auch unterbleiben. Wenn anorganische Salze fortgelassen werden, steigt der p11-Wert von einem anfänglichen Wert von 6,8 auf etwa 7,7 bis 8, wobei jedoch noch die Bildung der Endprodukte nach der Erfindung möglich ist. Die optimale Temperatur für das Wachstum der Mikroorganismen ist 37'C. Gegebenenfalls können die Temperaturen zwischen 25 und 37'C und sogar zwischen 20 und 40'C variieren. Die Reaktionszeit kann von 3 bis 48 Stunden variieren, je nachdem, welches Steroid umgesetzt werden soll. Jedes mit '\V asser mischbare Lösungsmittel, das für den Organismus nicht toxisch ist, kann zur Lösung oder Suspendierung der 1,4-Pregnadienverbindungen nach der Erfindung benutzt werden. Die Anwendung von Äthanol oder Aceton wird in solchen Mengen bevorzugt, daß die Endkonzentration dieser Lösungsmittel in der Reaktionsmischung nicht mehr als etwa 7 °'° beträgt.
  • Im Verlauf des Oxydations- oder Dehydrierungsprozesses, der von teilweiser oder vollständiger Hydrolyse begleitet werden kann, können die Reaktionsprodukte aus der Mischung durch Extraktion mit einem geeigneten, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, durch Filtration, durch Adsorption an einem geeigneten Adsorptionsmittel oder durch beliebige andere, allgemein benutzte Prozesse gewonnen werden. Zur Extraktion sind chlorierte, niedere Kohlenwasserstoffe, Ketone und Alkohole geeignet, wie z. B. Chloroform, Methylenchlorid, Tricbloräthan, Äthylendichlorid, Butanol, Diäthylketon. Zur Isolierung der Steroidprodukte eignet sich vorzugsweise die Extraktion. Im Anschluß an diese können die Produkte durch Einengen der Extrakte, gegebenenfalls bis zur Trockne, isoliert werden. Die Reinigung der Rückstände kann durch Umkristallisation aus einem Lösungsmittel oder einer Lösungsmittelmischung, wie Aceton, Methylenchlorid, Äthanol, Aceton-Hexan, lIethylenchlorid-Hexan usw., durchgeführt werden, wobei die erwünschten 1,4-Pregnadienderivate in ausgezeichneter Ausbeute und hohem Reinheitsgrad gewonnen werden.
  • Die chemischen Umwandlungen, die durch die deliydrierenden -Mikroorganismen auf die verschiedenen Pregnene bewirkt werden, sind somit von sehr verschiedener Art und können einzeln, gleichzeitig oder hintereinander erfolgen. Die Reaktionen werden offenbar durch andere Substituenten im Steroidkern oder in der Seitenkette nicht beeinflußt. Aus dem Vorhergehenden ist ersichtlich, daß es nicht wesentlich ist, daß das Ausgangsprodukt eine Doppelbindung in der 4-Stellung des A-Ringes hat. Es kann auch eine Doppelbindung in 5-Stellung besitzen. Das Ausgangsprodukt kann auch mehr als eine Doppelbindung besitzen. So können 4,6-Pregnadiene dehydriert bzw. anderweitig, wie oben beschrieben, umgewandelt werden unter Bildung von 1,4,6-Pregnatrienen, die leicht nach üblichen Methoden zu 1,4-Pregnadienen reduziert werden können. Beispielsweise kann 4,6-Pregnadien-17a,21-diol-3,11-,20-trion-21-acetat in 1,4,6-Pregnatrien-17a,21-diol-3,11,20-trion oder seine 21-Ester umgewandelt werden. Die entsprechenden lla-oder 11ß-Hydroxylverbindungen können in ähnlicher Weise in die 1,4,6-Triene umgewandelt werden. Die Triene können nach an sich bekannten Methoden zu 1-Dehydro-cortison oder 1-Dehydro-cortisol oder analogen Verbindungen reduziert werden. Die Ausgangsverbindung kann auch eine Doppelbindung in der 16-Stellung oder in der 9(11)-Stellung besitzen.
  • Die obenerwähnten Fischlösungen sind als Extrakt von Hering, Maifisch und als Mischungen, die einer enzymatischen Hydrolyse unterworfen wurden, im Handel verfügbar. Dieses Material kann der Kulturbrühe direkt als Nährmaterial zugeführt werden. Fischlösungen (5007, Gehalt an Feststoffen), die keiner enzymatischen Hydrolyse unterworfen wurden, werden mit Wasser verdünnt, etwa 10 Minuten bei 90°C gedämpft und anschließend filtriert.
  • Ein weiteres Beispiel eines dehydrierenden Mikroorganismus, dernach derErfindung die oben beschriebenen Reaktionen durchführt, ist Bacillus sphaericus var. fusiformis (amerikanische Typenkultur-Sammlung 7055), der ebenfalls eine Doppelbindung in den A-Ring einführt, ohne die 17-Seitenkette anzugreifen oder den D-Ring aufzuspalten. Die entstehenden, im A-Ring ungesättigten Steroide sind in einer Kultur dieses Mikroorganismus sehr stabil, und es sind keine speziellen Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, um eine Zersetzung der gebildeten Endprodukte zu verhindern. Die Inkubationszeit kann 96 Stunden betragen. Die Ausbeuten sind hoch und häufig fast quantitativ.
  • Wie bei den anderen, obengenannten dehydrierenden Mikroorganismen können an Stelle einer wachsenden Kultur von B. sphaericus var. fusiformis die abgetrennten Enzyme oder der enzymatische Extrakt einer solchen Kultur benutzt werden. Die Ausgangssteroide können in gleicher Weise sehr verschieden sein, aber vorzugsweise wird Ausgangsmaterial benutzt, das eine Doppelbindung entweder am C-4- oder C-5-Atom besitzt.
  • Im allgemeinen bewirkt B. sphaericusv ar. fusiformisdie gleiche chemische Umwandlung in den genannten Steroidverbindungen wie die Corynebacterien, außer daß es eine 3-Estergruppe nicht so schnell und in einigen Fällen überhaupt nicht hydrolysiert; es ist daher zweckmäßig, daß mit diesem Organismus 3-Keto- und 3-Hy droxysteroide und nicht die entsprechenden 3-Ester verarbeitet werden. Die Steroidsubstrate können Kerndoppelbindungen zusätzlich zu der am C-4- oder C-5-Atom besitzen, und solche zusätzlichen Doppelbindungen können mit Halogen oder Halogenwasserstoff oder durch Bildung von Addukten mit Dienophilen wie Maleinsäure und Maleinsäureanhydrid gesättigt werden.
  • Die Art der Kultivierung von B.sphaericus var. fusiformis und die Methode des Inokulierens des \Tährmediums, die Natur des Nährmediums, die Art des Zusammenbringens von Steroidsubstrat mit der wachsenden Kultur des Mikroorganismus kann die gleiche sein wie bei der Corynebacteriumspezies, außer daß die Inkubationszeit länger sein kann und im allgemeinen etwa 24 bis 96 Stunden beträgt. In allen Fällen empfiehlt es sich, die Steroid enthaltende Kultur zu rühren und zu belüften.
  • Zusätzlich zu den oben angegebenen Nährmedien können auch Protopeptone benutzt werden. Das Wachstum des Mikroorganismus wird vorzugsweise bei einem p$ von etwa 6,6 bis 7,2 in Gang gesetzt. Die optimalen Temperaturen für das Wachstum des B. sphaericus var. fusiformis sind etwa 28°C, aber die Temperatur kann zwischen 19 und 32°C variieren.
  • Die Steroidendprodukte werden vorzugsweise durch Extraktion mit den Lösungsmitteln und in der oben beschriebenen Weise gewonnen; jedoch kann jede andere geeignete, dem Chemiker bekannte Methode angewendet werden.
  • An Stelle der oben beschriebenen dehydrierenden Mikroorganismen können auch ihre Mutanten benutzt benutzt werden.
  • B. Kombination der mikrobiologischen 1,2-Dehydrierung mit 11- und 21-Hydroxylierung und 11-Oxydation Die Dehydrierung des A-Ringes mit Hilfe der dehydrierenden Mikroorganismen kann kombiniert «.erden mit anderen mikrobiologischen Umwandlungen, die im einzelnen allgemein bekannt sind, und mit einem chemischen Oxydationsschritt, der z. B. durchgeführt werden kann, um ein 17a-Hydroxy-progesteron oder 5-Pregnen-3,17a-diol-20-on in 1-Dehydro-cortison oder 1-Dehydro-cortisolumzuwandeln. DieOperationen können in verschiedener Reihenfolge angewandt werden mit der Einschränkung, daB der chemische Oxydationsschritt auf die mikrobiologische 11-Hydroxylierung folgen muB. Die mikrobiologischen Prozesse gliedern sich in drei Typen (1) Einführung einer 1,2-Doppelbindung unter gleichzeitiger Oxydation eines 3-Hydroxyls durch Einwirkung eines dehydrierenden Mikroorganismus unter Bildung des 3-Keto-1,4-pregnadiensystems. (2) Einführung einer 11a- oder einer 11ß-Hydroxylgruppe durch die Einwirkung eines 11-hydroxylierenden Mikroorganismus, z. B. des Rhizopus-nigricans- oder Curvularia-lunata-Typs.
  • (3) Einführung einer 21-Hydroxylgruppe durch Einwirkung eines Mikroorganismus der Art Ophiobolus. Die Reihenfolge dieser drei mikrobiologischen Umwandlungen kann abgewandelt werden und z. B. sein: (1), (2), (3); (2), (1), (3); (1), (3), (2) oder (3), (1), (2). Wenn z. B. 1-Dehydro-cortison hergestellt werden soll, wird zunächst nach Einführung der 11a-Hydroxylgruppe das gebildete Zwischenprodukt oxydiert, z. B. mit Chromsäure in Pyridin unter Bildung der 11-Ketogruppe.
  • Die Einführung eines 11a-Hydroxyls wird vorzugsweise durch die Einwirkung einer Kultur (oder des abgetrennten enzymatischen Materials) von Rhizopus nicricans durchgeführt in der Weise, wie in der USA.-Patentschrift 2 602 769 beschrieben; die Einführung einer 11ß-Hydroxylgruppe wird vorzugsweise mit einer Kultur (oder dem abgetrennten enzymatischen Material einer Kultur) von Curvularia lunata, wie in der USA.-Patentschrift 2 658 023 beschrieben, durchgeführt. Jedoch können auch andere 11a-hydroxyherende Organismen, wie z. B. Aspergillus niger, Rhizopus arrhizus u. ä., benutzt werden. Auch können andere ß-hydroxylierende Mikroorganismen, wie z. B. Cunninghamella blakesleeana u. ä., benutzt werden.
  • Die 21-Hydroxylgruppe wird in das Steroidmolekül durch einen hydroxylierenden Organismus der Art Ophiobolus, vorzugsweise 0. herbotrichus, in der Weise eingeführt, wie von Meystre und Mitarbeiter in Helvetica Chimica Acta, Bd. 37 (1954), S. 1548, beschrieben.
  • Die 1,2-Doppelbindungkann durcheinendehydrierenden Organismus in das Ausgangsmaterial oder in irgendeine der anfallenden Zwischenverbindungen eingeführt werden.
  • Die verschiedenen Reaktionen können durch die folgenden Gleichungen dargestellt werden:
    Weg A
    1,4-Pregnadien- 1,4-Pregnadien-
    17a-Hydroxyprogesteron 11a,17a-diol-3,20-dion 11a,17a,21-triol-3,20-dion
    Ie IIIC VIIa
    1 4-Pregnadien- 1,4-Pregnadien- 1,4-Pregnadien-
    17a-ol-3,20-dion - 17a-ol-3,11,20-trion 17a,21-diol-3,11-20-trion
    IIC Vc Ha,
    T T T
    5-Pregnen- 1,4-Pregnadien- 1,4-Pregnadien-
    3,17a-diol-20-on 11ß,17a-diol-3,20-dion @@ 11ß,17a,21-triol-3,20-dion
    I'c IVc IIIa
    Weg B
    4-Pregnen-11a,17a-diol-3,20-dion 3, IIIC VIIa
    VIc
    I c - 4-Pregnen-17a-ol-3,11-20-trion --D V c --3- 1I a
    VIII c
    T
    4-Pregnen-11ß,17a-diol-3,20-dion > IVc D, IIIa
    VIIc
    In der ersten Reaktionsfolge (Weg A) wird 17a-Hydroxy-progesteron (I c) oder 5-Pregnen-3,17a-diol-20-on (I'c) durch die Einwirkung von Corynebacterium simplex oder C. hoagii direkt in 1,4-Pregnadien-17a-ol-3,20-dion (11c) übergeführt. Durch die Hydroxylierung von IIc mit Rhizopus nigricans (in der in der USA.-Patentschrift 2 602 769 beschriebenen Weise) wird Verbindung III c erhalten. Andererseits entsteht durch Hydroxylierung von IIc mit Curvularia lunata (nach dem in der USA.-Patentschrift 2 658 023 angegebenen Verfahren) Verbindung IVc.
  • Auch andere 11a-hydroxylierende Organismen, wie z. B. Aspergillus niger, Rhizopus arrhizus, wandeln IIc in III c um. Für die Überführung von 1I c in IV c können weitere llß-hydrox-ylierende Organismen, wie z. B. Cunninghamella blakesleeana, benutzt werden. IIIc bzw. IV e kann zu V c und VII a bzw. III a kann zu Il a durch Einwirkung eines milden Oxydationsmittels, wie z. B. Pyridin-Chromsäure, oxydiert werden. Vorzugsweise verwendet man die 21-Acylate, z. B. 21-Acetate von IIIc, IV c, VII a und III a. Durch Kochen mit alkoholischem Kaliumcarbonat können die 21-Estergruppen anschließend verseift werden.
  • Die Hydroxylierung von III c, IV c oderV c in 21-Stellung kann z. B. mit Ophiobolus herbotrichus durchgeführt werden, wobei VII a, III a oder II a (s. Formelschema I) entstehen.
  • Nach Weg B wird erst 11-hydroxyliert und dann oxydiert. Man erhält so die neuen Zwischenprodukte VIc, VIIc und VIIIc. Die Endprodukte sind die gleichen wie bei Weg A. Kombination der mikrobiologischen 1,2-Dehydrierung mit einer 11- und 17a-Hydroxylierung Die bevorzugten Endprodukte, insbesondere 1-Dehydrocortison und 1-Dehydro-cortisol und deren Ester, können z. B. aus Desoxy-corticosteron oder aus 5-Pregnan-3,21-diol-20-on und deren Estern durch Kombination der mikrobiologischen 1,2-Dehydrierung mit einer 11- und 17a-Hydroxylierung erhalten werden. Die mikrobiologischen Umwandlungen sind die folgenden (1) Einführung einer 1,2-Doppelbindung bei gleichzeitiger Oxydation eines 3-Hydroxyls bzw. bei gleichzeitiger Hydrolyse eines 3-Esters und anschließender Oxydation des entstandenen 3-Hydroxyls durch Einwirkung eines dehydrierenden Mikroorganismus.
  • (2) Einführung einer 11a- oder llß-Hydroxylgruppe durch Behandlung mit einem Organismus z. B. des Typs Rhizopus nigricans oder Curvularia lunata.
  • (3) Einführung einer 17a-Hydroxylgrnppe durch Einwirkung einer Kultur eines hydroxylierenden Mikroorganismus z. B. aus der Art Trichothecium.
  • Die Reihenfolge dieser drei mikrobiologischen Umwandlungen kann folgendermaßen sein: (1), (2), (3) oder (2), (1), (3) oder (1), (3), (2) oder (3), (1), (2). Falls 1-Dehydro-cortison oder dessen Ester hergestellt werden sollen, wird in irgendeiner Stufe nach Einführung der 11-Hydroxylgruppe das Zwischenprodukt oxydiert, vorzugsweise in der Form seines 21-Esters z. B. mit Chromtrioxyd bei niederen Temperaturen. Diese Oxydation einer 11-Hydroxylgruppe zur 11-Ketogruppe führt man zweckmäßigerweise nur dann durch, wenn die 11-Hydroxylgruppe a-Konfiguration hat, da die ß-Konfiguration die therapeutisch wirksame Form darstellt.
  • Die 17a-Hydroxylgruppe wird in der Weise und mit der Apparatur eingeführt, wie von Meystre und Mitarbeiter beschrieben in Helvetica Chimica Acta, Bd. 37 (1954), S.1548. Ein geeigneter Organismus für diese 17a-Hydroxylierung ist z. B. Trichothecium roseum.
  • Nach erfolgter Dehydrierung des Ringes A, die von einer Hydrolyse begleitet sein kann (wenn Mono- oder Polyester benutzt werden), können die Reaktionsprodukte durch Extraktion, Filtration, Adsorption oder jede andere bekannte Arbeitsweise aus der Mischung gewonnen werden. Gegebenenfalls können die Endprodukte nach bekannten Verfahren in ihre Ester umgewandelt werden, z. B. in ihre niedern Alkan- und insbesondere in ihre Essigsäureester.
  • Das folgende Schema erläutert die verschiedenen Reaktionsfolgen
    Weg C
    1,4-Pregnadien- 1,4-Pregnadien-
    4-Pregnen-21-ol-3,20-dion 11a-,21-diol-3,20-dion 11a,17a,21-triol-3,20-dion
    Id IIId VIIa
    y y
    1,4-Pregnadien- 1,4-Pregnadien- 1,4-Pregnadien-
    21-ol-3,20-dion - 21-ol-3,11,20-trion 17a,21-diol-3,11,20-trion
    IId Vd Ha
    T T T
    1,4-Pregnadien- 1,4-Pregnadien-
    5-Pregnen-3,21-diol-20-on llß-,21-diol-3,20-dion 11ß,17a,21-triol-3,20-dion
    I'd IVd IIIa
    4-Pregnen-11a,21-diol-3,20-dion IIId -@ VIIa
    VId
    y
    I d - 4-Pregnen-21-ol-3,11-20-trion > V d > Ha
    VIIId
    T
    4-Pregnen-l lß,21-diol-3,20-dion > IV d D, III a
    VIId
    Im obigen Schema wurden aus Gründen der Einfachheit die Verbindungen III d, IV d, VI d, VII d, III a und VII a als freie 21-Alkohole angegeben. In der Praxis ist es jedoch vorteilhaft, die 21-OH-Gruppe vor der Oxydation z. B. mit einem niederen alkanoylierenden Agens zu verestern. Die Estergruppe wird dann später wieder hydrolysiert. Bei den Verbindungen VId und VIId kann die Hydrolyse gleichzeitig mit der Einführung der 1,2-Doppelbindung durch Corynebacterium oder einen anderen dehydrierenden Mikroorganismus erzielt werden.
  • In der ersten Folge wird Desoxy-corticosteron (Id) durch Behandlung mit Corynebacterium simpler in 1,4-Pregnadien-21-ol-3,20-dion übergeführt (IId), das auch durch analoge Behandlung von 5-Pregnen-3,21-diol-20-on (I'd) gebildet wird. Die Hydroxylierung von II d durch Rhizopus nigricans liefert III d, während die Hydroxylierung von IId mit Curvularia iunata IVd liefert. Diese Hydroxylierungsprozesse sind leicht durchführbar.
  • Andere 11a- bzw. l lß-hydroxylierende Organismen, wie z. B. Aspergillus niger, Rhizopus arrhizus usw. (11a) oder Cunninghamella blakesleeana (11ß), bewirken die gleichen Umwandlungen. IIId oder IVd oder vorzugsweise ihre 21-Acetate können zu V d oder seinen entsprechenden Estern durch Behandlung mit einem milden Oxydationsmittel, wie z. B. Pyridin-Chromsäure, oxydiert werden.
  • Die 17a-Hydroxylierung von III d, IV d oder V d, z. B. mit Trichothecium roseum durchgeführt, liefert VIIa, IIIa oder IIa. Sowohl VIIa als auch IIIa (oder vorzugsweise ihre 21-Acetate) können durch milde Oxydation (Pyridin-Chromsäure) in II a umgewandelt werden.
  • Nach der zweiten Reaktionsfolge wird I d zunächst 11-hydroxyliert und dann im A-Ring dehydriert, wobei drei neue Zwischenprodukte (VId, VIId und VIIId) entstehen, während die erhaltenen Endprodukte die gleichen sind. Verwendung eines 16,17-ungesättigten Pregnenderivats als Ausgangsmaterial Nach der Erfindung ist es möglich, ein 16,17-ungesättigtes Pregnenderivat als Ausgangsmaterial zu verwenden. Zum Beispiel kann man das relativ billige 16-Dehydro-pregnenolon (I e) und dessen Ester oder 16-Dehydro-progesteron (IIIe) in 1-Dehydro-cortisol und 1-Dehydro-cortison und deren Ester umwandeln. Die notwendigen Operationen sind die folgenden: (a) Umwandlung des 3-Hydroxy-5-pregnensystems in das 3-Keto-4-pregnensystem bei Verwendung von 16-Dehydro-pregnenolon.
  • (b) Einführung eines 17a-Hydroxyls über das 16,17-Epoxyd.
  • (c) Einführung einer 21-Hydroxylgruppe durch Einwirkung eines :Mikroorganismus der Art Ophiobolus, beispielsweise 0. herbotrichus.
  • (d) Einführung einer 11a- oder llß-Hydroxylgruppe durch Einwirkung eines 11-hydroxylierenden Mikroorganismus, wie oben beschrieben, und (e) Einführung der 1,2-Doppelbindung mit Hilfe von Corynebacterium simpler oder anderen analog dehydrierenden Mikroorganismen. Die Oxydation der 3-Hydroxylgruppe des 16-Dehydro-pregnenolons (Ie) kann nach der Oppenauer-Reaktion oder durch Oxydation mit Chromsäure (etwa bei Zimmertemperatur) durchgeführt werden. Es ist vorteilhaft, diese Oxydation gleichzeitig mit der Einführung der 1,2-Doppelbindung durch Behandlung mit einer Kultur eines dehydrierenden Mikroorganismus oder mit einem enzymatischen Extrakt solcher Kultur durchzuführen, wie es im vorangegangenen ausführlicher beschrieben wurde; jedoch sollte auf diese Behandlung die Einführung einer Hydroxylgruppe in einer oder mehreren der 11-, 17- und 21-Stellung folgen, da sonst die Ausbeuten gering sind. Falls erwünscht, können Ester des 16-Dehydro-pregnenolons als Ausgangsmaterial benutzt werden. Die Einführung der 17a-Hydroxylgruppe kann auch durch Behandlung mit einer Persäure (z. B. Monoperphthalsäure oder Benzopersäure) durchgeführt werden, wobei das 16,17-Epoxyd als Zwischenprodukt entsteht. Das letztere wird dann z. B. der Einwirkung von jod`vasserstoff-Eisessig-Essigsäureanhydrid unterworfen, wobei die 16-Jod-17a-Hydroxyverbindung entsteht. Das Jodatom kann durch Kochen der Verbindung in einem niederen aliphatischen Alkohol (z. B. Äthanol), der eine geringe Menge einer organischen Säure, wie z. B. Essigsäure, enthält und in Gegenwart von Raneynickel entfernt werden.
  • Die21-Hydroxylgruppewirdin derbereitsbeschriebenen Weise durch Behandlung der 21-Methylverbindung mit einer Kultur der Art Ophiobolus geführt; die Einführung der 11a- oder 11ß-Hydroxylgruppe wird, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die llß-Hydroxylgruppe kann auch in 1,16- und 1,4-Pregnadiene sowie 1,4,16-Pregnatriene eingeführt werden; in 1,4-Pregnadiene kann auch das 11a-Hydroxyl eingeführt werden, ohne daß eine der Doppelbindungen angegriffen wird.
  • Die Einführung der 1,2-Doppelbindung erfolgt ebenfalls, wie oben beschrieben, vorzugsweise nach der Hydroxylierungsreaktion. Die 1,2-dehydrierenden Mikroorganismen sind fähig, eine 1,2-Doppelbindung auch in solche Steroide einzuführen, die bereits Doppelbindungen am C-16-Atom und am C-S-Atom besitzen. Bei der gleichzeitig erfolgenden Oxydation einer 3-Hydroxylgruppe verschiebt sich eine in 5,6-Stellung vorhandene Doppelbindung in die 4,5-Stellung. Unter gewissen Bedingungen kann eine Oxydation einer 20-Hydroxylgruppe zu einer 20-Ketogruppe erfolgen.
  • Falls 1-Dehydro-cortison hergestellt werden soll, ist es zweckmäßig, eine 11a-OH-Gruppe einzuführen, da diese im allgemeinen leichter eingeführt und zur 11-Ketogruppe oxydiert werden kann.
  • Die Zwischenprodukte haben die Formeln VIII und IX (Formelschema II). In diesen Formeln ist X = H,H oder 0 oder H, OH (a oder ß), während R an Stelle von H, OH oder OAcyl steht, wobei die Acylgruppe den Rest einer organischen Carbonsäure bedeutet, wie z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure oder Capronsäure. Aber auch andere Säuren, wie z. B. substituierte Alkan- und aromatische Säure, wie Cyclohexylessigsäure, Cyclopentyl-propionsäure und Benzoesäure, sind verwendbar.
  • Verbindungen, in denen X Hydroxyl und R eine Acylgruppe darstellt, werden hergestellt durch 21-Veresterung von 16,17-Oxido-1,4-pregnadien-11,21-diol-3,20-dion und folgende Aufspaltung des Oxidorings mit H J oder HBr unter Bildung des entsprechenden Halogenhydrins, das anschließend mit Raneynickel oder mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladiumkohle vom Halogen befreit wird.
  • Das folgende Schema zeigt die wichtigsten Reaktionen dieses Syntheseweges
    Weg D
    Xe
    5-Pregnen-
    3,11,17a,21-tetrol-20-on T
    XIIIe IXe
    T T
    16,17-Oxido-5-pregnen- 16,17-Oxido-4-pregnen-
    3,11,21-triol-20-on 11,21-diol-3,20-dion
    XII e XV e
    T T
    16,17-Oxido-5-pregnen- 16,17-Oxido-4-pregnen-
    3,11-diol-20-on 11-ol-3,20-dion
    XI e XIV e
    T T
    16-Dehydro-pregnenolon 16,17-Oxido-5-pregnen- > 16,17-Oxido-4-pregnen- 17a-Hydroxy-
    - 3-ol-20-on 3,20-dion progesteron
    Ie He IVe VIIe
    y
    16-Dehydro-progesteron - 16,17-Oxido-1,4-pregna-
    dien-3,20-dion
    IIIe VIe
    16,17-Oxido-1,4-pregna- 1,4-Pregnadien-
    dien-21-ol-3,20-dion 17a,21-diol-3,20-dion
    y
    1-Dehydro-cortison -E 1,4-Pregnadien- 4-Pregnen- 4-Pregnen-
    11,17a-21-triol-3,20-dion 11,17a,21-triol-3,20-dion 17a,21-diol-3,20-dion
    IIa Xe Ixe VIIIe
    Die meisten dieser Reaktionen sind vollständig unabhängig voneinander, so daß die Reihenfolge der Operationen verschieden sein kann. E. 11-Hydroxylierung und folgende 11-Oxydation an 1,4-Pregnadienderivaten Ein Beispiel für die Verwendung eines Ausgangsmaterials, das bereits die 3-Keto-1,4-pregnadien-Struktur besitzt, ist 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion (1-Dehydro-Reichsteins-Substanz-S), das aus Reichsteins-Substanz-Sentweder chemisch (s. USA.-Patentschrift 2 579 479) oder nach der Erfindung durch Behandlung mit einem 1,2-dehydrierenden Mikroorganismus hergestellt werden kann.
  • Es wurde gefunden, daß 11-hydroxylierende Mikroorganismen fähig sind, eine 11-Hydroxylgruppe auch in 1,4-Pregnadiene einzuführen, ohne daß das konjugierte Doppelbindungssystem im A-Ring durch solche Mikroorganismen angegriffen wird. 1-Dehydro-cortison und 1-Dehydro-cortisol können somit z. B. in einfacher Weise aus 1-Dehydro-Reichsteins-Substanz-Shergestellt werden.
  • Verbindungen mit 3-Keto-1,4-pregnadien-Struktur (z. B. l f) können z. B. mit folgenden Mikroorganismen 11a-hydroxyliert werden: Rhizopus arrhizus, Rhizopus delmar, Rhizopus nigricans, Rhizopus reflexus, Aspergillus niger, Phycomyces blakesleeanus usw. l lß-Hydroxylierung kann z. B. erfolgen durch Einwirkung von Cunninghamella-blakesleeana, Curvularia lunata oder einem anderen bekannten, in 11ß-Stellung hydroxylierenden Mikroorganismus.
  • IM kann, vorzugsweise in Form seines 21-Acetats, in üblicher Weise (Cr03/Pyridin) zu IIb oxydiert werden, das dann leicht zu 1-Dehydro-cortison (IIa) hydrolysiert werden kann. Die 11ß-Hydroxylierung liefert den 21-Ester des 1-Dehydro-cortisols (IIIb), das gegebenenfalls auch zum 21-Ester des 1-Dehydro-cortisons oxydiert und anschließend zum freien 1-Dehydro-cortison hydrolysiert werden kann.
    Weg E
    1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion 1,4-Pregnadien-11a,17a,21-triol-3,20-dion
    oder 21-Ester oder 21-Ester
    If IIf
    1,4-Pregnadien-llß-17a,21-triol-3,20-dion 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion
    oder 21-Ester oder 21-Ester
    Ma oder IIIb Ha oder IIb
    Wenn If als 21-Alkohol vorliegt, wird es nach der 11-Hydroxylierung in 21-Stellung verestert und erst dann in 11-Stellung oxydiert. Das Acylradikal ist vorzugsweise der Essigsäurerest, es kann jedoch ebenfalls der Rest einer anderen niederen Fettsäure, wie z. B. Ameisensäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure oder Bernsteinsäure, oder von aromatischen Säuren, wie Benzoesäure, Salizylsäure, Phthalsäure und Veratrumsäure, §ein. Wenn zweibasische Säuren--zur Veresterung benutzt werden, so entstehen meistens die Halbester der 1,4-Pregnadienderivate. F. , Herstellung des 1,4-ungesättigten A-Ringes durch chemische :Mittel Die 21-Ester des Pregnan-17a,21-diol-3,11,20-trions (Ig, s. unten) und ebenso der 21-Ester und die 11,21-Diester des Pregnan-11 (a oder ß), 17a,21-triol-3,20-dions (II g, l 1ß-0 H-Verbindung) können an den 2- und 4-Stellungen durch Behandlung mit einem Halogen, das ein höheres Atomgewicht besitzt als das von Fluor, halogeniert werden unter Bildung der entsprechenden 2,4-Dihalogenide. Die Veresterung insbesondere des 11ß-Hydroxyls verbessert die Ausbeute. Die Halogenierung in den beiden Stellungen kann in einer oder zwei Stufen durchgeführt werden, und im letzteren Falle können verschiedene Halogene wie Chlor und Brom benutzt werden. Das Dihalogenid wird dann mit einem halogenwasserstoffabspaltenden Reagens behandelt, wobei die 1,2- und 4,5-Doppelbindung eingeführt wird (IIb, IIIb [21-Ester oder 11,21-Diesterl oder VIIb [Fofinelschemä IJ). Die Ester können in bekannter Weise hydrolysiert werden (IIa, IIIa oder VIIa).
  • Als halogenierendes Agens eignet sich vorzugsweise Brom, wobei die 2,4-Dibromide der 21-Ester von Pregnan-17a,21-diol-3,11,20-trion bzw. von Pregnan-11,17a;21-triol-3,20-dion erhalten werden.- Die Abspaltung von Bromwasserstoff-kann durch Behandlung mit Collidin am-Rückflußkühler durchgeführt werden. An Stelle von Collidin können andere, hochsiedende, organische Basen wie Chinaldin und Dimethylanilin benutzt werden.
  • Das Verfahren ist sowohl auf Allo- als auch auf normale Pregnane anwendbar. Durch- doppelte Bromierung von Allo-pregnan-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat bzw, von Allo-pregnan-lIß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat bilden sich die Dibromide III g bzw. III' g, die nach Dehydrobromierung die 21-Acetate der Diene II und III ergeben.
  • Die Diene der in 11a-Stellung hydroxylierten Steroide können in gleicher Weise hergestellt werden. Doppelte Bromierung von Pregnan-11a,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat ergibt das 2,4-Dibromid IVg, das nach Dehydrobromierung 1,4-Pregnadien-11a,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat VIIb liefert. Die Oxydation von VIIb liefert in guter Ausbeute II b (R = Acetyl). Hydrolyse von II b liefert II a.
  • Die Reaktionen werden durch die folgenden Gleichungen wiedergegeben
    Weg F1
    Pregnan-17a,21-diol- Brr, 2,4-Dibrom-Verbindung --@ 1,4-Pregnadien-17a,21-diol- -> Ha (1)
    3,11,20-trion-21-ester 3,11,20-trion-21-ester
    Ig IIb
    Pregnan-11ß,17a,21-triol- Brz 1,4-Pregnadien- .
    3,20-dion-21-ester #i 2,4-Dibrom-Verbindung -- > 11ß,17a,21-triol-3,20-dion- @ IIIa (2)
    21-ester
    IIg
    IIIb
    2,4-Dibrom-allo-pregnan-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-ester > IIb (3)
    IIIg
    2,4-Dibrom-allo-pregnan-llß,17a,21-triol-3,20-dion-21-ester IIIb (4)
    III'g
    2,4-Dibrom-pregnan-11a,17a,21-triol-@ 1,4-Pregnadien-lla,17a,21-triol-3,20-dion- C IIb IIa 3,20-dion-21-ester 21-ester (5)
    IVg VIIb
    Die obengenanntenZwzschenprodukte werden durch die Formel XI (Formelschema II) miedergegeben, worin X = 0 oder H, O H (a oder ß) und R = H oder einen niederen Alkanoy lrest darstellt. Der Pregnankern kann entweder die normale oder die allo-Konfiguration besitzen.
  • Die Bromierung wird in Essigsäure oder einem anderen, wasserfreien Lösungsmittel durchgeführt. Es ist nicht notwendig, das Dibromid vor der Dehydrobromierung zu reinigen. Der gebildete 1,4-Pregnadienester kann, wie bereits beschrieben, hydrolysiert werden.
  • Die 11a- und 11ß-Hydroxyle können zum Ketonsauerstoff, wie oben beschrieben, oxydiert werden.
  • Die chemische Einführung der 1,2-Doppelbindung in 4-Pregnen-3-on kann z. B. folgendermaßen erfolgen 6-Brom-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion (Kendall und Mitarbeiter, Journal of the Biological Chemistry, Bd. 197 [1952], S.261) bzw. 6-Brom-4-pregnen-llß,17a, 21-triol-3,20-dion-11-formiat-21-acetat (durchBromierung nach Kendall von 4-Pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion-11-formiat-21-acetat erhalten) wird mit einem Alkalisalz einer niederen Alkansäure, vorzugsweise Natriumacetat oder Kaliumacetat, behandelt, und die erhaltenen 2-A1-kansäuresalze werden durch milde Hydrolyse, z. B. mit wäßrigen oder alkoholischen Säuren oder Basen, in die 2-Hydroxysteroide umgewandelt. Durch Wasserabspaltung (2-Hydroxyl zusammen mit dem Wasserstoff am 1-C-Atom) bildet sich die 1,2-Doppelbindung.
  • Die beschriebenen Reaktionen werden mit folgenden Gleichungen wiedergegeben
    6-Brom-4-pregnen- 4-Pregnen-2,17a,21-triol- 4-Pregnen-2,17a,21-triol-
    IIa (1)
    17a,21-diol-3,11,20-trion- -> 3,11,20-trion-2,21-diester > 3,11,20-trion >
    21-ester
    Ih IIh IIIh
    6-Brom-4-pregnen- 4-Pregnen- 4-Pregnen-
    11ß,17a,21-triol-3,20-dion- @2,llß,17a,21-tetrol-3,20-dion-> 2 llß,17a,21-tetrol-3,20-dion IIIa (2)
    11-formiat-21-alkanoat 11-formiat-21-alkanoat
    IVh Vh VIh
    Die Formeln von IIIh und VIh sind (im Formelschema II) mit XII und XIII bezeichnet. R bedeutet Wasserstoff oder ein niederes Alkansäureradikal. In XIII kann die 11ß-0 H-Gruppe durch O R ersetzt sein.
  • An Stelle der Dehydratisierung von IIIh oder VIh können die 2,21-Diester der Einwirkung des dehydratisierenden Mittels unterworfen werden. Durch Behandlung des 2,21-Diacetats von IIIh mit Bromwasserstoff-Eisessig erhält man so 1-Dehydro-cortison-21-acetat. Die 1,2-Doppelbindung kann auch über einen Hydroxy-oder Acyloxysubstituenten am C-Atom 1 (z. B. des Cortison- oder Hydrocortison-21-acetats) eingeführt werden. Die Verbindungen sind im Formelschema II unter XIV gezeigt. X bedeutet = 0 oder H, O H und Y = O H oder 0 Acyl.
  • Die Umsetzungen werden durch folgende Gleichungen charakterisiert
    Weg F3*
    1-Pregnen-11 X-17a,21-diol-3,20-dion-21-ester 1,2-Oxido-11 X-pregnan-17a,21-diol-
    3,20-dion-21-ester
    Ii IIi
    2-Brom-pregnan-11 X-1,17a,21-triol- > Pregnan-11 X-1,17,21-triol-3,20-dion-21-ester
    3,20-dion-21-ester
    IIIi IVi
    Pregnan-11 X-1,17a,21-triol- 4-Brom-pregnan-11 X-1,17a,21-triol-
    3,20-dion-1,21-diester 3,20-dion-1,21-diester
    Vi VIi
    4-Pregnen-11 X-1,17a,21-triol- II oder III
    3,20-dion-1,21-diester
    VII i
    Die Estergruppen in den obigen Gleichungen sind vorzugsweise niedere Alkanoylradikale. Als Epoxydierungsmittel verwendet man z. B. Benzopersäure, Monoperphthalsäure, Peressigsäure usw. Die Oxidoverbindung (IIi) wird z. B. mit Bromwasserstoff behandelt und das so hergestellte Halogenhydrin (IIIi) mit Raneynickel oder mit Wasserstoff und Palladium-Calciumcarbonat zu IV i dehalogeniert. IV i kann wie üblich zu V i acyliert werden. Vi kann auch durch die obige Operation in veränderter Reihenfolge hergestellt werden. Durch Bromierung und Dehydrobromierung von Vi entsteht VIIi. Die Bromierung wird vorzugsweise mit Brom in Gegenwart von Natriumacetat durchgeführt. Üblicherweise wird die Dehydrobromierung mit Hilfe von Semicarbazid durchgeführt; das dabei entstehende Semicarbazon wird durch Behandlung mit Brenztraubensäure in VIIi umgewandelt.
  • In ähnlicher Weise läßt sich IVi in VIIIi umwandeln (ohne Acylierung). Bromierung in Gegenwart von Xatriumacetat und anschließende Dehydrobromierung ergibt die gewünschte Umwandlung.
  • Die entsprechenden l lß-Hydroxyverbindungen werden in gleicher Weise, ausgehend von 1-Pregnen-1lß,17a, 21-triol-3,"0-dion-21-acetat, hergestellt.
  • Zur Abspaltung der 1-Sauerstoffunktion können die Verbindungen mit einer Säure oder Base wie Aluminiumoxyd, Triton B (Tetramethylammoniumhydroxyd) u. ä. behandelt werden, wobei sich (z. B. aus VIIi) die antiarthritisch wirkenden Substanzen II und IIl (Formelschema I) bilden. G. Einführung von Halogen in der 9a-Stellung Für die Herstellung von IV und V ist es nicht notwendig, daß die Ausgangsverbindungen das 9a-Halogenatom (Fluor, Chlor oder Brom) enthalten, dieses kann vielmehr in das Steroidmolekül nach der Dehydrierung des A-Ringes eingeführt werden. Man geht z. B. von einer 11(a oder ß)-Hydroxy-1,4-pregnadienverbindung aus, wandelt diese in 1,4,9(11)-Pregnatrien um (z. B. durch Dehydratisierung) und führt in diese Verbindung gleichzeitig ein 9a-Halogen und ein 11ß-Hydroxyl ein. Das 11-Hydroxyl kann unter milden Bedingungen zur 11-Ketogruppe oxydiert werden (z. B. zu 9a-Halogen-l-dehydrocortison).
  • Als Ausgangsmaterial benutzt man z. B. 1,4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion (III) oder die entsprechende lla-Hydroxyverbindung (VII) oder deren 21-Ester. Die Ausgangsverbindung wird zunächst in der 21-Stellung verestert (IIIb) (z. B. mit Säureanhydrid-Pyridin oder mit Säurechlorid) unter Bildung der üblichen 21-Ester, z. B. des 21-Acetats, -Propionats, -Cyclopentylpropionats oder -Önanthats.
  • Die Dehydratisierung (Einführung der 9,11-Doppelbindung) kann z. B. durch Einwirkung von Phosphoroxychlorid in Pyridin erzielt werden. Vorzugsweise stellt man jedoch das 1,4,9(11)-Trien durch Behandlung des 21-Estersderlla-Hydroxyverbindung(VIIb) mit p-Toluolsulfochlorid in Pyridin dar. Das gebildete lla-Tosylat (Ij) kann durch Behandlung mit einer basisch wirkenden Verbindung wie Natriumacetat in Essigsäure (oder mit Kaliumacetat, Lithiumpropionat und ähnlichem) in die 9,11-ungesättigte Verbindung übergeführt werden. An Stelle des p-Toluolsulfonats kann auch das entsprechende Methansulfonät, -Benzolsulfonät oder andere ähnliche Sulfonsäureester hergestellt werden.
  • Die Reaktionen sind im folgenden Schema angegeben:
    Essigsäure- -
    anhydrid POCl3 1,4,9(11)-Pregnatrien-
    1-Dehydro-cortisol 21-Acetat 17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat
    III a Pyr?din III b Pyndin II j
    p-Toluol-
    1,4-Pregnadien- sulfochlorid Ila-p-Toluolsulfonat- Wärme
    lla,17a,21-triol-3,20-dion@ 21-Acetat
    21-acetat
    VIIa VIIb Pyridin I Na00CCH3
    CH,COOH
    Die Struktur der 1,4,9(11)-Pregnatriene, wie z. B. IIj, ist in Formel XV (Formelschema II) angegeben, worin R = H oder Acyl, vorzugsweise niederes Alkanoyl, bedeutet.
  • Das Trien (II j) wird jetzt mit einem ionogenen Bromierungsmittel wie N-Bromacetamid oder N-Bromsuccinimid in Perchlorsäure oder einer anderen starken Säure, wie Schwefelsäure, behandelt. Man erhält so das 9a-Bromderivat (III j ).
  • Wenn es erwünscht ist, Fluor oder Chlor in die 9a-Stellung einzuführen, wird die 9a-Bromverbindung (das Bromhydrin IIIj) dehalogeniert durch Einwirkung einer schwachen Base wie Kalium- oder Natriumacetät, wobei das Epoxyd IVj entsteht. Das letztere wird der Einwirkung von wasserfreiem Fluorwasserstoff unterworfen, wobei der Epoxydring geöffnet und ein 9a-Fluoratom zusammen mit einer 11ß-Hydroxylgruppe eingeführt wird. (Verbindung V, Z = F.) Bei Verwendung von wasserfreiem Chlorwasserstoff bildet sich das 9a-Chloranaloge. Letzteres kann zur Abspaltung der 21-Acylgruppe wie üblich hydrolysiert werden.
  • Die 9a-Fluor-llß-hydroxylverbindung kann durch milde Oxydation (Chromsäure-Pyridin) in die 9a-Fluor-11-ketoverbindung (IVb) übergeführt werden, die ebenfalls unter Abspaltung der 21-Acylgruppe hydrolysiert werden kann unter Bildung von 9a-Fluor-l-dehydrocortison.
  • Vorzugsweise wird 1,4-Pregnadien-11a,17a,21-triol-3,20-dion für die entsprechende 11ß-Hydroxyverbindung als Ausgangsmaterial benutzt. Es ist wichtig, daB vor der Behandlung mit p-Toluolsulfochlorid das 21-Hydroxyl geschützt wird. Falls die 21-Hydroxylgruppe nicht verestert wird, entstehen schwierig zu trennende Substanzgemische. Darüber hinaus ist es vorteilhaft, bei der Veresterung der 21-OH-Gruppe ein relativ mildes acylierendes Mittel, wie z. B. die vorbeschriebenen Anhydride, zu verwenden, weil dadurch eine wirkliche Selektivität erreicht wird, so daB das 11-Hydroxyl unverestert bleibt. H.
  • Herstellung von Estern mit erhöhter Wirkungsdauer Die Erfindung berücksichtigt auch die Herstellung solcher 21-Ester der Verbindungen II bis V, die im Körper nicht so schnell umgewandelt werden wie die freien 21-OH-Verbindungen, so daß die physiologische Wirksamkeit der Verbindungen für eine längere Zeitdauer aufrechterhalten wird und die Häufigkeit der Injektion dadurch stark reduziert wird.
  • Die Säuren, von denen gefunden wurde, daB ihre 21-Ester eine länger anhaltende Wirksamkeit besitzen, sind Cyclohexancarboxylsäure, 4-Methylcyclohexancarboxylsäure, 3-Äthylcyclohexylessigsäure, Cyclohexylpropionsäure, Cyclopentylpropionsäure, Phenylessigsäure, Trimethylessigsäure, tert.-Butylessigsäure, Butoxybuttersäure, Äthoxycaprönsäure, Methylthiovaleriansäure, Isopropylthioessigsäure, Phenylthioessigsäure, Capronsäure; Isobuttersäure, Önanthsäure, Isocaprylsäure, Cyclohexylcapronsäure, Undecylensäure, 2-Äthylbuttersäure, Tohryl:-säure und Äthoxybenzoesäure: Insbesondere wurde gefunden, daB Säuren der Aryloxyälkanoid- und Furansäuregruppe eine hervorragend längere Wirksamkeit der Hormonaktivität bewirken und dadurch eine wirksamere, günstige und nützliche Therapie ermöglichen, verglichen mit den ursprünglichen Hormonen. Typisch anwendbare Säuren dieser Gruppen sind: Phenoxyessigsäure, p-Chlorphenoxyessigsäure, 2;4-Dichlorphenoxyessigsäure, 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure, 5-Chlorfuransäure, 5-Methylfuransäure, 5-BromfÜransäure, 4-Bromphenoxyessigsäure, 4-Methylphenoxyessigsäure, 4-Methoxyphenoxyessigsäure, 4-tert.-Butylphenoxyessigsäure, 5-tert.-Butylfuransäure, Furansäure und Phenoxypropionsäure.
  • Die Ester der obengenannten Säuren verlängern, wie gefunden wurde, die Wirkungsdauer nicht nur von 1-Dehydro-cortison, 1-Dehydro-cortisol, 1-Dehydro-9a-halogen-cortison und 1-Dehydro-9a-halogen-cortisol (wobei das Halogenatom Chlor oder Brom ist), sondern auch die der physiologisch wirksamen Zwischenprodukte wie 1-Dehydro-corticosteron, 1-Dehydro-ll-desoxy-corticosteron, 1- Dehydro -11- desoxycortison, 1- Dehydro-17-desoxycortison und 1-Dehydro-aldosteron.
  • Als Beispiel für die erhöhte Wirkungsdauer wurde gefunden, daB bei Mäusen mit herausgeschnittener Nebenniere eine Injektion von 0,25 mg 1-Dehydro-cortison oder 1-Dehydro-cortisol oder ihrer Acetate eine Eosinopenie von etwa 2 bis 4 Tagen bewirkt. Eine gleiche Injektion von 1-Dehydro-cortison-21-(2',4'-dichlorphenoxy=acetat) hält 12 bis 20 Tage an. Das 21-(5'-Brömfuranät) des 1-Dehydro-cortisons wirkt 10 bis 18 Tage, das 21-Furänat von 1-Dehydro-cortisol wirkt 10 bis 16 Tage, und dessen 21-(4'-tert.-Butylphenoxyacetat) wirkt 14 bis 20 Tage.
  • Bei einem anderen Test verringerte eine Injektion von 1-Dehydro-cortison-21-(5'-chlorofuranat) bei Ratten das Gewicht der Thymusdrüse für 5- bis 8mal längere Zeit als das freie Hormon; demgegenüber bewirkte 1-Dehydrocortisol-21-(4'-tert.-butylphenoxyacetät) eine Rückbildung des Thymus für 4- bis 6mal längere Zeit als das freie Hormon. Diese Teste sind Standardangaben von glucocortischer (d. h. antiarthritischer) Aktivität. In gleicher Weise kann die mineralocortische Aktivität der Hormone durch Veresterung mit diesen Säuren erhöht werden. So erhält 1-Dehydro-11-desoxy-corticosteron-21-(4'-chlorophenoxyacetat) das Leben von Mäusen mit herausgeschnittener Nebenniere 5- bis 7mal länger als das freie Hormon und 1-Dehydro-aldosteron-21-furanat 6- bis 10mal länger als das entsprechende Hormon. Analoge. Ergebnisse werden in der Humantherapie erzielt. So ersetzen eine bis zwei Injektionen pro Woche von 1-Dehydro-cortison 21-furanat oder 1-Dehydro-cortisol 21-(4'-tert.-butylphenoxyacetat) sieben tägliche Medikamentgaben von freiem Hormon. In gleicher Weise haben 50 bis 100 mg Injektionen von 1-Dehydro-cortisol-21-(5'-tert.-butylfuranat) oder 1-Dehydro-cortison-21-(4'-chlorophenoxyacetat) eine 7- bis 10tägige Wirksamkeit im Vergleich mit -der Wirksamkeit von nur 1 Tag des freien Hormons.
  • Typische Beispiele der 21-Ester von 9a-Halogenderivaten von 1-Dehydro-cortison und 1-Dehydro-cortisol sind das 21-(2'-Furanat), 21-[(5'-tert.-Butyl)-2'-furanat], 21- Phenoxyacetat und - 21- (2',4',5' -Trichlorphenoxyacetat) .
  • Die Ester können in der bei cortischen Hormonen üblichen Weise gegeben werden. Sie können in Tabletten mit inertem Material zur oralen oder sublingualen Gabe verabreicht werden. Eine andere übliche Form ist die Salbe oder Lösung für örtlichen Gebrauch. Im allgemeinen ist die wirksamste Art der Gabe die intramuskuläre, subcutane oder intraartikuläre Injektion von öligen oder wäßrigen Lösungen oder Suspensionen. Die Ester können auf verschiedene Weise hergestellt werden, wobei es am einfachsten ist, die entsprechenden freien Hormone zu verestern., beispielsweise durch Behandlung des Hydroxysteröids mit dem entsprechenden Säureanhydrid oder Chlorid in Gegenwart oder Abwesenheit einer Base oder durch Behandlung des Hydroxysteroids mit der freien Säure in Gegenwart eines sauren Katalysators unter dehydratisierenden Bedingungen.
  • Die Ester können auch durch Veresterung von Zwischenprodukten bei der Herstellung der Hormone dargestellt werden, wobei diese Ester, wie das Acetat, als schützende Gruppe verwendet werden können. So kann bei der Herstellung von 1-Dehydro-cortison und 1-Dehydro-cortisol durch die oben beschriebenen chemischen Methoden der protrahierend wirkende 21-Ester des Zwischenprodukts gebildet werden, bevor das Halogen (gewöhnlich Brom) in der 2- und 4-Stellung eingeführt wird. Dieses Verfahren wird üblicherweise durch Umsatz der 21-Bromverbindung des Steroids mit einem Metallsalz der Säure durchgeführt. In der folgenden Gleichung ist diese Reaktion wiedergegeben, wobei die Ausgangspregnanverbindung normale oder allo-Konfiguration haben kann:
    21-Brom-pregnan-11X- Pregnan-11X-17a,21-diol- 1,4-Pregnadien-11X-
    17a-ol-3,20-dion 3,20-dion-21-ester . #- 2,4-Dibromderivat -> 17a,21-diol-3,20-dion-21-ester
    In dieser Gleichung bedeutet X = O oder H, OH. Beispiele 1. Umwandlung von Cortison in 1-Dehydro-cortison Aus einer Lösung von 30 g Hefeextrakt (»Difco«) in 3,01 Leitungswasser, die 13,2 g Kaliumdihydrogenphosphat und 26,4 g Dinatriumhydrogenphosphat (pH der Lösung 6,9)' enthält, werden 27 Teile von je 100 ml abgetrennt, in Erlenmeyerkolben von 300 ml Inhalt gebracht und im Autoklav 15 Minuten lang bei 776 Torr Dampfdruck (120°C) sterilisiert. Nach Behandlung im Autoklav und Abkühlung der Bouillon wird 1 ml einer Suspension von Corynebacterium simplex (ATCC 6946) in jeden Kolben gegeben. Die Kolben werden dann auf einem Schütteltisch bei 220 Stößen pro Minute und 28°C 24 Stunden lang geschüttelt.
  • In jeden der 27 Erlenmeyerkolben werden 150 mg Cortison gebracht. Anschließend wird 15 Minuten bei 776 Torr Dampfdruck (120°C) sterilisiert. jedem Kolben werden dann 5,0 ml Äthanol zugegeben. Die 24-Stunden-Bakterienkultur wird hierauf aseptisch übertragen und die entstehenden Suspensionen auf einem Schütteltisch bei 220 Stößen pro Minute und 28°C 48 Stunden geschüttelt. Der p1,-Wert beträgt am Ende 7,2. Der Inhalt aller Kolben wird vereinigt und mit einer Gesamtmenge von 9,01 Chloroform in drei gleichen Anteilen extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden zu einem Rückstand konzentriert, der aus Aceton-Hexan kristallisiert. Dabei entsteht 1,1 g von 1-Dehydro-cortison. Fp. @ 210 bis 215`C (Zersetzung). Durch weitere Umkristallisationen erhöht sich der Schmelzpunkt auf 230 bis 232°C (Zersetzung) ; [ä,205 = -f- 175,3 (Dioxan) ; e238 = 15,400 (Methanol). Analyse: C"H2605.
  • Berechr et . . . . . . . . C 70,37, H 7,31; gefunde=i . . . . . . . . . C 70,38, H 7,67. 21-Acetylierung von 1-Dehydro-cortison Einer Lösung von 0,5 g 1-Dehydro-cortison in 5 ml wasserfreiem Pyridin werden 3 ml Essigsäurea^hyarid zugefügt. Man läßt die Reaktionsmischung über Nacht bei Zimmertemperatur stehen und verdünnt sie dann mit Eis und Wasser. Die entstehende Fällung wird filtriert und aus Aceton-Hexan umkristallisiert. Es werden 0,35 g von 1-Dehydro-cortison-21-acetat erhalten. Fp. = 227 bis 228°C. Nach verschiedenen Umkristallisationen aus Aceton-Hexan schmilzt die Verbindung bei 233 bis 236°C (Zersetzung).
  • 2. Umwandlung von Cortisol in 1-Dehydro-cortisol je 150 mg Cortisol (4-Pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion) werden in 27 Erlenmeyerkolben, wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Der pH-Wert am Ende des Schüttelvorgangs beträgt 7,0. Der Inhalt aller Kolben wird vereinigt und mit einer Gesamtmenge von 9,01 Chloroform in drei gleichen Anteilen extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden dann zu einem Rückstand eingeengt, der 3,75 g wiegt. Der Schmelzpunkt des Rückstandes ist 227 bis 232°C. Nach dem Aufschlämmen mit 50 ml Aceton und Abkühlung werden aus 2,75 g dieses Rohmaterials bei Filtration 1,35 g 1-Dehydro-cortisol vom Fp. = 237 bis 239°C gewonnen. Weiteres Produkt kann aus der Mutterlösung gewonnen werden. Durch Umkristallisation aus Aceton erhöht sich der Schmelzpunkt auf 239 bis 241'C (Zersetzung) ; [a] öS 107° (Dioxan) ; e 243 = 14,600 (Methanol).
  • Analyse: C"H"05.
  • Berechnet .... C 69,97, H 7,83; gefunden . . . . . C 70,24, H 8,13.
  • 21 Acetylierung von 1-Dehydro-cortisol Einer Lösung von 0,85 g von 1-Dehydro-cortisol in 5 ml Pyridin werden 3 ml Essigsäureanhydrid zugefügt. Man läßt die Reaktionsmischung über Nacht bei Zimmertemperatur stehen und verdünnt sie dann mit Eiswasser. Die entstehende Fällung wird aus der Mischung abfiltriert und aus Aceton-Hexan umkristallisiert. Es wird 0,45 g von 1,4-Pregnadien-llß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat (1-Dehydro-cortisol-21-acetat) gewonnen. Fp. = 235 bis 239°C. Bei der Umkristallisation steigt der Schmelzpunkt auf 237 bis 239'C; [a] ö5 = -f-116° (Dioxan) ; E 243 =15,000 (Methanol).
  • Analyse: C"Hao0s.
  • Berechnet .... C 68,63, H 7,51; gefunden ..... C 68,62, H 7,78.
  • 3. Umwandlung von Reichsteins-Substanz-S in 1-Dehydro-Reichsteins-Substanz-S 100 ml eines 1 °/oigen Hefeextraktkonzentrates zusammen mit 9,0 ml von 0,2m KH,P04 Lösung und 9,0 ml von 0,2 m Nag H P 04 Lösung werden, wie vorher angegeben, sterilisiert und mit einer 1,0°/oigen Suspension von Corynebacterium simplex (ATCC 6946) einer 24-Stunden-Bouillonkultur geimpft. Die neu angesetzte Kultur wird irrkubiert und 24 Stunden bei 28° C geschüttelt (Schütteltisch). Nach der Inkubation wird die Bouillonkultur aseptisch in einen zweiten sterilen 300-ml-Erlenmeyerkolben übertragen, der 150,0 mg der sterilen Reichsteins-Substanz-S in 5,0 ml Äthanol oder Aceton enthält. Der pH-Wert der Reaktionsmischung ist 7,0. Die Bakterienkultur, die Steroid und Lösungsmittel enthält, wird irrkubiert und 48 Stunden bei 28°C geschüttelt. Der Endwert des pn der Reaktionsmischung ist 7,2 bis 7,4. Die Kultur wird dann mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte werden gesammelt und auf einem Dampfbad zur Trockne eingedampft (196,0 mg.) Der rohe Extrakt wird mit Methanol aufgeschlämmt. Es werden 80 mg Kristalle vom Fp. = 246 bis 250° C erhalten. Nach zweimaliger Kristallisation aus Aceton ist der Fp. = 246 bis 249° C (Zersetzung) ; [a] ö = + 76° (C H Cl,); s 245 = 15,500 (C,11, OH). Analyse: C21 Heg 04.
  • Berechnet .... C 73,22, H 8,19; gefunden ..... C 73,56, H 8,40. IR-Spektrum und Analyse besagen, daß das Produkt 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion ist. 21-Acetylierung von 1-Dehydro-Reichsteins-Substanz-S Zu einer Lösung von 0,25 g von 1-Dehydro-Reichsteins-Substanz-S in 2 ml Pyridin wird 1 ml Essigsäureanhydrid gegeben. Man läßt die Reaktionsmischung über Nacht bei Zimmertemperatur stehen und verdünnt sie dann. mit Eis und Wasser. Die entstehende Fällung wird filtriert und aus Methylenchlorid-Hexan umkristallisiert, wobei 0,20 g von 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat mit einem Schmelzpunkt von 226,5 bis 228° C erhalten werden. 4. Umwandlung von Reichsteins-Substanz-S in 1-Dehydro-Reichsteins-Substanz-S und 1,4-Pregnadien-17a,20,21-triol-3-on. 100m1 eines Nährmediums aus 10/, Fischlösungen, 0,10 ,7a Hefeextrakt, 9,0 ml einer 0,2m KH2P04Lösung und 9,0 ml einer 0,2m Na2HP04 Lösung werden, wie oben beschrieben, sterilisiert und mit einer Suspension von Corynebacterium simplex aus einer 24-Stunden-Kultur geimpft. Die neu angesetzte Kultur wird irrkubiert und 20 Stunden bei 28° C geschüttelt. Nach der Inkubation wird die Bouillonkultur aseptisch in einen zweiten sterilen 300-ml-Erlenmeyerkolben übertragen, der 150 mg sterile Reichsteins-Substanz-S in 5,0 ml Äthanol enthält. Der pH-Wert der Mischung beträgt 6,9. Die Steroid und Lösungsmittel enthaltende Bakterienkultur wird irrkubiert und 48 Stunden bei 28° C geschüttelt. Am Ende beträgt der pH-Wert 7,3. Die Kultur wird mit 21 Chloroform in fünf gleichen Anteilen extrahiert, die Extrakte werden gesammelt und die Gesamtmenge auf einem Dampfbad konzentriert. Der rohe Rückstand wird in Methylenchlorid aufgenommen und über Magnesiumsilikat (bekannt unter dem Handelsnamen Florisil) chromatographiert. Aus dem Chromatogramm werden Ausgangsmaterial (15 mg), 1-Dehydro-Reichsteins-Substanz-S (30 mg) und 1,4-Pregnadien-17a,20,21-triol-3-on (90 mg) isoliert. Letzteres wird aus Aceton-Hexan umkristallisiert und schmilzt bei 195 bis 196° C; [a] ö5 = -f-33° (Methanol). Analyse: C21 H30 04.
  • Berechnet .... C 72,80, H 8,73; gefunden ..... C 72,79, H 9,08. An Stelle von Äthanol können andere wasserlösliche organische Lösungsmittel benutzt werden, die auf den Mikroorganismus nicht toxisch wirken, wie Aceton, Mischungen von Äthanol und Aceton u. ä. 5. Umsetzung von 5-Pregnen-3ß,20-diol 100 ml eines 0,1°/oigen Hefeextraktkonzentrates, enthaltend 9,0 ml einer 0,2 m K H2 P 04 Lösung und 9,0 ml einer 0,2 m Nag H P 04 Lösung, werden in einem 300-ml-Erlenmeyerkolben 15 Minuten im Autoklav bei 776 Torr (120° C) gehalten. Anschließend läßt man den Kolben auf Zimmertemperatur abkühlen. In dem Kolben wird dann eine Suspension von Corynebacterium simplex angesetzt. Der angesetzte Kolben wird irrkubiert und 24 Stunden bei 28° C geschüttelt (Schütteltisch). Ein zweiter 300-ml-Erlenmeyerkolben, der 150 mg 5-Pregnen-3ß,20-diol (oder 5-Pregnea-3a,20-diol) enthält, wird 15 Minuten bei 776 Torr (120° C) in einem Autoklav sterilisiert. In diesen Kolben werden dann 5,0 ml Aceton oder Äthanol zugegeben. Die 24-Stunden-Wachstumskultur von Corynebacterium simplex wird aseptisch in den Kolben übertragen, der das Steroid enthält, und die Reaktionsmischung wird 36 Stunden bei 28- C geschüttelt (Schütteltisch). Am Ende der Umsetzungszeit beträgt der pH-Wert 7,1 bis 7,2. Die Reaktionsmischung wird dann sorgfältig mit Chloroform extrahie: t, die Chloroformextrakte werden gesammelt und die entstehende Lösung bis auf einen Rückstand (0,20 g) konzentriert. Der rohe Extrakt kristallisiert aus Äther in langen Prismen aus, Fp. = 135 bis 138"C. Nach zweimaliger Umkristallisation aus Methylenchlorid-Hexar entsteht 0,06 g 1,4-Pregnadien-3,20-dion mit einem Fp. = 152 bis 153° C; [a] 2s = -f-122° (CH C13), a 245 = 15,000 (C2115011). Das IR-Spektrum zeigt die Anwesenheit eines 1,4-Dien-3-on-s-ystems, eines weiteren Carbonyls (sechsgliedriger Ring oder Seitenkette) sowie die Abwesenheit von Hydroxyl an.
  • 6. Herstellung von 1-Dehydro-Reichsteins-Substanz-S Eine 100-mI-Bouillonkultur aus einem 0,1 "/oigen Hefeextraktkonzentrat,enthaltend 9,0 ml ein er 0,2 m K H2 P04-Lösung und 9,0 ml einer 0,2m Na. HP0,-Lösung, wird mit 1 ml einer 24-Stunden-Bouillonkultur von Corynebacterium simplex angesetzt. Der Kolben wird 24 Stunden bei 28° C irrkubiert. Ferner werden 150 ml steriles 5-Pregnen-3ß,17a,21-triol-20-on-3,21-diacetat in 50 ml Aceton in einem 300-rnl-Erlenmeyerkolben mit einer 24-Stundenkultur von Corvnebacterium simplex geimpft und bei 28 bis 30°C 48 Stunden lang irrkubiert. Die Produkte werden mit Chloroform extrahiert und die Chloroformextrakte auf ein kleines Volumen eingeengt und an »Florisil« (Magnesiumsilikat) chromatographiert. Die Reihenfolge der Elutionist: Ausgangsmaterial (75 mg), Reichsteins-Substanz-S-21-acetat (15 mg), 1-Dehydro-Reichsteins-Substanz-S (30 mg).
  • Unter Benutzung des gleichen Reaktionsmediums und des gleichen Mikroorganismus wie im Beispiel 6 und mit der gleichen Steroidkonzentration wird Corticosteron in kristallines 1-Dehydro-corticosteron umgewandelt. In ähnlicher '\Veise erhält man aus Desoxycorticosteron kristallines 1-Dehydro-desoxy-corticosteron und aus 4-Pregnen-21-ol-3,11,20-trion (11-Dehydro-corticosteron) kristallines 1,4-Pregnadien-21-ol-3,11,20-trion.
  • Analog der Acetylierung der Diene, wie in den Beispielen 1, 2 und 3 beschrieben, können auch andere Ester der Dienverbindungen hergestellt werden. Durch Reaktion des entsprechenden Säureanhydrids oder -chlorids können z. B. die Formiate, Propionate, Butyrate oder Valerianate sowie die Ester anderer nichttoxischer Säuren, wie die Benzoate, und ebenso die neutralen und sauren Ester der mehrbasischen Säuren, wie Bernsteinsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Phthalsäure, und Hexahydrophthalsäure, hergestellt werden. Die Metallsalze, z. B. die Alkali- oder Erdalkalisalze der sauren Ester, können in üblicher Weise durch Reaktion mit dem entsprechenden Hydroxyd, Carbonat oder Hydrogencarbonat hergestellt werden.
  • Es können auch die Ester des Cortisons und Hydrocortisons (Cortisol) sowie ihre Zwischenprodukte dem 1-Dehydrierungsprozeß der vorliegenden Erfindung unterworfen werden. So kann im Beispiel l Cortison durch seinen 21-Ester oder seinen 17a,21-Diester oder durch 5-Pregnen-3,17a,21-triol-11,20-dion-21-acetat oder dessen 17a,21-Diacetat oder dessen 3,17a,21-Triacetat oder andere Ester ersetzt werden. Ebenso kann im Beispiel 2 Cortisol durch sein 21-Acetat oder 17a,21-Diacetat oder llß,17a,21-Triacetat oder durch 5-Pregnen-3,11f,17a, 21-tetrol-20-o.^.-3,21-diacetat, dessen 3,17a,21-Triacetat oder dessen 3,11ß,17a,21-Tetraacetat ersetzt werden. Die letzte Gruppe der Verbindungen kann durch die entsprechenden lla-Hydroxyepimeren ersetzt werden. Man erhält so 11-epi-l-Dehy dro-cortisol sowie dessen 21-Ester oder 17a,21-Diester. Die Polyester können in allen Fällen gemischte Ester, wie z. B. 3-Propionat-21-acetat, sein. Zum Beispiel kann Cortisol in 1-Dehydro-cortisol (Beispiel 2), das Cortisol-21-acetat in 1-Dehydro-cortisol oder sein 21-Acetat umgewandelt werden. Aus 1,0 g Cortisol-21-acetat wird 0,22 g 1-Dehydro-cortisol (IIIa), Fp. = 239 bis 241' C (Zersetzung), erhalten.
  • Wenn es erwünscht ist, die Verseifung in 21-Stellung zu vermeiden, wird die Temperatur der Umgebung während des Wachstums des Mikroorganismus und während der Reaktion auf 36° C erhöht. Das Produkt wird in der üblichen Weise isoliert. Aus 1,0 g des Cortisol-21-acetats entsteht dann 0,13 g 1-Dehydro-cortisol-21-acetat (IIIb), Fp. = 237 bis 239° C (Zersetzung).
  • In ähnlicher «'eise wird wie im Beispiel 1 1,0 g Cortison-21-acetat in 1-Dehydro-cortison umgewandelt, von dem 0,17 g isoliert werden, Fp. = 230 bis 232° C. Wenn die Temperatur der Umgebung während des Wachstums des Mikroorganismus und während der Reaktion auf 36° C erhöht wird, entsteht aus 1,0 g Cortison-21-acetat 0,11 g 1-Dehydro-cortison-21-acetat, Fp. = 230 bis 233° C (Zersetzung).
  • 7. Umwandlung von Cortisol in 1-Dehydro-cortisol Aus einer Lösung von 1 g Hefeextrakt (»Difco") in 1,01 Leitungswasser, die 4,4g Kaliumdihydrogenphosphat und 8,8 g Dinatriumhydrogenphosphat (pH der Lösung 6,9) enthält, werden 10 Arteile von je 100 ml abgezogen, in 300-ml-Erlenmeyerkolben gebracht und im Autoklav 15 Minuten bei 776 Torr Dampfdruck (120° C) sterilisiert. Nach der Behandlung im Autoklav und Abkühlung der Bouillon wird 1 ml einer Suspension von Corynebacterium hoagii (American Type Culture Collection 7005) in jeden Kolben gebracht. Die Kolben werden dann auf einem Schütteltisch bei 220 Stößen pro Minute und 28° C 161;2 Stunde geschüttelt. In jeden der zehn Erlenmeyerkolben werden 50 mg Cortisol, in 1 ml 90°/oigem Methanol gelöst, aseptisch zugegeben. Die Kolben werden wieder in die Schüttelmaschine gegeben und 7 Stunden inkubiert. Der pH-Wert am Ende der Schüttelperiode beträgt 6,82. Der Inhalt aller Kolben wird vereinigt und mit einer Gesamtmenge von 31 Chloroform in drei gleichen Anteilen extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden zu einem Rückstand von 425 mg eingeengt. Die Kristallisation des Rückstandes aus Aceton liefert 248 mg 1-Dehydro-cortisol.
  • B. Umwandlung von Cortisol in 1-Dehydro-cortisol Aus einer Lösung von 0,5 g der Lösung des getrockneten wasserlöslichen Teiles eines Hefeautotysates,beknnnt unter demHandelsnamenBasaminBusch (Anheuser-Busch) in 1 1 Leitungswasser werden 10 Teile von j e 100 ml abgezogen, in 300-ml-Erlenmeyerkolben gebracht und durch Behandlung im Autoldav von 15 Minuten Dauer bei 776 Torr Dampfdruck (120° C) sterilisiert. Nach Behandlung im Autoklav und Abkühlen der Bouillon wird 1 ml einer Suspension von Corynebacterium simplex in jeden Kolben gegeben. Die Kolben werden dann auf einem Schütteltisch bei 220 Stößen pro Minute und 28° C für 24 Stunden geschüttelt. Jedem der zehn Erlenmeyerkolben werden 50 mg Cortisol, gelöst in 0,8 ml absolutem Alkohol, aseptisch zugesetzt. Die Kolben werden auf den Schütteltisch gebracht und für weitere 4 bis 7 Stunden inkubiert. Der pH-Wert am Ende der Schüttelperiode beträgt 7,2 bis 7,6. Der Inhalt aller Kolben wird vereinigt und mit einer Gesamtmenge von 31 Chloroform in drei gleichen Anteilen extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden zu einem Rückstand von 490 mg konzentriert. Die Kristallisation des Rückstandes aus Aceton liefert 403 mg 1-Dehydro-cortisol. Fp. = 238 bis 240° C (Zersetzung) ; [a]-D5= -f-105° (Dioxan) ; s 243 = 14,500 (Methanol).
  • Bei Benutzung von Cortison an Stelle von Cortisol und bei erhöhter Umsetzungszeit von 6 bis 12 Stunden wird das rohe 1-Dehydro-cortison in einer Ausbeute von 85 °,1o erhalten.
  • Aus diesem Beispiel ist ersichtlich, daß sich die Ausbeute bei verringerter Konzentration des Ausgangsproduktes erhöht. Die anderen im obigen genannten 4-Pregnenverbindungen können in analoger Weise behandelt werden. Wie bei den vorstehenden Beispielen können die 21-Ester als Ausgangsverbindungen und in gleicher Weise die 5-Pregnen-3-hydroxy-Analoga benutzt werden. 9. Umwandlung von Cortison in 1-Dehydro-cortison Bacillus sphaericus var. fusiformis (ATCC 7055) wird auf ein Nähr-Agar aus einem unter dem Handelsnamen »Bacto-Beef-Extrakt« bekannten Fleischextrakt (3 g), Pepton, z. B. dem unter dem Handelsnamen »Bactopepton" bekannten Produkt (5 g), Na Cl (8 g), Agar (15 g) und 1 1 Leitungswasser für 24 Stunden bei 28'C inkubiert. Zu 100 ml einer sterilen Nährbouillon (aus Bacto-Beef-Extrakt [3 g], Bactopepton [5 g], mit Leitungswasser auf 11 aufgefüllt), wird in einem 300-ml-Kolben eine mit einer Platindrahtschlinge entnommene Menge der inkubierten Kultur zugesetzt und die Bouillonmischung dann weitere 24 Stunden bei 28°C auf einer Schüttelmaschine unter aeroben Bedingungen inkubiert. Die so erhaltene Bouillonkultur wird als Impfmittel in 1%iger Lösung benutzt. Zu jedem der zehn Kolben, die 100 ml sterile Nährlösung enthalten, wird 1 ml des Impfmittels hinzugesetzt. Die Kolben werden auf einer rotierenden Schüttelmaschine aerob 8 Stunden lang bei 28°C und 240 Stößen pro Minute gerührt. Nach dieser Wachstumsperiode wird eine Lösung von 25 mg Cortison in 0,5 ml Methanol aseptisch jedem Kolben zugeführt, der wiederum geschüttelt und für weitere 24 Stunden inkubiert wird. Am Ende ist der pH-Wert etwa 7,8. Der Inhalt der Kolben wird vereinigt, mit Chloroform extrahiert und in üblicher Weise behandelt, wobei 1-Dehydro-cortison entsteht. An Stelle von Cortison können als Ausgangsmaterial 5-Pregnen-3,17a,21-triol-11,20-dion, 5-Pregnen-3,17a,20,21-tetrol-11-on oder deren 3-Acetate oder andere Ester benutzt werden, die dem Mikroorganismus gegenüber nicht toxisch oder seinem Enzym gegenüber nicht verzögernd wirken. Ebenso können an Stelle von Cortisol 5-Pregnen-3,11ß,17a,21-tetrol-20-on, 5-Pregnen-3,llß,17a,20,21-pentol oder deren 3-Acetate oder andere Ester benutzt werden. Wie oben angegeben, wird die 20-Hydroxygruppe zu einer Ketogruppe oxydiert.
  • 10. Umwandlung von Cortisol in 1-Dehydro-cortisol Das Wachstumsmedium wird aus 30 g kondensierter Fischlösung behandelt, 4,49 g K HZ P 04 und 8,83 g Nag H P 0, - 7 HZ O hergestellt und alles mit Leitungswasser auf 1 1 aufgefüllt. Der pH-Wert dieses Mediums ist etwa 6,8. In jeden der zehn 300-ml-Kolben werden 100 ml des Wachstumsmediums gebracht und die Kolben mit Inhalt 15 Minuten bei 776 Torr Dampfdruck im Autoklav behandelt. Jedem abgekühlten Kolben werden dann 1 ml des im Beispiel 9 beschriebenen Impfmittels zugegeben und das Wachstum 12 Stunden zugelassen.
  • In jeden Kolben werden dann aseptisch 25 mg Cortisol zugegeben und die aerobe Inkubation weitere 24 Stunden lang durchgeführt. Die Fermentationsmischung wird dann, wie oben beschrieben, unter Gewinnung von 1-Dehydro-cortisol aufgearbeitet. Die Umwandlungen nach den Beispielen 9 und 10 können durch Benutzung von 1°/@gem Hefeextrakt (»Difco<<) in Leitungswasser als Nährmedium abgewandelt werden.
  • 11. Umwandlung von 6-Dehydro-cortison-21-acetat in 1-Dehydro-cortison 0,85 g 4,6-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat (6-Dehydro-cortison-21-acetat), das in der in Journal of the Biological Chemistry, Bd. 197 (1952), S. 261, beschriebenen Weise erhalten wurde, wird in 1,4,6-Pregnatrien-17a,21-diol-3,11,20-trion in der oben beschriebenen Weise durch Einwirkung der Enzyme einer Kultur von Corynebacterium simplex in einer Ausbeute von etwa 180/, umgewandelt. Dieses neue Trien besitzt adrenocortische Hormoneigenschaften und kann partiell zu dem entsprechenden 1,4-Dien durch Reduktion unter relativ milden Bedingungen hydriert werden, z. B. durch Zink, Essig- und Ascorbinsäure, wie in der angeführten Veröffentlichung beschrieben. In analoger Weise können andere 1,4,6-Pregnatriene aus Ausgangsprodukten mit einem System konjugierter Doppelbindungen, die im A- und B-Ring verteilt sind, hergestellt werden, und solche Pregnatriene können in gleicher Weise partiell zu den entsprechenden 1,4-Pregnadienen hydriert werden. Der Substituent in 3-Stellung kann eine OH-Gruppe sein; in diesem Fall befinden sich die konjugierten Doppelbindungen meistens an den 5,6- und 7,8-C-Atomen. Der Substituent in 11-Stellung kann ein a- oder ß-Hydroxyl sein oder kann überhaupt fehlen, und in 21-Stellung kann Methyl- an Stelle von Hydroxymethyl- oder Acyloxymethyl- sein. So kann 6-Dehydro-cortisol und 5,7-Pregnadien-3,11ß,17a,21-tetrol-20-on durch Einwirkung der obengenannten Kulturen in 1,6-bis-Dehydrocortisol umgewandelt werden. Weiterhin kann 6-Dehydro-Reichsteins-Substanz-S in 1,4,6-Pregnatrien-17a, 21-diol-3,20-dion umgewandelt werden. In jedem Falle kann der 21-Ester benutzt werden, der hydrolysiert oder nicht hydrolysiert werden kann. Durch partielle Hydrierung werden, wie oben beschrieben, die entsprechenden 1,4-Pregnadiene erhalten.
  • 12. Umwandlungvon4-Pregnen-lla,17a,21-triol-3,20-dion in 11-epi-l-Dehydro-cortisol Die Reaktion wird genau, wie für die Umwandlung von Cortisol in das entsprechende Dien beschrieben, durchgeführt und das Produkt durch Extraktion mit Chloroform isoliert und aus- Aceton-Hexan kristallisiert. Von 1,0 g des 11-epi-Cortisolswerden 0,25 g von 11-epi-l-Dehydro-cortisol in kristalliner Form isoliert. Fp. = 245 bis 246°C (Zersetzung).
  • Die Acetylierung von 11-epi-l-Dehydro-cortisol (1,0 g) wird durch Lösen in 15 ml wasserfreiem Pyridin und anschließendem Zusatz von 0,3g Essigsäureanhydrid durchgeführt. Man läßt die Reaktionsmischung über Nacht bei Zimmertemperatur stehen und gießt sie dann in Eiswasser. Die entstehende Fällung von 11-epi-l-Dehydrocortisol-21-acetat wird durch Filtration abgetrennt und aus Aceton-Hexan umkristallisiert.
  • 13. 1,4-Pregnadien-9a,fluor-21-ol-3,11,20-trion In einen 300-ml-Erlenmeyerkolben werden 100m1 eines 0,1°/oigen Hefeextraktes (»Difco«), der 9,0 m1 einer 0,2 m Kaliumdihydrogenphosphatlösung und 9,0 ml einer 0,2 m Dinatriumhydrogenphosphatlösung enthält, gegeben. Der Kolben mit Inhalt wird durch Behandlung im Autoklav 15 Minuten lang bei 120°C sterilisiert, und dem sterilen Medium wird 1 ml einer 1 °/jgen Suspension von Corynebacterium simplex zugegeben. Anschließend wird der Kolben mit Inhalt 24 Stunden bei 28°C inkubiert. In einen zweiten 300-ml-Erlenmeyerkolben werden 2 ml Äthanol und 25 mg 9a-Fluor-11-dehydro-corticosteron gegeben. Die Kultur wird nach 24stündigem Wachstum aseptisch in den Kolben, der das Steroid enthält, übertragen, und die Mischung wird bei 28°C inkubiert und 10 Stunden geschüttelt. Danach wird die Mischung mit Chloroform extrahiert und der Chloroformextrakt eingeengt. Der Rückstand wird aus Aceton-Hexan kristallisiert und liefert 4 mg 9a-Fluor-1,4-pregnadien-21-ol-3,11,20-trion. Das 21-Acetat dieser Verbindung wird durch Umsatz von 1 g dieses 21-Alkohols, in 20 ml abs. Pyridin mit 0,3 g Essigsäureanhydrid (über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen) und anschließende Verdünnung mit Eiswasser hergestellt.
  • In ähnlicher Weise wird 9a-Fluor-1,4-pregnadien-11ß, 21-diol-3,20-dion in einer Ausbeute von 5 mg aus 25 mg einfach ungesättigtem Ausgangsprodukt erhalten. Das 21-Acetat wird durch die übliche Acetylierung erhalten.
  • Durch Benutzung einer 1%igen Suspension von Corynebacterium hoagii an Stelle des Corynebacterium simplex werden bei sonst gleichen Bedingungen 25 mg von 9a-Chlor-corticosteron in 9a-Chlor-1,4-pregnadien-1lß, 21-diol-3,20-dion in einer Ausbeute von 7 mg umgewandelt. Das Produkt kann durch Umsatz mit Propionsäureanhydrid in das 21-Propionat umgewandelt werden. Ebenfalls mit Corynebacterium hoagii wird 9a-Bromcorticosteron-21-acetat in 9a-Brom-1,4-pregnadien-11ß, 21-diol-3,20-dion umgewandelt. Analog, jedoch bei einer Inkubationszeit von 48 Stunden (28 bis 30°C), wird 9a-Fluor-cortisol in 9a-Fluor-l-dehydro-cortisol umgewandelt. Entsprechend können 9a-Fluor-, 9a-Chlor- und 9a-Brom-cortison in 9a-Fluor-, 9a-Chlor- und 9a-Brom-1-dehydro-cortison umgewandelt werden. 9a-Chlor- und 9a-Brom-cortisol können analog zu 9a-Chlor- und 9a-Brom-l-dehydro-cortisol umgesetzt werden.
  • Die 17-Desoxyverbindungen können in die entsprechenden 17a-Hydroxyverbindungen (9a-Halogenderivate von 1-Dehydro-cortisol und 1-Dehydro-cortison) durch Einwirkung einer Kultur von Trichothecium roseum, wie unten beschrieben, umgesetzt werden.
  • 14. 1-Dehydro-Reichsteins-Substanz-S Je 1 ml einer Bouillonkultur, die als Impfmittel (10/0) nach Beispiel 9 hergestellt wird, wird in zehn Kolben gebracht, die 100 ml des sterilen Nährmediums enthalten, wie oben beschrieben. Die Kolben werden auf einer rotierenden Schüttelmaschine 8 Stunden bei 28'C und 240 Stößen pro Minute gerührt. Nach dieser Wachstumsperiode wird jedem Kolben eine Lösung von 25 mg Reichsteins-Substanz-S in 0,5 ml Methanol aseptisch zugegeben, der dann wiederum geschüttelt und weitere 24 Stunden inkubiert wird. Der pH-Wert beträgt am Ende 7,8. Der Inhalt der Kolben wird dann vereinigt und dreimal mit 21 Chloroform pro Extraktion extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte werden zur Trockne eingedampft, wobei 310 mg des Rohproduktes anfallen. Das rohe Steroid wird durch Chromatographie nach der Methode von G. M. Shull (Abstracts of Papers of the 126th Meeting of the American Chemical Society, December 12-17, 1954, S. 9 a) gereinigt. Die chromatographische Auswertung zeigt eine quantitative Umwandlung des Ausgangsmaterials in das 1,4-Dien. Das Rohprodukt kann aus Aceton umkristallisiert werden und liefert 225 mg 1-Dehydro-Reichsteins-Substanz-S. Fp. = 246 bis 248°C. 15. 1-Dehydro-cortisol Aus einer Lösung von 1°'oigem Hefeextrakt (,#>Difco") in Leitungswasser werden 10 Anteile von j e 100 ml abgezogen, in 300-ml-Kolben gebracht und durch Behandlung im Autoklav 15 Minuten bei 776 Torr Dampfdruck sterilisiert. Nach Behandlung im Autoklav und Abkühlung der Bouillon wird 1 ml einer geschüttelten Kultur von Bacillus sphaericus war. fusiformis, die in einer \ährbouillon, wie im Beispiel 14 beschrieben, gewachsen ist, in jeden Kolben gebracht. Die Kolben werden dann auf einem Schütteltisch 12 Stunden bei 28°C und 240 Stößen pro Minute geschüttelt. In jeden Kolben wird aseptisch eine Lösung von 25 mg Cortisol in 0,5 ml Methanol zugefügt und die Kolben mit Inhalt geschüttelt und weitere 8 Stunden inkubiert. Nach Vereinigung des Inhalts aller Kolben und Extraktion mit Chloroform, wie im Beispiel 14 beschrieben, werden 304 mg des rohen 1,4-Diens erhalten. Die Reinigung wird durch Umkristallisation aus Aceton durchgeführt unter Benutzung von entfärbender Kohle, worauf 230 mg von 1-Dehydro-cortisol erhalten werden. Fp. = 240 bis 241°C.
  • Bei Verwendung von 250 mg Cortisol-21-acetat als Ausgangsmaterial werden 220 mg von 1-Dehydro-cortisol-21-acetat erhalten. Fp. = 237 bis 239°C (Aceton-Hexan). 16. 1-Dehydro-cortison Ein Wachstumsmedium wird aus 30g kondensierter Fischlösung (enzymbehandelt), 4,49g KHZP04 und 8,83 g Na, H P 04 - 7 H2 O und Verdünnung mit Leitungswasser auf 1 1 hergestellt (pH-Wert etwa 6,8). In jeden von zehn 300-ml-Kolben werden 100 ml des Wachstumsmediums gebracht und die Kolben mit Inhalt 15 Minuten bei 776 Torr Dampfdruck im Autoklav behandelt. Jeder Kolben wird mit 1 ml von Bacillus sphaericus war. fusiformis wie im Beispiel 15 geimpft und das Wachstum 12 Stunden lang zugelassen. Jedem Kolben wird dann aseptisch eine Lösung von 50 mg Cortison in 1 ml Methanol zugesetzt und das Schütteln und die Inkubation weitere 24 Stunden fortgesetzt. Der Inhalt der Kolben wird vereinigt und, wie im Beispiel 14 beschrieben, mit Chloroform extrahiert, wobei 630 mg des rohen 1-Dehydro-cortisons erhalten werden. Die Reinigung wird durch Kristallisation aus Aceton in Gegenwart von Aktivkohle durchgeführt, worauf 420 mg 1-Dehydrocortison erhalten werden. Fp. = 233 bis 235°C.
  • Analog wird Corticosteron in 1-Dehydro-corticosteron umgewandelt. Nach Beispiel 14 wird 9a-Fluor-cortisol in 9a-Fluor-l-dehydro-cortisol umgewandelt, das als kristalliner Körper erhalten wird.
  • Nach Beispiel 16 wird 5-Pregnen-3ß,20-diol in 1,4-Pregnadien-3,20-dion umgewandelt, Fp. = 152 bis 153'C nach Extraktion mit Chloroform, Verdampfung und Umkristallisation des Rückstandes aus Äther.
  • Desoxycorticosteron kann nach Beispiel 14 in 1,4-Pregnadien-21-ol-3,20-dion umgewandelt werden.
  • Die dehydrierenden Mikroorganismen bewirken somit die Einführung einer Doppelbindung in der 4,5-Stellung unter gleichzeitiger Oxydation der 3-Hydroxylgruppe der 3-Hydroxy-5-pregnene und gleichzeitiger Dehydrierung in 1,2-Stellung. Obwohl Kulturen der dehydrierenden Mikroorganismen auf 3-Hydroxy- oder 3-Keto-l-pregnene einwirken können, ist es vorteilhaft, als Ausgangsmaterial Verbindungen zu benutzen, die eine Doppelbindung am 5-C-Atom besitzen.
  • Die Beispiele 17 bis 19 zeigen verschiedene Kombinationen der mikrobiologischen 1,2-Dehydrierung in Verbindung mit anderen mikrobiologischen Umwandlungen. 17. A. 1,4-Pregnadien-17a-ol-3,20-dion (11c) Mit Hilfe der im Beispiel 3 beschriebenen Kultur ,werden 150,0 mg steriles 4-Pregnen-17a-ol-3,20-dion (17a-hy droxy-progesteron) (I c) in 5,0 ml Äthanol dehydriert. Der rohe Extrakt wiegt 178 mg. Das Rohprodukt wird aus Aceton-Hexan kristallisiert und liefert reine Kristalle von 1,4-Pregnadien-17a-ol-3,20-dion (IIc).
  • B. 1,4-Pregnadien-11a,17a-diol-3,20-dion (111c) Diese Umwandlung wird mit Hilfe einer Kultur von Rhizopus nigricans in der im einzelnen im Journal of the American Chemical Society, Bd. 74 (1952), S. 5933, beschriebenen Weise durchgeführt. Zu 61 einer 24-Stunden-Wachstumskultur von Rhizopus nigricans wird 1,0 g von 11c in 200 mI Äthanol zugefügt. Nach einer 48stündigen Umwandlungsperiode in der Anordnung und dem Medium, wie in der obigen Veröffentlichung beschrieben, wird die Kultur mit Methylenchlorid extrahiert, das Lösungsmittel abgedampft. Der rohe kristalline Rückstand liefert aus Aceton-Hexan umkristallisiert kristallines 1,4-Pregnadien-lla,17a-diol-3,20-dion (IIIc). C. 1,4-Pregnadien-17a-ol-3,11,20-trion (Vc) Eine Lösung von 3,0 g von IIIc in 30 ml Pyridin wird langsam zu einer Aufschlämmung von 1,5 g Chromsäure in 15 ml Pyridin gegeben (Poos und Mitarbeiter, Journal of the American Chemical Society, Bd. 75 -1953j, S. 422) und die entstehende Mischung wird über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Zu der Reaktionsmischung werden dann 4,5g Natriumsulfit in 45 ml Wasser zugefügt und weitere 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird in 600 ml Wasser eingegossen und die entstehende Lösung mit Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte werden mit verdünnter Schwefelsäure, wäßrigem Natriumcarbonat und Wasser neutral gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Konzentration der getrockneten Lösung und Kristallisation des Rückstandes aus Aceton-Hexan entsteht kristallines 1,4-Pregnadien-17a-ol-3,11,20-trion (Vc).
  • D. 1-Dehydro-cortison (II a) 41 eines 1o/oigen Hefeextraktes (@,Difco") werden in einem Schüttelkolben sterilisiert und mit einer Gattung von Ophiobolus herbotrichus geimpft. Die Kultur wird 3 Tage lang unter Schütteln bei 27°C inkubiert. Dann wird 1,0 g von Vc in 25 ml Aceton (steril) aseptisch dem Schüttelkolben zugesetzt und das Schütteln weitere 3 Tage bei 27°C fortgeführt. Das Myzel wird von der Reaktionsmischung abgetrennt und ebenso wie das wäßrige Filtrat mit 3 Anteilen von Chloroform vollständig extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, mit Wasser gewaschen und konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird über >>FlorisiL, (Magnesiumsilikat) (30 g) chromatographiert und die Säule mit Methylenchlorid gewaschen. Mit 0,5 °j', und 1,0 % Methanol enthaltendem Methylenchlorid wird das 1-Dehydro-cortison eluiert und aus Äceton-Hexan umkristallisiert. 18. A. Herstellung von 1,4-Pregnadien-llß,17-diol-3,20-dion (IV c) aus II c Eine Kultur von Curvularia lunata (Identifizierung nach »United States Quartermaster Corps.,, Philadelphia) läßt man in Kolben wachsen, die das gleiche Medium, wie im Beispiel 17 beschrieben, enthalten (s. auch USA.-Patentschrift 2 658 023). 100 ml dieses Impfmittels werden unter sterilen Bedingungen in 21 eines wäßrigen Mediums gegeben, das die folgenden Bestandteile enthält: Rohrzucker ........................ 1 Difco trypton ...................... 1 Natriumnitrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 Dikaliumhydrogenphosphat .......... 0,1 Magnesiumsulfat-Heptahydrat . . . . . . . . 0,05 Kaliumchlorid...................... 0,05 Ferrosulfat-Heptahydrat . . . . . . . . . . . . . 0,001 Diese Mischung wird auf p$ 7 mit Schwefelsäure gebracht und, ehe die Mischung sterilisiert wird, wird 0,25 °/o Calciumcarbonat zugesetzt. Das geimpfte Medium wird 24 Stunden bei 27 bis 28°C belüftet, und zwar pro Minute mit etwa 1i'2 bis 1 Volumen Luft pro Volumen Lösung. Während dieser Zeit wird die Mischung mit einem Rührer, der mit etwa 1700 Umdrehungen pro Minute rotiert, gerührt. 1/2 g von 1,4-Pregnadien-17a-ol-3,20-dion (II c) wird in 20 ml 95°/@gem Äthanol gelöst. Die Lösung wird der Fermentationsmischung unter sterilen Bedingungen zugefügt. Die Reaktion -wird dann weitere 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen fortgesetzt.
  • Die Fermentationsmischung wird mit 3 Teilen Methylenchlorid extrahiert, die vereinigten Extrakte werden über Magnesiumsulfat getrocknet und auf ein kleines Volumen eingeengt. Die konzentrierte Lösung wird einer Säule von Florisil (Magnesiumsilikat) (30 g) zugeführt, die mit Heran beschickt wird, und wird anschließend mit Heran, das Äther in wechselnden Mengen (zwischen 1 und 99 °/,) enthält, eluiert. Das erwünschte Produkt wird aus den am stärksten voneinander entfernten Flutionen (25 °/o Äther -+- 99 °/o Äther) gesammelt und aus Aceton-Hexan umkristallisiert, wobei kristallines 1,4-Pregnadien-11ß,17a-diol-3,20-dion (IVc) erhalten wird. B. Herstellung von V c aus IV c Diese Reaktion -wird genau wie die Umwandlung von 1I1 c in V c durchgeführt. Das Produkt wird dann in Ha in der oben beschriebenen Weise umgewandelt.
  • 19. Herstellung von 11-epi-l-Dehydro-cortisol (VIIa) aus IIIc Das gleiche Verfahren wie bei der Umwandlung von V c in Il a wird angewendet. Als Ausgangsmaterial wird III c verwendet. VIIa wird durch Chromatographie über Florisil (Magnesiumsilikat) isoliert. (Flution durch 1 bis 20/, Methanol enthaltendes Methylenchlorid.) Die Umkristallisation von VIIa aus Aceton ergibt ein kristallines Produkt. Fp. = 243 bis 245°C.
  • Analog der Umwandlung von V c in Ha wird IV c in III a umgewandelt. Die Umkristallisation von III a aus Aceton ergibt Kristalle mit einem Fp. = 238 bis 240°C.
  • Die Oxydation von III a oder VII a, vorzugsweise in Form der 21-Acetate oder anderer niederer Alkanoylester (IIIb und VIIb), wird nach dem Verfahren, wie zur Umwandlung von III c in V c beschrieben, durchgeführt. Die 21 Acetatgruppe wird mit Kaliumhydrogencarbonat in wäßrigem Methanol hydrolysiert (Herstellung von IIa).
  • Die Umwandlung von I c in 4-Pregnen-11a,17a-diol-3,20-dion (VIc) (Weg B) wird durch dieselbe Umwandlung durchgeführt, wie sie bei der Umwandlung von IIc in IIIc angewandt wurde (Beispiel 17, B).
  • 4-Pregnen-11ß,17a-diol-3,20-dion (VIIc) wird aus Ic -wie IV c aus Il c hergestellt. Die Verbindungen VI c und VIIc werden beide zu 4-Pregnen-17a-ol-3,11,20-trion (VIII c) oxydiert, analog der Umsetzung von III c und IVc zu Vc.
  • Die noch verbleibenden Umwandlungen nach Weg B folgen in gleicher Weise auf die Reaktionen des Weges A. So wird Verbindung V I c in III c und Verbindung VIII c in V c umgewandelt, während Verbindung VII c in I V c umgewandelt wird in gleicher Weise, wie I c in II c umgewandelt wurde, d. h. durch Behandlung mit einer Kultur oder einem enzymatischen Extrakt einer Kultur von Corynebacterium simpler oder hoagii. In diesem Falle sind die Umwandlungen die gleichen wie in Weg A. 20. A. 1,4-Pregnadien-21-ol-3,20-dion (II d) 150,0 mg steriles 4-Pregnen-21-ol-3,20-dion (1d) in 5,0 ml Äthanol werden der Fermentation in dem gleichen Medium, mit dem gleichen Mikroorganismus und in gleicher Weise, wie im Beispiel 17,A beschrieben, unterworfen, wobei ein roher Extrakt gewonnen wird, der 137 mg wiegt. Das Rohprodukt wird aus Aceton-Hexan umkristallisiert und liefert kristallines 1,4-Pregnadien-21-ol-3,20-dion (Il d). B. 1,4-Pregnadien-l la,21-diol-3,2Q-dion (III d) 1,0 g 1I d in 200 ml Äthanol wird in einer Kultur von Rhizopus nigricans in der im Beispiel 17, B beschriebenen Weise behandelt. Der rohe kristalline Rückstand wird aus Aceton-Hexan umkristallisiert und liefert kristallines 1,4-Pregnadien-lla,21-diol-3,20-dion (IIId). C. 1,4-Pregnadien-21-ol-3,11, 20-trion (V d) Eine Lösung von 3,0 g III d in 30 ml Pyridin wird in der im Beispiel 17, C beschriebenen Weise oxydiert. Die Verdampfung des getrockneten Methylenchloridextraktes und Kristallisation des Rückstandes aus Aceton-Hexan liefert kristallines 1,4-Pregnadien-21-ol-3,11,20-trion (Vd). D. 1-Dehydro-cortison (Il a) 21 von Czapek-Dox-Medium wird in einem Schüttelkolben sterilisiert und mit einer Gattung von Trichothecium roseum geimpft. Nach 3tägigem Schütteln bei 27°C werden der Kultur aseptisch 500 mg 1,4-Pregnadien-21-ol-3,11,20-trion (Vd) in 15 ml Aceton zugefügt. Das Schütteln wird 60 Stunden bei 27°C fortgeführt. Das Myzel wird abgetrennt und ebenso wie das wäßrige Filtrat mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden gut mit Wasser gewaschen, getrocknet und konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird über »Florisila (Magnesiumsilikat) chromatographiert und 1-Dehydrocortison (IIa) wird in den 0,5 und 1,0 °/o Methanol erthaltenden Methylenchloridfraktionen eluiert und anschhe- Bend mit Methylenchlorid aus der Säule gewaschen. Die Umkristallisation der angegebenen Fraktionen ausAceton liefert Kristalle von Ha, Fp. 226 bis 229°C (Zersetzung).
  • 21. A. 1,4-Pregnadien-llß,21-diol-3,20-dion (IVd) Man läßt eine Kultur von Curvularia lunata (Identifizierung nach -United Stetes Quartermaster Corps«, Philadelphia) in Kolben wachsen, die das gleiche Medium, wie im Beispiel 1 der USA.-Patentschrift 2 658 023 beschrieben, enthält und benutzt sie wie im Beispiel 18, A für die Umwandlung von 1,4-Pregnadien-21-ol-3,20-dion (Il d). Aus den am meisten voneinander entfernten Eluaten (25 °,1p Äther -+- 99 0, 1, Äther) wird 1,4-Pregnadienllß,21-diol-3,20-dion (IVd) erhalten, das aus Aceton-Hexan umkristallisiert wird. B. Herstellung von 1,4-Pregnadien-21-ol-3,11,20-trion (Vd) Diese Reaktion wird analog der Umwandlung von IIId in Vd durchgeführt. Als Ausgangsmaterial wird IVd verwendet.
  • Verbindung III wird in 11-epi-l-Dehydro-cortisol (VIIa) analog der Umwandlung von V d in Ha, übergeführt. Das Produkt wird chromatographisch über »Florisil« (Mag:iesiumsilikat) durch 1 und 2 °,'o Methanol enthaltendes Methylenchlorid eluiert. Die Umkristallisation von VII a aus Aceton ergibt das Produkt in kristallierter Form; Fp. = 243 bis 245'C.
  • In gleicher Weise wird das zur Umwandlung von IV d in I I I a angewandte Verfahren benutzt, um V d in I I a überzuführen. III a wird durch Chromatographie über -FlorisiL (Magnesiumsilikat), wie oben beschrieben, isoliert. Die Umkristallisation von III a aus Aceton ergibt ein kristallines Produkt; Fp. = 238 bis 240` C.
  • Die Oxydation von III a oder VII a, vorzugsweise als 21-Acetat, wird entsprechend der Umsetzung von IIId zu Vd durchgeführt. Die 21Acetatgruppe wird durch Erhitzen mit Kaliumhydrogencarbonat in wäßrigem Methanol hydrolvsiert unter Bildung von Ha.
  • Die Umwandlung von 4-Pregnen-11a,21-diol-3,20-dion (V1 d) , 4-Pregnen-1 lß,21-diol-3,20-dion (VII d) und 4-Pregnen-21-ol-3,11,20-trion (VIIId) zu IIId, IVd und Vd wird entsprechend der Umwandlung von I d in II d durchgeführt.
  • In analoger Weise folgt die Umwandlung von I d in die Zwischenprodukte VId und VIId analog der Umwandlung von Il d in III d bzw. IV d. Die Verbindungen VI d und VIId werden unter milden oxydierenden Bedingungen, wie oben beschrieben, in VIII d übergeführt.
  • Wie im vorangegangenen beschrieben, können an Stelle von Desoxycorticosteron und seinen Estern 5-Pregnen-3,21-diol-20-on und seine 21-Ester, wie das Acetat und andere, niedere Alkanoylester, als Ausgangsprodukte benutzt werden. Man kann so 5-Pregnen-3,21-diol-20-on und seine 21-Ester in Il a und seine 21-Ester überführen.
  • Bessere Ausbeuten bei der Oxydation von lla-OH und 11ß-0 H-Verbindungen zu den entsprechenden 11-Ketoverbindungen «-erden im allgemeinen unter weniger schwierigen Umständen erhalten, wenn das 21-Hydroxyl zunächst in der in Beispielen 20,C und 21, B beschriebenen Weise verestert wird (anschließend eventuell Hydrolyse).
  • Das 21 .,1cetat von Vd kann durch die Oxydation des 11-Hydroxyls der 21-Acetate von IIId und IVd mit Chromsäure in Pvridin erhalten werden. Der 21-Ester von V d wird durch Behandlung am Rückfluß mit Kaliumcarbo iat in wägrigem Metha-iol leicht hydrolysiert.
  • Verbindungen. VId und VIId lassen sich in ihre 21-Acetate in gleicher Weise wie IIId und IVd umwandeln. Die Oxydation von VId-21Acetat und VIId-21-Acetat zu VIIId-21-Acetat erfolgt analog der Oxydation von III d-21-Acetat zu V d-21-Acetat.
  • Im Formelschema für Weg D wird die Umwandlung von 16-Dehydro-pregnenolon (Ie) und 16-Dehydro-progesteron (III e) in 1-Dehydro-cortison (II a) über die 16,17-Epoxyde gezeigt. Diese Wege umfassen ebenfalls die Anlagerung eines 11(a oder ß) -Hydroxyls, die Anlagerung eines 21-Hydroxyls, die Einführung eines 17a-Hydroxyls durch Öffnung des 16,17-Oxidoringes, die Einführung der 1,2-Doppelbindung und die Oxydation des 11-Hydroxyls zu Ketosauerstoff. Während die Ordnung dieser Reaktionen innerhalb gewisser Grenzen abgeändert werden kann (beispielsweise muß der Oxydationsschritt auf die Einführung des 11-Hydroxyls folgen), ist es vorteilhaft, die Behandlung mit dem dehydrierenden Mikroorganismus nach der Anlagerung einer Hydroxylgruppe zum mindesten in einer der 11,17a- und 21-Stellungen oder nach der Bildung des 16,17-Epoxyds durchzuführen. 22. 1-Dehydro-cortison 1 g von 16-Dehydro-progesteron (III e), in 25 ml Chloroform gelöst, wird bei Zimmertemperatur etwa 15 Stunden lang mit der äquivalenten Menge von Benzopersäure, in Chloroform gelöst, umgesetzt. Der Reaktionsmischung wird dann Wasser zugesetzt, die organische Schicht zunächst mit Natriumsulfitlösung, dann mit Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und dann über Natriumsulfit getrocknet. Das Chloroform wird abgedampft und der Rückstand aus einer Mischung von Aceton und Heran kristallisiert, wobei 16,17-Oxido-4-pregnen-3,20-dion (IV e) entsteht.
  • Eine Suspension von 1 g von 16,17-Epoxyd in 10 ml Eisessig wird mit einer Lösung von 1,1 g 47°;'oigem wäßrigem Jodwasserstoff, 10 ml Essigsäure und 4,1 g Essigsäureanhydrid gemischt. Die Temperatur wird bei etwa 15 bis 20'C während der Anlagerung und einer weiteren halben Stunde gehalten. Die ;Mischung wird dann in 5 Volumina Wasser gegossen, filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Rohprodukt ist 16-Jod-4-pregnen-17a-ol-3,20-dion und wird in 100 ml Äthanol und 1 ml Essigsäure gelöst und etwa 6 Stunden mit 2,5 g Raneynickel am Rückfluß behandelt. Der Katalysator wird dann durch Filtration entfernt, das Filtrat konzentriert und dann nach Zusatz von Wasser eine Fällung von 17a-Hydroxy-progesteron (VII e) erhalten.
  • 41 eines 1°/oigen Hefeextraktes (»Difco«) werden im Schüttelkolben sterilisiert und mit Ophiobolus herbotrichus geimpft. Die Kultur wird 3 Tage unter Schütteln bei 27°C inkubiert, dann wird 1,0 g 17a-Hydroxyprogesteron in 25 ml Aceton (steril) aseptisch zugesetzt und weitere 3 Tage bei 27°C geschüttelt. Das Myzel wird abgetrennt und ebenso wie das wäßrige Filtrat mit 3 Anteilen Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, getrocknet, konzentriert und an Florisil (Magnesiumsilikat) chromatographiert. Das bei der Elution z. B. mit 0,5 bis 1,5 °/p Methanol enthaltendem Methylenchlorid erhaltene Material wird aus Aceton-Hexan kristallisiert und ergibt Reichsteins-Substanz-S- (VIIIe).
  • Eine Lösung von 1,0 g VIII e in 150 ml Äthanol wird 1 1 einer 24-Stunden-Wachstumskultur von Rhizopus nigricans zugesetzt. Nach 48stündiger Inkubation wird die Mischung mit Methylenchlorid extrahiert und der organische Extrakt zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wird aus Aceton-Hexan kristallisiert und ergibt 4-Pregnen-11a,17a,21-triol-3,20-dion (IXe).
  • Die Verbindung IXe wird nun der Einwirkung einer Kultur eines dehydrierenden Mikroorganismus, wie z. B. Corynebacterium simpler, unterworfen. Nach etwa 48stündiger Inkubation bei 28°C wird 11-epi-l-Dehydrocortisol (Xe, VIIa) erhalten. Diese Verbindung wird dann, wie oben beschrieben, zu 1-Dehydro-cortison (IIa) oxydiert.
  • Durch Verwendung einer Kultur von Curvularia lunata (Identifizierung nach »United States Quartermaster Corps«, Philadelphia) wird nach Beispiel 18, A aus IXe IIIa erhalten, das analog zu 1-Dehydro-cortison oxydiert werden kann. 23. 1-Dehydro-cortison 16-Dehydro-pregnenolon wird in das 16,17-Epoxyd durch Behandlung mit Perphthalsäure übergeführt. Das 16,17-Oxido-5-pregnen-3-ol-20-on (IIe) wird dann in das lla-Hydroxyderivat (XIe) durch Behandlung mit einer Kultur von Rhizopus nigricans umgewandelt. XI e wird der Einwirkung einer Kultur von Ophiobolus herbotrichus unterworfen unter Bildung von 16,17-Oxido-5-pregnen-3,lla,21-triol-20-on (XIIe). Der Epoxydring wird mit H J geöffnet, wobei 5-Pregnen-3,lla,17a,21-tetrol-20-on (XIII e) entsteht. Aus XIII e bildet sich durch Einwirkung einer Kultur eines dehydrierenden Mikroorganismus 11-epi-l-Dehydro-cortisol (Xe), daszu 1-Dehydro-cortison oxydiert werden kann.
  • 16-Dehydro-pregnenolon kann auch zunächst mit einer Kultur von Ophiobolus herbotrichus behandelt werden unter Bildung von 5,16-Pregnadien-3,21-diol-20-on, das in an sich bekannter Weise zum 3,21-Diacetat acetyliert wird. Bei Behandlung mit einem dehydrierenden Mikroorganismus wird dieses Diacetat in 1,4,16-Pregnatrien-21-ol-3,20-dion umgewandelt, das, wie oben beschrieben, in das 16,17-Epoxyd übergeführt wird, das, wie ebenfalls oben beschrieben, durch Spaltung und Reduktion in 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion übergeführt werden kann. Letzteres kann durch Behandlung mit einer Kultur Curvularia lunata in 1-Dehydro-cortisol übergeführt werden.
  • An Stelle der Persäuren kann zur Bildung des Oxidoringes Wasserstoffperoxyd zusammen mit einer Alkalimetallbase (Na0 H; K 0 H) benutzt werden. Diese Mischung kann einen Alkohol, wie z. B. Methanol oder tert.-Butanol, enthalten, um die Lösung der Steroidkomponente zu unterstützen; aber ein solcher Alkohol ist im allgemeinen nicht unbedingt notwendig.
  • Zusätzliche Ausgangsprodukte sind 5,16-Pregnadien-3,11-diol-20-on und seine 3-Ester, 5,16-Pregnadien-3,21-diol-20-on und seine 3- und 21-Ester 5,16-Pregnadien-3,11,21-triol-20-on und seine 3- und 21-Ester und 4,16-Pregnadien-21-ol-3,11,20-trion und seine 21-Ester, die in beliebiger Reihenfolge der Einwirkung der Kultur eines dehydrierenden Mikroorganismus und der Behandlung mit einer Persäure oder mit Wasserstoffperoxyd unterworfen werden können. 24. A. 11-epi-l-Dehydro-cortisol (VII a) Entsprechend der in Journal of the American Chemical Society, Bd. 74 (1952), S. 5933, beschriebenen Verfahrensweise wird zu 61 einer 24-Stunden-Wachstumskultur von Rhizopus nigricans 1,0 g von 1-Dehydro-Reichsteins-Substanz-S in 200 ml Äthanol gegeben. Nach 48stündiger Inkubation in der Anordnung und dem Medium, wie in der vorgenannten Veröffentlichung beschrieben, wird mit Methylenchlorid extrahiert und der rohe, kristalline, feste Rückstand dreimal mit 5 ml Anteilen von eiskaltem Chloroform gewaschen. Die Ausbeute an Verbindung VII a beträgt 0,9 g. Das Produkt wird aus Aceton-Hexan umkristallisiert.
  • B. 1-Dehydro-cortison (II a) Einer Lösung von 0,4g VIIa in 10m1 wasserfreiem Pyridin wird 0,11 g Essigsäureanhydrid zugesetzt. Man läßt die Reaktionsmischung bei Zimmertemperatur über Nacht stehen und gibt sie dann in eine Mischung von 0,15 g Chromtrioxyd in 15 ml Pyridin (das Chromtrioxyd-Pyridin-Reagens wird nach P o o s und Mitarbeiter, Journal of the American Chemical Society, Bd. 75 [1953], S. 422) hergestellt. Man läßt die entstehende Mischung über Nacht bei Zimmertemperatur stehen und gießt sie dann in 5 Volumina Wasser. Das Produkt wird mit Methylenchlorid extrahiert und wie üblich aufgearbeitet. Die Kristallisation des 21-Acetats von Ha wird mit Aceton-Hexan durchgeführt und liefert 0,21 g feste Kristalle (IIb).
  • Zu einer Lösung von 0,12 g des 21-Acetats von Ha in 3,3 ml Methanol wird 0,0315 g Kaliumhydrogencarbonat in 0,5 ml Wasser zugesetzt. Die Mischung wird 3 Minuten am Rückfluß behandelt und schnell abgekühlt. Sie wird dann mit Wasser verdünnt, mit verdünnter Salzsäure neutralisiert und mit Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte werden getrocknet und eingedampft. DerRückstand wird aus Aceton-Hexan kristallisiert und liefert 0,051 g 1-Dehydro-cortison (IIa). 25. A. 1-Dehydro-cortisol (III a) 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion (0,5 g) wird mit einer Kultur von Curvularia lunata (Identifizierung nach »United States Quartermaster Corps«, Philadelphia) behandelt, die in der folgenden Weise hergestellt wurde: Man läßt Curvularia lunata 2 Tage in Schüttelkolben bei 28°C auf einem Malz-Rohr-Zucker-Salze-Mediumwachsen. 100 ml dieser Kultur werden benutzt, um 2000 ml des gleichen Mediums, das in einem mit einem untergetauchten Belüfter versehenen Fermenter enthalten ist, zu beimpfen. Das geimpfte Medium wird bei 1700 Drehungen pro Minute gerührt und 22 Stunden bei 28°C belüftet mit 0,5 Volumen Luft pro Volumen Medium. 50 g des durch Filtration der so hergestellten Bouillon erhaltenen feuchten Myzels werden in 2000 ml Wasser mit dem vorgenannten Steroid in einen Fermenter gegeben. Nachdem die Myzel-Steroid-Suspension, wie oben beschrieben, 22 Stunden gerührt wurde, wird sie mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden getrocknet, eingeengt und an »Florisil« (Magnesiumsilikat) chromatographiert. Die Florisilsäule wird mit Hexan beschickt, die Steroidmischung in Methylenchloridlösung zugegeben und die Elution mit Methylenchlorid und Methylenchlorid-Methanol-Mischungen durchgeführt. Nicht umgewandeltes Ausgangsprodukt wird mit 0,5 °/o Methanol enthaltendem Methylenchlorid eluiert und das erwünschte Produkt III a in 1 bis 2 °/o Methanol enthaltendem Methylenchlorid eluiert. Aus 0,5 g 1-Dehydro-Reichsteins-Substanz-S werden 0,17 g IIIa als kristalliner Körper erhalten; Fp. = 237 bis 239°C. B. 1-Dehydro-cortison (II a) Verbindung III a wird in Verbindung Ha analog der Umwandlung von VII a in Ha übergeführt. Aus 0,400 g III a werden 0,205 g II a erhalten. 26. 1-Dehydro-cortison (IIa) Eine Lösung von 1 g Uopregnan-17a,21-diol-3,11, 20-trion-21-acetat in 15 ml Essigsäure wird durch Zusatz von 0,80 g Brom in 10 ml Essigsäure bromiert. Durch Zusatz von Wasser fällt das 2,4-Dibrom-allopregnan-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat aus. Ohne Reinigung wird das Dibromid (1,5 g) in 50 ml Collidin 1 Stunde am Rückfluß behandelt. Chloroform und Wasser werden zugesetzt, der organische Extrakt mit verdünnter Schwefelsäure und dann mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Das Rohprodukt wird an nFlorisil« (Magnesiumsilikat) chromatographiert und ergibt 1-Dehydro-cortison-21-acetat (Ib, R = Acetyl); Fp. = 232 bis 235°C (Zersetzung).
  • In gleicher Weise wird durch Bromierung von Pregnan-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat mit 2 Äquivalenten Brom und Dehydrobromierung mit Hilfe von Collidin das 1-Dehydro-cortison-21-acetat erhalten.
  • Durch 2,4-Bromierung von Allopregnan-llß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat und anschließende Dehydrobromierung mit Collidin wird das 1-Dehydro-cortisol-21-acetat erhalten.
  • Analog liefert die Bromierung von Pregnan-11ß,17a, 21-triol-3,20-dion-21-acetat mit 2 Mol Brom und anschließende Dehydrobromierung mit Collidin das 1-Dehydro-cortisol-21-acetat.
  • Allopregnan-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat kann durch Hydrierung von 2,00 g Cortison-21-acetat in 200 ml Äthylacetat mit Wasserstoff bei Atmosphärendruck und Zimmertemperatur hergestellt werden, wobei 0,20 g von 5 °/o Palladium an Kohle als Katalysator benutzt werden. Man läßt die Reaktion über Nacht fortschreiten, entfernt den Katalysator durch Filtration und verdampft das Filtrat unter vermindertem Druck. Die Allopregnanverbindung wird aus Aceton umkristallisiert. Ebenso kann Allopregnan-llß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat durch Hydrierung von 5,0 g Cortison-21-acetat in 750 ml Äthylacetat mit Wasserstoff in Gegenwart von 0,5 g 5°/oiger Palladiumkohle gewonnen werden.
  • II a 21-Acetat und III a-21-Acetat können durch Behandlung am Rückfluß mit Hydrogencarbonat in wäßrigem Methanol hydrolysiert werden unter Bildung der entsprechenden freien Alkohole. 27. 11-epi-l-Dehydro-cortisol-21-acetat Eine Lösung von 2,0 g Pregnan-lla,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat in 25 ml Essigsäure wird in den Stellungen 2 und 4 durch Anlagerung von 1,60 g Brom in 15 ml Essigsäure bromiert. Das rohe 2,4-Dibrompregnanlla,17a,21-triol-3,20-dion 21-acetat wird durch Zusatz von Wasser gefällt. Die 1stündige Dehydrobromierung mit 100 ml Collidin ergibt nach Chromatographie 11-epi-1-Dehydro-cortisol-21-acetat (VIIb). Die Hydrolyse mit Kaliumhydrogencarbonat in wäßrigem Methanol durch 10 Minuten lange Behandlung am Rückfluß ergibt 11-epi-1-Dehydro-cortisol (VIIa). Die Oxydation des Acetats mit Cr03, N-Bromacetamid oder N-Bromsuccinimid ergibt I I b. 28. A. 4-Pregnen-2,17a,21-triol-3,11,20-trion-2,21-diacetat (IIh) Eine Lösung von 2,0 g 6-Brom-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat in 100 ml Eisessig wird unter Rückfluß in einer Stickstoffatmosphäre mit 10 g wasserfreiem Kaliumacetat 4 Stunden erhitzt. Die Reaktionsmischung wird dann mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte werden getrocknet, im Vakuum eingeengt und der Rückstand in einem kleinen Volumen von Methylenchlorid aufgenommen. Die entstehende Lösung wird an 2#Florisil" (Magnesiumsilikat) chromatographiert und das feste Material, das mit 50°/oigem Äther-Hexan eluiert wird, mehrere Male aus Aceton-Hexan umkristallisiert. Man erhält 4-Pregnen-2,17a,21-triol-3,11,20-trion-2,21-diacetat; Fp. = 210 bis 215°C. @,nax = 238 (s = 14,700). (Alkohol.) B. 4-Pregnen-2,17a,21-triol-3,11,20-trion (IIIh) Zu einer Lösung von 1,0 g IIh in 100 ml Methanol werden unter Stickstoff 0,45 g Kaliumhydrogencarbonat, in 10 ml Wasser gelöst, bei Kochen am Rückfluß zugesetzt. Die Mischung wird 3 bis 5 Minuten am Rückflu13 gekocht und der pH-Wert auf 6,8 bis 7,0 durch Zusatz von Essigsäure eingestellt. Die entstehende Mischung wird dann im Vakuum bis auf einen festen Rückstand eingeengt, der Rückstand mit Äthylacetat extrahiert, und die Extrakte werden konzentriert. Die Rückstände werden aus Aceton-Hexan kristallisiert und liefern 4-Pregnen-2,17a,21-triol-3,11,20-trion. 29. A. 6-Brom-cortisol-11-formiat-21-acetat (IVh) Zu 160 ml Chlorbenzol werden 1,6 g 4-Pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion-11-formiat-21-acetat zugesetzt und die Mischung bis zur vollständigen Lösung des Steroids erwärmt. Hierauf werden 180 ml trockner Tetra-Chlorkohlenstoff zugesetzt und die Mischung gekocht, um das Wasser zu entfernen. Dann werden 4,2 ml einer 10°/jgen Lösung von Pyridin in Tetrachlorkohlenstoff und 0,79 g N-Bromsuccinimid zugesetzt, Kohlendioxyd durch die Mischung geleitet, wobei die Mischung mit einer 50-Watt-Glühbirne mit mattierter Oberfläche, die vor den Kolben gebracht wird, erleuchtet wird, und die Reaktionsmischung schnell zum Sieden erhitzt. Nach 10 bis 20 Minuten Erhitzen hat sich das N-Bromsuccinimid vollständig umgesetzt. Die Lösung wird abgekühlt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand kann aus Methylenchlorid-Hexan kristallisiert werden, wobei die kristalline Verbindung IVh erhalten wird. B. 4-Pregnen-2,11ß,17a,21-tetrol-3,20-dion-11-formiat-2,21-diacetat Die Reaktion wird, wie im Beispiel 28 beschrieben, durchgeführt. Ausgangssteroid ist IVh. Das obengenannte Produkt wird über »Florisil« (Magnesiumsilikat) chromatographiert, und die Kristallfraktionen (501/, Äther-Hexan und 100 °/o Äther) werden gesammelt und aus Aceton-Hexan umkristallisiert. C. 4-Pregnen-2,11ß,17a,21-tetrol-3,20-dion (VIh) Eine Lösung von 0,5 g des Triesters in 50 ml Methanol wird mit einer Lösung von 0,165 g Natriumhydroxyd in 5 ml Wasser unter einer Argonatmosphäre behandelt. Man läßt die Reaktionsmischung bei Zimmertemperatur über Nacht stehen und neutralisiert sie dann mit Essigsäure. Die Lösung wird im Vakuum konzentriert und der Rückstand vollständig mit Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte werden eingeengt und der Rückstand aus Aceton-Hexan kristallisiert, wobei kristallines 4-Pregnen-2,llß,17a,21-tetrol-3,20-dion (VIh) entsteht. 30. A. 1,2-Oxidopregnan-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat (IIi) Zu einer Lösung von 0,4g 1-Pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trio_n=21-äcetat (Ii) in 100 ml Chloroform werden bei 5'£ 0,14 g Benzopersäure in 25 ml Chloroform zugesetzt. Man läßt die Mischung bei 5'C über Nacht stehen und wäscht sie dann mit verdünntem, wäßrigem Natriumhydrogencarbonat. Die Chloroformlösung wird getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird aus Aceton-Hexan kristallisiert und liefert die kristalline Verbindung IIi.
  • B. 2-Brompregnan-17a,21-triol-3,11,20-trion-21-acetat (IIIi) Zu einer Lösung von 0,42 g IIi in 100 ml Chloroform bei 5'C werden 0,08g wasserfreier Bromwasserstoff, in 100m1 Chloroform gelöst, zugesetzt. Man läßt die Mischung bei 5'C 1 Stunde stehen und engt sie dann im Vakuum ein. Der Rückstand wird aus Methylenchlorid-Hexan kristallisiert und ergibt das kristalline Produkt IIIi.
  • C. Pregnan-1,17a,21-triol-3,11,20-trion-21-acetat (IVi) Eine Lösung von 1 g IIIi in 100 ml Methanol wird mit 10 g 100/jgem Palladium-Calciumcarbonat-Katalysator in einer Wasserstoffatmosphäre bei Normaldruck geschüttelt. Nach Aufnahme eines Äquivalents Wasserstoff (nach mehrstündigem Schütteln) wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum bis auf einen festen Rückstand (IVi) eingeengt.
  • D. Pregnan-1,17a,21-triol-3,11,20-trion-1,21-diacetat(Vi) Das Rohprodukt IVi wird in einer Mischung von 0,5 mI Essigsäureanhy drid und 5 ml Pyridin gelöst. Man läßt die Reaktion über Nacht fortschreiten und verdünnt die Lösung mit Eiswasser. Die entstehende Fällung wird filtriert und aus Methylenchlorid-Hexan umkristallisiert und liefert kristallines Pregnan-1,17a,21-triol-3,11,20-trion-1,21-diacetat (Vi).
  • E. 4-Brompregnan-1,17a,21-triol-3,11,20-trion-1,21-diacetat (VIi) Zu einer Lösung von 0,46 g Vi in 50 ml Eisessig wird 0,5m1 von 0,28 n-Bromwasserstoff in Essigsäure zugegeben. Dann wird unter guter Rührung eine Lösung von 0,16 g Brom, 0,08g Natriumacetat und 15 ml Eisessig in solcher Geschwindigkeit tropfenweise zugesetzt, daß jeder Tropfen die Möglichkeit hat, zu reagieren, ehe einweiterer zugesetzt wird. Nach vollständigem Zusatz wird die Reaktionsmischung mit 5 Volumina Wasser verdünnt und die gefällte Verbindung VIi durch Filtration gesammelt.
  • F. 4-Pregnen-1,17a,21-triol-3,11,20-trion-1,21-diacetat (VIIi) Einer Lösung von 0,54 g VIi in 50 ml Eisessig wird unter einer C02 Atmosphäre eine Lösung aus 0,25 g Semicarbazid-hydrochlorid, 180 mg wasserfreiem Natriumacetat, 10 ml Wasser und 10 ml Eisessig zugesetzt. Die Mischung wird 10 Minuten gerührt, dann werden 20 ml einer 1 n-Natriumacetat-Eisessig-Lösung zugesetzt. Das Rühren wird weitere 10 Minuten fortgesetzt, 2 ml Brenztraubensäure zugesetzt und die Mischung 10 Minuten am Rückfluß gekocht. Die abgekühlte Lösung wird mitWasser verdünnt, mit Methylenchlorid extrahiert, die Extrakte werden mit Wasser neutral gewaschen und die Lösung über Magnesiumsulfat getrocknet. Beim Einengen der trocknen Lösung und nach Zusatz von Hexan kristallisiert VIIi.
  • Pregnan-1,17a,21-triol-3,11,20-trion-21-acetat kann bromiert und dehydrobromiert werden durch das Verfahren nach den Beispielen 30, E und F unter Bildung von kristallinem 4-Pregnen-1,17a,21-triol-3,11,20-trion-21-acetat.
  • 31. Umwandlung von 1-Pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat in 4-Pregnen-1,11ß,17a,21-tetrol-3,20-dion-1,21-diacetat Wie in den Beispielen 30, A bis F wird 1-Pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat über 1,2-Oxido-pregnan-llß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat, 2-Brompregnan-1,llß,17a,21-tetrol-3,20-dion-21-acetat, Pregnan-1,11ß, 17a,21-tetrol-3,20-dion-21-acetat, Pregnan-1,11ß,17a,21-tetrol-3,20-dion-1,21-diacetat und 4-Brompregnan-1,llß, 17a,21-tetrol-3,20-dion-1,21-diacetat in 4-Pregnen-1,11ß, 17a,21-tetrol-3,20-dion-1,21-diacetat umgewandelt. Ebenso kann Pregnan-1,11ß,17a,21-tetrol-3,20-dion-21-acetat bromiert und dehydrobromiert werden unter Bildung von 4-Pregnen-1,11ß,17a,21-tetrol-3,20-dion-21-acetat.
  • 32. Entfernung der 1-Hydroxylgruppemit Aluminiumoxyd A.EineLösungvon0,1 g4-Pregnen-1,11ß,17a,21-tetrol-3,20-dion-21-acetat in 100 ml Chloroform wird über eine aktivierte Aluminiumoxydsäule (30 g von 100 bis 200 Maschen) geleitet und die Säule dann mit Methanol gewaschen. Die vereinigten Eluate werden eingeengt. Der Rückstand, der aus Aceton kristallisiert, besteht aus 1-Dehydro-cortisol-21-acetat.
  • B. Eine Lösung von 0,1 g 4-Pregnen-1,17a;21-triol-3,11,20-trion-21-acetat in 100 ml Chloroform wird in gleicher Weise über eine aktivierte Aluminiumoxydsäule (30 g von 100 bis 200 Maschen) geleitet und die Säule dann mit Methanol ausgewaschen. Die vereinigten Eluate werden eingeengt und der Rückstand aus Aceton kristallisiert. Das erhaltene Produkt ist 1-Dehydrocortison-21-acetat.
  • 33. 1,4,9 (11)-Pregnatrien-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat (IIj) 1-Dehydro-cortisol (III a) wird mit Essigsäure in Pyridin acetyliert. Zu 1,22 g 1-Dehydro-cortisol-21-acetat, gelöst in Pyridin und mit Eis gekühlt, werden 0,30 ml Phosphoroxychlorid gegeben und die Reaktionsmischung über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Danach wird die Lösung im Vakuum bei 25'C auf ein Volumen von 5 ml konzentriert und 50 ml Wasser zugesetzt. Das sich abscheidende 0I wird in Äthylacetat aufgenommen, und die Extrakte werden einmal mit Wasser, dann mit 1 n-Salzsäure von Pyridin freigewaschen und anschließend erneut mit Wasser und dann mit 5°/oiger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die Äthylacetatlösung wird getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, wobei 1,4,9 (11)-Pregnatrien-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat auskristallisiert. 34. 9a-Fluor-l-dehydro-cortisol 11-epi-l-Dehydro-cortisol (VIIa) wird in 21-Stellung acetyliert. Zu einer Lösung von 1,0 g des Acetats in 15 ml wasserfreiem Pyridin bei 0°C wird 1,0 g p-Toluolsulfochlorid zugesetzt und die Reaktionsmischung über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Sie wird dann mit Eiswasser verdünnt, und die entstehende Fällung des 1la-p-Toluolsulfonat-21-acetats (Ij) wird aus der Lösung abfiltriert.
  • Eine Lösung von 1,0 g Ij in 25 ml Essigsäure, die 2,0 g Natriumacetat enthält, wird 45 Minuten am Rückfluß behandelt. Die entstehende Lösung wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Methylenchlorid aufgenommen. Der Methylenchloridextraktwird mit Wasser essigsäure frei gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Die trockene Lösung wird eingeengt und der Rückstand mit Äther verrieben. Das Produkt (IIj ) wird aus Aceton-Hexan kristallisiert.
  • Zu einer Suspension von 2,0 g feinverteiltem II j in 200 ml gereinigtem Dioxan und 20 ml Wasser wird 1,0 g N-Bromacetamid und 10 ml wäßrige 1 n-Perchlorsäure zugesetzt. Die Mischung wird gelegentlich gerührt, bis der suspendierte Festkörper in Lösung gegangen ist. Nach einer Stunde wird wäßriges Natriumsulfit zugesetzt, um den Überschuß an N-Bromacetamid zu zersetzen. Die entstehende Lösung wird mit Methylenchlorid extrahiert und der Extrakt mit Wasser säurefrei gewaschen. Nach Trocknung über Magnesiumsulfat wird die Lösung im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus Aceton umkristallisiert. Man erhält 9a-Brom-l-dehydro-cortisol-21-acetat in kristalliner Form.
  • Eine Lösung von 1,0 g der 9a-Bromverbindung in 100 ml Methanol, die 2 g wasserfreies Kaliumacetat enthält, wird 1 Stunde am Rückfluß behandelt und dann bis auf einen Rückstand eingeengt. Der Festkörper wird vollständig mit Methylenchlorid extrahiert und die Extrakte gut mit Wasser gewaschen. Nach Trocknung werden die Extrakte konzentriert und aus Aceton-Hexan kristallisiert. Man erhält 9,11-Oxido-1,4-pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat.
  • Eine Lösung von 1,0 g der Oxidoverbindung in 50 ml Chloroform wird mit wasserfreiem Fluorwasserstoff bei 0°C gesättigt. Man hält die Lösung 5 Stunden bei dieser Temperatur, entfernt den Überschuß an H F und Lösungsmittel im Vakuum bei 0° C, kristallisiert den Rückstand aus Aceton-Hexan und erhält kristallines 9a-Fluor-1-dehydro-cortisol-21-acetat. Letzteres wird in Methanol-Chloroform mit wäßriger Salzsäure bei 20 bis 25°C während etwa 48 Stunden hydrolysiert und liefert 9a-Fluor-l-dehydro-cortisol, das aus Aceton-Hexan umkristallisiert wird.
  • 9a-Fluor-l-dehydro-cortisol-21-acetatkann zu 9a-Fluor-1-dehydro-cortison-21-acetat oxydiert werden, indem man tropfenweise eine Lösung von 30 mg Chromtrioxyd in 0,5 ml Wasser und 2 ml Eisessig zu einer Lösung von 162 mg 9a-Fluor-l-dehydro-cortisol-21-acetat in 10m1 Eisessig zusetzt. Nach 6 Stunden wird die grüne Lösung mit 2 ml Methanol verdünnt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Methylenchlorid extrahiert, und die Extrakte werden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Beim Einengen der trockenen Lösung entsteht kristallines 9a-Fluor-l-dehy dro-cortison-21-acetat, das leicht zum freien 9a-Fluor-l-dehydro-cortison hydrolysiert werden kann (IV, Z = F). 35. 9a-Chlor-l-dehydro-cortisol Eine Lösung von 1,0 g 9,11-Oxido-1,4-pregnadiea-17a, 21-diol-3,20-dion-21-acetat in 50 ml alkoholfreiem Chloroform wird mit wasserfreier Salzsäure bei 0°C gesättigt. Nachdem man die Lösung 5 Stunden bei dieser Temperatur gehalten hat, wird der überschüssige Chlorwasserstoff und das Lösungsmittel im Vakuum bei 0°C entfernt und der Rückstand aus Aceton-Hexan kristallisiert, wobei kristallines 9a-Chlor-l-dehydro-cortisol-21-acetat entsteht. Letzteres wird hydrolysiert und ergibt die freie 21-OH-Verbindung.
  • Durch Oxydation des 21-Acetats, wie im Beispiel34 beschrieben, wird das 21-Acetat von 9a-Chlor-l-dehydrocortison erhalten, das dann zur freien 21 -GH-Verbindung hydrolysiert werden kann.
  • Der Ester der nach Beispiel 33 hergestellten Verbindung kann durch Behandlung einer Mischung von 1,0 g des Esters in 10 ml Methanol unter Stickstoff und Zusatz von 0,22 g Natriumhydrogencarbonat in 1 ml Wasser am Rückfluß hydrolysiert werden. Die Behandlung am Rückfluß wird 10 Minuten fortgesetzt und dann die Reaktionsmischung mit Essigsäure neutralisiert. Die Lösungsmittel werden im Vakuum entfernt, der Rückstand mit Methylenchlorid extrahiert und die Kristallisation des freien 21 -Alkohols durch Zusatz von Hexan zu der konzentrierten Methylenchloridlösung eingeleitet.
  • 36. 1-Dehydro-cortisol-21-(5'-tert.-butylfuroat) 1 g 1-Dehydro-cortisol wird in 10 ml Pyridin gelöst, eisgekühlt und mit 0,6g 5-tert.-Butylfuroylchlorid behandelt. Nach Rühren über Nacht wird die Mischung in verdünnte Schwefelsäure eingegossen und der Festkörper mit Äther extrahiert. Das Rohprodukt wird aus einer Benzol-Methanol-Mischung kristallisiert und ergibt das reine Produkt, das unter Zersetzung bei etwa 237 bis 239°C schmilzt.
  • 37. A. Pregnan-3a,17a,21-triol-11,20-dion-21-(2',4'-dichlorophenoxyacetat) 100g Pregnan-3a-17a-diol-11,20-dion werden in 1 1 Chloroform, das 10/, Äthanol enthält, gelöst und die Mischung auf 10°C gekühlt und mit 12 g gasförmigem Bromwasserstoff behandelt. Nach Abkühlung auf -20° C und bei einer Temperatur von unterhalb -10°C wird die Mischung mit einer Lösung von 48 g Brom in 650 ml Chloroform innerhalb von 3 Stunden behandelt. Die Reaktionsmischung wird dann auf 250 ml im Vakuum unterhalb von 25°C konzentriert. Zu der Lösung werden 800 ml Aceton zugesetzt sowie anschließend 200 g Kalium-2,4-dichlorophenoxyacetat (erhalten durch Vakuumverdampfung einer Methanollösung von 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure, neutralisiert mit Kaliumcarbonat). Die Mischung wird mit 200 ml Wasser versetzt und 16 Stunden am Rückfluß erwärmt. Das Lösungsmittel wird dann durch Dampfdestillation nach Zusatz von 500 ml Wasser entfernt und die Mischung 30 Minuten auf 100°C erhitzt. Das Produkt wird durch Filtration gesammelt, dreimal mit heißem Wasser gewaschen und aus wäßrigem Methanol umkristallisiert. Man erhält Pregnan-3a,17a,21- triol -11,20 - dion -21- (2',4'- dichlorophenoxyacetat). B. Pregnan-17a,21-diol-3,11-20-trion-21-(2',4'-dichlorophenoxyacetat) Der rohe, feuchte, nach Beispiel 37, A erhaltene Rückstand wird in 1170 ml Aceton und 100 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird auf -5°C gekühlt und der pH-Wert auf 2,4 mit 6 n-Salzsäure (0,2 bis 1,0 ml) eingestellt. Unter Lichtabschluß werden 89,8g N-Bromsuccinimid zugesetzt und die Mischung 1 Stunde lang bei -5°C gehalten. Zu der roten Lösung wird so viel Natriumsulfitlösung zugesetzt (123 g Natriumsulfit in 670 ml Wasser), bis der pH-Wert auf 4,5 bis 5,0 gestiegen ist. Anschließend wird die Mischung dampfdestilliert (1 Stundelang). Das Produkt wird abfiltriert und dreimal mit heißem Wasser gewaschen und getrocknet. Das rohe Pregnan-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-(2',4'-dichlorophenoxyacetat) wirddurchKristallisation aus einer Aceton-Methanol-Mischung gereinigt. C. 2,4-Dibrompregnan-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-(2',4'-dichlorophenoxyacetat) 10 g des nach Beispiel 37, B erhaltenen Produkts werden in 250 ml Eisessig gelöst, gerührt und tropfenweise mit einer Lösung von 5,85 g Brom in 50 ml Essigsäure in dem Maße versetzt; wie die Farbe verschwindet (etwa 30 Minuten). Durch Zusatz von Wasser fällt das rohe Dibromid aus, das abfiltriert wird. Kristallisation aus Aceton-Methanol ergibt reines 2,4-Dibrompregnan-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-(2',4'-dichlorophenoxyacetat). D. 1-Dehydro-cortison-21-(2',4'-dichlorophenoxyacetat) 5 g des nach Beispiel 37, C erhaltenen Produkts werden in 25 ml Chinaldin gelöst und 16 Stunden auf 95 bis 100'C gehalten. Die Mischung wird dann dampfdestilliert, und der Ester wird mit Äther extrahiert. Die Lösung wird mit verdünnter Schwefelsäure und Wasser gewaschen, getrocknet und bis auf einen Rückstand abgedampft. Chromatographie aus Benzol an aktiviertem Magnesiumsilikat ergibt das reine 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11, 20-trion-(2',4'-dichlorophenoxyacetat), das mit Benzol eluiert wird und eine Drehung von etwa [a] D = 116 (Dioxan) hat.
  • 38. A. Pregnan-11ß,17a,21-triol-3,20-dion-21-(4'-chlorophenoxyacetat) In gleicher Weise wie im Beispiel 36 werden 2 g Pregnan-11ß,17a,21-triol-3,20-dion mit 1,40 g 4-Chlorophenoxyacetylchlorid behandelt. Das Rohprodukt wird in Methanol gelöst und eingeengt und ergibt kristallines Pregnan-11ß,17a,21-triol-3,20-dion-21-(4'-chlorophenoxyacetat) . B. 1-Dehydro-cortisol-21-(4'-chlorophenoxyacetat) 1 g des nach Beispiel 38, A erhaltenen Produkts wird, wie im Beispiel 37, A, mit 0,62 g Brom in Essigsäure bromiert. Das rohe, wassergefällte Dibromid wird getrocknet und in 10 ml Toluol und 5 ml 2,4,6-Collidin gelöst. Die Mischung wird 16 Stunden am RückfluB behandelt und dampfdestilliert, um die Lösungsmittel zu entfernen. Das rohe Produkt wird aufgearbeitet und wie im Beispiel 37, D chromatographiert, und das Benzoleluat wird aus Methanol kristallisiert und ergibt 1,4-Pregnadienl lß,17a,21-triol-3,20-dion-21- (4'-chlorophenoxyacetat), Fp. = 184 bis 186°C. 39. A. Allopregnan-l1ß,17a,21-triol-3,20-dion-21-(4'-chlorophenoxyacetat) 10 g von Cortisol werden, wie im Beispiel 36, mit 7,0 g 4-Chlorophenoxyacetylchlorid verestert. Das rohe Produkt wird aus 95°/oigem Äthanol umkristallisiert und liefert reines Cortisol-21-(4'-chlorophenoxyacetat). 5 g dieses Esters werden in 150 ml Äthylacetat suspendiert und 2 g 5 °/o Palladiumkohle zugesetzt. Die Mischung wird mit Wasserstoff geschüttelt, bis ein Äquivalent (231 cm3 bei 25°C) absorbiert ist und die Aufnahme aufhört. Die Mischung wird filtriert und auf 25 ml konzentriert. Das auskristallisierende Produkt wird abfiltriert und getrocknet. Es kann weiterhin aus Aceton umkristallisiert werden und ergibt Allopregnan-1lß,17a,21-triol-3,20-dion-21-(4'-chlorophenoxyacetat). Dieser Ester kann ebenfalls durch Hydrolyse von Allopregnan-llß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat und erneute Veresterung hergestellt werden. 10 g des 21-Acetats werden in 200 ml Methanol gelöst und mit einer Lösung von 2,95 g Kaliumhydrogencarbonat in 25 ml Wasser behandelt. Die Mischung wird 24 Stunden durch langsam durchströmenden Stickstoff gerührt. Essigsäure wird dann bis zum Neutralpunkt zugesetzt, 50 ml Wasser zugesetzt und die Mischung im Vakuum auf 125 ml eingeengt. Die Fällung wird gesammelt, mit Wasser gewaschen und aus verdünntem Methanol kristallisiert und ergibt Allopregnan-11ß,17a,21-triol-3,20-dion. 5 g des letzteren werden wie im Beispiel 36 mit 3,5 g 4-Chlorophenoxyacetylchlorid verestert. Das Produkt wird aus Benzol-Methanol kristallisiert und ergibt Allopregnani lß,17a,21-triol-3,20-dion-21- (4' -chlorophenoxyacetat) . B. 1-Dehydro-cortisol-21-(4'-clilorophenoxyacetat) 2 g des nach Beispiel 39, A erhaltenen Produkts werden mit 25 ml Eisessig bedeckt, gerührt und tropfenweise mit 1,25 g Brom in 5 ml Essigsäure behandelt. Nachdem die Farbe verschwunden ist, wird Wasser zugesetzt und das rohe Dibromid abfiltriert und getrocknet.
  • 1 g des Dibromids wird in 5 ml Diäthylanilin suspendiert und auf 95 bis 100° C auf dem Dampfbad unter Rühren 6 Stunden lang erwärmt. Die Mischung wird dann in verdünnte Schwefelsäure eingegossen und mit Methylenchlorid extrahiert. Die Lösung wird getrocknet und abgedampft und der Rückstand dreimal aus Methanol-Aceton umkristallisiert. Man erhält 1-Dehydro-cortisol-21-(4'-chlorophenoxyacetat), Fp. = 184 bis 186° C. 40. 9 a-Fluor-l-dehydro-cörtison-21-(2'-furoat) 1,0g von 9a-Fluor-l-dehydro-cortison wird in 20m1 trocknem Pyridin gelöst und die entstehende Lösung auf 0° C abgekühlt. Zu der gerührten Lösung wird tropfenweise 0,45 g 2-Furoylchlorid zugesetzt. Man läBt die Reaktionsmischung sich langsam auf Zimmertemperatur erwärmen und rührt sie über Nacht. Die Mischung wird dann in 200 ml kalte 10°/oige Schwefelsäure eingegossen. Die entstehende Fällung wird filtriert und anteilweise mit Wasser, wäßrigem Natriumhydrogencaxbonat und Wasser gewaschen. Bei der Kristallisation aus Methanol-Wasser entsteht der 21-(2'-Furoat)-ester als kristalline Substanz.
  • In gleicher Weise kann der 21-(2'-Furoat)-ester des 9a-Fluor-l-dehydro-cortisols und des 9a-Chlor-analogons beider Verbindungen erhalten werden. Bei Benutzung von 5-tert.-Butyl-2-furoyl-chlorid, Phenoxyacetylchlorid und 2,4,5-Trichlorophenoxyacetylchlorid werden 21-[(5'-tert.-Butyl)-2'-furoat], 21-Phenoxyacetat und 21-(2',4',5'-Trichlorophenoxyacetat) der 9a-Fluor- und 9a-Chlorderivate von 1-Dehydro-cortisol und von 1-Dehydro-cortison erhalten.
  • Durch Umsatz des entsprechenden freien 21-Alkohols mit dem Chlorid der Säure werden zusätzlich folgende Ester erhalten: 1,4-Pregnadien-21-ol-3,20-dion-21-(5'-bromfuroat) ; 1-Dehydro-cortisol-21-furoat, Fp. = 240 bis 242° C (unter Zersetzung) ; 1,4-Pregnadien-11 ß,21-diol-3,20-dion-21-(4'-methylphenoxyacetat) ; 1-Dehydro-cortisol-21-(5'-chlorfuroat) ; 1-Dehydro-cortisol-21-(4'-tert.-butyl-phenoxyacetat), Fp. = 203 bis 206° C (unter Zersetzung) ; 1,4-Pregnadien-21-ol-3,20-dion-21-phenoxyacetat; 1-Dehydro-cortison-21-(4'-chlorophenoxyacetat), Fp. = 180 bis 182° C ; 1-Dehydro-cortison-21-(4'-methoxy-phenoxyacetat), Fp. = 130 bis 135° C (unter Verlust des Solvats) ; 1-Dehydro-cortison-21-(5'-bromfuroat) ; 1-Dehydro-cortisol-21-phenoxyacetat, Fp. = 196 bis 199° C; 1-Dehydro-cortisol-21-(4'-bromophenoxyacetat) ; 1-Dehydro-cortison-21-furoat, in zwei Formen, Fp. = 233 bis 235 und 251 bis 254° C; 1-Dehydro-cortison-21-(4'-tert.-butylphenoxyacetat), Fp. = 130 bis 135° C (unter Verlust des Solvats) ; 1-Dehydro-cortison-21-phenoxyacetat, Fp. = 205 bis 207° C und 1-Dehydro-cortison-21-(5'-tert.-butylfuroat), Fp. = 241 bis 243° C: Diese Ester können, wie eingangs beschrieben, verabreicht werden.

Claims (7)

  1. PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von Pregnadienen der allgemeinen Formel worin X = 0 oder H (a oder ß), 0 H oder H (a oder ß) Acyloxy, R = H oder Acyl und W = H, F, Cl oder Brist, dadurch gekennzeichnet, daß man ein im RingA gesättigtes Pregnanderivat mit Sauerstoffunktionen in 3- und 20-Stellung durch Behandlung mit dehydrierenden Mikroorganismen oder bekannten chemischen Dehydrierungsmitteln in das entsprechende 1,4-Pregnadien überführt und gegebenenfalls in dieses in bekannter Weise eine 11-X- und /oder 17a-OH-und(oder 21-0 R- und(oder 9 a-'#V-Gruppe einführt und zusätzlich, soweit das Ausgangssteroid außerhalb des Ringes A Doppelbindungen aufweist, diese nach bekannten Methoden in gesättigte Bindungen überführt,, oder daß man ein in 1- und/oder 4-Stellung ungesättigtes Steroid der Pregnanreihe in entsprechender Weise behandelt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangsverbindung eine Doppelbindung an zumindest einer, aber nicht mehr als drei der 1-, 4-, 6-, 9(11)- und 16-Stellungen besitzt.
  3. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangsverbindung eine Sauerstoffunktion in 11- und/oder 17a- und/oder 21-Stellung besitzt.
  4. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dehydrierung durch Einführung einer Sauerstoffunktion in Stellung 1 oder 2 und nachträgliche Abspaltung der Sauerstofffunktion unter Bildung der 1,2-Doppelbindung bewirkt.
  5. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Dehydrierung in 1,2-und(oder 4,5-Stellung 1 oder 2 Bromatome in den Ring A einführt und HBr abspaltet.
  6. 6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Doppelbindung, vorzugsweise die lständige Doppelbindung, in den A-Ring durch Behandlung einer entsprechenden Ausgangsverbindung mit einer Kultur eines dehydrierenden Mikroorganismus, der nicht gleichzeitig weitere Stellen des Moleküls angreift, oder mit dem abgetrennten Enzymmaterial einer solchen Kultur; einführt.
  7. 7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus ein Corynebacterium, wie Corynebacterium simplex bzw. Corynebacterium hoagii, verwendet. $. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß Progesteron in den 11-, 17a- und 21-Stellungen hydroxyliert und in 1,2-Stellung dehydriert wird. 9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein 16,17-ungesättigtes Pregnadien oder Pregnatrien mit einer Persäure oder mit Wasserstoffperoxyd umgesetzt wird unter Bildung eines 16,17-Oxidoderivates, das anschließend hydrolysiert wird. 10. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 3 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß Pregnan-11 a,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat mit Brom umgesetzt wird, das gebildete 2,4-Dibromid dehydrobromiert und in der erhaltenen 1,4-Pregnadienverbindung die 11a-Hydroxylgruppe zu einer Ketogruppe oxydiert wird. 11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß in ein 1,4-Pregnadien oder 1,4,9(11)-Pregnatrien durch Epoxydation und Behandlung mit Halogenwasserstoff, vorzugsweise Fluorwasserstoff,ein 9a-Halogenatom, eingeführtwird. Formelschema I In den Gleichungen 1 bis 3 bedeutet R = niederes Alkanoyl, R' = niederes Alkyl, W = H, F, Cl oder Br, X = H, H oder 0 oder H, 0 H (a oder ß), Y und Y'= -COCH,OH, -COCH20COR' oder -CHOHCH,OH; Y' kann auch -CHOHCH3 bedeuten, Z'= O H oder H.
    Formelschema II R = H, OH oder Acyl, R'= H oder Acyl, X = O, H,H H,OH (a oder ß), Y = OH oder OAcyl.
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