DD266504A1 - Verfahren zur separation und isolierung von cu tief 2 zn tief 2-superoxid-dismutase aus erythrozyten von vertebraten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Separation und Isolierung von Cu2Zn2-Superoxiddismutase aus Erythrozyten von Vertebraten. Die Erfindung findet ihre Anwendung in der Biotechnologie, der pharmazeutischen Industrie und in der Medizin. Erfindungsgemaess wird aufbereitetes Erythrozytenkonzentrat mit einem farbstoffligandierten Traeger in Saeulen- oder Batch-Verfahren in Kontakt gebracht und anschliessend die Superoxiddismutase gewonnen. Als Traeger verwendet man sphaerische oder faserfoermige Materialien; als Farbstoffe werden Cibacron Blue F 3 GA, Procion Blue 11 X-B, Procion Red HE-38, Procion Yellow 11 X-R verwendet.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Separation und Isolierung von CuiZn₂-Suporoxlddismutaso aus Erythrozyten von Vertobraten unter vorzugsweiser Verwendung humaner Erythrozyten zum medizinischen Einsatz. Das Verfahron findet Anwendung In der Biotechnologie, dor pharmazeutischen Industrio und in dor Medizin.

Charakteristik des bekannten Standes dor Technik

Superoxiddismutase (SuD) sind Enzyme, ciio die Disproportionierung von Superoxidanion-Radikalen entsprechend Gleichung (I) katalysieren.

2 (T₂+ 2H⁺-* H₂Oj+ O₂ (I)

Gegenwärtig sind verschiedene Suporoxiddismutpsen mit unterschiedlichen Metallatomen im aktiven Zentrum bekannt, die jedoch die gleiche enzymatische Funktion ausüben. Im Zytoplasma von Eukaryoten ist ausschließlich die Cu₂Zn₂-Superoxiddismutase nachwuisbar. Im folgenden wird das Synonym Superoxiddismutase für diose verwandt. '

Cu₂Zn₂-Suporoxiddismutase aus humanen Erythrozyten hat eine Molokularmasse von 320000 und setzt sich aus zwei identischen Untereinheiten mit je einem Kupfer- und Zinkatom zusammen. Die Aminosäuresequenz sowie die dreidimensionale Struktur dieses Enzyms sind bekannt (s.z.B.: A.Gärtner, U.Weser: Biomimoticand Bioorganic Chemistry 12 [1986} 1). Superoxidanion-Radikalen wird eine zentrale Rolle im Entzündungsprozoß zugesprochen. Insbesondere bei Erkrankungen dos rheumatischen Formenkroises, ab6r auch bei Strahlenerkrankungon vordichtoten sich in den leiten Jahren die Hinweise, daß Superoxldanion-Radiknlen eine kausale Rolle boi der Auslösung von Entzündungsreaktionon zukommt (s. z. B.; W. Puhl, H. Sios/ Hrsg./ Superoxid-Dismutase — Biochemie und therapeutischer Einsatz, Porimod-Fachbuchverlagsgesollschaft mbH Erlangen 1982). Auf Grund dessen wird der Einsatz antiphlogistisch wirksamer SOD-Pröporate zunehmend diskutiert. Gegenwärtig befindet sich ein für den Arzneimittalverkehr zugelassenes SOD-Präparat vom Rind mit dom Handelsnamen „Pcroxynorm" (Grünenthal GmbH, BRD) auf dem Wettmarkt. Allerdings kann es auf Grund der tierischen Herkunft dieses Präparntes bei Langzeitanwendung am Monschen zu Unverträglichkeiten kommen (S. Carson, E. E. Vegin, W. Huber, T. l.. Schulte: Toxikol. Appl, Pharm. 26 (1973) 184), Deshalb ist ein SOD-Präparat humanen Ursprungs erstrebenswert.

In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Verfahren zi-r Separation und Isolierung von Cu₂Zn₂-Superoxiddis"-iutase aus Erythrozyten beschrioben, die jedoch mit zahlreichen Nachteilen, wie unbefriedigender Reinheitsgrad und damit eingeschränkter Wirksamkeit und/odor niedrigen Ausbeuten, verknüpft sind.

Im Jahr 1969 beschrieben J. M. Mc Cord und I. Fridovich (J. Biol. Chem. 244 (1969] 6049) eine Methode zur Isolierung von SOD, die auf der bemerkenswerten Stabilität dieses Enzyms in Anwesenheit von organischen LösungsmitUln basiert. Diesos Vorfahren ergibt zwar eine reine SOD, ist jedoch relativ aufwendig und nicht zuletzt auf Grυ id der niedrigen Ausbeute von 25% rocht teuer. Hinzu kommt, daß din Verwendung von chloriorten Lösungsmitteln (Chlorofor n) nicht unbedonklich ist und erhebliche technologische Probleme mit sich bringt

M. J.Stansell und H.F.Deutsch (J. Biol. Chem. 240 (1965) 4299) entwickelten eine wäßrige Ibtlierungsmethode, din auf der

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Bindung dos Enzyms an Anionenaustuuschor basiert und später durch Modifizierungen bis auf Ausbouton von 50% gostoiejort wurde (A.Qärtner, U.Weser: FEBS Lottors 16511983| 16).

Allerdings sind dleso Verfahren relativ zeitaufwendig und mit einem nicht unorhoblichon Aufwand verbunden.

Eino Kombination der Lösungsmittolfällung mit der chromatooraphlscnon Isolierung an Anionenaustauschorn beschrieben

J. Bannister, W. Bannister, E. Wood (Europ. J. Biochem. 18 (1971) 178), die jodoch die Nachteile beidor Vorfahren In sich voroinigt.

Aus dor JA-OS 53-31206 sowie der'FR 2485203 ist oino Methode zur Isolierung von SOD bekannt, die auf dor beachtlichen Thermostabilität des Enzyms beruht. Hiorbei werden vor ullom das Hämoglobin durch Hitzobolumdlung hämolysiertor Blutzöllen in Gegenwart von Salzen zwoiwortigor Metalle oder aber auch ohne Motalliononzusatz (DE 3410159) präzipitiert. Obwohl dioso Methode durch ihren goringon technologischen Aufwand besticht, liefert sie jedoch nur oin unreines Präparat mit einor niodrigon spezifischen Aktivität.

Dieser Nachteil war Ausgangspunkt der DE-PS 3124228, in der ein Vorfahren der Isolierung von SOD aus hämolysiorten Erythrozyten durch zweimalige Hitzefällung in Anwosonhoit von Noutralsalzon und nachfolgender lononaustauschchromatographle beschrieben Ist. Allerdings ist dieses Verfahren — bedingt durch die zweimalige Hitzofällung und die von der lonenaustauschchromatographie erforderliche Dialyse — rola^(lv aufwendig und dürfte somit für industrielle Prozesse kaum Anwendung finden,

Unstrittig stellt das Verfahren der Hitzefällung untei Ausnutzung der Thormostabilität dos Enzyms einon eleganten, kostengünstigen und effizienten Schritt zur Isolierung dor SOD dar. Da, wie beroits ausgoführt, diosos Voifahron in. - zu oinom relativ unroinon Präparat mit einer gorinQon spezifischen Aktivität führt, erweist es sich als notwendig, diosos Vorfahren mit weiteren Rninigungsschritton zu kombinioren. So hai es nicht an Vorsuchen gofohlt, affinitätschromatographischo Molhocion zur Separation und Isolierung dor Superoxiddismutaso einzusetzen.

So ist in der Patentschrift EP 112299 dor Einsatz der Immunaffinitätschromatographio zur Reinigung von SOD aus Erythrozyten beschrieben Aus technischer und technologischer Sicht dürfto jedoch dor Einsatz trägorgobundoner Antikörper prinzipielle Probleme doi Stabilität dor chemischen Bindung zwischen dem Träger und dom Protein und vor allem des Erhalts dor funktionellon Aktivität des Antikörpers bol wiederholtem Einsatz untor storilon und pyrogon'roion Bedingungen mit sich bringen.

Ein anderer Wog ist in der JP 589686 sowie in dor DD-PS 207928 boschrieben. Diose Autoren setzen die Hydrophobizitäts-Chromatographie bzw. die ladungskontrollierte Hydrophoblzitäts-Chromatographie zur Isolierung und Reinigung dor SOD ein.

Beide Verfahren sind jedoch nicht zuletzt auf Grund des Einsatzes von Ammoniumsulfat nur schwer in größere Maßstäbe übertragbar.

Als Alternative bietet die Wakomoto Pharmaceutical Co. Ltd. (JP 58/183031) die Nutzun j dor Metall-Cholat-Affinitötschromatographie zur Isolierung von SOD an. Oieses Verfahren ist jedoch mit einem erheblichen Kostonaufwand verbunden.

Von großer Bedeutung für großtechnisch? Verfahren zur Isolierung von SOD mit dem Ziel des medizinischen Einsatzes sind neben dun Kosten des Verfahrens, dio im wesentlichen durch die Ausbeute und den technologischen Aufwar d bestimmt weHon, die Reinheit des Präparates, die Sterilität und Pyrogenfreiheit dos Präparatos und nicht zuletzt dio Reproduziorbarkoit und Standardisiorbarkeit dos Verfahrens. Allen diesen Anforderungen wurden die bisher bokannten Methoden und Vorfahron zur Separation und Isolierung von Superoxiddismutase aus Erythrozyten nicht öder nur unzureichend gerecht.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung i3t es, ein einfaches, kostengünstiges und effizientes Verfahren zur Separation und Isolierung von äuporoxiddismuvase aus Erythrozyten von Vertebraten zu entwickeln, das eino großtechnische I lerstollung dieses Enzyms unter sterilen und pyregenfreien Bedingungen in hoher Ausbeute gestattet.

Dürlogung des Wesens der Erfindung '

Der Erfindung liegt dio Aufgabe zugrunde, uin Verfahren zur Separation und Isolierung von Superoxiddismutase aus Erythrozyten auf der Basis eines affinitätschromatographischen Schrittes zu entwickeln, das es gestattet, das Enzym einfach, schnell und kostengünstig großtechnisch in hoher Ausbeute und Reinheit unter sterilen und pyrogenfreien Bedingungen herzustellen.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt durch Einsatz von trägergebundenen Farbstoffen zur Entfernung vbfi kontaminierenden Proteinen, so vor allem Hämoglobin, aber auch Plasmaproteinen, oder aber zur spezifischen Bindung und nachfolgenden Elution der Superoxiddismutase. Erfindungsgemäß werden (humano) Erythrozyten durch Reduzierung der lononstärke hämolysiert und anschließend auf bekannte Art und Weise einer Hitzofällung unterzogen. Nach Entfei;.ung der Zellmembranbostandteilo sowie dor gefällten Proteine, so vor allem Hämoglobin, wird das Hämolysat mit farbstoffligandierton Trägern in Kontakt gebracht. Nach Bindung der kontaminierenden und unerwünschten Proteine an die farbstoffligandierteri Träger wird die SOD-enthaltonde Lösung mittels Ultrafiltration konzentriert und gegebenenfalls erneut mit farbstoffligandiorten Trägern in Kontakt gebracht, wobei der Farbstoff identisch oder verschieden ist. Nach abschließender Sterilfiltration und Portionierung sieht das Präparat für medizinische Anwendungen zur Verfügung. Die farbstoffligandiorten Träger lassen sich auf einfache Art und Weiso regenerieren <jnd sind somit reproduzierbar über lango Zeiträume ohne Verlust der Bindungskapazität einsetzbar. Alternativ kann unter bestimm ten Bedingungen eil· j nahezu spezifische Gindung des Enzyms Superoxiddismutase an farbstoffligandiorte Träger erzielt werden, so daß nach Entfernung dor ηκ-ht gebundenen kontaminierenden Proteine die SOD durch geeignete nicht denaturierende Dissoziationsreagenzion von den farbstoffligandierton Trägern abgespaltet und gewonnen werden kann.

Als Farbstoffe für die erfindungsgemäße Farbstoffligand-Affinitätschromatographie bieten sich vor allem Cibacron Blue F 3 GA (reactive blue, Cl 61211), Procion Blue 11 X-R (reactive blue 4, Cl 61205), Procion Red HE-3B (reactive red 120), Prorion Yellow 11 X-R (reactive yellow 4, Cl 13190) u. a. an. Besonders vorteilhaft und kostengünstig gestaltet sich der Einsatz von

Trägern, dio mit Cibacron Blue umgesetzt sind, wobei die Bindung dt* r'arbstoffs clirokt übor den Trlazinrlng dos Reaktivfai bstoffc oder aber unter Verwendung von chemisch aktivierten Trägern mit oder ohne Brückonverbindungen, wie homo- oder heterobifunktionolle Reagenzien, erfolgt.

Prinzipiell sind alle sphärischen und faserförmigen Träger geeignet, vorausgesetzt, sie verfügen Ober funktionell Gruppon, vorzugsweise Hvdroxyl-Gruppon, die eine Umsetzung mit dun genannten Farbstoffen gestatten. Dos weiteren sollton sich dio Träger durch eine hinreichend große Oberfläche, die für optimale Blndungskapazitäton erforderlich ist, sowie durch eino Porosität, die ein ungehindertes Eindringen von Proteinen ermöglicht, auszeichnen. Bei sphärischen Trägorn erweison eich hierbei Partikelgrößen von 1 bis 1000μηι und Porengrößen < 10nm als besonders goeignot. Von großer Bedeutung für don cfindungsgemäßen Einsatz sind die mechanische Stabilität und Belastbarkeit der Träger, die möglichst geringen unspozifischon Bindungen on diese sowie die Möglichkeit des einfachen Rogonerierons und Sterilisierons dieser Träger. Unter Berücksichtigung docson erweisen sich einige als besonders vorto'lhaft. Hierzu zählen Perlzellulose und Agarose-Derlvato, jedoch sind auch andere einsetzbar.

Die Inkubation des Hämolystites mit den farbstoffligandierten Trägern erfolgt im Säulenverfahren oder aber besonders vorteilhaft im batch-Verfahron, da hierbei bei hinreichend hoher Bindungskapazität des farbstoffligandierten Trägers nur geringe Mengen desselben im Verhältnis zu dem eingesetzten Hämolysat erforderlich sind, so daß rur geringe Verluste auftreten könnon. Hinzu kommt, daß die Bindung der kontaminierenden Proteine oder aber dor SOD sehr sclvioll erfolgt, so daß nur kurze Inkubationszeiten erforderlich sind. Dies erweist sich vor allem untor dom Aspokt eines sterilen ur d pyrogonfreiei. Rogimos der Herstellung dieses Präparates für medizinische Anwendungen als entscheidender Vorteil. Vorteilhaft ist auch, daß sich bei Anwendung im batch-Verfahren die Träger einfach und schnell von dem überstehenden Hämolysat entfernon lasson. Die Bindung des Hämoglobins und anderer unerwünschter Proteine a : die farbstoffligandierten Träger ist bei hohen Konzt trationen bevorzugt. Deshalb kann es gogebonenfalls ompfohlonswert sein, .las Hämolysat nach df ersten Inkubation mit den farbstoffligandierton Trägorn und Konzentrierung erneut mit farbstoffligandiorten Trägern ir. Kontakt zu bringen, wobei diese die gleichen Farbstoffe oder abor andoro enthalten können. Auf dioso Al und Weise erhält ,nnn oin nanozu rolnos Produkt mit einor hohen spezifischen Aktivität.

Von großer Bedeutung für dio medizinische Anwendung des Präparates ist die Sterilität und Pyrogenfreiheit des Endproduktes. Deshalb muß das gesamte Vorführen der Separation und Isolierung der SOD unter sterilen und pyrogenfreion Kautelen durchgeführt werden. Dies sotzt voraus, daß die farbstoffligandierten Träger einfach und reproduzierbar regenerierbar und sterilisierbar sind. Unter Umständen erfolgt nach der Isolierung und Herstellung der SOD eine Entpyrogonisierung des Präparates mit geeigneten Mitteln,

Das erfindungsgemäße Verfahron führt zu einer erheblichen Reduzierung des Au.wandes und dor Kcston zur Separation und Isolierung von SOD aus Erythrozyten und liefert ein Präpii at hohor Reinheit. Alb besondere Vorteile erweisen sich dio hohen Ausbeuten sowio der geringe Zeitbedarf dos Verfahrens, die nie Jrigen Kosten der farbstoffligandierten Träger sowie ihre chemische und mechanische Stabilität, die eine leichte Regenerierung und Sterilisierung der farbstoffligandierten Trägor ermöglicht. Diese Vorteile kommen vor allem bei großtechnischen Anwendungen zum Tragen.

Ausfdhrungsbelsplelo Im folgenden wird die Erfindung an einigen Beispielen erläutert, wobei diese keinon Anspruch auf Vollständigkeit erhob ar.. Beispiel 1:

10g Perzellulose (Charge 040387, VEB Leipziger Arzneimittelwerk, DDR) werden mit Aqua dest. gewaschon und in 150ml Aquadest. suspendiert. 1 g Cibcron 3lue F 3 G-A (Ciba Geigy, Schweiz) wird in 60 ml Wasser gelöst, boido Lösungen vereinigt undanschließend auf 60⁰C erhitzt.

Nach 30min werden 25g NaCI unter Rühren zugegeben und weiterhin unter ständigem Rühron bei 6O⁰C belassen. Nunmehr

worden 2g Na₂CO₃ zugegeben (der pH-Wert sollte zwischen 10,6 und 11 lieptjn) und auf 8O⁰C erhitzt und zwei Stunden bei dieser

Temperatur belassen. Nach dem Abkühlen und Waschen mit der Aqua dest. und 0,02 m Phosphat-Puffer, pH 7,0 ist die Cibracron Fllue-Perlzelluloso einsetzbar. Beispiel 2:

1 Volumeiiteil (VT) humanes Erythrozyten-Konzentrat wird mit 2VT Aqua dest. versetzt und Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 2%zugegeben. Anschl'eßend wird das Hämolysat auf 73⁰C erhitzt und 10min bei diesor Temperatur belassen. Nach dom Abkühlen mit Vj VT Eis wird das Präzipitat durch Abnutschen entfernt. Der pH-Wort des Hämolysates sollte bei 6,5 liecen. Die Hämoglobin-Konzentration beträgt nach diese. Hltzefällunn in der Regel etwa 3mg/ml. Nunmehr wird das Hämolysat mit der nach Beispiel I hergestellten Cibacron Blue-Perlzellulose in oinom Verhältnis von 20:1 (V/V) gemischt und im batch-Verfahren etwa 30min gerührt. Die Hämoglobin-Konzentration liegt nunmehr in der Regel bei 50pg/ml. Nach Entfernung des Trägers durch Absaugen über eine Fritte wird das Hämolysat durch Ultrafiltration konzentriert und erneut mit Cibacron Blue-Perlzellulose in einem Verhältnis 10:1 (V/V) gemischt und 30min gerührt. Die so erhaltene Suporoxiddismutase, die sich im Überstand befindet, ist nahezu froi von kontaminierenden Proteinen und besitzt eine spezifische Aktivität von 5100 U/mg Die Ausbeute des Verfahrens beträgt 75%.

Beispiel 3:

Die nach Beispiel 1 hergostellto und nach Beispiel 2 eingesetzte Cibacron Blue-Perlzellulose wird mit 6m Harnstoff in 0,1 η NaOH regeneriert. Nach Entfe.-nung des Harnstoffs ist die faibstoffligandierte PerlzeMulose ohne Verlust der Bind: ingsfähigkeit reproduzierbar einsotzbiir.

Beispiel 4:

Die nach Delspiol 1 hergestellte Cibacron Bluo-Porlzolluloso wird mohrfach und untorsrhiodlicho Zojton boi 120'C entsprochond dem 2. AB dor DOR (Akademie-Verlag, Bc.-Iin 1985) autoklflvlort und anschließend auf ihre bindungsknr. uität gogonUbor Hämoglobin (Hb) untersucht. Öle Ergebnisse sind In Tabollo 1 zusammengofflßt.

Tabolle 1

Autoklaviorung	mg Hb/ml Träger
—	60
2 x 30 min	60
3 x 30 min	60
4 x 30 min	60
2 x 30min + 1 x 60min	80

Beispiels:

Die nach Beispiel 2 hergestellte humane SOD wird anschließend sterilfiltriort, mit physiologischer Kochsalzlösung eingestellt und mittels Detoxi-Gel (Pierce, USA) entpyrogonisiert. Dieses Präparat ist steril und pyrogenfrei und somit für medizinische Anwendungen geeignet.

Beispiele:

10ml Hämoly3at werden aus humanon Erythrozyten entsprechend Beispiel 2 hergestellt und mit 0,2η NaOH auf einon pH-Wort von 8,0 eingestellt und nachfolgend mit 1 ml entsprochond Beispiel 1 horgostolltor Cibacron Blue-Perlzellulose versetzt und 6h bei Rnumtemperatur geschüttelt. Unter diesen Bedingungen wird das Hämoglobin vollständig gebunden. Der die SOD enthrltende Üborstand wird nach Separation desselben mit 0,01 m Citronensäure auf oinon pH-Wort von 4,0 eingestellt und erneut mit 1 m! Cibacron Blun-Porlzelluloso, entsprechend Beispiel 1, versetzt und über Nacht boi 4°C inkubiort. Unter dioson Bedingungen wird die SOD quantitativ gebunden (s. Tab.2).

Tabelle 2

Verfahrensschritt SOD^g/ml)

Hämolysat	34
nach Blue-Perlzelluloso pH 8,0	' 34
ÜberstandpH4,0	34
nach Bluo-Porlzellulose pH 4,0	—

Die Abspaltung und Elution des Enzyms erfolgt mit 1 m Kallumthiocydnat, pH 8,0, 2OmM EDTA enthaltend.

Claims (9)

1. Verfahren zur Separation und Isolierung von Cu₂Zn₂ Üuperoxiddismutase aus Erythrozyten von Vertebrates dadurch gekennzeichnet, daß man aufbereitetes Erythrozytan-Konzentrat mit einem farbstoffligandierton Träger einmal oder in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten, wobei der Farbstoff Identisch oder ve-schieden ist, im Säulen- oder Batr.h-Verfahren in Kontakt bringt und anschließend die Superoxiddismutase gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Bindung der Farbstoffe sphärische oder faserförmige Träger mit einer hinreichend großen Oberfläche einsetzt.

3. Vorfahren noch Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man sphärische Träger mit einer Partikelgröße von 1 blsiOOOpm und Porengrößen <10nm einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß man zollulosohaltige Materialien, vorzugsweise Perlzellulose, einsetzt.

5. Vorfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß man agarosehaltige Materialien oin3Otzt.

6. Vorfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff Cibacron Blue F3GA einsetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff Procion Blue 11X-B einsetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff Procion Red HE-3B einsetzt.

9. Vorfahren nach Anspruch ¹I₁ dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff Procion Yellow 11X-R einsetzt.