DD241130A1

DD241130A1 - Messverfahren zur gleichzeitigen bestimmung zweier substrate mit enzymelektroden

Info

Publication number: DD241130A1
Application number: DD28085885A
Authority: DD
Inventors: Lutz Asperger; Christa Krabisch
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1985-09-23
Filing date: 1985-09-23
Publication date: 1986-11-26

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung zweier Substrate mit Enzymelektroden und ist fuer den Einsatz in der klinischen Chemie, Biotechnologie und Abwassertechnik geeignet. Bei den bekannten Verfahren werden die Substrate meist nacheinander durch Modifizierung der entsprechenden Analysenverfahren bestimmt. Ziel der Erfindung ist, ein Verfahren zu schaffen, mit dem in Substratgemischen zwei Komponenten nebeneinander ermittelt werden koennen. Die Merkmale der Erfindung bestehen darin, dass zwei elektrochemische Indikatorelektroden sowohl mit verschiedenen Enzympraeparationen als auch mit unterschiedlichen Reaktionsschichtdicken versehen werden. Nach der Elektrodenpraeparation, bei der auf eine Elektrode ein Enzymgemisch mit groesserer Schichtdicke zur Spaltung des einen Substrates und auf die zweite Elektrode nur ein Teil des Enzymgemisches mit niedrigerer Schichtdicke zur Spaltung des zweiten Substrates aufgetragen wird, erfolgt die Verknuepfung beider Enzymelektroden zu einer Differenzmessung. Das ueber die Zeit registrierte Signal enthaelt zur Konzentrationsbestimmung zweier Substrate sowohl einen Peak als auch einen stationaeren Bereich.

Description

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Titel der Erfindung

Meßverfahren zur gleichzeitigen Bestimmung zweier Substrate mit Enzymelektroden

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Meßverf_ahren, mit dem in einer Probelösung zwei Substrate nebeneinander bestimmt werden können, sofern für die Spaltung des einen Substrates ein Enzymgemisch und für die Spaltung des weiteren Substrates nur ein Teil des Enzymgemisches erforderlich ist. Die Erfindung kann in der klinischen _;Ghemie, Biotechnologie und Abwassertechnik eingesetzt werden. Sie ist in die IPK G 01 N einzuordnen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es sind Verfahren bekannt, bei denen eine Enzymelektrode mit einem Enzymgemisch präpariert wird. Mit dieser Enzymelektrode erfolgt zunächst die Konzentrationsbestimmung beider Substrate. Durch eine zweite Messung mit einer Elektrode, die nur ein Enzym oder einen Teil des Enzymgemisches enthält, kann selektiv eines der beiden Substrate ermittelt werden (Anal. Chim. Acta 126 (1981), 23 - 24). Der Nachteil dieser Verfahren be- steht darin, daß zwei Analysen nacheinander durchgeführt werden müssen. Weiterhin sind Verfahren bekannt, bei denen zunächst mit einer üblichen Enzymelektrode ein Substrat selektiv bestimmt wird. Danach erfolgt die Zugabe eines Enzyms oder mehrerer Enzyme in reiner oder immobilisierter Form zur Probe, wodurch mit der gleichen Enzymelektrode auch das zweite Substrat bestimmt werden kann (Lebensmittelindustrie 28 (1981) 11, 491 - 93; Anal. Chim. Acta 155 (1983) 29 - 36). Diese Verfahren setzen eine Modifizierung und Erweiterung der notwendigen Arbeitstakte pro Analyse voraus und erfordern

einen höheren Enzymverbrauch. In einem anderen Verfahren ist es gelungen, durch die Anordnung einer weiteren Elektrode in der enzymatischen Reaktionsschicht die Enzymaktivität auf verschiedene Substrate unter Einbeziehung spezieller Redoxsysteme zu beeinflussen, um dadurch Parallelbestimmungen durchführen zu können. Der Aufbau der Enzymelektroden und die Auswerteverfahren sind allerdings verhältnismäßig kompliziert (Anal. Chem. 54 (1982), 1394).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, mittels Enzymelektroden zwei Substrate in einem Substratgemisch nebeneinander unter Beibehaltung des Analysenzyklus für Einzelsubstratbestimmungen zu bestimmen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Meßverfahren mit Enzymelektroden zu entwickeln, wobei zur Spaltung des einen Substrates nur ein Teil der Enzymmischung verwendet wird.' Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß auf einer Doppelindikatorelektrode oder auf zwei getrennten Elektroden verschiedene Enzympräparationen aufgetragen werden, wobei auf die eine Indikatorelektrode bzw. eine der Elektroden das gesamte Enzymgemisch und auf die verbleibende Elektrode nur ein Enzym oder ein Teil des Enzymgemisches aufgetragen wird. Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht darin, daß sich die Schichtdicken der enzymatischen Reaktionsschicht auf beiden Elektroden wesentlich voneinander unterscheiden, wobei die Elektrode mit dem gesamten Enzymgemisch über die größere-Schichtdicke verfügt. Zur Erläuterung dient Fig. 1. Auf eine Indikatorelektrode wird mit geringer Schichtdicke ein einzelnes Enzym aufgetragen, welches das Substrat A umsetzt.

Das amperometrische Signal entspricht Kurvenzug a. Die das Substrat B umsetzende Enzymmischung kann ebenfalss das Substrat A spalten. Da für die enzymatische Reaktionsschicht auf der die Enzymmischung enthaltenden Indikatorelektrode eine größere Schichtdicke vorgesehen wird, ergibt sich für das Substrat A ein amperometrisches Signal, das dem Kurvenzug b entspricht» Die Elektrode mit der größeren Schichtdicke verfügt über eine größere Einstellzeit, liefert aber im stationären Bereich für das Substrat A analoge Strombeträge, Da auch das Substrat B von der Enzymmischung gespalten wird und aufgrund seiner Molekülgröße einen kleineren Diffusionskoeffinzienten als Substrat A besitzt, vergrößert sich die Zeit, bis das amperometrische Signal entsprechend Kurve c die stationäre Phase erreicht, abermals. Befinden sich die Substrate A und B in der Probelösung, so setzt sich das amperometrische Signal der die gesamte Enzymmischung enthaltenden Elektrode aus den Beträgen beider Substrate zusammen und ergibt den Kurvenzug d.

Bildet eine Elektronik die Differenz zwischen beiden Indikatorelektroden, so wird ein Signal erhalten, das dem Kurvenzug e entspricht. Dieser Kurvenzug enthält ein Maximum, dessen Höhe ein Maß für die Konzentration des Substrates A mit dem größeren Diffusionskoeffizienten darstellt. Der stationäre Bereich dient zur Konzentrationsbestimmung des Substrates B mit dem niedrigeren Diffusionskoeffizienten.

Ausführungsbeispiel

In melassehaltigen Fermentationsmedien befinden sich üblicherweise sowohl Glucose als auch Saccharose. Zur Bestimmung beider Substrate nebeneinander wird auf einem amperometrischen Sensor immobilisierte Glucoseoxidase mit einer Schichtdicke von ca. 25 ,um aufgetragen. Ein zweiter amperometrischer Sensor enthält ein Enzymgemisch aus Glucoseoxidase, Mutarotase und Invertase mit einer Reaktionsschichtdicke von ca.

50 /Um. Die Fixierung aller Enzyme erfolgt mit einer Dialysemembran. Nach dem Zusatz eines Wasserstoffakzeptors, z. B. p-Chinon, verlaufen an den beiden Elektroden folgende Reaktionen :

1. Elektrode mit Glucoseoxidase

ß-Glucose + p-Chinon ^ Gluconsäure + Hydrochinon (1)

Hydrochinon " p-Chinon + 2 H⁺ + 2 e (2)

2. Elektrode mit Enzymgemisch

Saccharose > oC-Glucose + ß-Fructose (3)

ß-Glucose (4)

Das entsprechend Gleichung (1) und (2) gewonnene amperometrische Signal setzt sich an der zweiten Elektrode somit aus einem im. Probemedium enthaltenen Glucoseenteil und der durch Invertierung gebildeten Glucose zusammen. Durch die Verknüpfung beider Elektroden in einer Brücke ergibt sich eine Differenzmessung. Da die zweite Elektrode über eine größere Reaktionsschichtdicke als die erste Elektrode verfügt, liefert das über die Zeit registrierte amperometrische Signal in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration ein auswertbares Maximum. Die größeren Saccharosemoleküle beeinflussen aufgrund ihrer bezüglich Glucose geringeren Diffusionsgeschwindigkeit und der größeren Reaktionsschichtdicke in Elektrode 2 die Stromwerte zu diesem Zeitpunkt nicht. Erst mit fortschreitender Meßzeit, wenn das durch die Glucose bedingte ampeeometrische Signal an Elektrode 2 die stationäre Phase erreicht hat, wird der Meßwert ausschließlich durch die Konzentration der Saccharose bestimmt.

Claims

Erfindungsanspruch

1. Meßverfahren zur gleichzeitigen Bestimmung zweier Substrate mit Enzymelektroden, wobei zur Spaltung des einen Substrates eine Enzymmischung und zur Spaltung des zweiten Substrates

' ^{a a} notwendig

nur ein Enzym oder ein Teil des Enzymgemisches nötig ist, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrochemischen Signale zweier Enzymelektroden, deren enzymatische Reaktionsschichtdicken sich deutlich voneinander unterscheiden, nach Verknüpfung in einer elektrischen Schaltung zur Differenzbildung für die Konzentrationsbestimmung beider Substrate genutzt werden.
2. Meßverfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nur ein Enzym oder einen Teil des Enzymgemisches enthaltende Elektrode über die niedrigere enzyma'tische Reaktionsschichtdicke, bezogen auf die das gesamte Enzymgemisch enthaltende Elektrode, verfügt.
3. Meßverfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,

daß die zur Differenzmessung verknüpften elektrochemischen

von
Signale/amperometrischen Sensoren gebildet werden und ihre Detektion über die Zeit erfolgt, wobei der stationäre Bereich des Strom-Zeit-Verlaufs zur Konzentrationsbestimmung der durch das vollständige Enzymgemisch spaltbaren Komponente und das Maximum des Signals zur Konzentrationsbestimmung der durch ein Enzym oder ein Teil des Enzymgemisches spaltbaren Komponente dient.

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