DD237521A1 - Verfahren zur gewinnung eines dnase-freien bakteriolytischen enzympraeparates - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines bakteriolytischen DNase-freien Enzympraeparates aus Kulturfiltraten des Stammes Streptomyces globisporus ZIMET 43 770. Sie verfolgt das Ziel, aus solchen Filtraten ein derartiges Praeparat in wenigen und schnell durchfuehrbaren Schritten bereitzustellen. Die Aufgabe wird erfindungsgemaess dadurch geloest, dass die bakteriolytische Aktivitaet an einen hydrophoben Traeger bei einer Ammoniumsulfatsaettigung um 25% im Batch-Verfahren gebunden wird und danach mit einem ethanolischen Puffer von p H 8,0 von diesem Traeger eluiert wird. Nach Faellung des Rohenzyms bei 75%iger Ethanolkonzentration und Loesen des Praezipitates in einem neutralen Phosphat-Puffer niedriger Ionenstaerke erfolgt eine Feinreinigung an Carboxymethyl-Ionenaustauschern. Die Absorption erfolgt bei niedrigen Ionenstaerken bei neutralem p H-Wert; die Elution gelingt mit erhoehter Ionenstaerke bei p H 8,0. Das verfahrensgemaess erhaltene bakteriolytische DNase-freie Enzympraeparat findet Anwendung in der mikrobiologischen, biotechnologischen sowie medizinischen Forschung und/oder Industrie.

Description

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 25% zugegeben wird.

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als hydrophober Träger Phenylsepharose eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß als hydrophober Träger Octylsepharose eingesetzt wird.

5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die bakteriolytische Enzymaktivität mit Phosphatpuffer, pH 8, der 20% Ethanol enthält, desorbiert und an einem Carboxymethyl-lonenaustauscher weiter gereinigt wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines bakteriolytischen Enzympräparates aus Bakterienkulturfiltraten, vorzugsweise Streptomycetenkulturfi!traten. Zellwandlysierende Enzyme werden von Bakterien verschiedener Spezies, aber auch von tierischen Zellen, wie z. S. im Hühnerei, gebildet Die Substratspezifität solcher, das Mukopeptidgerüst von Bakterien spaltender Enzyme ist meist verschieden. Oft werden von einer Bakterienspezies gleichzeitig zwei oder mehrere solcher Enzyme gebildet.

Die Lyse von Bakterien ist einmal Voraussetzung für die Gewinnung von DNS in der Gentechnik; sie wird aber ebenso benötigt zur Extraktion verschiedener Komponenten aus Zellwand und Zellplasma wie Proteine, Proteide, verschiedene Polysaccharide, Teichonsäuren und deren Spaltprodukte. In isotonischen Medien finden solche Enzyme weiterhin· Anwendung bei der Herstellung von Protoplasten.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der mikrobiologischen und biotechnologischen Forschung und Industrie, hinsichtlich der Anwendung des hergestellten Stoffes darüber hinaus in der Gentechnik und in der Gewinnung von Spaltimpfstoffen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Bildung bakteriolytischer Enzyme wurde bisher für eine größere Anzahl von Mikroorganismen beschrieben. Oft werden — vor allem bei Streptomyceten — gleichzeitig zwei oder mehrere bakteriolytische Enzyme verschiedener Spezifität gebildet (J.M.Ghysen et al. in „Methods in Enzymology", Vol.VIII (Ed. E. F. Neufeld & V.Ginsburg) Academic Press, 1966). Zu den in o.g. Literaturstelle aufgelisteten, bakteriolytische Enzyme bildenden Bakterienspezies der Gattungen Streptomyces (Strept albus, Strept. griseus), Stapylococcus, Streptococcus (phageninduzierte Enzyme), Baciullus subtilis, Escherichia coli, Flavobacterium, Myxobacterium kommen — wie die Durchsicht von jüngerer Literatur aufweist—noch weitere Mikroorganismen hinzu. So sind inzwischen hierfür auch Stämme aus den Spezies Streptomyces globisporus (K. Yokogawa et al., Agr. Bio!. Chem. 36,2 055,1972 und ebendea 37,799,1973) und Streptomyces rutgersensis (K. Hayashi et al., J. Ferment. Techno!. 59,319,1981) sowie Cytophaga (S. Kawata et al.,Agr. Biol. Chem. 48, 2253,1984) und Pneumococcus-Stämme (A.Tomasz, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 59, 86, 1968) eingesetzt worden.

Bei den Mikroorganismen, die mehrere bakteriolytische Enzyme unterschiedlichr Substratspezifität bilden, hängt der Anteil der einzelnen Enzyme in einem angereicherten Präparat in starkem Maße von der Reinigungsmethode ab. Bisher bekannte präparative Lösungen zur Konzentrierung bakteriolytischer Enzyme aus KuIturfi!traten von Bakterien beruhen

a) auf Vakuumeinengung und/oder Ammoniumsulfatfällung (J.B.Ward und H.R.Perkins, Biochem. J. 106, 69,1968; T.Yoshrmotound D.Tsuri, J. Biochem."72 379,1972; K. Hayashi et al., Agr. Biol. Chem. 45, 2289,1981; McCarty,J.Exp. Med. 96, 555,1952) sowie anschließender Gel- oder lonenaustauschchromatographie und

b) auf Konzentrierung durch Einrühren von lonenaustauschharzen wieAmber!itCG-50(J.H.Hash, Arch. Biochem. Biophys. 102, 379,1963; K. Yokogawa et al.. Antimicrobial Agents & Chemother, 6,156,1972; K. Yokogawa et al., Agr. Biol. Chem. 39,1533, 1975) oder Amberlit IRC-50 (XE64)H⁺ (J.F.Petit et al., Biochem. 5,2764,1966) und nach deren Elution mit anschließender Ammoniumsulfatfällung auf Weiterreinigung durch lonenaustauschchromatographie.

Die Nachteile der bisher bekannten Verfahren liegen darin, daß ·

— zum einen viele Reinigungsstufen notwendig sind, die zum Teil einen großen Zeitaufwand erfordern (Dialysen zum Umpuffern oder Entsalzen von Lösungen nach Ammoniumsulfatfällung) und

— zum anderen, bedingt durch den zeitlichen Aufwand, eine Abnahme der enzymatischen Aktivität in solchen empfindlichen bakteriolytischen Enzympräparaten schon zu verzeichnen ist, bevor man das gewünschte Endprodukt erhalten hat.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, eine DNase-freies bakteriolytisches Enzympräparat zu gewinnen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches Verfahren zu beschreiben, mit dem aus Kulturfiltraten von Streptomyceten in wenigen und schnell durchführbaren Schritten ein DNase-freies bakteriolytisches Enzympräparat

konzentriert wird. _t

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe wie folgt gelöst:

Dem Filtrat einer 48 Stunden bis 75 Stunden aerob submers fermentierten Kultur von Streptomyces globisporus HP5 wird Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 20% bis 40% zugegeben. Der so bezeichnete Mikroorganismus, der bislang nicht als Produzent von bakteriolytischen Enzympräparaten eingesetzt wurde, ist unter der Registriernummer ZIMET 43770 hinterlegt worden.

In die erhaltene Lösung wird zur Bindung der bakteriolytischen Aktivität ein hydrophoberTräger in granulierter oder Pulverform, vorzugsweise Octyl- oder Phenylsepharose, in einer Menge zwischen einem Vierzigstel bis zu einem Sechzigstel des Kulturfiltratvolumens eingerührt (Batch-Verfahren). Nach 30 Minuten Rühren läßt man absitzen und dekantiert den Überstand ab. Der mit bakteriolytischer bzw. mit Enzymaktivität beladene Träger wird dann nacheinander in abnehmenden Konzentrationen mit wäßriger Ammoniumsulfatlösung bis zu 5% auf einer Fritte oder in einer Chromatographiesäule bei 4⁰C gewaschen. Auch alle weiteren Arbeitsschritte werden bei einer Temperatur von 4°C durchgeführt.

Die Resorption der bakteriolytischen Aktivität erfolgt mit einem schwach ionischen, schwach alkalischen Puffer mit Ethanolanteil, vorzugsweise Phosphatpuffer, zum Beispiel 0,001 mol/l Na₂HPO₄ x 2H₂O, pH 8,0 der 20% Ethanol enthält. Im Eluat wird die Ethanolkonzentration (Alkoholfällung vorzugsweise bei 75%) dann auf 75% erhöht und das auf diese Weise erhaltene Präzipität, das die bakteriolytische Aktivität enthält, nach Lösen in 0,001 mol/l Phosphatpuffer, pH7,0, weiter an einem Ionenaustauscher, vorzugsweise einem Carboxymethyl-Ionenaustauscher, gereinigt. Das erhaltene Enzympräparat hat seinen günstigsten Wirkungsbereich für grampositive (Streptokokken, Staphylokokken, Pneumokokken u.a.) und gramnegative Bakterien (Escherichia coli) bei pH-Werten zwischen 7,0 und 8,0 und einer Temperatur von 45°C.

Die bakteriolytische Aktivität wurde mit einem Streptococcus equisimilis (Gruppe C)-Stamm bestimmt (Laborstamm S.

equisimiiisS1011). Als eine bakteriolytische Einheit wurde die Extinktionsabnahme einer Bakteriensuspension dieses Streptococcus equisimilis-Stammes definiert (Ausgangsextinktion 0,5, von 0,001/min bei45°C, pH 8,0), der 5% Vol-% Enzymlösung entsprechend verdünnt beigemischt war.

Die Aufbewahrung des Enzympräparats über ein Jahr in wäßriger Pufferlösung, der 10% Glycerin beigemischt sein können, bei -2O⁰C ergab keinen Aktivitätsverlust.

Neben seiner bakteriolytischen Aktivität enthält das bakteriolytische Enzympräparat noch einen Anteil caseionolytischer Aktivität, die zwischen 5μg bis 20ju,g Trypsinaktivität/ml beträgt. Das Präparat ist DNase-frei und eignet sich zur Freisetzung von DNS aus Bakterien. Die DNase-Aktivität wurde durch Inkubation von λ-Phagen-DNS mit dem bakteriolytischen Enzympräparat und anschließender Agarosegelelektrophorese der inkubierten DNS geprüft. Wie gefunden wurde, wird die λ-Phagen-DNS hierbei nicht gespalten. Die absolute Ausbeute bakteriolytischer Enzymaktivität beträgt ca. 5% bis 8%. Die spezifische Aktivität von ca. 150 bis 200 Einheiten/mg Protein im Kulturfiltrat erhöht sich nach der lonenaustauschchromatographie auf das lOfache und beträgt zwischen 1 500 und 3000 Einheiten/mg Protein.

(Die Proteinkonzentration wurde spektrophotometrisch nach der Methode von J.R.Whitaker and P. E.Granum, Anal. Biochem.

109,156,1980 bestimmt).

Die Vorteile der Erfindung liegen darin begründet, daß ,

— durch die Bindung an einen hydrophoben Träger in einem Schritt eine Konzentrierung auf ein Fünzigstel des Ausgangsvolumens gelingt und, nach Elution der Enzymaktivität von diesem Träger durch eine ethanolische Fällung, eine weitere Konzentrierung sehr schnell erfolgen kann sowie

— nach Lösen des ethanölisch gefällten Präzipitates in einem neutralen Puffer eine Feinreinigung unmittelbar an einem Carboxymethyl-Ionenaustauscher erfolgen kann, so daß eine zeitraubende Zwischendialyse oder eine andersgeartete Entsalzung, wie sie bei Salzfällungen notwendig wird, hier nicht vorgesehen werden muß.

Die Möglichkeit der unmittelbaren Abfolge der Reinigungsschritte bringt eine beträchtliche Zeitersparnis mit sich. Da die bakteriolytische Enzymaktivität wegen der Anwesenheit von Proteasen in den Kulturfiltraten schon nach einwöchigem Aufbewahren bei 4°Cauf die Hälfte herabgesetzt werden kann, ist eine schnelle Reinigung zur Steigerung der Ausbeuten unbedingt notwendig.

Ausführungsbeispiel .

2Ol einer 60 Stunden aerob fermentierten Kultur des Stammes Streptomyces globisporus ZIMET 43770 werden filtriert. In das Kulturfiltrat werden dann langsam 200g CaCI₂ und anschließend 400g Na₂HPO₄ eingerührt. Nach 15 Minuten Rühren wird das gebildete Phosphatgel abzentrifugiert. Der Überstand wird dann durch Einrühren von festem'Ammoniumsulfat auf 30% Sättigung eingestellt und 400 ml Phenylsepharose, die mit 30%iger Ammoniumsulfatlösung vorbehandelt wurde, zugegeben. Nach 30 Minuten Rühren laßt man 2 Stunden absitzen und dekantiert den Überstand ab. Mit dem verbleibenden Flüssigkeitsrest wird das Trägermaterial in eine Fritte oder eine entsprechende Chromatographiesäule gespült. Alle weiteren Arbeiten werden bei +4°C durchgeführt. Nach Waschen mit einer 20prozentigen und danach mit einer Sprozentigen Ammoniumsulfatlösung wird die bakteriolytische Aktivität mit 0,001 moi/l Phosphatpuffer, pH 8,0, der 20% Ethanol enthält, vom Träger eluiert. Die dje bakteriolytische Aktivität enthaltenden Fraktionen werden dann vereinigt und die Ethanolkonzentration mit vorgekühltem Ethanol auf 75% erhöht. Das Präzipität, in dem sich die angereicherte enzymatische Aktivität befindet, wird rasch zentrifugiert und der Niederschlag in 200 bis 300ml eines 0,01 mol/l Phosphatpuffers, pH 7,0, aufgenommen. Dieses Rohmaterial wird weiter auf ainorarhnvvmethvi-lnnfinanstansehsaule. die mit dem gleichen Puffer equilibriert wurde, aufgetragen. Die Säule wird dann

Claims (1)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Gewinnung eines DNase-freien bakteriolytischen Enzympräparates auf Streptomyces-Kulturen, gekennzeichnet dadurch, daß

   — dem Filtrat einer 48 Stunden bis 75 Stunden fermentierten Kultur des Stammes Streptomycesglobisporus ZIiVIET 43770 Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 20% bis 40% zugegeben,

   — in die erhaltene Lösung ein hydrophober Träger eingerührt und nach Sedimentation mit wäßriger Ammoniumsulfatlösung gewaschen und

   — anschließend die bakteriolytische Enzymaktivität mit schwach ionischem, schwach alkalischem Puffer mit Ethanol-Anteil desorbiert und an einem Ionenaustauscher weiter gereinigt