DD211360A5 - METHOD FOR PRODUCING A RECOMBINANT DNA CLONING VECTOR - Google Patents

Abstract

There is described a recombinant DNA cloning vector useful in Streptomyces and E. coli, comprising a) a functional origin of replication- containing restriction fragment of plasmid SCP2 or SCP2*, b) a restriction fragment comprising an E. coli origin of replication, c) one or more DNA segments that confer resistance to at least one antibiotic when transformed into a cell of E. coli, said cell being sensitive to the antibiotic for which resistance is conferred, and d) one or more DNA segments that independently confer either or both of the Streptomyces tra function or resistance to at least one antibiotic when transformed into a cell of Streptomyces, said cell being sensitive to the antibiotic for which resistance is conferred. Transformants and a method for detecting transformants of the vector are also disclosed.

Description

Verfahren zur Herstellung eines rekombinierenden DNA-Klonierungsvektors 25 Method of Making a Recombinant DNA Cloning Vector 25

Anwendungsgebiet der Erfindung;Field of application of the invention;

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer rekombinierender DNA-Klonierungsvektoren, die einen funktionellen Startpunkt eines replikationshaltigen Restriktionsfragments der Plasmide SCP2 oder SCP2* und einen funktionellen Startpunkt eines replikationshaltigen und eine Antibiotikumresistenz verleihenden Restriktions-^OJ fragments eines Plasmids enthalten, das in Escherichia coli funktionell ist.The invention relates to a process for the preparation of new recombining DNA cloning vectors that imparting a functional start point of a replication-containing restriction fragment of plasmid SCP2 or SCP2 * and a functional start point of a replication-containing and antibiotic resistance restriction ^OJ fragment of a plasmid contained in Escherichia coli is functional.

ι ο ' > K Π 7ι ο '> K Π 7

Die erfindungsgemäß erhältlichen Vektoren sind vor allem deshalb besonders brauchbar, weil sie klein, versatil und in Streptomyces oder Escherichia coli transformierbar und selektierbar sind. Mehr als die Hälfte der klinisch wichtigen Antibiotika werden durch Stämme von Strepto- : myces gebildet, so daß die Entwicklung von Klonierungssystemen und Klonierungsvektören wünschenswert ist, die sich auf diese industriell wichtige Gruppe anwenden lassen. Solche Vektoren erlauben die Klonierung von Genen in Streptomyces, wodurch sich sowohl die Ausbeuten an bekannten Antibiotika erhöhen als auch neue Antibiotika und Antibiotikaderivative produzieren lassen.The vectors obtainable according to the invention are particularly useful because they are small, versatile and are transformable and selectable in Streptomyces or Escherichia coli. More than half of the clinically important antibiotics are formed by strains of Streptomyces, so it is desirable to develop cloning systems and cloning vectors that can be applied to this industrially important group. Such vectors allow the cloning of genes in Streptomyces, thereby increasing both the yields of known antibiotics and producing new antibiotics and antibiotic derivatives.

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

und Aufgabe* Ber Erfindung:and task * Ber invention:

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine einfache Selektion von Transformanten. Eine Transformation ist ein Ereignis mit sehr niedriger Häufigkeit, so daß ein solcher funktiöneller Test eine praktische Notwendigkeit zur Bestimmung der Zellen aus Millionen Zellen ist, die das Plasmid DNA aufgenommen haben. Dies ist wichtig, weil __ DNA-Sequenzen, die nicht selektierbar sind, in die Vektoren eingesetzt werden können und sich nach Transformation dann die Zellen, die den Vektor und die jeweils interessierende DNA-Sequenz enthalten, durch geeignete Phenotypselektion isolieren lassen.The method according to the invention allows a simple selection of transformants. Transformation is a very low frequency event, so such a functional assay is a practical necessity for determining the cells from millions of cells that have taken up the plasmid DNA. This is important because DNA sequences which are not selectable can be inserted into the vectors and, after transformation, then the cells containing the vector and the DNA sequence of interest can be isolated by suitable phenotype selection.

Im Zusammenhang mit der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden bestimmte Begriffe verwendet, die wie folgt definiert sind:In the context of the description of the present invention, certain terms are used which are defined as follows:

3,4kb BamHI-Restriktionsfragment der Plasmide pLR1 oder pI.R4 = das gleiche, eine Neomycinresistenz übertragende 3,4kb BamHI-Fragment, das im Plasmid pIJ2 enthalten ist.3.4kb BamHI restriction fragment of plasmids pLR1 or pI.R4 = the same, neomycin resistance-conferring 3.4kb BamHI fragment contained in plasmid pIJ2.

R Amp = der ampicillinresistente Phenotyp.R amp = the ampicillin-resistant phenotype.

Amp = der ampicillinsensitive Phenotyp.Amp = the ampicillin-sensitive phenotype.

R Tet = der tetracyclinresistente Phenotyp.R Tet = the tetracycline resistant phenotype.

g Tet = der tetracyclinsensitive Phenotyp.g Tet = the tetracycline-sensitive phenotype.

cm = der chloraraphenicolresistente Phenotyp.cm = the chloro-phenolic-resistant phenotype.

g Cm = der chloramphenicolsensitive Phenotyp.g Cm = the chloramphenicol-sensitive phenotype.

R Neo = der neomycinresistente Phenotyp.R Neo = the neomycin resistant phenotype.

S Neo = der neomycinsensitive Phenotyp.S Neo = the neomycin-sensitive phenotype.

Thio = der thiostreptonresistente Phenotyp. Thio = der thiostreptonsensitive Phenotyp.Thio = the thiostrepton-resistant phenotype. Thio = the thiostreptone-sensitive phenotype.

RSR S Neo , Neo , Thio und Thio beziehen sich lediglich auf Ergebnisse von Versuchen in Streptomyces, wie sie vor-RSR S Neo, Neo, Thio and Thio only refer to results of experiments in Streptomyces as described above.

R SR S R liegend angewandt wurden. Amp , Amp , Tet , Tet , CmR SR S R were applied horizontally. Amp, Amp, Tet, Tet, Cm

20 und Cm beziehen sich nur auf Ergebnisse von Versuchen in Escherichia coli, wie sie vorliegend angewandt wurden.20 and Cm refer only to results of experiments in Escherichia coli as used herein.

Darlegung des Wesens der Erfindung;Explanation of the essence of the invention;

^ZJ Die Erfindung bezieht sich speziell auf ein Verfahren zur Herstellung eines rekaribinierenden DNA-Klonierungsvektors, das da-' durch gekennzeichnet ist, daß man einen funktioneilen Startpunkt eines replikationshaltigen Restriktionsfragments der Plasmide SCP2 oder SCP2* mit ein oder mehr ^ZJ The invention specifically relates to a method for producing a rekaribinierenden DNA cloning vector that is DA 'characterized by, that a more functional starting point of replication-containing restriction fragment of plasmid SCP2 or SCP2 * with one or

DNA-Sequenzen verbindet, die enthaltenConnects DNA sequences that contain

(ä) ein Restriktionsfragment, das einen Replikationsstartpunkt von Escherichia coli enthält,(a) a restriction fragment containing an origin of replication of Escherichia coli,

(b) ein oder mehr-DNA-Segmente, die eine Resistenz(b) one or more DNA segments that have resistance

gegenüber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, c wenn sie in eine Zelle von Escherichia coli transformiert sind, die gegenüber dem Antibiotikum sensitiv ist, für das eine Resistenz verliehen wird, undconferring on at least one antibiotic, c, when transformed into a cell of Escherichia coli that is sensitive to the antibiotic for which resistance is conferred, and

IQ (c) ein oder mehr DNA-Segmente, die unabhängig eine Streptomyces tra-Funktion und/oder Resistenz gegenüber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in eine Zelle von Streptomyces transformiert sind, die gegenüber dem Antibiotikum sensitiv ist, für welches eine Resistenz verliehen wird.IQ (c) one or more DNA segments that independently confer Streptomyces tra function and / or resistance to at least one antibiotic when transformed into a Streptomyces cell sensitive to the antibiotic for which resistance is conferred becomes.

Die erfindungsgemäß erhältlichen rekombinierenden DNA-Klonierungsvektoren eignen sich unter anderem zur Detektion transformierter Zellen von Streptomyces, indem man ·The recombinant DNA cloning vectors obtainable according to the invention are suitable inter alia for detecting transformed cells of Streptomyces by

1) Zellen von Streptomyces unter Transformationsbedingungen mit einem solchen rekombinierenden1) cells of Streptomyces under transformation conditions with such a recombining

25 DNA-Klonierungsvektor vermischt und25 DNA cloning vector mixed and

2) diese Zellen von Streptomyces auf einem Rasen aus einem Indikator für einen Stamm von Streptomyces wachsen läßt und die Kolonien, die den2) grows these cells of Streptomyces on a lawn from an indicator of a strain of Streptomyces and the colonies containing the

30 M-Pustelphenotyp zeigen, selektiert.30 M-pustule phenotype show, selected.

Die obigen Vektoren werden am besten konstruiert durch Verbinden eines Startpunkts eines replikationshaltigen und eine Streptomyces tra-Funktion verleihenden Restriktionsfragments der Plasmide SCP2 oder SCP2* mit einem Startpunkt von Escherichia coli eines replikationshaltigen und eine Antibiotikumresistenz verleihenden Restriktionsfragments eines Plasmids von Escherichia coli. Die Plasmide SCP2 und SCP2*, aus denen Startpunkte einer Replikation konstruiert werden/ haben jeweils eine Größe von etwa 31 kb und zeigen ähnliche Restriktionsmuster. Das Plasmid SCP2* entspringt als spontane Mutante des Plasmids SCP2 und kodiert für _ eine selektierbare Kolonie an Pustelmorphologie. Diese Pustel ist zwar von derjenigen des Plasmids SCP2 unterscheidbar, doch sind die Plasmide SCP2 und SCP2* ansonsten praktisch identisch.The above vectors are best constructed by linking a starting point of a replication-containing and Streptomyces tra function-conferring restriction fragment of plasmids SCP2 or SCP2 * to a starting point of Escherichia coli of a replication-containing and antibiotic resistance-conferring restriction fragment of an Escherichia coli plasmid. The plasmids SCP2 and SCP2 *, from which start points of a replication are constructed, each have a size of about 31 kb and show similar restriction patterns. The plasmid SCP2 * originates as a spontaneous mutant of the plasmid SCP2 and encodes a selectable colony of pustule morphology. Although this pustule is distinguishable from that of the plasmid SCP2, the plasmids SCP2 and SCP2 * are otherwise virtually identical.

nn Da die vorliegende Offenbarung lehrt, daß die Streptomyces tra-Funktion und der Startpunkt der Replikation der Plasraide SCP2 und SCP2* innerhalb ihrer jeweiligen etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Restriktionsfragmente liegen, läßt sich eine Reihe replikationshaltiger und Streptomyces tra-Funktion verleihender Fragmente mit unterschiedlichem Startpunkt bilden. Dies wird erreicht durch Verdauung mit Restriktionsenzymen, die den etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Bereich ausschneiden. Ein detaillierter Restriktionsstellenplan für das Plasmid SCP2* (und nn Because the present disclosure teaches that the Streptomyces tra function and the origin of replication of Plasraide SCP2 and SCP2 * are within their respective approximately 5.4 kb EcoRI-Sall restriction fragments, can be a series replikationshaltiger and Streptomyces tra function-imparting Form fragments with different starting point. This is achieved by digestion with restriction enzymes that cut out the approximately 5.4 kb EcoRI-Sall region. A detailed restriction site plan for the plasmid SCP2 * (and

3Q somit auch für das Plasmid SCP2) geht aus Figur 1 der Zeichnung hervor.3Q thus also for the plasmid SCP2) is apparent from Figure 1 of the drawing.

Die Plasmide SCP2 und SCP2* können in herkömmlicher Weise aus den jeweiligen Stämmen von Streptomyces coelicolor A3(2) und Streptomyces coelicolor M110 isoliert werden, die beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, V.'St.A. hinterlegt und Teil der dortigen ständigen Kulturensammlung sind. Streptomyces coelicolor A3(2) ist ohne jede Beschränkung als eine bevorzugte Quelle und Vorrat für das Plasmid SCP2 unter der Nummer 15042 erhältlich. Streptomyces coelicolor M110 ist ohne jede Beschränkung als eine bevorzugte Quelle und Vorrat für das Plasmid SCP2* unter der Nummer 15041 erhältlich.Plasmids SCP2 and SCP2 * can be isolated in a conventional manner from the respective strains of Streptomyces coelicolor A3 (2) and Streptomyces coelicolor M110 available from the Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, V. St. are deposited and part of the local permanent cultural collection. Streptomyces coelicolor A3 (2) is available without any limitation as a preferred source and stock for the plasmid SCP2 under the number 15042. Streptomyces coelicolor M110 is available without limitation as a preferred source and stock for the plasmid SCP2 * under the number 15041.

Es läßt sich eine Reihe von tra-Funktion.verleihenden und einen Replikationsstartpunkt enthaltenden Restriktionsfragmenten von Plasmiden SCP2 und SCP2* konstruieren. Zu den beispielsmäßig speziell belegten Restriktionsfragmenten gehören die Restriktionsfragmente etwa 5,4 kb EcoRI-Sall, etwa 6,0 kb Sail, etwa 19 kb EcoRI-Hindlll und etwa 31 kb EcoRI des Plasmids SCP2* und das Restriktionsfragment etwa 31 kb BgIII des Plasmids SCP2. Die oben erwähnten Fragmente der Plasmide SCP2* und SCP2 sind jeweils an ein einen Replikationsstartpunkt enthaltendes und eine Antibiotikumresistenz verleihendes Fragment vonIt is possible to construct a series of trait function-conferring and replication-origin-containing restriction fragments of plasmids SCP2 and SCP2 *. Restriction fragments of about 5.4 kb Eco RI Sal, about 6.0 kb Sail, about 19 kb Eco RI Hind III and about 31 kb Eco RI of the plasmid SCP2 * and the restriction fragment about 31 kb BgIII of the plasmid SCP 2 belong to the specifically assigned restriction fragments , The above-mentioned fragments of the plasmids SCP2 * and SCP2 are each attached to an origin of replication-containing antibiotic resistance-conferring fragment of

^ÄJI Plasmiden pBR325 und pBR322 von Escherichia coli gebunden. Für den Fachmann ist ohne weiteres ersichtlich, daß - auch wenn dies nicht unbedingt erforderlich ist zweckmäßigerweise sowohl das DNA-Segment, das eine Antibiotikumresistenz in Escherichia coli verleiht, als auch ^ÄJI plasmids pBR325 and pBR322 bound by Escherichia coli. It will be readily apparent to those skilled in the art that, although not necessarily required, both the DNA segment conferring antibiotic resistance in Escherichia coli and the art

der Replikationsstartpunkt von Escherichia coli ein Restriktionsfragment des gleichen Plasmids von Escherichia coli enthält.the replication origin of Escherichia coli contains a restriction fragment of the same plasmid of Escherichia coli.

Aus Gründen einer einfachen und leichten Konstruktion verbindet man daher das Fragment etwa 31 kb EcoRI des Plasmids SCP2* und das Fragment etwa 6 kb EcoRI des Plasmids pBR325 miteinander, wodurch beispielsweise die PlasmideFor reasons of a simple and easy construction, therefore, the fragment of about 31 kb of EcoRI of the plasmid SCP2 * and the fragment of about 6 kb of EcoRI of the plasmid pBR325 are joined together, whereby, for example, the plasmids

pJL120 und pJL121 gebildet werden. Man erhält rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, da die Fragmente in einer von zwei Richtungen verbunden werden können. In ähnlicher Weise erhält man durch Verbinden des SCP2* etwa 6,0 kb Sall-Fragments mit dem etwa 6 kb SaII-Fragment von pBR325 beispielsweise die Plasmide pJL180 und pJLi81. Durch Verbinden des SCP2* etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Fragments mit dem etwa 4,8 kb EcoRI-Sall-Fragment von pBR325 gelangt man beispielsweise zum Plasmid pJL125. 1Ö Durch Verbinden des SCP2 BamHI-Verdauungsprodukts mit dem etwa 4,4 kb BamHI-Fragment des Plasmids pBR322 ergibt sich beispielsweise das Plasmid pJLi14.pJL120 and pJL121 are formed. Recombinant plasmids having two orientations are obtained because the fragments can be joined in one of two directions. Similarly, by coupling the SCP2 * about 6.0 kb Sall fragment with the approximately 6 kb SaII fragment of pBR325, for example, plasmids pJL180 and pJLi81 are obtained. By connecting the SCP2 * approximately 5.4 kb EcoRI-Sall fragment with the approximately 4.8 kb EcoRI-Sall fragment of pBR325, for example, one arrives at the plasmid pJL125. By combining the SCP2 BamHI digestion product with the approximately 4.4 kb BamHI fragment of the plasmid pBR322, the plasmid pJLi14 results, for example.

. Alle oben erwähnten Vektoren sind sowohl in Escherichia coli als auch in Streptomyces leicht selektierbar. So verleihen in Escherichia coli beispielsweise die Plasmide pJL120 und pJL121 eine Resistenz gegenüber Ampicillin und Tetracyclin, die Plasmide pJL180 und pJLi81 eine Resistenz gegenüber Ampicillin und Chloramphenicol und die Plasmide pJL125 und pJLi14 eine Resistenz gegenüber lediglich Ampicillin. Die Vektoren sind daher in herkömmlicher Weise im Wirtssystem aus Escherichia coli selektierbar, indem man dem Kulturmedium das jeweils geeignete Antibiotikum zusetzt., All of the above-mentioned vectors are readily selectable in both Escherichia coli and Streptomyces. For example, in Escherichia coli, plasmids pJL120 and pJL121 confer resistance to ampicillin and tetracycline, plasmids pJL180 and pJLi81 confer resistance to ampicillin and chloramphenicol, and plasmids pJL125 and pJLi14 confer resistance to ampicillin alone. The vectors are therefore selectable in a conventional manner in the host system from Escherichia coli by adding the appropriate antibiotic to the culture medium.

Die oben erwähnten Vektoren bilden ferner auch den sogenannten Pustelphenotyp, so daß sie in üblicher Weise in Streptomyces selektierbaf sind. Der Pustelphenotyp ist eine erkennbare Eigenart und bekannte ErscheinungThe above-mentioned vectors also also form the so-called pustule phenotype, so that they are selectable in Streptomyces in the usual way. The pustule phenotype is a recognizable feature and familiar appearance

(J. Gen. Microbiol. 126,427 (1981)), die verbunden ist mit einer letalen Zygose und der tra-Funktion (tra = Gene, die für eine Sexualübertragbarkeit kodieren) von Sexualfaktoren von Streptomyces. Nach Auftragen auf einen geeigneten Indikatorstamm ergeben sich mit Transformanten der Plasmide SCP2 und SCP2* sowie der Derivate der Plasmide SCP2 und SCP2* drei unterscheidbare Pustelmbrphologien. Die Koloniemorphologie für den wilden Typus SCP2 und die Mutante SCP2* bezeichnet man hierin jeweils als(J. Gen. Microbiol., 126, 477 (1981)) associated with lethal zygosis and tra function (tra = genes that code for sexual transmission) of Streptomyces sexual factors. After application to a suitable indicator strain, transformants of the plasmids SCP2 and SCP2 * as well as the derivatives of the plasmids SCP2 and SCP2 * result in three distinguishable pustular morbidities. Colony morphology for wild type SCP2 and mutant SCP2 * are each referred to herein as

P bzw. P*. Eine dritte und bisher unbekannte Pustelmorphologie ergibt sich durch Klonierung in die Restriktionsstelle EcoRI von SCP2 oder SCP2*. Durch eineP or P *. A third and hitherto unknown pustular morphology results from cloning into the restriction site EcoRI of SCP2 or SCP2 *. By a

solche Inserierung kommt es zu einer Inaktivierung des 5such insertion leads to an inactivation of the 5

Gens P und unerwarteten Bildung eines morphologisch unterscheidbaren Minipustelphenotyps, der hierin als M bezeichnet wird, wenn Transformanten in geeigneter Weise aufgezogen werden. Bei einem Minipustel handelt es sich um ein Pustel mit wesentlich kleinerer Größe als die Pusteln, die entweder durch SCP2 oder SCP2* gebildet werden.Gene P and unexpected formation of a morphologically distinguishable mini-legume phenotype, referred to herein as M, when transformants are appropriately reared. A mini-pustule is a pustule of significantly smaller size than the pustules formed by either SCP2 or SCP2 *.

Nur transformierte Zellen von Streptomyces zeigen den -C M-Pustelphenotyp, so daß sich Transformanten leicht identifizieren und selektieren lassen. Aus der obigen Beschreibung der vorliegenden pJL-Vektoren kann der Fach-Only transformed cells of Streptomyces show the -C M pustule phenotype, so that transformants can be easily identified and selected. From the above description of the present pJL vectors, the skilled artisan can

— ΟΙ mann ohne weiteres erkennen, daß die Plasmide pJL120, pJLi21 und pJL125 für den Phenotyp M kodieren, daß die Plasmide pJL180 und pJLi8i für den Phenotyp P* kodieren und daß das Plasmid pJL114 für den Phenotyp P kodiert. Die zur Expression des Pustelphenotyps geeigneten Indikatorstämme sind bekannt, und hierzu gehören die verschiedenen Stämme von SCP2~ und SCP2*~, wie sie aus den späteren Beispielen hervorgehen. Die vorliegenden Vektoren sind daher in Streptomyces selektierbar und äußerst brauchbar.It can be readily recognized that the plasmids pJL120, pJLi21 and pJL125 code for the phenotype M, that the plasmids pJL180 and pJLi8i encode the phenotype P * and that the plasmid pJL114 encodes the phenotype P. The indicator strains suitable for expression of the pustule phenotype are known, and these include the various strains of SCP2 ~ and SCP2 * ~, as shown in the later examples. The present vectors are therefore selectable in Streptomyces and extremely useful.

Die oben erwähnten Plasmide können ferner auch mit einem DNA-Segment versehen werden, das in Streptomyces eine Antibiotikumresistenz verleiht. Solche Derivate, von denen spezielle Beispiele die Plasmide pJLi90 und pJL195 sind, exprimieren einen weiteren selektierbaren Phenotyp. Das Plasmid pJL190 wird konstruiert durch Verbinden des eine Neomycinresistenz verleihenden etwa 7,7 kb EcoRI-HindlII-Fragments des Plasmids pLR4 mit dem etwa 19 kb EcoRI-Hindlll-Fragment des Plasmids pJL121. Das Plasmid pJL195 wird konstruiert durch Verbinden des pLR4 etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-Fragments mit dem etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Fragment des Plasmids pJL125. Das letztgenannte Plasmid pJL125 enthält das größte (5,4 kb) EcoRI-SaII-Fragment des. Plasmids pSCP2* und wird konstruiert durch Sall-Auslöschung des Plasmids pJL121. Zusätzlich zur Neomycinresistenz exprimieren die Plasmide pJL190 und pJL195 obigen Ausführungen zufolge auch den Phenotyp.M.The above-mentioned plasmids may also be provided with a DNA segment conferring antibiotic resistance in Streptomyces. Such derivatives, of which specific examples are plasmids pJLi90 and pJL195, express another selectable phenotype. Plasmid pJL190 is constructed by joining the neomycin resistance-conferring approximately 7.7 kb EcoRI-HindIII fragment of plasmid pLR4 to the approximately 19 kb EcoRI-HindIII fragment of plasmid pJL121. Plasmid pJL195 is constructed by joining the pLR4 about 7.5 kb EcoRI partial SalI fragment to the approximately 5.4 kb EcoRI-Sall fragment of plasmid pJL125. The latter plasmid pJL125 contains the largest (5.4 kb) EcoRI-SalI fragment of plasmid pSCP2 * and is constructed by SalI extinction of plasmid pJL121. In addition to neomycin resistance, plasmids pJL190 and pJL195 also express the phenotype, as noted above.

Das Plasmid pLR4, nämlich die Quelle für die eine Neomycinresistenz verleihenden Fragmente, hat eine Größe von etwa 7,7 kb und wird konstruiert durch Verbinden der mit BamHI behandelten Plasmide pBR322 und pLR1. Das Plasmid pLR1 hat eine Größe von etwa 14,8 kb und wird konstruiert durch Verbinden des mit Hindlll behandelten Plasmids pIJ2 (Nature 286, 525 (1980)) mit dem mit Hindlll behandelten Plasmid pBR322. Wie vom Fachmann ohne weiteres erkennbar, enthalten beide Plasmide pLR4 und pLR1 das gleiche GenThe plasmid pLR4, namely the source of the neomycin resistance conferring fragments, has a size of about 7.7 kb and is constructed by joining the BamHI treated plasmids pBR322 and pLR1. The plasmid pLR1 has a size of about 14.8 kb and is constructed by joining the HindIII-treated plasmid pIJ2 (Nature 286, 525 (1980)) with the HindIII-treated plasmid pBR322. As will be readily appreciated by those skilled in the art, both plasmids pLR4 and pLR1 contain the same gene

-ΙΟΙ für die Neomycinresistenz, so daß sich zur Konstruktion der oben erwähnten neomycinresistenten pJL-Vektoren eines dieser Plasmide verwenden läßt.-ΙΟΙ for the neomycin resistance, so that one of these plasmids can be used for the construction of the above-mentioned neomycin-resistant pJL vectors.

Ein weiteres, eine Neomycinresistenz verleihendes Piasmid, das als Plasmid pJL192 bezeichnet wird, wird als spontane Mutante des Plasmids pJL190 isoliert, die in Streptomyces griseofuscus vorkommt. Das Plasmid pJL192 sorgt für eine Resistenz gegenüber erhöhten Mengen an Neomycin, und es enthält daher ein neues Gen für eine Neomycinresistenz, das vom Resistenzgen, welches die Plasmide pJL190, pJLi95, pIJ2, pLR4 und pLR1 enthält, unterscheidbar ist. In ähnlicher Weise wird auch ein weiteres, eine Neomycinresistenz verleihendes Plasmid, das als Plasmid pJLi99 bezeichnet wird, als spontane Mutante des Plasmids pJLi95 isoliert. Der Fachmann erkennt ohne weiteres, daß sich das neue Gen für eine Neomycinresistenz der Plasmide pJLi92 oder pJLi99 ohne weiteres ausschneiden und mit anderen Vektoren verbinden läßt.Another neomycin resistance-conferring piasmid, referred to as plasmid pJL192, is isolated as a spontaneous mutant of plasmid pJL190 found in Streptomyces griseofuscus. The plasmid pJL192 provides resistance to increased levels of neomycin and therefore contains a novel gene for neomycin resistance, which is distinguishable from the resistance gene containing plasmids pJL190, pJLi95, pIJ2, pLR4 and pLR1. Similarly, another neomycin resistance-conferring plasmid, referred to as plasmid pJLi99, is isolated as a spontaneous mutant of plasmid pJLi95. The skilled artisan readily recognizes that the new gene for neomycin resistance of plasmids pJLi92 or pJLi99 can be readily excised and linked to other vectors.

Das Gen erlaubt eine bessere und wirkungsvollere Selektion von Transformanten. Wie im Falle der Plasmide pJL190 und pJL195 exprimieren auch die Transformanten der Plasmide ρJL192 und pJL199 den Phenotyp M, wenn man sie aufThe gene allows a better and more efficient selection of transformants. As in the case of the plasmids pJL190 and pJL195, the transformants of the plasmids ρJL192 and pJL199 express the phenotype M when they are on

einen geeigneten Indikatorstamm aufträgt. 25applies a suitable indicator strain. 25

Das Plasmid pJL192 läßt sich in üblicher Weise aus Escherichia coli K12 C600R_k-M_k~/pJL192 isolieren, nämlich aus einem Stamm, der beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, V.St.A. hinterlegt und Teil der dortigen ständigen Kulturensammlung ist. Dieser Stamm ist von dort als Vorrat und bevorzugte Quelle für das Plasmid pJLi92 unter der Nummer B-15040 frei beziehbar.The plasmid pJL192 can be isolated in the usual way from Escherichia coli K12 C600R _k -M _k ~ / pJL192, namely from a strain available from the Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, V.St.A. deposited and is part of the local permanent cultural collection. This strain is freely available therefrom as a supply and preferred source for the plasmid pJLi92 under the number B-15040.

Ein DNA-Segment, das eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Thiostrepton verleiht, wie beispielsweise das etwa 1,35 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLR2, kann auch zusammen mit dem eine Neomycinresistenz verleihenden Seg-A DNA segment conferring resistance to the antibiotic thiostrepton, such as the approximately 1.35 kb BamHI restriction fragment of the plasmid pLR2, may also be used with the neomycin resistance-conferring segment.

ment oder anstelle dieses Segments verwendet werden. Das Plasmid pLR2, nämlich die Quelle für das die Thiostreptonresistenz verleihende Fragment, hat eine Größe von etwa 18,7 kb und wird konstruiert durch Verbinden des mit Hindlll behandelten Plasmids pIJ6 (Nature 286, 525 (1980)) mit dem mit Hindlll behandelten Plasmid pBR322. Das Plasmid pLR2 ist in Escherichia coli funktionell und läßt sich daher für eine einfache anschließende Manipulation verstärken und isolieren.ment or used instead of this segment. The plasmid pLR2, namely the source of the thiostrepton resistance conferring fragment, has a size of about 18.7 kb and is constructed by joining the HindIII-treated plasmid pIJ6 (Nature 286, 525 (1980)) with the HindIII-treated plasmid pBR322 , The plasmid pLR2 is functional in Escherichia coli and can therefore be amplified and isolated for easy subsequent manipulation.

Aus Gründen einer einfachen und leichten Konstruktion verbindet man das die Thiostreptonresistenz verleihende etwa 1,35 kb BaraHI-Fragment des Plasmids pLR2 mit der BamHI-Restriktionsstelle des Plasmids pBR328 unter BiI-dung des Plasmids pJL193. Das etwa 1 kb Bcll-Restriktionsfragment des Plasmids pJL193 enthält das die Thiostreptonresistenz verleihende DNA-Segment. Durch entsprechendes Verbinden, wie dies in den Beispielen 52 bis 56 beschrieben ist, erhält man daher Vektoren, die innerhalb des Ümfangs der vorliegenden Erfindung liegen.For ease and ease of construction, the thiostrepton resistance-conferring approximately 1.35 kb BaraHI fragment of plasmid pLR2 is joined to the BamHI restriction site of plasmid pBR328 using plasmid pJL193. The approximately 1 kb BclI restriction fragment of plasmid pJL193 contains the thiostrepton resistance conferring DNA segment. Thus, by appropriately bonding, as described in Examples 52-56, vectors are obtained which are within the scope of the present invention.

Verschiedene Restriktionsfragmente der Plasmide SCP2 und SCP2* können für Zwecke einer Konstruktion der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sofern der in ihren jeweiligen etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Restriktionsfragmenten enthaltene Replikationsstartpunkt vorhanden ist. Zu solchen weiteren Restriktionsfragmenten der Plasmide SCP2 und SCP2* gehören unter anderem die Fragmente etwa 6 kb Sail, etwa 15 kb Pstl, etwa 23 kb BgIII, etwa 15 kb BamHI,Various restriction fragments of the plasmids SCP2 and SCP2 * may be used for purposes of construction of the present invention, provided that the origin of replication contained in their respective approximately 5.4 kb EcoRI-Sall restriction fragments is present. Such further restriction fragments of the plasmids SCP2 and SCP2 * include, inter alia, the fragments about 6 kb Sail, about 15 kb Pstl, about 23 kb BgIII, about 15 kb BamHI,

etwa 14 kb EcoRI-PstI, etwa 13 kb EcoRI-BamHI und etwa 15 kb Pstl-BamHI. Diese Fragmente enthalten die Streptomyces tra-Funktion und können mit einem Restriktionsfragment eines Plasmids von Escherichia coli verbunden werden, das einen in Escherichia coli funktioneilen Repli-about 14kb EcoRI-PstI, about 13kb EcoRI-BamHI, and about 15kb Pstl-BamHI. These fragments contain the Streptomyces tra function and can be linked to a restriction fragment of a plasmid of Escherichia coli which has a replication function in Escherichia coli.

·" kationsstartpunkt enthält und eine Antibiotikumresistenz verleiht. Zu solchen Plasmiden von Escherichia coli gehören beispielsweise die Plasmide pBR322, pBR324, pBR325, pBR327, pBR328 und dergleichen. Die vorliegende ErfindungSuch plasmids of Escherichia coli include, for example, plasmids pBR322, pBR324, pBR325, pBR327, pBR328, etc. The present invention

ist daher nicht auf die Verwendung eines der Plasmide pBR322 oder pBR325 beschränkt, wie sie als Beispiele in mehreren Konstruktionen von pJL verwendet werden.is therefore not limited to the use of any of the plasmids pBR322 or pBR325, as used as examples in several constructions of pJL.

Als DNA-Segmente, die eine Resistenz gegenüber den Antibiotika Neomycin und Thiostreptqn verleihen, sind hierin zwar beispielsmäßig die etwa 7,7 kb EcoRI-HindiII«und die etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-Fragmente des Plasmids pLR4 sowie die pLR2 etwa 1,35 BamHI- und die pJL193 etwa 1 kb Bcll-Fragmente erwähnt, doch kann der Fachmann auch andere DNA-Segmente konstruieren und verwenden, die ebenfalls eine Resistenz gegenüber Neomycin oder Thiostrepton verleihen. Zu anderen DNA-Segmenten des Plasraids pLR1, die eine Neomycinresistenz verleihen, gehören beispielsweise das etwa 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment, das etwa 3,5 kb Pstl-Restriktionsfragment und das größere der Sstl-Kpnl-Subfragmente des etwa 3,4 kb BamHI-Re-.striktionsfragments. Zu anderen eine Thiostreptonresistenz verleihenden Segmente gehört beispielsweise das etwa 13 kb Pstl-Fragment des Plasmids pLR2. Es lassen sich auch weitere DNA-Segmente, die eine Resistenz gegenüber den gleichen oder anderen Antibiotika verleihen, wie beispielsweise gegenüber Hygromycin, Viamycin, Tylosin, Erythromycin und dergleichen, in dem Fachmann geläufiger Weise konstruieren und verwenden. Darüber hinaus können auch verschiedene funktionelle Derivate der oben beschriebenen, eine Antibiotikumresistenz verleihenden DNA-Segmente konstruiert werden, indem man Nucleotide in Übereinstimmung mit dem genetischen Kode addiert, eliminiert oder sub-As DNA segments conferring resistance to the antibiotics neomycin and thiostreptin, for example, the approximately 7.7 kb EcoRI-HindIII and the approximately 7.5 kb EcoRI partial SalI fragments of the plasmid pLR4 and the pLR2 are exemplified herein The artisan may also construct and use other DNA segments that also confer resistance to neomycin or thiostrepton. Other DNA segments of plasride pLR1 which confer neomycin resistance include, for example, the approximately 3.4 kb BamHI restriction fragment, the approximately 3.5 kb PstI restriction fragment, and the larger of the approximately 3.4 kb Sstl KpnI subfragments BamHI Re-.striktionsfragments. Other thiostrepton resistance conferring segments include, for example, the approximately 13 kb PstI fragment of plasmid pLR2. Other DNA segments that confer resistance to the same or other antibiotics, such as hygromycin, viamycin, tylosin, erythromycin, and the like, may also be constructed and used in a manner well known to those skilled in the art. In addition, various functional derivatives of the above-described antibiotic resistance-conferring DNA segments can also be constructed by adding, eliminating or subclassing nucleotides in accordance with the genetic code.

^ou stituiert. Durch Verbinden der oben erwähnten Derivate oder irgendeines der anderen, eine Antibiotikumresistenz verleihenden DNA-Segmente mit einem Vektor, der ein eine Antibiotikumresistenz verleihendes DNA-Segment von Escherichia coli, ein Restriktionsfragment mit einem ^ou stituiert. By combining the above-mentioned derivatives or any of the other antibiotic resistance-conferring DNA segments with a vector containing an antibiotic resistance-conferring DNA segment of Escherichia coli, a restriction fragment having a

Replikationsstartpunkt von Escherichia coli und ferner ein einen Replikatxonsstartpunkt enthaltendes Restriktionsfragment der Plasmide SCP2 oder SCP2* enthält, ge-The replication origin of Escherichia coli and also contains a replication starting point containing restriction fragment of the plasmids SCP2 or SCP2 *,

langt man zu Plasmiden, die innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen. Das eine Antibiotikumresistenz verleihende DNA-Segment läßt sich daher als selektierbarer Präger anstelle der Streptomyces tra-Funktion verwenden und mit einem Pustelphenotyp in Verbindung stehen. Die erfindungsgemäßen Vektoren sind daher nicht auf die Verwendung von tra allein oder in Kombination mit einem eine Antibiotikumresistenz verleihenden DNA-Segment beschränkt. Darüber hinaus ist ein besonderes, eine Antibiotikumresistenz verleihendes DNA-Segment nicht auf eine einzige Stelle an den vorliegenden chimeren Plasmiden beschränkt sondern läßt sich auch an verschiedenen Stellen verbinden oder einsetzen, sofern der Replikationsstartpunkt oder sonstige kritische plasmidgesteuerte physiologische Funktionen nicht zerstört werden. Der Fachmann weiß oder kann ohne weiteres ermitteln, welche Stellen für eine Verbindung oder einen Einsatz eines bestimmten DNA-Segments zweckmäßig sind.reaching plasmids which are within the scope of the present invention. The antibiotic resistance-conferring DNA segment can therefore be used as a selectable promoter in place of Streptomyces tra function and associated with a pustular phenotype. The vectors of the invention are therefore not limited to the use of tra alone or in combination with an antibiotic resistance-conferring DNA segment. In addition, a particular DNA segment conferring antibiotic resistance is not limited to a single site on the subject chimeric plasmids, but may be joined or deployed at various sites unless the origin of replication or other critical plasmid-directed physiological functions are disrupted. The person skilled in the art knows or can readily determine which sites are appropriate for a compound or use of a particular DNA segment.

Die verschiedenen Restriktionsfragmente der Plasmide SCP2, SCP2*, pBR325, pBR322 und dergleichen und ferner auch die verschiedenen, eine Antibiotikumresistenz verleihenden DNA-Segmente, welche die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten, können zu einer Erleichterung der Verbindung modifiziert sein. So lassen sich beispielsweise bei einigen oder allen der oben erwähnten DNA-Fragmente Molekülverknüpfer vorsehen. Auf diese Weise können ganz einfach spezielle Stellen für eine nachfolgende Verbindung konstruiert werden. Die einen Replikationsstartpunkt enthaltenden Restriktionsfragmente können weiter auch durch Addition, Eliminierung oder Substitution bestimmter Nucleotide so abgewandelt werden, daß es hierdurch zu einer Veränderung ihrer Eigenschaften unter Bildung einer Vielfalt an Restriktionsstellen für eine Verbindung von DNA kommt. Der mit der Nucleotidchemie und dem genetischen Kode vertraute Fachmann weiß, welche Nucleotide gegenseitig austauschbar sind und durch welche AbwandlungenThe various restriction fragments of the plasmids SCP2, SCP2 *, pBR325, pBR322 and the like and also the various antibiotic resistance-conferring DNA segments containing the vectors of the invention may be modified to facilitate compounding. Thus, for example, some or all of the above-mentioned DNA fragments may provide molecular linkage. In this way, it is easy to construct special locations for a subsequent connection. The restriction fragment containing an origin of replication may be further modified by addition, elimination or substitution of particular nucleotides, thereby changing their properties to form a variety of restriction sites for a compound of DNA. The person skilled in the art of nucleotide chemistry and genetic code knows which nucleotides are interchangeable and by what modifications

-14-von DNA sich jeweils ein bestimmter Zweck erreichen läßt.DNA can always achieve a specific purpose.

Die rekombinierenden DNA-Klonierungsvektoren, die die SCP2 oder SCP2* Streptomyces tra-Funktion enthalten, sind selbstübertragbar und lassen sich daher ohne weiteres während einer Paarung zwischen transformierten und nichttransformierten Vertretern aus der Gattung der Streptomyces übertragen. Dies ist von Vorteil, weil sich die vorliegenden Vektoren daher nicht nur durch Protoplasttransformation sondern auch durch herkömmliche genetische Kreuzungen übertragen lassen. Die Vektoren sind daher in Stämmen von Streptomyces brauchbar, die schwierig protoplastizierbar sind, wodurch sich die Anzahl an Wirten stark erhöht, in denen eine Genmanipulation und DNA-KIo-The recombinant DNA cloning vectors containing the SCP2 or SCP2 * Streptomyces tra function are self-transmittable and therefore can be readily transferred during mating between transformed and non-transformed members of the genus Streptomyces. This is advantageous because the present vectors can therefore be transferred not only by protoplast transformation but also by conventional genetic crosses. The vectors are therefore useful in strains of Streptomyces which are difficult to protoplastize, thus greatly increasing the number of hosts in which gene manipulation and DNA cloning can occur.

15 nierung vorgenommen werden kann.15 nierung can be made.

Noch wichtiger ist, daß in den vorliegenden Vektoren konstruierte DNA-Bibliotheken einfach und rasch durch herkömmliche Doppelplättenpaarungsverfahren bezüglich interessierender Gene durchgesehen werden können. Ohne die tra-Funktion muß die DNA von jedem der Tausende an Klonen in der Bibliothek abgetrennt und in geeignete Stämme transformiert werden, damit sich die Klone identifizieren lassen, die die gewünschten Gene enthalten.More importantly, DNA libraries constructed in the present vectors can be readily and rapidly screened for genes of interest by conventional double-strand pairing techniques. Without the tra function, the DNA from each of the thousands of clones in the library must be separated and transformed into appropriate strains to identify the clones containing the desired genes.

^z;j Es gibt keine breit anwendbaren Phagvektoren für einen Einsatz in Streptomyces, so daß die vorliegenden tra Vektoren die allgemeine Klonierungs- und Auswahlrolle analog zu der des Bacteriophagen λ bei einer Doppelplattenpaarung für eine Durchsuchung von Genbibliothe- ^{z; j} There is no widely applicable phage vectors for use in Streptomyces, so that the present tra vectors the general cloning and selection role analogous to that of the bacteriophage λ in a double-plate pairing for a search of Genbibliothe-

ken in Escherichia coli erfüllen. Auf diese Weise lassen sich durch das Doppelplättenpaarungsverfahren ohne weiteres die erwünschten Gene identifizieren und dann durch Einschleusung in Escherichia coli in der im späteren Beispiel 2OC beschriebenen Weise leicht verstärken. , Die erfindungsgemäßen Vektoren sind breit anwendbar und werden in Wirtszellen mancher Vertreter aus der Gattung der Streptomyces transformiert, insbesondere in restriktions-ken in Escherichia coli. In this way, the double-mating process readily identifies the desired genes and then readily amplifies them by introduction into Escherichia coli in the manner described in Example 2OC, below. The vectors according to the invention are widely applicable and are transformed into host cells of some representatives of the genus Streptomyces, in particular in restriction

losen Stämmen wirtschaftlich wichtiger Taxa, die Antibiotika bilden, wie Aminoglycosid-, Makrolid-, ß-Lactam-, Polyether- und Glycopeptidantibiotika. Solche restriktionslose Stämme lassen sich aus der Gattung der Streptomyces unter Anwendung herkömmlicher Verfahren leicht selektieren und isolieren (Microbiological Reviews 44, 206 (1980)). Wirtszellen restriktionsloser Stämme enthalten keine Restriktionsenzyme, so daß sie Plasmid-DNA nach Transformation nicht schneiden oder abbauen. Wirtszellen, die Restriktionsenzyme enthalten, welche keine Restriktionsstellen der vorliegenden Vektoren schneiden, werden erfindungsgemäß ebenfalls als restriktionslos angesehen.loose strains of economically important taxa that produce antibiotics such as aminoglycoside, macrolide, β-lactam, polyether and glycopeptide antibiotics. Such restrictionless strains can be readily selected and isolated from the genus Streptomyces using conventional techniques (Microbiological Reviews 44, 206 (1980)). Host cells of restriction-less strains contain no restriction enzymes so that they do not cut or degrade plasmid DNA after transformation. Host cells containing restriction enzymes that do not cut restriction sites of the present vectors are also considered to be restriction free in this invention.

1.5 Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Gattung Streptomyces, die Aminoglycosidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen:1.5 Preferred host cells of restriction-less strains of the genus Streptomyces, which produce aminoglycoside antibiotics and in which the present vectors are particularly useful and are transformed, include restriction-free cells of, for example, the following organisms:

s. kana myceticus (Kanamycine), S. chrestomyceticus (Aminosidin), S. griseoflavus (Antibiotikum MA 1267), S. microsporeus (Antibiotikum SF-767),S. ribosidificus (Antibiotikum SF733), S. flavopersicus (Spectinomycin), S. spectabilis (Actinospectacin), S. rimosus formas. kana myceticus (kanamycins), S. chrestomyceticus (aminosidine), S. griseoflavus (antibiotic MA 1267), S. microsporeus (antibiotic SF-767), p. ribosidificus (antibiotic SF733), S. flavopersicus (spectinomycin), S. spectabilis (Actinospectacin), S. rimosus forma

paromomycinus (Paromomycine, Catenulin), S. fradiae var. italicus (Aminosidin), S. bluensis var.. bluensis (Bluensomycin), S. catenulae (Catenulin), S. olivoreticuli var. cellulophilus (Destomycin A), S. tenebrarius (Tobramycin,paromomycinus (paromomycin, catenulin), S. fradiae var. italicus (aminosidine), S. bluensis var. bluensis (bluensomycin), S. catenulae (catenulin), S. olivoreticuli var. cellulophilus (destomycin A), S. tenebrarius ( tobramycin,

Apramycin), S. lavendulae (Neomycin), S. albogriseolus on ^Λν (Neomycine), S. albus var. metamycinus (Metamycin), S. hygroscopicus var. sagamiensis (Spectinomycin), S. bikiniensis (Streptomycin), S. griseus (Streptomycin), S. erythrochromogenes var. narutoensis (Streptomycin),Apramycin), S. lavendulae (neomycin), S. albogriseolus on ^Λν (neomycin), S. albus var. Metamycinus (metamycin), S. hygroscopicus var. Sagamiensis (spectinomycin), S. bikiniensis (streptomycin), S. griseus ( Streptomycin), S. erythrochromogenes var. Narutoensis (streptomycin),

S. poolensis (Streptomycin), S. galbus (Streptomycin),S. poolensis (streptomycin), S. galbus (streptomycin),

S. rameus (Streptomycin), S. olivaceus (Streptomycin),S. rameus (streptomycin), S. olivaceus (streptomycin),

S. mashuensis (Streptomycin), S. hygroscopicus var.· limoneus (Validamycine), S. rimofaciens (Destomycine),S. mashuensis (streptomycin), S. hygroscopicus var. Limoneus (validamycin), S. rimofaciens (destomycin),

S. hygroscopicus forma glebosus (Glebomycin), S. fradiae (Hybrimycine, Neomycine), S. eurocidicus (Antibiotikum A16316-C), S. aquacanus (N-Methylhygromycin B), S. crystallinus (Hygromycin A), S. noboritoensis (Hygromycin), S. hygroscopicus (Hygromycine), S. atrofaciens (Hygromycin), S. kasugaspinus (Kasugamycine), S. kasugaensis (Kasugamycine), S. netropsis (Antibiotikum LL-AM31), S. lividus (Lividomycine), S. hofuensis (SeI-domycinkomplex) und S. canus (Ribosylparoiiiamin).S. hygroscopicus forma glebosus (glebomycin), S. fradiae (hybrimycins, neomycins), S. eurocidicus (antibiotic A16316-C), S. aquacanus (N-methylhygromycin B), S. crystallinus (hygromycin A), S. noboritoensis (S. Hygromycin), S. hygroscopicus (hygromycin), S. atrofaciens (hygromycin), S. kasugaspinus (kasugamycin), S. kasugaensis (kasugamycin), S. netropsis (antibiotic LL-AM31), S. lividus (lividomycin), S. hofuensis (Se-domycin complex) and S. canus (Ribosylparoiiiamin).

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Gattung Streptomyces, die Makrolidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden, gehören restriktions-Preferred host cells of restriction-less strains of the genus Streptomyces, which form macrolide antibiotics and in which the present vectors are particularly useful and are transformed, include restriction enzymes.

15 lose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen:15 loose cells of, for example, the following organisms:

S. caelestis (Antibiotikum M188), S. platensis (Platenomycin), S. rochei var. volubilis (Antibiotikum T2636), S. venezuelae (Methymycine), S. griseofuscus (Bundlin), S. narbonensis (Josamycin, Narbomycin), S. fungicidicusS. caelestis (antibiotic M188), S. platensis (platenomycin), S. rochei var. Volubilis (antibiotic T2636), S. venezuelae (methymycins), S. griseofuscus (Bundlin), S. narbonensis (Josamycin, Narbomycin), S.E. fungicidicus

20 (Antibiotikum NA-181), S. griseofaciens (Antibiotikum20 (antibiotic NA-181), S. griseofaciens (antibiotic

PA133A, B), S. roseocitreus (Albocyclin), S. bruneogriseus (Albocyclin), S. roseochromogenes (Albocyclin), S. cinerochromogenes (Cineromycin B), S. albus (Albomycetin), S. felleus (Argomycin, Picromycin), S. rochei (Lankacidin,PA133A, B), S. roseocitreus (albocycline), S. bruneogriseus (albocycline), S. roseochromogenes (albocycline), S. cinerochromogenes (cineromycin B), S. albus (albomycetin), S. felleus (argomycin, picromycin), S. rochei (Lankacidin,

Borrelidin), S. violaceoniger (Lankacidin), S. griseus (Borrelidin), S. maizeus (Ingramycin), S. albus var. coilmyceticus (Coleimycin), S. mycarofaciens (Acetylleukomycin, Espinomycin), S. hygroscopicus (Turimycin, Relomycin, Maridomycin, Tylosin, Carbomycin), S. griseo-Borrelidin), S. violaceoniger (lankacidin), S. griseus (borrelidin), S. maizeus (ingramycin), S. albus var. Coilmyceticus (Coleimycin), S. mycarofaciens (acetylleukomycin, Espinomycin), S. hygroscopicus (Turimycin, Relomycin , Maridomycin, tylosin, carbomycin), S. griseo-

° spiralis (Relomycin), S. lavendulae (Aldgamycin), S.° spiralis (relomycin), S. lavendulae (aldgamycin), S.

rimosus (Neutramycin), S. deltae (Deltamycine), S. fungicidicus var. espinomyceticus (Espinomycine), S. furdicidicus (Mydecamycin), S. eurocidicus (Methymycin),S.rimosus (neutramycin), S. deltae (deltamycins), S. fungicidicus var. espinomyceticus (espinomycins), S. furdicidicus (mydecamycin), S. eurocidicus (methymycin), S.

griseolus (Griseomycin), S. flavochromogenes (Amaromycin,griseolus (griseomycin), S. flavochromogenes (amaromycin,

Shincomycine), S-.* fimbriatus . (Amaromycin) , S. fasciculus (Amaromycin), S. erythreus (Erythromycine), S. antibioticus (Oleandomycin), S. olivochromogenes (Oleandomycin),Shincomycins), S -. * Fimbriatus. (Amaromycin), S. fasciculus (amaromycin), S. erythreus (erythromycins), S. antibioticus (oleandomycin), S. olivochromogenes (oleandomycin),

S. spinichromogenes var. suragaoensis (Kujimycine), S. kitasatoensis (Ijeucomycin) , S. narbonensis var. josamyceticus (Leucomycin A3, Josamycin), S. albogriseolus (Mikonomycin), S. bikiniensis (Chalcomycin), S. cirratus (Cirramycin), S. djakartensis (Niddamycin), S. eurythermus (Angolamycin), S. fradiae (Tylosin, Lactenocin, Macrocin), S. goshikiensis (Bandamycin), S. griseoflavus (Acumycin), S. halstedii (Carbomycin), S. tendae (Carbomycin), S. macrosporeus (Carbomycin), S. thermotolerans (Garbomycin), S. albireticuli (Carbomycin) und S. ambofaciens (Spiramycin).S. spinichromogenes var. Suragaoensis (kujimycins), S. kitasatoensis (Ijeucomycin), S. narbonensis var. Josamyceticus (leucomycin A3, josamycin), S. albogriseolus (miconomycin), S. bikiniensis (chalcomycin), S. cirratus (cirramycin) , S. djakartensis (niddamycin), S. eurythermus (angolamycin), S. fradiae (tylosin, lactenocin, macrocin), S. goshikiensis (bandamycin), S. griseoflavus (acumycin), S. halstedii (carbomycin), S. tendae (Carbomycin), S. macrosporeus (carbomycin), S. thermotolerans (garbomycin), S. albireticuli (carbomycin) and S. ambofaciens (spiramycin).

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Gattung Streptomyces, die ß-Lactamantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen: S. lipmanii (A16884, MM4550, MM13902), S. clavuligerus (A16886B, Clavulansäure), S. lactamdurans (Cephamycin C),Preferred host cells of restriction-less strains of the genus Streptomyces which produce β-lactam antibiotics and in which the present vectors are particularly useful and are transformed include restriction-free cells of, for example, the following organisms: S. lipmanii (A16884, MM4550, MM13902), S. clavuligerus (A16886B, clavulanic acid), S. lactamdurans (cephamycin C),

s. griseus (Cephamycin A, B), S. hygroscopicus (Desacetoxycephalosporin C), S. wadayamensis (WS-3442-D), S. chartreusis (SF 1623), S. heteromorphus und S. panayensis (C2081X), S. cinnamonensis, S. fimbriatus, S. halstedii, S. rochei und S. viridochromogenes (Cephamycine A, B),s. griseus (cephamycin A, B), S. hygroscopicus (desacetoxycephalosporin C), S. wadayamensis (WS-3442-D), S. chartreusis (SF 1623), S. heteromorphus and S. panayensis (C2081X), S. cinnamonensis, S. fimbriatus, S. halstedii, S. rochei and S. viridochromogenes (cephamycins A, B)

" S. cattleya (Thienamycin) und S. olivaceus, S. flavovirens, S. flavus, S. fulvoviridis, S. argenteolus sowie S. sioyaensis (MM 4550 und MM 13902).S. cattleya (thienamycin) and S. olivaceus, S. flavovirens, S. flavus, S. fulvoviridis, S. argenteolus and S. sioyaensis (MM 4550 and MM 13902).

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Gattung Streptomyces, die. Polyetherantibiotika bürden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen: S. albus (A204, A28695A und B, Salinomycin), S. hygro-³ß scopicus (A218, Emericid, DE3936), A120A, A28695A und B, Etheromycin, Dianemycin), S. griseus (Grisorixin), S. conglobatus (Ionomycin), S. eurocidicus var. asterocidicus (Laidlomycin), S. lasaliensis (Lasalocid), S. ribosi-Preferred host cells of restriction-less strains of the genus Streptomyces, the. Polyether loads and in which the present vectors are especially useful and are transformed, include restrictionless cells of, for example, the following organisms: S. albus (A204, A28695A and B, salinomycin), S. hygro- ³ ß scopicus (A218, Emericid, DE3936) Griseus (grisorixin), S. conglobatus (ionomycin), S. eurocidicus var. Asterocidicus (Laidlomycin), S. lasaliensis (Lasalocid), S. ribosi-

dificus (Lonomycin), S. cacaoi var. asoensis (Lysocellin), S. cinnamonensis (Monensin), S. aureofaciens (Narasin), S. gallinarius (RP 30504) , S-. longwoodensis (Lysocellin) , S. flaveolus (CP38936), S. mutabilis (S-11743a) und sidificus (Lonomycin), S. cacaoi var. asoensis (Lysocellin), S. cinnamonensis (Monensin), S. aureofaciens (Narasin), S. gallinarius (RP 30504), S-. longwoodensis (Lysocellin), S. flaveolus (CP38936), S. mutabilis (S-11743a) and si

5 violaceoniger (Nigericin).5 violaceoniger (Nigericin).

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Gattung Streptomyces, die Glycopeptidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen: S. orientalis und S. haranomachiensis (Vancomycin), S. candidus (A-35512, Avoparcin) und S. eburosporeus (LL-AM 374).Preferred host cells of restriction-less strains of the genus Streptomyces, which produce glycopeptide antibiotics and in which the subject vectors are particularly useful and are transformed, include restriction-free cells of, for example, the following organisms: S. orientalis and S. haranomachiensis (vancomycin), S. candidus (A. -35512, avoparcin) and S. eburosporeus (LL-AM 374).

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme anderer Streptomyces, in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgen-Preferred host cells of restriction-less strains of other Streptomyces in which the present vectors are particularly useful and are transformed include restriction-free cells of, for example,

20 den Organismen: S. granuloruber, S. roseosporus, S. lividans, S. espinosus und S. azureus.To the organisms: S. granuloruber, S. roseosporus, S. lividans, S. espinosus and S. azureus.

Zusätzlich zu den oben beschriebenen Wirtszellen typischer Streptomyces sind die vorliegenden Vektoren auch in Escherichia coli brauchbar und transformierbar. Die erfindungsgemäßen Vektoren sind daher breit anwendbar und geeignet, und sie können in Wirtszellen aus einer Vielfalt von Organismen transformiert werden.In addition to the above-described host cells of typical Streptomyces, the present vectors are also useful and transformable in Escherichia coli. The vectors of the invention are therefore broadly applicable and suitable, and can be transformed into host cells from a variety of organisms.

Im allgemeinen sind alle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung brauchbar. Einige der vorliegenden rekombinierenden DNA-Klonierungsvektoren und Transformanten sind jedoch bevorzugt. Bevorzugte Vektoren sind daher pJL114, pJLi21, pJLi25, pJL180, pJL190, pJL192, pJL195, pJL197, pJLi99 und pHJL212, und zu bevorzugten Transformanten gehören demnach Streptomyces griseofuscus/pJL114, S. griseofuscus/pJLi21, S. griseofuscus/pJL125, S. gri-In general, all embodiments of the present invention are useful. However, some of the present recombinant DNA cloning vectors and transformants are preferred. Preferred vectors are therefore pJL114, pJLi21, pJLi25, pJL180, pJL190, pJL192, pJL195, pJL197, pJLi99 and pHJL212, and thus preferred transformants include Streptomyces griseofuscus / pJL114, S.griseofuscus / pJLi21, S.griseofuscus / pJL125, S.gri -

seofuscus/pJLieO, S- griseofuscus/pJLI90, S. griseofuscus/ pJLi92, S. griseofuscus/pJL195, S. griseofuscus/pJL199, S. griseofuscus/pJLI97, S. griseofuscus/pHJL212, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL114, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL121, E. coli K12 C600R_k -M_k-/pJL125, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL-griseofuscus / pJLi92, S. griseofuscus / pJL195, S. griseofuscus / pJL199, S. griseofuscus / pJLI97, S. griseofuscus / pHJL212, E. coli K12 C600R _k -M _k - / pJL114, E. coli K12 C600r _k -M _k - / pJL121, E. coli K12 C600r _k -M _k - / pJL125, E. coli K12 C600r _k -M _k - / PJL

180, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL190, E. coli K12 C600R_k~M_k-/pJL192, E. coli K12 C600R_k"M_k-/pJL195, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJLi99, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL197 und E. , coli K12 C600R_k-M_k-/pHJL212. Am meisten bevorzugt sind aus dieser bevorzugten Gruppe die Plasmide pJL190, pJL192, PJL195, pJLi97, pJL199 und pHJL212 und die Transformanten S. griseofuscus/pJLI90, S. griseofuscus/pJLi92, S. griseofuscus/pJLi95, S. griseofuscus/pJLI97, S. griseofuscus/pJL199, S. griseofuscus/pHJL212, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL190, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL192, E, coli K12 C600R_k-M_k-/pJL195 und E. coli K12 C600R_k-M_k~/pJL197, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL199 und E. coli K12 C600R_k~M_k-/pHJL212. Streptomyces griseofuscus ist ein bevorzugter Wirt, weil dieser Organismus kein endogenes Plasmid enthält und kein Antibiotikum synthetisiert. Transformanten von Streptomyces griseofuscus können daher auf Klone durchsucht werden, die Gene für eine Antibiotikumsynthese ausdrücken.180, E. coli K12 C600r _k -M _k - / pJL190, E. coli K12 C600r ~ _k M _k - / pJL192, E. coli K12 C600r _k 'M _k - / pJL195, E. coli K12 C600r _k -M _k - / pJLi99, E. coli K12 C600r _k -M _k - / pJL197 and E. coli K12 C600r _k -M _k -. / pHJL212 most preferably, the plasmids pJL190, pJL192, PJL195, pJLi97, pJL199 are from this preferred group and griseofuscus / pJLI90, S. griseofuscus / pJLi92, S. griseofuscus / pJLi95, S. griseofuscus / pJLI97, S. griseofuscus / pJL199, S. griseofuscus / pHJL212, E. coli K12 C600R _k -M _k - / pJL190, E. coli K12 C600r _k -M _k - / pJL192, E. coli K12 C600r _k -M _k - / pJL195 and E. coli K12 C600r _k -M _k ~ / pJL197, E. coli K12 C600r _k - M _k - / pJL199 and E. coli K12 C600R _k - M _k - / pHJL212 Streptomyces griseofuscus is a preferred host because this organism does not contain an endogenous plasmid and does not synthesize an antibiotic. Therefore, clones of Streptomyces griseofuscus transformants can be searched Genes for antibiotic synthesis au Skey.

Die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten Replikationsstartpunkte, die in Escherichia coli und Streptomyces funktionell sind und gestalten die Auswahl an Wirten daher flexibel. Klonierte DNA-Sequenzen können deshalb in Escher ichia coli eingeschleust werden, um hierdurch neue Plasmide zu konstruieren, physikalisch zu analysieren und Restriktionsstellen vorzusehen, und sie lassen sich dann wieder in Streptomyces rückschleusen, um die Stämme funktionell zu analysieren und zu verbessern. Dies ist besonders vorteilhaft, weil sich eine Verstärkung und Manipulierung von Plasmiden in Escherichia coli rascher und einfacher durchführen läßt als in Streptomyces. So können die vorliegenden Vektoren beispielsweise in übli-The vectors of the invention contain origins of replication that are functional in Escherichia coli and Streptomyces and thus make the selection of hosts flexible. Therefore, cloned DNA sequences can be introduced into Escherichia coli to thereby construct, physically analyze, and provide restriction sites for new plasmids, and they can then be returned to Streptomyces to functionally analyze and improve the strains. This is particularly advantageous because amplification and manipulation of plasmids in Escherichia coli is faster and easier than in Streptomyces. For example, the present vectors can be used in conventional

eher Weise in Escherichia coli K12 verstärkt werden, indem man sie mit Spectinomycin oder Chloramphenicol wachsen läßt- Dies ist in dem Wirtssystem aus Streptomyces nicht möglich. Da alle Plasmidvektoren Resistenzpräger enthalten, die in Escherichia coli K12 ausgedrückt werden, lassen sich ferner auch Rekombinanten leicht selektieren. Man kann daher große Mengen an Plasmid-DNA einfach und in kürzerer Zeit isolieren als bei Anwendung ähnlicher Verfahren in Streptomyces. Nach Abschluß derIt is more likely to be enhanced in Escherichia coli K12 by growing them with spectinomycin or chloramphenicol. This is not possible in the Streptomyces host system. Furthermore, since all plasmid vectors contain resistance markers expressed in Escherichia coli K12, recombinants can also be readily selected. It is therefore possible to isolate large quantities of plasmid DNA simply and in a shorter time than when using similar methods in Streptomyces. After completion of the

TO gewünschten rekombinierenden DNA-Verfahren im Wirtssystem in Escherichia coli kann man die jeweilige Streptomyces-DNA daher entfernen, wieder zur Plasmidform (falls erforderlich) umkonstruieren und dann in eine Wirtszelle von Streptomyces transformieren. Die vorliegenden Vektoren sind in Streptomyces vollständig selektierbar, so daß sich die rekombinierenden Klone sauber und rasch identifizieren lassen.For desired recombinant DNA methods in the host system in Escherichia coli, the respective Streptomyces DNA can therefore be removed, reconstructed again to the plasmid form (if required) and then transformed into a host cell of Streptomyces. The present vectors are fully selectable in Streptomyces so that the recombinant clones can be identified cleanly and rapidly.

Die erfindungsgemäßen rekombinierenden DNA-Klonierungsvektoren und Transformanten verfügen über eine breite Brauchbarkeit und tragen zur Auffüllung des Bedarfs an geeigneten Klonierungsträgern bei, die in Streptomyces und Escherichia coli verwendet werden können. Die Fähigkeit der vorliegenden Vektoren, einen Pustelphenotyp oder eine Resistenz gegenüber Antibiotika zu verleihen, sorgt ferner für ein funktionelles Werkzeug zur Selektierung von Transformanten. Dies ist wichtig, weil in der Praxis die Notwendigkeit zur Bestimmung und Selektierung der besonderen Zellen besteht, die Vektor-The recombinant DNA cloning vectors and transformants of the present invention have broad utility and contribute to filling the need for suitable cloning vehicles that can be used in Streptomyces and Escherichia coli. The ability of the present vectors to confer a pustular phenotype or resistance to antibiotics also provides a functional tool for selecting transformants. This is important because in practice there is a need to identify and select the particular cells that

DNA aufgenommen haben. Zusätzliche DNA-Segmente, für deren Gegenwart es keine funktionellen Tests gibt,· können in die vorliegenden Vektoren ebenfalls inseriert werden, wobei sich dann durch Selektion mit einem geeigneten Antibiotikum oder einem anderen Phenotyp TransformantenHave recorded DNA. Additional DNA segments, for the presence of which there are no functional tests, can also be inserted into the present vectors, transformants then being selected by selection with a suitable antibiotic or other phenotype

isolieren lassen, die die nichtselektierbare DNA enthalten. Solche nichtselektierbare DNA-Segmente können an jeder Stelle mit Ausnahme der Bereiche inseriert werden,isolate those containing the nonselective DNA. Such non-selectable DNA segments can be inserted at any site except the regions,

die für die Funktion und Replikation des Plasmids erforderlich sind, und hierzu gehören Gene, bei denen es sich um Antibiotikamodifikationsenzyme und Regulationsgene jeglicher Art handelt.which are required for the function and replication of the plasmid and include genes that are antibiotic modification enzymes and regulatory genes of any kind.

Ein nichtselektxerbares DNA-Segment, das ein Gen enthält, kann vor allem in ein Plasmid, wie beispielsweise das Plasmid pJLi92, an der inneren BamHI-Restriktionsstelle des eine Resistenz verleihenden etwa 7,7 kb EcoRI-Hindlll-Fragments inseriert werden. Eine solche Insertion führt zu einer Inaktivierung des Gens für die Neomycinresistenz und ermöglicht so eine leichte Identifizierung von Streptomyces-Transformanten, die das rekombinierende Plasmid enthalten. Hierzu führt man zuerst eine Selektion bezüglich der M-Pustelmorphologie durch und identifiziert dann diejenigen M-Transformanten, die gegenüber Neomycin nicht resistent sind. In ähnlicher Weise führt eine Insertion eines DNA-Segments in das Plasmid pJL180 an beispielsweise der einmaligen Pstl-Restriktionsstelle zu einer Inaktivierung des Gens für die Ampicillinresistenz. Transformanten von Escherichia coli, die dieses rekombinierende Plasmid enthalten, lassen sich daher ebenfalls leicht identifizieren, indem man zuerst eine Selektion bezüglich einer Chloramphenicolresistenz durchführt und dann diejenigen chloramphenicolresistenten Transformanten identifiziert, die gegenüber Ampicillin nicht resistent sind. Die Selektierbarkeit bezüglich einer Antibiotikumresistenz oder sonstiger phenotypischer Präger in Streptomyces und EscherichiaIn particular, a non-selectable DNA segment containing a gene may be inserted into a plasmid, such as plasmid pJLi92, at the internal BamHI restriction site of the resistance conferring about 7.7 kb EcoRI-HindIII fragment. Such insertion results in inactivation of the gene for neomycin resistance, allowing easy identification of Streptomyces transformants containing the recombinant plasmid. To do this, one first makes a selection for M pustule morphology and then identifies those M transformants that are not resistant to neomycin. Similarly, insertion of a DNA segment into plasmid pJL180 at, for example, the unique PstI restriction site results in inactivation of the gene for ampicillin resistance. Thus, transformants of Escherichia coli containing this recombinant plasmid are also readily identifiable by first selecting for chloramphenicol resistance and then identifying those chloramphenicol resistant transformants which are not resistant to ampicillin. The selectivity for antibiotic resistance or other phenotypic markers in Streptomyces and Escherichia

™ coli erlaubt daher eine saubere und wirkungsvolle Isolierung der äußerst seltenen Zellen, die die jeweils interessierende nichtselektierbare DNA enthalten.Therefore, coli allows a clean and efficient isolation of the extremely rare cells containing the non-selectable DNA of interest.

Der oben beschriebene funktionelle Test bezüglich einer Antibiotikumresistenz kann auch zur Identifizierung von DNA-Segmenten verwendet werden, die als Steuerungselemente wirken und eine Expression eines individuellen GensThe antibiotic resistance functional test described above may also be used to identify DNA segments that act as control elements and expression of an individual gene

für eine Antibiotikumresistenz lenken. Solche Segmente, zu denen unter anderem Promotoren, Abschwächer, Repressoren, Induktoren, ribosomale Bindestellen und dergleichen gehören, können zur Steuerung der Expression anderer Gene in Zellen von Streptomyces und Escherichia coli verwendet werden.for antibiotic resistance. Such segments, which include, but are not limited to, promoters, attenuators, repressors, inducers, ribosomal binding sites, and the like, may be used to direct the expression of other genes in cells of Streptomyces and Escherichia coli.

Die erfindungsgemäßen, eine Antibiotikumresistenz verleihenden Vektoren eignen sich auch zur Sicherstellung, daß verknüpfte DNA-Segmente in Wirtszellen über eine Reihe von Generationen stabil gehalten werden. Diese Gene oder DNA-Fragmente, die kovalent an ein eine Antibiotikumresistenz übertragendes Fragment gebunden sind und in Streptomyces oder Escherichia coli propagiert werden, werden aufrechterhalten, indem man die Transformanten solchen Konzentrationen an Antibiotikum aussetzt, die für die nichttransformierten Zellen toxisch sind. Transformanten, die den Vektor und infolgedessen jegliche kovalent gebundene DNA verlieren, können daher nicht wachsen und werden aus der Kultur eliminiert. Die erfindungsgemäßen Vektoren lassen sich daher zur Aufrechterhaltung irgendeiner interessierenden DNA-Sequenz verwenden.The antibiotic resistance conferring vectors of the present invention are also useful in assuring that linked DNA segments are stably maintained in host cells over a number of generations. These genes or DNA fragments covalently linked to an antibiotic resistance-conferring fragment and propagated in Streptomyces or Escherichia coli are maintained by exposing the transformants to those concentrations of antibiotic that are toxic to the untransformed cells. Therefore, transformants that lose the vector and, as a result, any covalently bound DNA can not grow and are eliminated from the culture. The vectors of the invention can therefore be used to maintain any DNA sequence of interest.

Die erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren und Transforraanten sorgen für die Klonierung von Genen unter Verbesserung der Ausbeuten an verschiedenen Produkten, die derzeit in Streptomyces und damit verwandten Zellen gebildet werden. Zu Beispielen für solche Produkte gehören unter anderem Streptomycin, Tylosin, Cephalosporine, Actaplanin, Narasin, Monensin,. Apramycin, Tobramycin, Erythromycin und dergleichen.- Die Erfindung sorgt weiter für selektierbare Vektoren, die geeignet sind für eine Klonierung, Charakterisierung und Rekonstruktion von DNA-Sequenzen, welche für kommerziell wichtige Proteine ko-^OJ dieren, wie beispielsweise für Humaninsulin, Humanproinsulin, Humanwachstumshormon, Rinderwachstumshormon, GIucagon, Interferon und dergleichen, für enzymatischeThe cloning vectors and transformants of the invention provide for the cloning of genes to improve the yields of various products currently formed in Streptomyces and related cells. Examples of such products include, but are not limited to, streptomycin, tylosin, cephalosporins, actaplanin, narasin, monensin. Apramycin, Tobramycin, Erythromycin and dergleichen.- The invention also provides selectable vectors that are useful for cloning, characterizing and reconstructing DNA sequences which code for commercially important proteins co- ^OJ decode, such as for human insulin, human proinsulin, human growth hormone Bovine growth hormone, glucagon, interferon and the like, for enzymatic

Funktionen in metabolischen Reaktionen, die zu technisch wichtigen Verfahren und Verbindungen führen, oder für Steuerelemente zur Verbesserung einer Genexpression. Zu diesen gewünschten DNA-Sequenzen gehört unter anderem DNA, die für Enzyme, welche eine Synthese von Antibiotikaderivaten katalysiert, wie beispielsweise Streptomycin-, Cephalosporin-, Tylosin-, Actaplanin-, Narasin-, Monensin-, Apramycin-j Tobramycin- und Erythromycinderivaten, oder für Enzyme kodiert, die eine Bioproduktion von Antibiotika oder sonstigen Produkten vermittelt oder verbessert.Functions in metabolic reactions leading to technically important procedures and compounds, or for controls to improve gene expression. Among these desired DNA sequences are DNA encoding enzymes which catalyze synthesis of antibiotic derivatives, such as streptomycin, cephalosporin, tylosin, actaplanin, narasin, monensin, apramycin, tobramycin and erythromycin derivatives, or encoding enzymes that mediate or enhance bioproduction of antibiotics or other products.

Die Fähigkeit zur Insertion, Stabilisierung und Einschleusung der oben erwähnten DNA-Segmente in Streptomyces und Escherichia coli ermöglicht eine leichte rekombinierende genetische Manipulation unter Erhöhung der Ausbeute und Verfügbarkeit von Antibiotika, die durch Streptomyces erzeugt werden. Der Replikationsstartpunkt der Plasmide SCP2 oder SCP2* kodiert auch für eine niedrige Kopienzahl, so daß zusätzlich nahezu jede DNA-Seguenz unter Einschluß der Sequenzen, die letal sind, wenn sie aus einem eine hohe Kopienzahl ergebenden Plasmid ausgedrückt werden, ohne weiteres in die vorliegenden Vektoren kloniert und zwischen Streptomyces und EscherichiaThe ability to insert, stabilize, and introduce the above-mentioned DNA segments into Streptomyces and Escherichia coli allows easy recombinant genetic manipulation to increase the yield and availability of antibiotics produced by Streptomyces. The replication origin of the plasmids SCP2 or SCP2 * also encodes a low copy number, so that in addition almost any DNA sequence, including the sequences which are lethal when expressed from a high copy number-yielding plasmid, readily into the present vectors cloned and between Streptomyces and Escherichia

coil hin- und hergeschleust werden kann. 25coil can be moved back and forth. 25

Streptomyces coelicolor A3(2) und Streptomyces coelicolor M110 lassen sich jeweils als Quellen für die Plasmide SCP2 und SCP2* in einer Reihe von Wegen unter Verwendung irgendeines von mehreren verschiedenen Medien züchten.Streptomyces coelicolor A3 (2) and Streptomyces coelicolor M110, respectively, can be grown as sources of plasmids SCP2 and SCP2 * in a variety of ways using any of several different media.

zu Kohlenhydratquellen, die in einem Kulturmedium bevorzugt sind, gehören beispielsweise Melasse, Glucose, Dextrin und Glycerin, während zu Stickstoffquellen beispielsweise Sojamehl, Aminosäuregemische und Peptone gehören. Anorganische Nährsalze werden ebenfalls zugeführt, und hierzu gehören die üblichen Salze, die für Ionen von Natrium, Kalium, Ammoniak, Calcium, Phosphat, Chlorid, Sulfat und ähnlichem sorgen. Genau wie dies für dasCarbohydrate sources preferred in a culture medium include, for example, molasses, glucose, dextrin and glycerol, while sources of nitrogen include, for example, soybean meal, amino acid mixtures and peptones. Inorganic nutrient salts are also supplied, and these include the usual salts which provide ions of sodium, potassium, ammonia, calcium, phosphate, chloride, sulfate and the like. Just like that for the

Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen notwendig ist, werden auch im vorliegenden Fall essentielle Spurenelemente zugesetzt. Solche Spurenelemente werden gewöhnlich in Form von Verunreinigungen zugeführt, die in den zugesetzten anderen Bestandteilen des Mediums zufällig vorhanden sind.Growth and the development of other microorganisms is necessary, essential trace elements are also added in the present case. Such trace elements are usually supplied in the form of impurities which are incidentally present in the added other constituents of the medium.

Streptomyces coelicolor M110 oder Streptomyces coelicolor • A3(2) wächst unter aeroben Züchtungsbedingungen über einem verhältnismäßig breiten pH-^Bereich von etwa 5 bis 9 bei Temperaturen, die von etwa 15 bis 40⁰C reichen. Zur Bildung der Plasmide SCP2 und SCP2* in höchster Kopienzahl geht man jedoch zweckmäßigerweise von einem Kulturmedium mit einem pH-Wert von etwa 7,2 aus und hält die Züchtungstemperatur bei etwa 30⁰C. Durch Züchtung von Streptomyces coelicolor M110 und Streptomyces coelicolor A3(2) unter den oben erwähnten Bedingungen gelangt man zu einem Zellvorrat, aus welchem sich die Plasmide SCP2 und SCP2* ohne weiteres unter Anwendung herkömmlicher Techniken isolieren lassen.Streptomyces coelicolor M110 or Streptomyces coelicolor • A3 (2) grows under aerobic culture conditions over a relatively broad pH range of about 5 to 9 at temperatures ranging from about 15 to 40 ^° C. However, the formation of plasmids SCP2 and SCP2 * in the highest copy number is expediently started from a culture medium having a pH of about 7.2 and keeps the cultivation temperature at about 30 ^° C. By cultivating Streptomyces coelicolor M110 and Streptomyces coelicolor A3 (cf. 2) Under the conditions mentioned above, a cell stock is obtained from which the plasmids SCP2 and SCP2 * can readily be isolated using conventional techniques.

Ausführungsbeispiele;Embodiments;

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert. Erforderlichenfalls werden darin sowohl Erläuterungen als auch tatsächliche Verfahren zum Aufbau der Erfindung beschrieben.The invention will be further explained below with reference to examples. If necessary, both explanations and actual methods of constructing the invention will be described therein.

Beispiel 1 30 Example 1 30

Isolierung des Plasmids SCP2*Isolation of the plasmid SCP2 *

ι. A. Züchtung von Streptomyces coelicolor M110ι. A. Breeding of Streptomyces coelicolor M110

Man stellt in herkömmlicher Weise ein vegetatives Inokulum von Streptomyces coelicolor M110 (NRRL 15041) her, indem man den Stamm unter submersen aeroben Bedingungen in 50 ml sterilisierten Trypticase-Sojabrühe* bei einerIn a conventional manner, a vegetative inoculum of Streptomyces coelicolor M110 (NRRL 15041) is prepared by incubating the strain under 50 ml sterilized trypticase soy broth under submerged aerobic conditions

Konzentration von 35 g/l in deionisiertem Wasser wachsen läßt.Concentration of 35 g / l grow in deionized water.

Das Inokulum aus der Trypticase-Sojabrühe wird 48 Stunden bei einer Temperatur von 30⁰C inkubiert. Die 50 ml Kultur wird dann homogenisiert, in 450 ml sterilisiertes YEMESG**- Medium übertragen und dann wenigstens 40 Stunden/ jedoch nicht mehr als 65 Stunden, bei 30⁰C inkubiert. Der pH-Wert wird nicht eingestellt. Nach Inkubation sind die Zellen von Streptomyces coelicolor M110 fertig zur Ernte und nachfolgenden Isolierung der Plasmid-DNA.The inoculum from the Trypticase soy broth is incubated for 48 hours at a temperature of 30 ⁰ C. The 50 ml culture is then homogenized in 450 ml of sterilized YEMESG ** - transfer medium, and then incubated however, at least 40 Hours / not more than 65 hours, at 30 ⁰ C. The pH is not adjusted. After incubation, the cells of Streptomyces coelicolor M110 are ready for harvest and subsequent isolation of the plasmid DNA.

* Die Trypticase-Sojabrühe ist erhältlich von Difco* The trypticase soy broth is available from Difco

Laboratories, Detroit, Michigan, V.St.A. 15Laboratories, Detroit, Michigan, V.St.A. 15

** Das YEMESG enthält 0,3 % Hefeextrakt, 0,5 % Pepton, 0,3 % Malzextrakt, 1 % Dextrose, 34 % Saccharose, 0,1 % MgCl, und 0,1 % Glycin.** The YEMESG contains 0.3% yeast extract, 0.5% peptone, 0.3% malt extract, 1% dextrose, 34% sucrose, 0.1% MgCl, and 0.1% glycine.

20 B. Isolierung des Plasmids20 B. Isolation of the plasmid

Etwa 10 g (Naßgewicht) an Zellen von Streptomyces coelicolor M110 werden durch Zentrifugieren (10 Minuten, 4⁰C, 10 000 UpM) geerntet und dann mit etwa 10 ml/g feuchter Zellen an TES-Puffer (0,01 Mol Tris(hydroxymethyl)aminoethan /Tris/, 0,001 Mol EDTA, 25 % Saccharose, pH 8) versetzt. Die Zellen werden zu einer Suspension verwirbelt, worauf man 10 ml/g Naßgewicht der Zellen an 0,25m EDTA vom pH 8 und dann 5 ml/g Naßgewicht der Zellen an Lyso-About 10 g (wet weight) of cells of Streptomyces coelicolor M110 are (by centrifugation (10 min, 4 ⁰ C, 10,000 rpm), harvested and then mixed with about 10 ml / g of wet cells of TES buffer (0.01 M Tris hydroxymethyl ) aminoethane / Tris /, 0.001 mol EDTA, 25% sucrose, pH 8). The cells are vortexed to give 10 ml / g wet weight of the cells to 0.25m EDTA of pH 8 and then 5 ml / g wet weight of cells to lysosomal cells.

™ zym (10 mg/ml in TES) zugibt. Nach Inkubieren des Gemisches bei 37⁰C über etwa 15 Minuten gibt man etwa 1,5 ml/g Naßgewicht der Zellen an 20 %-igem SDS zu (Natriumlaurylsulfat von BDH Chemicals Ltd. Poole, England). Man läßt das erhaltene Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur ste-™ zym (10 mg / ml in TES). After incubating the mixture at 37 ⁰ C for about 15 minutes, add about 1.5 ml / g wet weight of the cells of 20% SDS to (sodium lauryl sulfate by BDH Chemicals Ltd. Poole, England). The resulting mixture is allowed to stand at room temperature for 30 minutes.

hen und versetzt es dann mit 5m NaCl bis zu einer Endkonzentration von 1 Mol NaCl. Nach erneutem Stehenlassen bei Raumtemperatur (15 Minuten) gibt man das Gemisch 2 Stunden auf Eis. Das Lysat wird abzentrifugiert (20 Minu-Then it is mixed with 5m NaCl to a final concentration of 1 mol NaCl. After standing again at room temperature (15 minutes), the mixture is placed on ice for 2 hours. The lysate is centrifuged off (20 minutes).

. ten, 4⁰C, 17 500 UpM) und die überstehende Flüssigkeit zusammengefaßt und mit 0,64 Volumina Isopropylalkohol vermischt. Der DNA-Niederschlag wird durch Zentrifugieren (15 Minuten, 4°C, 10 000 UpM) gesammelt. Der Niederschlag wird an der Luft getrocknet und dann in 1 ml TE-Puffer (0,01 Mol Tris, 0,001 Mol EDTA) pro g Naßzellen resuspendiert. Zur Reinigung wird die Plasmid-DNA hierauf unter Anwendung von Cäsiumchloridgradienten mit Propidiumiodid zentrifugiert (20 Stunden, 20⁰C, 50 000 UpM). Nach der Zentrifugation wird die Bande der gewünschten Plasmid-SCP2*-DNA entfernt und das Propidiumiodid in herkömmlicher Weise extrahiert. Die CsCl-DNA-Lösung wird bei -20⁰C aufbewahrt. Vor Verwendung wird die DNA entweder durch PD10-Säulenaustausch (Bio Rad) mit TE oder durch Dialyse gegen TE entsalzt. Die DNA wird durch herkömmliche Verfahren mit Ethanol ausgefällt und wieder in TE gelöst., , 4 ⁰ C, 17 500 rpm) and the supernatant liquid are combined and mixed with 0.64 volumes of isopropyl alcohol. The DNA precipitate is collected by centrifugation (15 minutes, 4 ° C, 10,000 rpm). The precipitate is dried in air and then resuspended in 1 ml of TE buffer (0.01 mol Tris, 0.001 mol EDTA) per g of wet cells. For purification, the plasmid DNA is then centrifuged using cesium chloride gradient with propidium iodide (20 hours, 20 ^° C., 50,000 rpm). After centrifugation, the band of the desired plasmid SCP2 * DNA is removed and the propidium iodide is extracted in a conventional manner. The CsCl-DNA solution is stored at -20 ^0C. Before use, the DNA is desalted either by PD10 (Bio Rad) column exchange with TE or by dialysis against TE. The DNA is precipitated by conventional methods with ethanol and redissolved in TE.

Beispiel 2Example 2 Konstruktion des Plasmids pLR1Construction of the plasmid pLR1

A. Hindlll-Verdauung des Plasmids pIJ2A. HindIII digestion of plasmid pIJ2

Man inkubiert etwa 20 μΐ (20 μg) Plasmid-pIJ2-DNA (Nature 286,525 (1980)), 5 μΐ BSA (Rinderserumalbumin, 1 mg/ml), 19 μΐ Wasser, 1 μΐ Hindlll-Restriktionsenzym* (das 3 New England Bio Labs-Einheiten enthält) und 5 μΐ Reaktionsmischung** 2 Stunden bei 37⁰C. Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4m Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol abgebrochen. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igera Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet, in 20 μΐ TE-Puffer suspendiert und zur Aufbewahrung auf -20⁰C eingefroren.Incubate approximately 20 μΐ (20 μg) of plasmid pIJ2 DNA (Nature 286,525 (1980)), 5 μΐ BSA (bovine serum albumin, 1 mg / ml), 19 μΐ water, 1 μΐ HindIII restriction enzyme * (the 3 New England Bio Labs units) and 5 μΐ reaction mixture ** for 2 hours at 37 ⁰ C. The reaction is stopped by adding about 50 μΐ 4m ammonium acetate and 200 μΐ 95% ethanol. The resulting DNA precipitate is washed twice in 70% -igera ethanol, dried under vacuum, suspended in 20 μΐ TE buffer and frozen for storage at -20 ⁰ C.

* Die Restriktionsenzyme und anderen Enzyme sind von folgenden Firmen erhältlich:* The restriction enzymes and other enzymes are available from the following companies:

1 New England Bio Labs., Inc. 32 Tozer Road Beverly, Massachusetts 01915, V.St.A.1 New England Bio Labs., Inc. 32 Tozer Road Beverly, Massachusetts 01915, V.St.A.

Boehringer-Mannheim BiochemicalsBoehringer-Mannheim Biochemicals

7941 Castleway Drive7941 Castleway Drive

Indianapolis, Indiana 46250, V.St.A.Indianapolis, Indiana 46250, V.St.A.

Bethesda Research Laboratories (BRL)Bethesda Research Laboratories (BRL)

Box 6010Box 6010

Rockville, Maryland 20850, V.St.A.Rockville, Maryland 20850, V.St.A.

Research ProductsResearch Products

Miles Laboratories, Inc.Miles Laboratories, Inc.

Elkhart, Indiana 465.15, V.St.A.Elkhart, Indiana 465.15, V.St.A.

** Die Reaktionsmischung für das Hindlll-Restriktionsenzym wird unter Verwendung folgender Zusammensetzung hergestellt:** Reaction mixture for HindIII restriction enzyme is prepared using the following composition:

15 600 mMol NaCl15 600 mmol NaCl

100 mMol Tris-HCl, pH 7,9100 mM Tris-HCl, pH 7.9

70 mMol MgCl₂ 70 mmol MgCl ₂

10 mMol Dithiothreit10 mmol dithiothreitol

20 B. Hindlll-Verdauung des Plasmids pBR32220 B. HindIII digestion of plasmid pBR322

Man inkubiert etwa 8 μΐ (4 μg) Plasmid-pBR322-DNA, 5 μΐ Reaktionsmischung, 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 31 μΐ Wasser und 1 μΐ Hindlll-Restriktionsenzym 2 Stunden bei 37°C. Nach Abbrechen der Reaktion durch 10 Minuten langes Inkubieren bei 60⁰C gibt man etwa 50 μΐ Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-iges Ethanol zu. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 45 μΐ Wasser suspendiert.Incubate about 8 μΐ (4 μg) of plasmid pBR322 DNA, 5 μΐ reaction mixture, 5 μΐ BSA (1 mg / ml), 31 μΐ water and 1 μΐ HindIII restriction enzyme for 2 hours at 37 ° C. After stopping the reaction by incubating for 10 minutes at 60 ⁰ C., to about 50 μΐ ammonium acetate and 200 μΐ 95% ethanol. The resulting DNA precipitate is washed twice in 70% ethanol, dried under vacuum and suspended in 45 μΐ water.

30 '..·'30 '.. ·'

C. . Verbindung der mit Hindlll verdauten Plasmide pIJ2 und pBR322C.. Compound HindIII-digested plasmids pIJ2 and pBR322

Man inkubiert etwa 20 μΐ mit Hindlll behandeltes Plasmid pIJ2 (von Beispiel 2A), 20 μΐ mit Hindlll behandeltes Plasmid pBR322 (von Beispiel 2B) , 5 μΐ BSA (.1 mg/ml) , 1 μΐ T4-DNA-Ligase* und 5 μΐ Verknüpfungsmischung**Incubate approximately 20 μΐ HindIII-treated plasmid pIJ2 (from Example 2A), 20 μΐ HindIII-treated plasmid pBR322 (from Example 2B), 5 μΐ BSA (.1 mg / ml), 1 μΐ T4 DNA ligase * and 5 μΐ linkage mixture **

4 Stunden bei 16⁰C. Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4m Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol abgebrochen. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in TE-Puffer suspendiert. Die suspendierte DNA stellt das gewünschte Plasmid pLR1 dar.4 hours at 16 ⁰ C. The reaction is stopped by adding about 50 μΐ 4m ammonium acetate and 200 μΐ 95% ethanol. The resulting DNA precipitate is washed twice in 70% ethanol, dried under vacuum and suspended in TE buffer. The suspended DNA represents the desired plasmid pLR1.

* Die T4-DNA-Ligase ist von folgender Firma erhältlich:* T4 DNA ligase is available from the following company:

New England Bio Labs., Inc.New England Bio Labs., Inc.

32 Tozer Rd.32 Tozer Rd.

Beverly, Massachusetts 01915, V.St.A.Beverly, Massachusetts 01915, V.St.A.

** Die Verknüpfungsmischung wird unter Verwendung fol- ** gender Zusammensetzung hergestellt:** The linking mixture is prepared using the following composition:

500 mMol Tris-HCl, pH 7,8 200 mMoi Dithiothreit 100 mMol MgCl₂ 20 10 mMol ATP500 mM Tris-HCl, pH 7.8 200 mMoi dithiothreitol 100 mM MgCl ₂ 20 10 mM ATP

Beispiel 3Example 3 Konstruktion von Escherichia coli K12 HB101/pLR1Construction of Escherichia coli K12 HB101 / pLR1

Etwa 10 ml gefrorene leistungsfähige Zellen von Escherichia coli K12 HB101 (Gene 2, 75 bis 93 (1977)) werden durch Zentrifugation pelletisiert und dann^ in etwa 10 ml 0,01m Natriumchlorid suspendiert. Hierauf werden die ZellenAbout 10 ml of frozen high-potency cells of Escherichia coli K12 HB101 (Gene 2, 75-93 (1977)) are pelleted by centrifugation and then suspended in about 10 ml of 0.01M sodium chloride. Then the cells become

erneut pelletisiert, in etwa 10 ml 0,03m Calciumchlorid resuspendiert, 20 Minuten auf Eis inkubiert, ein drittes Mal pelletisiert und schließlich abermals in 1,25 ml 0,03m Calciumchlorid suspendiert. Die erhaltene Zellsuspension ist für eine anschließende Transformationpelleted again, resuspended in about 10 ml of 0.03m calcium chloride, incubated on ice for 20 minutes, pelleted a third time and finally resuspended in 1.25 ml of 0.03m calcium chloride. The resulting cell suspension is for a subsequent transformation

35 leistungsfähig. 35 powerful.

Das Plasmid pLR1 in TE-Puffer (hergestellt gemäß Beispiel 2C) wird in Ethanol gefällt, in 150 μΐ 30-milli-The plasmid pLR1 in TE buffer (prepared according to Example 2C) is precipitated in ethanol, in 150 μΐ 30-milli

molarer CaIc iuinchlor idlösung suspendiert und in einem Teströhrchen mit etwa 200 μΐ leistungsfähigen Zellen von Escherichia coli K12 HB101 leicht vermischt. Das erhaltene Gemisch wird etwa 45 Minuten auf Eis und dann etwa 1 Minute bei 42⁰C inkubiert. Hierauf gibt man etwa 3 ml L-Brühe (J. Bacteriology 62, 293 (1951)) zu, die 50 ^g/ml Ampicillin enthält. Das Gemisch wird unter Schütteln 1 Stunde bei 37°C inkubiert und dann auf L-Agar (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York) aufgezogen, der Ampicillin enthält. Die überlebenden Kolonien werden selektiert und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp ,molar CaIc iuinchlor idlösung suspended and mixed in a test tube with about 200 μΐ efficient cells of Escherichia coli K12 HB101 slightly. The resulting mixture is incubated on ice for about 45 minutes and then at 42 ^° C. for about 1 minute. Then, about 3 ml of L broth (J. Bacteriology 62, 293 (1951)) containing 50 μg / ml ampicillin is added. The mixture is incubated with shaking for 1 hour at 37 ° C and then grown on L-agar (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York) containing ampicillin. The surviving colonies are selected and compared to the expected phenotype (Amp,

ο Tet ) untersucht. Sie stellen die gewünschten Escherichiaο Tet). They represent the desired Escherichia

coli K12 HB101/pLRi-Transformanten dar. 15coli K12 HB101 / pLRi transformants. 15

Beispiel 4Example 4

Konstruktion des Plasmids pLR4 20 A. Teil-BamHI-Verdauung des Plasmids pLR1 Construction of plasmid pLR4 20 A. Partial BamHI digestion of plasmid pLR1

Man inkubiert etwa 10 μΐ (10 ng) des Plasmids pLR1, 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 29 μΐ Wasser, 1 μΐ BamHI-Restriktionsenzym (mit Wasser auf 1:4 verdünnt) und 5 μΐ Reaktionsmischung*15 Minuten bei 37°C. Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4m Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 20 μΐ Wasser suspendiert.Incubate about 10 μΐ (10 ng) of the plasmid pLR1, 5 μΐ BSA (1 mg / ml), 29 μΐ water, 1 μΐ BamHI restriction enzyme (diluted to 1: 4 with water) and 5 μΐ reaction mixture * for 15 minutes at 37 ° C. The reaction is terminated by addition of about 50 μM 4m ammonium acetate and 200 μM 95% ethanol. The resulting DNA precipitate is washed twice in 70% ethanol, dried under vacuum and suspended in 20 μΐ water.

* Die Reaktionsmischung für das BamHI-Restriktionsenzym wird unter Verwendung folgender Zusammensetzung hergestellt:The reaction mixture for the BamHI restriction enzyme is prepared using the following composition:

35 1,5 Mol NaCl35 1.5 mol NaCl

60 mMol Tris-HCl, pH 7,9 60 mMol MgCl₂ 60 mM Tris-HCl, pH 7.9 60 mM MgCl ₂

-30-1 B. BamHI-Verdauung des Plasmids pBR322B. BamHI digestion of plasmid pBR322

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 2B beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man BamHI-Restriktionsenzym und Reaktionsmischung anstelle von Hindlll-Restriktionsenzym und Reaktionsmischung verwendet. Das verdaute Plasmid pBR322 wird in 29 μΐ Wasser suspendiert.The desired digestion is carried out in a manner similar to that described in Example 2B, except that BamHI restriction enzyme and reaction mixture are used instead of HindIII restriction enzyme and reaction mixture. The digested plasmid pBR322 is suspended in 29 μΐ of water.

10 C. Verknüpfung von mit BamHI teilverdautem Plasmid pLR1 und mit BamHI verdautem Plasmid pBR32210 C. Linkage of BamHI partially digested plasmid pLR1 and BamHI digested plasmid pBR322

Die gewünschte Verknüpfung wird praktisch wie in Beispiel 2C beschrieben durchgeführt. Die erhaltene verknüpfte DNA wird in TE-Puffer suspendiert und stellt das gewünschte Plasmid pLR4 dar.The desired linkage is carried out in practice as described in Example 2C. The resulting linked DNA is suspended in TE buffer and is the desired plasmid pLR4.

'.,-/;;:, Beispiel 5 >. ^v* 20 Konstruktion von Escherichia coli K12 HB101/pLR4 '., - / ;;:, Example 5 >. ^ v * 20 Construction of Escherichia coli K12 HB101 / pLR4

Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man anstelle des Plasmids pLRi für die Transformation das Plasmid pLR4 verwendet. Die überlebenden Kolonien werden selektiert und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht. Sie stellen die gewünschten Escherichia coli K12 HB101/pLR4-Transformanten dar.The desired construction is carried out in practice as described in Example 3, with the exception that the plasmid pLR4 is used instead of the plasmid pLRi for the transformation. The surviving colonies are selected and examined for the expected phenotype (Amp, Tet). They represent the desired Escherichia coli K12 HB101 / pLR4 transformants.

30 Beispiel 6 30 Example 6

Konstruktion der Plasmide pJL120 und ρJLI21Construction of plasmids pJL120 and ρJLI21

A. EcoRI-Verdauung des Plasmids SCP2* 35A. EcoRI digestion of the plasmid SCP2 * 35

Man inkubiert etwa 150 μΐ (5,7 μg) Plasmid-SCP2*-DNA, 1 ml Wasser, 2 μΐ EcoRI-Restriktionsenzym (mit einem Ge-Approximately 150 μΐ (5.7 μg) of plasmid SCP2 * DNA, 1 ml of water, 2 μΐ of EcoRI restriction enzyme (with a

halt von 20 BRL-Einheiten) und 17 μΐ EcoRI-Reaktionsmischung* 2,5 Stunden bei 37°C. Die Reaktion wird durch 15 Minuten lange Inkubation bei 65⁰C beendet. Das Reaktionsgemisch wird in üblicher Weise durch Agarosegelelektrophorese (AGE) analysiert/ um so den Endpunkt der Restriktion zu ermitteln. Die erhaltene restriktierte DNA wird bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt.containing 20 BRL units) and 17 μΐ EcoRI reaction mixture * at 37 ° C for 2.5 hours. The reaction is terminated by incubation at 65 ^° C. for 15 minutes. The reaction mixture is analyzed in the usual way by agarose gel electrophoresis (AGE) / so as to determine the end point of the restriction. The resulting restricted DNA is stored at 4 ^° C. until later use.

* Die Reaktionsmischung für das EcoRI-Restriktionsenzym wird unter Verwendung folgender Zusammensetzung hergestellt:The reaction mixture for the EcoRI restriction enzyme is prepared using the following composition:

500 mMol NaCl 1000 mMol Tris-HCl, pH 7,5 15 100 mMol MgCl₂ 500 mmol NaCl 1000 mmol Tris-HCl, pH 7.5 15 100 mmol MgCl ₂

B. EcoRI-Verdauung des Plasmids pBR325B. EcoRI digestion of plasmid pBR325

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 6A beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids SCP2* hier jedoch das Plasmid pBR325 verwendet. Die erhaltene DNA wird bis zur späteren Verwendung bei 4⁰C aufbewahrt.The desired digestion is carried out in practice as described in Example 6A, except that the plasmid pBR325 is used instead of the plasmid SCP2 * here. The DNA obtained is stored at 4 ^° C. until later use.

C. Verknüpfung der mit EcoRI verdauten Plasmide SCP2* und pBR325C. Linkage of the EcoRI digested plasmids SCP2 * and pBR325

Man inkubiert etwa 40 μΐ mit EcoRI verdautes Plasmid SCP2* (von Beispiel 6A), 10 ul mit EcoRI verdautes Plas_mid pBR325 (von Beispiel 6B), 10 μΐ MgCl₂ (0,1 Mol), 10 μΐ (NH₄J₂SO₄ (0,1 Mol), 10 μΐ ATP (2 mMol), 0,1 μΐ T4-DNA-Ligase und 20 μΐ Verknüpfungsmischung* 18 Stunden bei 4°C. Die Reaktion wird durch AGE analysiert, wodurch die gewünschte Verknüpfung bestätigt wird. Die suspendierte DNA stellt die gewünschten etwa 35,8 kb Plasmide pJLi20 und pJL121 dar.Is incubated about 40 μΐ with Eco RI digested plasmid SCP2 * (from Example 6A), 10 ul digested with EcoRI Plas _m id pBR325 (from Example 6B), 10 μΐ MgCl ₂ (0.1 mol), 10 μΐ (NH ₄ J ₂ SO ₄ (0.1 mol), 10 μΐ ATP (2 mmol), 0.1 μΐ T4 DNA ligase and 20 μΐ linkage mixture * 18 hours at 4 ° C. The reaction is analyzed by AGE, confirming the desired linkage The suspended DNA represents the desired approximately 35.8 kb plasmids pJLi20 and pJL121.

Es entstehen rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, da das Plasmid pBR325 EcoRI-Fragment nach jeweilsThere are recombinant plasmids with two orientations, since the plasmid pBR325 EcoRI fragment after each

. einer von zwei Richtungen orientiert sein kann. Man bestimmt die Restriktionsstellenpläne der beiden Plasmide pJLi20 und pJLi21 (nach Isolierung gemäß Beispiel 7), und diese gehen aus Figur 2 der Zeichnung hervor., one of two directions can be oriented. Determine the restriction site plans of the two plasmids pJLi20 and pJLi21 (after isolation according to Example 7), and these are shown in Figure 2 of the drawing.

* Die Verknüpfungsmischung wird unter Verwendung* The linking mix is using

folgender Zusammensetzung hergestellt: 10of the following composition: 10

50 mMol Tris-HCl, pH 7,5 10 mMol ß-Mercaptoethanol50 mM Tris-HCl, pH 7.5 10 mM β-mercaptoethanol

1 mMol EDTA 50 mg/ml BSA 151 mmol EDTA 50 mg / ml BSA 15

Beispiel 7Example 7

Konstruktion von Escherichia coli K12 C600R,-M_k-/pJL120 und Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-/pJL121 *~Construction of Escherichia coli K12 C600r, -M _k - / pJL120 and Escherichia coli K12 C600r _k -M _k - / pJL121 * ~

.20; : —— — - :;..20; : - - -:;.

A. Herstellung von gefrorenem leistungsfähigem Escheiichia coli K12 C600R_k-M_k~A. Preparation of Frozen Efficient Escherichia coli K12 C600R _k -M _k ~

Man unterteilt frische Übernachtkulturen von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k- (Proc. Nat. Acad. Sei. 71, 1030 bis 1034 (1974)) mit frischer L-Brühe (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York) in einem Verhältnis von 1:10 in Unterkulturen und läßt diese 1 Stunde bei 37°C wachsen. Es werden insgesamt 660 Klett-Einheiten an Zellen geerntet, mit 2,5 ml 100-millimolarem NaCl gewaschen, in 150-millimolarem CaCl₂ mit 10 % Glycerin suspendiert und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, in 0,5 ml CaCl-- ^OD Glycerin resuspendiert, 3 bis 5 Minuten auf Eis gekühlt und eingefroren. Die Zellsuspensionen werden bis zum Gebrauch in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Konservierung und Aufbewahrung führen zu keiner BeeinträchtigungFresh overnight cultures of Escherichia coli K12 C600R _k -M _k - (Proc. Nat. Acad., 71, 1030-1034 (1974)) are subdivided with fresh L broth (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York) in a 1:10 ratio in subcultures and allowed to grow at 37 ° C for 1 hour. A total of 660 Klett units are harvested on cells, washed with 2.5 ml of 100 mM NaCl, suspended in 150 mM CaCl ₂ with 10% glycerol and incubated for 20 minutes at room temperature. The cells are harvested by centrifugation, resuspended in 0.5 ml CaCl- ^OD glycerol, chilled on ice for 3 to 5 minutes and frozen. The cell suspensions are stored in liquid nitrogen until use. Preservation and storage do not lead to any impairment

der Lebensfähigkeit oder Häufigkeit einer Transformation durch kovalent geschlossene zirkuläre DNA.the viability or frequency of transformation by covalently closed circular DNA.

B. Transformation 5B. Transformation 5

Die leistungsfähigen Zellen werden in einem Eisbad aufgetaut und in einem Verhältnis von 0,1 ml Zellen auf 0,05 ml DNA (10 ill der in Beispiel 6C beschriebenen Probe und 40 μΐ 0,1 XSSC (0,015 Mol NaCl, 0,0015 Mol Natriumzitrat vom pH 7) vermischt. Das Transformationsgemisch wird 20 Minuten auf Eis gekühlt, 1 Minute einem Wärmeschock von 42⁰C unterzogen und 10 Minuten auf Eis gekühlt. Die Proben werden dann mit 0,85 ml L-Brühe verdünnt, 1,5 Stunden bei 37⁰C inkubiert, auf L-Agar, der Ampicillin (50 ug/ml) und Tetracyclin (12,5 ug/ml) enthält, aufgetragen und 18 Stunden bei 37⁰C inkubiert.The powerful cells are thawed in an ice bath (in a ratio of 0.1 ml of cells to 0.05 ml of DNA sample and 10 of 40 described in Example 6C ill μΐ 0.1XSSC (0.015 M NaCl, 0.0015 mole sodium citrate The transformation mixture is cooled on ice for 20 minutes, subjected to a thermal shock of 42 ^° C. for 1 minute and cooled on ice for 10 minutes, the samples are then diluted with 0.85 ml of L broth for 1.5 hours 37 ⁰ C, applied to L-agar containing ampicillin (50 ug / ml) and tetracycline (12.5 ug / ml), and incubated at 37 ⁰ C for 18 hours.

Die erhaltenen Kolonien werden selektiert und bezüglichThe resulting colonies are selected and compared

RRS des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet , Cm ) untersucht.RRS of the expected phenotype (Amp, Tet, Cm) was investigated.

Sie stellen die gewünschten Transformanten von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-/pJL120 und Escherichia coli K12 C600-Rj-Mj-/pJLi21 dar. Die gegenüber Ampicillin und Tetracyclin resistenten Kolonien werden nach bekannten Verfahren isoliert, gezüchtet und dann in üblicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und AGE-Analyse hinsichtlich der *5 Plasmide identifiziert, aus denen sie aufgebaut sind.To set the desired transformants of Escherichia coli K12 C600r _k -M _k -. / PJL120 and E. coli K12 C600-Rj-Mj / pJLi21 represents the to ampicillin and tetracycline resistant colonies are isolated according to known procedures, cultured, and then in a conventional manner by restriction enzyme analysis and AGE analysis for the * 5 plasmids from which they are constructed.

Die identifizierten Transformanten verwendet man dann zur anschließenden Produktion und Isolierung der PlasmideThe identified transformants are then used for subsequent production and isolation of the plasmids

pJL120 und pJLi2i unter Anwendung bekannter Verfahren. 30pJL120 and pJLi2i using known methods. 30

Beispiel 8Example 8 Konstruktion der Plasmide pJLi80 und pJL181Construction of plasmids pJLi80 and pJL181

A. Sall-Verdauung des Plasmids SCP2* und Isolierung des etwa 6,0 kb Säll-FragmentsA. Sall Digestion of the SCP2 * plasmid and isolation of the approximately 6.0 kb Säll fragment

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 6The desired digestion becomes practical as in Example 6

beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme der Verwendung von Sall-Restriktionsenzymynd Reaktionsmischung* anstelle von EcoRI-Restriktionsenzym und Reaktionsmischung. Die Reaktion wird durch AGE untersucht, um ihren vollständigen Ablauf zu verifizieren, und durch 15 Minuten langes Erwärmen auf 65⁰C beendet. Die erhaltenen SaIl-Restriktionsfragmente werden durch AGE abgetrennt und die abgetrennten Fragmente dann im Gel durch Anfärben mit Ethidiumbromid und Sichtbarmachen der fluoreszierenden Banden mit einem Ultraviolettlicht lokalisiert. Das Gelfragment, welches das interessierende etwa 6,0 kb-Fragment enthält, wird aus dem Gel ausgeschnitten und in TBE-Puffer (1,6 % Sigma 7 bis 9 Puffer**, 0,093 % Na-EDTA, 0,55 % Borsäure) elektroeluiert. Das Gelfragment im TBE-Puffer wird in einen Dialyseschlauch gegeben und 1 Stunde bei 100 Volt einer Elektrophorese unterzogen. Die wässrige Lösung wird vom Dialyseschlauch gesammelt und durch eine mit DEAE-Cellulose gefüllte Säule*** (0,5 ml Whatman DE52) geführt, die mit einem Äquilibrie-with the exception of the use of Sall restriction enzyme reaction mixture * instead of EcoRI restriction enzyme and reaction mixture. The reaction is assayed by AGE to verify its completion and terminated by heating to 65 ^° C for 15 minutes. The resulting SalI restriction fragments are separated by AGE and the separated fragments then localized in the gel by staining with ethidium bromide and visualizing the fluorescent bands with ultraviolet light. The gel fragment containing the approximately 6.0 kb fragment of interest is excised from the gel and placed in TBE buffer (1.6% Sigma 7 to 9 buffer **, 0.093% Na-EDTA, 0.55% boric acid). electroeluted. The gel fragment in the TBE buffer is placed in a dialysis tube and electrophoresed for 1 hour at 100 volts. The aqueous solution is collected from the dialysis tube and passed through a DEAE-cellulose filled column *** (0.5 ml Whatman DE52), which is equilibrated

20 rungspuffer (0,1 Mol KCl, 10 mMol Tris-HCl, pH 7,8)20% buffer (0.1 mol KCl, 10 mmol Tris-HCl, pH 7.8)

äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit 2,5 ml Äquilibrierungspuffer gewaschen und die DNA (etwa 5 μg) mit 1,5 ml Elutionspuffer (1 Mol NaCl, 10 mMol Tris-HCl, pH 7,8) eluiert. Das Elüat wird.auf eine etwa 0,35m Konzentration an Na⁺-Ionen eingestellt, worauf man die DNA durch Zugabe von 2 Volumina (etwa 9 ml) an 100 %-igem Ethanol und anschließendes 16-stündiges Kühlen auf -20⁰C ausfällt. Der DNA-Niederschlag wird durch Zentrifugation pelletisiert, mit 75 %-igem Ethanol gewaschen, getrocknethas been equilibrated. The column is washed with 2.5 ml of equilibration buffer and the DNA (about 5 μg) eluted with 1.5 ml of elution buffer (1 mol NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.8). The Elüat wird.auf an approximately 0.35m concentration of Na ⁺ ions is set, after which the DNA by addition of 2 volumes (about 9 ml) ethanol and then 16-hour cooling to -20 ⁰ C fails to 100% , The DNA precipitate is pelleted by centrifugation, washed with 75% ethanol, dried

und in TE-Puffer gelöst. Diese herkömmliche Isolierungstechnik wird im folgenden als AGE/DE52/Elektroelution bezeichnet.and dissolved in TE buffer. This conventional isolation technique will hereinafter be referred to as AGE / DE52 / electroelution.

* Die Reaktionsmischung für das Sall-Restriktionsenzym wird unter Verwendung folgender Zusammensetzung hergestellt: -The reaction mixture for the Sall restriction enzyme is prepared using the following composition:

1 1500 mMol NaCl1 1500 mmol NaCl

80 mMol Tris-HCl, pH 7,5 60 mMol MgCl₂ 2 mMol EDTA80 mM Tris-HCl, pH 7.5 60 mM MgCl ₂ 2 mM EDTA

** Der Sigma.7 bis 9 Puffer ist erhältlich von Sigma Chemical Company, P.O.Box 14508, St. Louis, Missouri 63178, V.St.A.** Sigma 7-9 buffer is available from Sigma Chemical Company, P.O. Box 14508, St. Louis, Missouri 63178, V.St.A.

*** Die DEAE-Cellulose (DE52) ist erhältlich von Whatman Inc., 9 Bridewell Place, Clifton, New Jersey 07014, V.St.A.*** The DEAE-cellulose (DE52) is available from Whatman Inc., 9 Bridewell Place, Clifton, New Jersey 07014, V.St.A.

B. Sall-Verdauung des Plasmids pBR325 15B. Sall digestion of plasmid pBR325 15

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 8A beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon jedoch das Plasmid pBR325 verwendet und die Fragmente nicht durch präparative AGE/DE52/Elektroelution abtrennt. Die erhaltene DNA wird in TE-Puffer gelöst und bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt.The desired digestion is carried out in practice as described in Example 8A, but deviating from this, the plasmid pBR325 is used and the fragments are not separated by preparative AGE / DE52 / electroelution. The DNA obtained is dissolved in TE buffer and stored at 4 ^° C. until later use.

C. Verknüpfung von mit Sail verdautem Plasmid pBR325 und etwa 6,0 kb Sall-Fragment des Plasmids SCP2*C. Linkage of Sail-digested plasmid pBR325 and about 6.0 kb Sall fragment of the plasmid SCP2 *

Man vermischt etwa 1,5 ug des gemäß Beispiel 8A hergestellten 6,0 kb Sall-Fragments von SCP2* mit 0,5 μg des gemäß Beispiel 8B hergestellten, mit Sail verdauten pBR325. Das DNA-Gemisch wird durch übliche Fällung mit Ethanol ausgefällt und wieder in 3 μΐ destilliertem Wasser, 4 μΐ 0,66m ATP, 2 μΐ Ligase-Kinase-Mischung (0,25 Mol Tris'HCl, pH 7,8, 50 mMol .MgCl₂, 25 mMol Dithiothreit und 25 % Glycerin) sowie 1 μΐ T4-DNA-Ligase (1 Einheit) gelöst. Nach 1-stündiger Inkubation bei 15⁰C wird das Reaktionsgemisch mit 12 μΐ Wasser, 20 μΐ 0,66m ATP und 8 μΐ Ligase-Kinase-Mischung verdünnt und dann 18 Stunden bei 15⁰C inkubiert. Die erhaltene verknüpfte DNA wirdApproximately 1.5 μg of the 6.0 kb Sall fragment of SCP2 * prepared according to Example 8A is mixed with 0.5 μg of the sail-digested pBR325 prepared according to Example 8B. The DNA mixture is precipitated by conventional precipitation with ethanol and again in 3 .mu.ΐ distilled water, 4 .mu.ΐ 0.66m ATP, 2 μΐ ligase kinase mixture (0.25 mol Tris'HCl, pH 7.8, 50 mmol. MgCl ₂ , 25 mmol dithiothreitol and 25% glycerol) and 1 μΐ T4 DNA ligase (1 unit). After 1 hour of incubation at 15 ⁰ C, the reaction mixture is diluted with 12 .mu.ΐ water, 20 .mu.ΐ 0.66m ATP and 8 .mu.ΐ ligase kinase mixture and then incubated at 15 ⁰ C for 18 hours. The resulting linked DNA becomes

unter einem Verhältnis von 1:5 mit 0,1 XSSC verdünnt und stellt die gewünschten etwa 12,0 kb Plasmide pJLi80 und pJLi81 dar.diluted at a ratio of 1: 5 with 0.1 XSSC and represents the desired approximately 12.0 kb plasmids pJLi80 and pJLi81.

Es ergeben sich rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, da das Plasmid pBR325 Sall-Fragment nach jeweils einer von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die Restriktionsstellenpläne für die beiden Plasmide pJL180 und pJL181 gehen aus Figur 3 der Zeichnung hervor. 10This results in recombinant plasmids with two orientations, since the plasmid pBR325 Sall fragment can be oriented in one of two directions. The restriction site maps for the two plasmids pJL180 and pJL181 are shown in Figure 3 of the drawings. 10

Beispiel 9Example 9

Konstruktion von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-/pJL180 und Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-/pJL181Construction of Escherichia coli K12 C600r _k -M _k - / pJL180 and E. coli K12 C600r _k -M _k - / pJL181

15 : ^: 15 ^:

Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle der Plasmide pJL120 und pJL121 hier jedoch das Gemisch der Plasmid-pJLi80 und pJLi81-DNA (von Beispiel 8C) ver-The desired constructions are carried out in practice as described in Example 7, except that instead of the plasmids pJL120 and pJL121, the mixture of the plasmid pJLi80 and pJLi81 DNA (of Example 8C) is used here.

20 wendet. Die erhaltenen Transformantenkolonien werden20 turns. The resulting transformant colonies are

R selektiert und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp ,R and with respect to the expected phenotype (Amp,

SR Tet , Cm ) untersucht. Sie stellen die gewünschtenSR Tet, Cm). They provide the desired

Transformanten von Escherichia coli K12 C600R_k~M_k-/pJL180 und Escherichia coli K12 C600R,-M_l,-/pJL181 dar. Die ge^z;> genüber Ampicillin und Chloramphenicol resistenten Kolonien werden nach bekannten Verfahren isoliert, gezüchtet und dann in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und AGE-Analyse bezüglich der Plasmide identifiziert/ aus denen sie aufgebaut sind. Die identifizieren. Transformants of Escherichia coli K12 C600r _k ~ M _k - / pJL180 and E. coli K12 C600r, -M _l, - / pJL181 is Ge ^z;> genüber ampicillin and chloramphenicol resistant colonies are isolated according to known procedures, cultured, and then conventionally Manner identified by restriction enzyme analysis and AGE analysis of the plasmids / from which they are constructed. The identify

ten Transformanten lassen sich dann für eine anschließende Produktion und Isolierung der Plasmide pJLi80 und pJLi81 nach bekannten Verfahren verwenden.The transformants can then be used for subsequent production and isolation of the plasmids pJLi80 and pJLi81 according to known methods.

Beispiel 10 35 Example 10 35

Konstruktion des Plasmids pJL125.Construction of plasmid pJL125.

A. Sall-Verdauung des Plasmids pJLi21 und Isolierung des etwa 10,2 kb Sail-FragmentsA. Sall digestion of plasmid pJLi21 and isolation of the approximately 10.2 kb Sail fragment

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Reaktion vor Beendigung der Verdauung gestoppt wird und daß man anstelle des Plasmids SCP2* hier das Plasmid pJLi21 verwendet. Die erhaltenen Sall-Restriktionsfragmen te werden nicht durch präparative AGE abgetrennt sondem durch übliche Fällung mit Ethanol ausgefällt. Die Restrxktionsfragmente werden in TE-Puffer gelöst und sofort verknüpft.The desired digestion is carried out in a manner similar to that described in Example 8, except that the reaction is stopped before the end of the digestion and that, instead of the plasmid SCP2 *, the plasmid pJLi21 is used here. The Sall restriction fragments obtained are not separated by preparative AGE but precipitated by usual precipitation with ethanol. The Restrxktionsfragmente be dissolved in TE buffer and immediately linked.

B. Verknüpfung des etwa 10,2 kb Sail-Fragments des Plasmids pJL121B. Linkage of the approximately 10.2 kb Sail fragment of the plasmid pJL121

Die gewünschte Verknüpfung wird praktisch wie in Beispiel 8C beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme der Verwendung der Sall-Fragmente des Plasmids pJLi21 anstelle des SaII-Fragments der Plasmide SCP2* und pBR325. Die erhaltene verknüpfte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pJL125 und 12 anderen Plasmiden, deren anschließende Isolierung ergibt, daß sie weitere Sall-Restriktionsfragmente des Plasmids pJL121 enthalten. Das Plasmid pJL.125, das in herkömmlicher Weise isoliert wird und einen Replikationsstartpunkt vom Plasmid pBR325 und ferner den etwa 5,4 kb« Startpunkt des replikationshaltigen EcoRI-Sall-Fragments des Plasmids SCP2* enthält, wird in TE-Puffer gelöst und bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt. Der Restriktionsstellenplan für das Plasmid pJL125 geht aus Figur 4 der Zeichnung hervor. Der Restriktiorisstellenplan ist mit einem Plasmid aus transformiertem Escherichia coli K12 C600R_k-M, - bestimmt worden.The desired linkage is performed in practice as described in Example 8C, except for the use of the Sall fragments of plasmid pJLi21 in place of the SalI fragment of plasmids SCP2 * and pBR325. The resulting linked DNA consists of the desired plasmid pJL125 and 12 other plasmids whose subsequent isolation reveals that they contain additional SalI restriction fragments of plasmid pJL121. The plasmid pJL.125, which is isolated in a conventional manner and contains an origin of replication from the plasmid pBR325 and also the approximately 5.4 kb starting point of the replication-containing EcoRI-Sall fragment of the plasmid SCP2 *, is dissolved in TE buffer and incubated until stored later at 4 ^° C. The restriction site map for the plasmid pJL125 is shown in Figure 4 of the drawings. The Restriktiorisstellenplan has been determined with a plasmid from transformed Escherichia coli K12 C600R _k -M.

35 Beispiel 11 35 Example 11

Konstruktion von*Escherichia coli K12 C600R.-M*-/pJL125Construction of * Escherichia coli K12 C600R.-M * - / pJL125

Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt/ wobei anstelle der Plasmide pJL120 und pJL121 hier jedoch das Plasmid pJL125 verwendet wird. Die erhaltenen Kolonien werden selektiert R SS und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet , Cm ) untersucht, und sie stellen die gewünschten Transformanten von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-/pJLi25 dar. Die Identität der Transformanten wird durch AGE-Analyse und Restriktionsanalyse unter Anwendung des in Plasmid 1,The desired construction is carried out in practice as described in Example 7, wherein instead of the plasmids pJL120 and pJL121 here the plasmid pJL125 is used. The resulting colonies are selected for R SS and assayed for the expected phenotype (Amp, Tet, Cm) and represent the desired transformants of Escherichia coli K12 C600R _k -M _k - / pJLi25. The identity of the transformants is determined by AGE analysis and restriction analysis using the in plasmid 1,

(1978) und Plasmid 3, 88 (1980) beschriebenen Verfahrens weiter bestätigt. Die Transformanten werden dann in herkömmlicher Weise gezüchtet, um sie schließlich zur Produktion und Isolierung des Plasmids pJL125 nach bekannten Verfahren zu verwenden.(1978) and Plasmid 3, 88 (1980). The transformants are then grown in a conventional manner for use eventually in the production and isolation of plasmid pJL125 by known methods.

15 ___15 ___

Beispiel 12Example 12 Konstruktion des Plasmids pJL190Construction of plasmid pJL190

A. EcoRI-Hindlll-Verdauung des Plasmids pJL121 und Isolierung des etwa 19,0 kb EcoRI-HindiII-FragmentsA. EcoRI-HindIII digestion of plasmid pJL121 and isolation of the approximately 19.0 kb EcoRI-HindIII fragment

Man inkubiert etwa 200 μΐ (80 μg) Plasmid-pJL121-DNA, 30 μΐ BSA (1 mg/ml), 40 μΐ Hindlll-Restriktionsenzym (das 200 BRL-Einheiten enthält) und 30 μΐ Hindlll-Reaktionsmischung* etwa 3 Stunden bei 37⁰C und dann 10 Minuten bei 65°C. Die 300 μΐ Reaktionsgemisch werden auf 4°C gekühlt und mit 110 μΐ 10Χ HindIII-*EcoRI-Verdünnungsreaktionsmischung** und 30 μΐ EcoRI-Restriktionsenzym (das 300 BRL-Einheiten enthält) ergänzt, worauf man sie zuerst 3 Stunden bei 37⁰C inkubiert, dann 10 Minuten bei 65⁰C inkubiert und schließlich auf 4⁰C kühlt. Das erhaltene etwa 19,0 kb EcoRI-Hindlll-Restriktionsfragment wird in herkömmlicher Weise durch AGE/DE52/Elektroelution isoliert.Incubate approximately 200 μΐ (80 μg) of plasmid pJL121 DNA, 30 μΐ BSA (1 mg / ml), 40 μΐ HindIII restriction enzyme (containing 200 BRL units) and 30 μΐ HindIII reaction mixture * for approximately 3 hours at 37 ⁰ C and then 10 minutes at 65 ° C. The 300 μΐ reaction mixture is cooled to 4 ° C with 110 μΐ 10Χ HindIII * EcoRI dilution reaction mixture ** and 30 μΐ EcoRI restriction enzyme (containing 300 BRL units containing) added, after which they are first incubated for 3 hours at 37 ⁰ C. , then incubated for 10 minutes at 65 ⁰ C and finally cooled to 4 ⁰ C. The resulting approximately 19.0 kb EcoRI-HindIII restriction fragment is isolated in a conventional manner by AGE / DE52 / electroelution.

Die gewünschte DNA wird in TE-Puffer gelöst und bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt.The desired DNA is dissolved in TE buffer and stored at 4 ^° C. until later use.

* Die Hindlll-Reaktionsmischung wird unter Verwendung folgender Zusammensetzung hergestellt:* The HindIII reaction mixture is prepared using the following composition:

60 mMol Tris-HCl, pH 7,5 5 500 mMol NaCl 60 mMol MgCl₂ 60 mM Tris-HCl, pH 7.5 5 500 mM NaCl 60 mM MgCl ₂

** Das Hindlll-VEcoRI-Verdünnungsmittel wird unter** The HindIII VEcoRI diluent is added

Verwendung folgender Zusammensetzung hergestellt: 10Using the following composition: 10

382 mMol Tris-HCl, pH 7,5 _t 50 mMol NaCl 22 mMol MgCl₂ 382 mmol Tris-HCl, pH 7.5 _t 50 mmol NaCl 22 mmol MgCl ₂

B. EcoRI-Hindlll-Verdauung des Plasmids pLR4 und Isolierung des etwa 7,7 kb EcoRI-Hindlll-FragmentsB. EcoRI-HindIII digestion of the plasmid pLR4 and isolation of the approximately 7.7 kb EcoRI-HindIII fragment

Die gewünschte Verdauung und Isolierung führt man praktisch wie in Beispiel 12A beschrieben durch, wobei man abweichend davon anstelle des Plasmids pJL121 hier jedoch das Plasmid pLR4 verwendet. Das gewünschte etwa 7,7 kb-Fragment wird in TE-Puffer gelöst und bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt.The desired digestion and isolation are carried out in practice as described in Example 12A except that instead of the plasmid pJL121, the plasmid pLR4 is used here. The desired approximately 7.7 kb fragment is dissolved in TE buffer and stored at 4 ^° C. until later use.

C. Verknüpfung des etwa 19,0 kb EcoRI-Hindlll-Fragments des Plasmids pJLi21 mit dem etwa 7,7 kb EcoRI-Hind-III-Fragment des Plasmids pLR4C. Linkage of the approximately 19.0 kb EcoRI-HindIII fragment of the plasmid pJLi21 with the approximately 7.7 kb EcoRI-HindIII fragment of the plasmid pLR4

Die gewünschte Verknüpfung wird praktisch wie in Beispiel 8C beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des 6,0 kb Sail-Fragments des Plasmids SCP2* und des mit Sail verdauten Plasmids pBR325 hier jedoch das etwa 19,0 kb EcoRI-Hindlll-Fragment des Plasraids pJL121 und das etwa 7,7 kb EcoRI-Hindlll-Fragment des Plasmids pLR4 verwendet. Die erhaltene verknüpfte DNA stellt das gewünschte Plasmid pJLi90 dar, das bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt wird. Ein Restriktionsstellenplan und ein Funk-The desired linkage is carried out in practice as described in Example 8C, except that instead of the 6.0 kb Sail fragment of the plasmid SCP2 * and the Sail digested plasmid pBR325 here about 19.0 kb EcoRI-HindIII fragment of the plasmid pJL121 and using about 7.7 kb EcoRI-HindIII fragment of plasmid pLR4. The linked DNA obtained constitutes the desired plasmid pJLi90, which is stored until later use at 4 ⁰ C. A restriction site plan and a radio

tionsplan für das Plasmid pJL190 geht aus Figur 4 der Zeichnung hervor. Der Restriktionsstellenplan ist an einem in Escherichia coli K12 C600R,-M, -transformierten Plasmid bestimmt worden.Plan for the plasmid pJL190 is apparent from Figure 4 of the drawing. The restriction site map was determined on a plasmid transformed into Escherichia coli K12 C600R, M-M.

Beispiel 13Example 13

Konstruktion von Escherichia coli K12 C600R_k-Mj-/pJL190Construction of Escherichia coli K12 C600R _k -Mj- / pJL190

Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle der Plasmide pJL120 und pJLi21 hier jedoch das Plasmid pJL190 ver~ wendet. Die erhaltenen Kolonien werden selektiert undThe desired construction is carried out in practice as described in Example 7, except that the plasmid pJL190 is used instead of the plasmids pJL120 and pJLi21. The resulting colonies are selected and

R SRs

bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) und ihrer Größe in üblicher Weise (wie in Beispiel 11 beschrieben) untersucht. Sie stellen die gewünschten Transformanten von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k~/pJLi90 dar. Die Transformanten werden dann in herkömmlicher Weise gezüchtet, um daraus dann nach bekannten Verfahren das Plasmid pJL19Q zu bilden und zu isolieren.with respect to the expected phenotype (Amp, Tet) and their size in the usual way (as described in Example 11). They represent the desired transformants of Escherichia coli K12 C600R _k -M _k ~ / pJLi90. The transformants are then grown in a conventional manner, to then form and isolate plasmid pJL19Q by known methods.

Beispiel 14 ; Example 14 ;

Isolierung_des Plasmids pJL192 Isolation of the plasmid pJL192

Das Plasmid pJI.192, welches für eine hohe Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Neomycin (10 ug/ml) sorgt, kann in herkömmlicher Weise aus Escherichia coli K12 C600R,-M.-/pJL192 isoliert werden, nämlich aus einem in der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, V.St.A. hinterlegten Stammt der von dieser Hinterlegungsstelle unter der Nummer 15040 frei bezogen werden kann. Der Restriktionsstellenplan des Plasmids pJL192 scheint nicht unterscheidbar zu sein vom in Figur 4 gezeigten Restriktionsstellenplan für das Plasmid pJL190.The plasmid pJI.192, which provides a high resistance to the antibiotic neomycin (10 μg / ml), can be isolated in a conventional manner from Escherichia coli K12 C600R, -M .- / pJL192, namely from one in the permanent culture collection of the Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, V.St.A. deposited Stammt can be obtained from this depository under the number 15040 free. The restriction site map of plasmid pJL192 does not appear to be distinguishable from the restriction site map shown in Figure 4 for plasmid pJL190.

-41-1 Beispiel 15 -41-1 Example 15

Konstruktion des Plasmids pJL195Construction of plasmid pJL195

A. EcoRI-Sall-Verdauung des Plasmids pJL125 und Isolierung des etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-FragmentsA. EcoRI-Sall digestion of plasmid pJL125 and isolation of the approximately 5.4 kb EcoRI-Sall fragment

Die gewünschte Verdauung und Isolierung führt man praktisch wie in Beispiel 12A beschrieben durch, wobei man abweichend davon hier jedoch das Plasmid pJL125 und das Sall-Restriktionsenzym und die Reaktionsmischung verwendet, und nicht das Plasmid pJL121 und das HindIII-Restriktionsenzym und die Reaktionsmischung. Zusätzlich verwendet man auch das SalI-»EcoRI-Verdünnungsmittel*.The desired digestion and isolation are carried out in practice as described in Example 12A, except that here, however, the plasmid pJL125 and the Sall restriction enzyme and the reaction mixture used, and not the plasmid pJL121 and the HindIII restriction enzyme and the reaction mixture. In addition, the SalI »EcoRI diluent * is also used.

Das erhaltene etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Fragment wird in TE-Puffer gelöst und bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt.The resulting approximately 5.4 kb EcoRI-Sall fragment is dissolved in TE buffer and stored at 4 ^° C. until later use.

* Das SalI-*EcoRI-Verdünnungsmittel wird unter Ver-Wendung folgender Zusammensetzung hergestellt:The SalI * EcoRI diluent is prepared using the following composition:

940 mMol Tris-HCl, pH 7,5 55 mMol MgCl₂ 940 mmol Tris-HCl, pH 7.5 55 mmol MgCl ₂

25 B. EcoRI-Teil-Sall-Verdauung des PlasmidsB. EcoRI partial Sall digestion of the plasmid

pLR4 und Isolierung des etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-FragmentspLR4 and isolation of the approximately 7.5 kb EcoRI partial SalI fragment

Die Sall-Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 12A beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids pJL121 hier jedoch das Plasmid-pLR4 verwendet. Da lediglich eine teilweise Sall-Verdauung gewünscht ist, inkubiert man das erhaltene Gemisch zuerst 15 Minuten bei 37°C und dann 10 Minuten bei 65°C. Nach Abkühlen auf 4^ec isoliert man das erhaltene Teil-Sall etwa 7,7 kb-Linearfragment in herkömmlicher Weise durch AGE/DE52/Elektroelution. Die gewünschte DNA wird in TE-Puffer gelöst und praktisch unter Anwendung des in Beispiel 6A beschrie-Sall digestion is carried out in practice as described in Example 12A except that plasmid pLR4 is used instead of plasmid pJL121 here. Since only a partial Sall digestion is desired, incubate the resulting mixture first at 37 ° C for 15 minutes and then at 65 ° C for 10 minutes. After cooling to 4 ^e c, the resulting partial SalI about 7.7 kb linear fragment is isolated in a conventional manner by AGE / DE52 / electroelution. The desired DNA is dissolved in TE buffer and treated in practice using the procedure described in Example 6A.

T benen Verfahrens mit EcoRI-Restriktionsenzym verdaut, wobei man abweichend davon jedoch das obige Fragment verwendet, und nicht das Sall-Fragment von SCP2*. Das gewünschte etwa 7,5 kb EcoRI-Sall-Fragment (das größtmögliche EcoRI-Sall-Fragment) wird durch AGE/DE52/Elektroelution isoliert, in TE-Puffer gelöst und dann bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt.T benen method digested with EcoRI restriction enzyme, but deviating from the above fragment used, and not the SalI fragment of SCP2 *. The desired approximately 7.5 kb EcoRI-SalI fragment (the largest possible EcoRI-Sall fragment) was isolated by AGE / DE52 / electroelution, dissolved in TE buffer and then stored until future use at 4 ⁰ C.

C. Verknüpfung des etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Fragments des Plasmids pJL125 mit dem etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-Fragment des Plasmids pLR4C. Linkage of the approximately 5.4 kb EcoRI-Sall fragment of the plasmid pJL125 with the approximately 7.5 kb EcoRI partial SalI fragment of the plasmid pLR4

Die gewünschte Verknüpfung wird praktisch wie in Beispiel 8C beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man hier das etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Fragment des Plasmids pJL125 und das etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-Fragment des Plasmids pLR4 verwendet, und nicht das etwa 6,0 kb Sall-Fragment des Plasmids SCP2* und das mit Sail verdaute Plasmid pBR325. Die erhaltene verknüpfte DNA stellt das gewünschte Plasmid pJLi95 dar und wird bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt. Ein Restriktionsstellenplan des Plasmids pJL195 geht aus Figur 5 der Zeichnung hervor. Der Restriktionsstellenplan ist mit einer Plas-The desired linkage is carried out in practice as described in Example 8C, except that here the approximately 5.4 kb EcoRI-Sall fragment of the plasmid pJL125 and the approximately 7.5 kb EcoRI partial Sall fragment of the plasmid pLR4 and not the approximately 6.0 kb Sall fragment of the SCP2 * plasmid and the Sail digested pBR325 plasmid. The linked DNA obtained constitutes the desired plasmid pJLi95 and will be retained for later use at 4 ⁰ C. A restriction site map of plasmid pJL195 is shown in Figure 5 of the drawings. The restriction site plan is available with a plasma

midisolierung aus Escherichia coli K.12 C600R, -M, - beoc KKmidisolation from Escherichia coli K.12 C600R, -M, - beoc KK

25 stimmt worden.25 has been agreed.

Beispiel 16Example 16

Konstruktion von Escherichia coli K12 C600R,-M_k-/pJL195Construction of Escherichia coli K12 C600r, -M _k - / pJL195

Die gewünschte. Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon hier jedoch das Plasmid pJL195 verwendet und nicht die Plasmide pJL120 und pJL121. Die erhaltenen Kolonien werden bezüglich des erwarteten Phenotype (Amp , Tet ) und ihrer Größe (wie in Beispiel 11 beschrieben) untersucht und stellen die gewünschten Escherichia coli K12 C600Rj-M,-/pJL195-Tränsförmanten dar. Die TransförmantenThe desired. Construction is carried out in practice as described in Example 7, but deviating from this, the plasmid pJL195 is used instead of the plasmids pJL120 and pJL121. The resulting colonies are assayed for the expected phenotype (Amp, Tet) and their size (as described in Example 11) and represent the desired Escherichia coli K12 C600Rj-M, - / pJL195 transient response variants. The transfusion manners

werden dann in herkömmlicher Weise gezüchtet, um hierauf unter Anwendung bekannter Verfahren das Plasmid pJLi95 zu produzieren und isolieren.are then grown in a conventional manner to then produce and isolate plasmid pJLi95 using known methods.

5 Beispiel 17 5 Example 17

Konstruktion des Plasmids pJL114Construction of plasmid pJL114

A. BamHI-Teilverdauung des Plasmids SCP2A. BamHI partial digestion of the plasmid SCP2

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 6A beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon hier jedoch das Plasmid SCP2 (welches gemäß Beispiel 1 aus Streptomyces coelicolor A3(2) isoliert worden ist, nämlieh einem in der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory hinterlegten Stamm, der von dort unter der Nummer 15042 frei bezogen werden kann) und das BamHI-Restriktionsenzym sowie die Reaktionsmischung* verwendet und nicht das Plasmid SCP2* und das EcoRI-Restriktionsenzym und die Reaktionsmischung. Die gewünschte DNA wird bis zum späteren Gebrauch bei 4°C aufbewahrt.The desired digestion is carried out in practice as described in Example 6A, except that here, however, the plasmid SCP2 (which according to Example 1 from Streptomyces coelicolor A3 (2) has been isolated, namely one deposited in the permanent culture collection of the Northern Regional Research Laboratory strain , which can be obtained from there under the number 15042) and the BamHI restriction enzyme and the reaction mixture used * and not the plasmid SCP2 * and the EcoRI restriction enzyme and the reaction mixture. The desired DNA is stored at 4 ° C until later use.

* Die Reaktionsmischung für das BamHI-Restriktionsenzym wird unter Verwendung folgender Zusammensetzung hergestellt:The reaction mixture for the BamHI restriction enzyme is prepared using the following composition:

1000 mMol Tris-HCl, pH 7,41000 mM Tris-HCl, pH 7.4

100 mMol MgCl₂ 30100 mmol MgCl ₂ 30

B. Verknüpfung von mit BamHI verdautem Plasmid SCP2 mit dem mit BamHI verdauten Plasmid pBR322B. Linkage of BamHI digested plasmid SCP2 with BamHI digested plasmid pBR322

Die gewünschte Verknüpfung wird praktisch wie in Be ispiel 6C beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon hier jedoch das mit BamHI verdaute Plasmid SCP2 (hergestellt gemäß Beispiel 17A) und das mit BamHI ver-*The desired linkage is carried out in practice as described in Example 6C, but deviating from this, however, the BamHI-digested plasmid SCP2 (prepared according to Example 17A) and the BamHI *

daute Plasmid pBR322 (hergestellt gemäß Beispiel 4B) verwendet, und nicht die Plasmide SCP2* und pBR325. Die erhaltene DNA wird bei 4⁰C aufbewahrt und stellt das gewünschte etwa 34,6 kb-Plasmid pJL114 dar.The plasmid pBR322 (prepared according to Example 4B) was used, and not the plasmids SCP2 * and pBR325. The DNA obtained was stored at 4 ⁰ C, and represents the desired about 34.6 kb plasmid pJL114.

·.' 5; ' ' ·. ' 5; ''

Beispiel 18Example 18

Konstruktion von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-/pJLiConstruction of Escherichia coli K12 C600R _k -M _k - / pJLi

Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt, wobei man hier jedoch das Plasmid pJL114 und nicht die Plasmide pJL120 und pJL-121 verwendet. Die erhaltenen Kolonien werden selektiertThe desired construction is carried out in practice as described in Example 7, except that plasmid pJL114 is used here, not plasmids pJL120 and pJL-121. The resulting colonies are selected

R S und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht. Sie stellen die gewünschten Escherichia coli K12 C600Rj-M_k-/pJL114-Transformanten dar. Die ampicillin™ resistenten und tetracyclinsensitiven Kolonien werden unter Anwendung bekannter Verfahren isoliert, gezüchtet _N und dann in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzym- \ j 20 analyse und elektrophoretische Analyse mit Agarosegel / hinsichtlich der Plasmide identifiziert, aus denen sie aufgebaut sind.RS and with respect to the expected phenotype (Amp, Tet). To set the desired Escherichia coli K12 C600Rj-M _k - is / pJL114 transformants ampicillin ™ resistant and tetracycline-sensitive colonies are isolated using known procedures, cultured _N and analysis in conventional manner by restriction enzyme \ j 20 and electrophoretic analysis. Agarose gel / with regard to the plasmids from which they are constructed.

Bei dieser Analyse ergibt sich, daß das BamHI-Restrlktionsenzym während der in Beispiel 17A beschriebenen Verdauung nur eine der Bglll-Restriktionsstellen von SCP2 geschnitten hat. Da es sich hierbei um ein seltenes Ereignis handelt, welches nicht mehr wiederholt worden ist, wurde Escherichia coli K12 C600R, -M, -/pJL114 in der stän-3" digen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, V.St.A. hinterlegt, von der es unter der Nummer B-15039 frei beziehbar ist. Der Stamm ist als eine bevorzugte Quelle und als Grundvorrat für das Plasmid pJL114 verfügbar. Ein Restriktionsstellen-In this analysis, it appears that the BamHI restriction enzyme has cut only one of the BglII restriction sites of SCP2 during the digestion described in Example 17A. Since this is a rare event that has not been repeated, Escherichia coli K12 C600R, M- / pJL114 was grown in the culture stand of the Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Ill., V.St. A, from which it is freely available under the number B-15039 The strain is available as a preferred source and as a stock for the plasmid pJL114.

plan für das Plasmid pJL114 geht aus Figur 5 der Zeichnung hervor.Plan for the plasmid pJL114 is apparent from Figure 5 of the drawing.

' -45- 1 Beispiel 19 '-45- 1 Example 19

/ Konstruktion von Streptomyces griseofuscus/pJL120 / Construction of Streptomyces griseofuscus / pJL120

A. Wachsenlassen von Kulturen zur Herstellung von ProtoplastenA. growing cultures for protoplast production

Man stellt in herkömmlicher Weise ein vegetatives Inokulum her/ indem man den Stamm unter submersen Bedingungen 20 Stunden bei 30⁰C in TSB wachsen läßt, das mit 0,4 % Glycin ergänzt worden ist. Die Kultur wird homogenisiert und unter einer 1:20-Verdünnung in das gleiche Medium inokuliert und dann 18 Stunden bei 30⁰C wachsen gelassen.A vegetative inoculum is conventionally prepared by growing the strain under submerged conditions for 20 hours at 30 ^° C. in TSB supplemented with 0.4% glycine. The culture is homogenized and inoculated under 1:20 dilution into the same medium and then grown at 30 ^° C. for 18 hours.

15 B. Transformation15 B. Transformation

Unter Verwendung von etwa 20 ng Plasmid-pJL120-DNA undUsing about 20 ng of plasmid pJL120 DNA and

9 1X10 Protoplasten von Streptomyces griseofuscus, nämlich einem in der ständigen Kulturen Sammlung der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St.A. hinterlegten Stamm, von der er unter der Nummer ATCC 23916 frei beziehbar ist, wird die gewünschte Transformation praktisch wie im Beispiel 2 der internationalen Offenlegungsschrift WO79/01169 (internationale Patentanmeldung PCT/BG79/00095) beschrieben durchgeführt.9 1X10 protoplasts of Streptomyces griseofuscus, viz. One in the Standing Cultures Collection of the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St.A. deposited strain, of which it is freely obtainable under the number ATCC 23916, the desired transformation is carried out practically as described in Example 2 of International Publication WO79 / 01169 (international patent application PCT / BG79 / 00095).

jß. SelektionJSS. selection

Zur Untersuchung einer Transformation sogar bei niedrigen Häufigkeiten werden zwei Verfahren angewandt.Two methods are used to study transformation even at low frequencies.

(1) Pustelversuch(1) pustule test

Von den Regenerationsplatten, die ineinanderfließende Rasen an,regenerierten Protoplasten enthalten, werden Sporen wie folgt geerntet. Man versetzt die Platte mit etwa 10 ml sterilem destilliertem Wasser und kratzt die Oberfläche der Kultur zur Entfernung der Sporen mit einerFrom the regeneration plates containing confluent turfs to regenerated protoplasts, spores are harvested as follows. Place the plate in about 10 ml of sterile distilled water and scrape the surface of the culture to remove the spores

Schlaufe leicht ab. Die erhaltene Sporensuspension wird 10 Minuten bei 20 000 UpM zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen, und das zurückbleibende Sporenpellet resuspendiert man in 0,3 ml 20 %-igem (Volumen/ Volumen) Glycerin. Man macht ReihenVerdünnungen der Präparation bis hinab zu 10 durch aufeinanderfolgende Übertragung von 0,1 ml der Sporensuspension auf 0,9 ml 20 %-igem (Volumen/Volumen) Glycerin. Die Sporen werden dann bei -20⁰C aufbewahrt» wodurch sie nur wenig an Lebensfähigkeit verlieren. Mengen von etwa 0,1 ml von eini-Slightly turn off. The resulting spore suspension is centrifuged for 10 minutes at 20,000 rpm. The supernatant is discarded and the remaining spore pellet is resuspended in 0.3 ml of 20% (v / v) glycerol. Serial dilutions of the preparation are made down to 10 by successive transfer of 0.1 ml of the spore suspension to 0.9 ml of 20% (v / v) glycerol. The spores are then stored at -20 ⁰ C "thereby losing little of viability. Quantities of about 0.1 ml of some

-1 -2 gen der Verdünnungsreihen (beispielsweise 10 , 10 ,-1 -2 gene of dilution series (for example, 10, 10,

-4 10 ) aus jeder der abgeernteten Platten überträgt man dann auf mit R.-Medium (Molecular and General Genetics 162, 30 (1978)) versehene Platten, die eine solche Menge an Sporen des Stammes von Streptomyces griseofuscus enthalten, wie er ursprünglich beim Transformationsverfahren verwendet worden ist, daß ein ineinanderfließender Rasen gebildet wird. Dieses Verfahren kann auch unter Verwendung von YMX-Agar durchgeführt werden (0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % Malzextrakt, 0,1 % Dextrose und 2 % Agar). Transformanten lassen sich im allgemeinen nach dreitägigem Wachsenlassen bei 30⁰C durch das Auftreten der sogenannten Pusteln feststellen, nämlich einem Gut, das von Sporen ausgedrückt wird, die das Plasmid in einer ausdrückbaren Form im Rasen enthalten. Die Transformanten werden gewonnen, indem man in herkömmlicher Weise vom Zentrum der Pustel Sporen entnimmt und auf eine mit YMX-Medium versehene Agarplatte gibt (Bacteriological Review, 31,-4-10) from each of the harvested plates is then transferred to R. Medium (Molecular and General Genetics 162, 30 (1978)) provided plates containing such an amount of spores of the strain of Streptomyces griseofuscus, as originally in the Transformation method has been used that a merging lawn is formed. This procedure can also be carried out using YMX agar (0.5% yeast extract, 0.5% malt extract, 0.1% dextrose and 2% agar). Transformants are generally found after three days of growth at 30 ⁰ C by the appearance of the so-called pustules, namely a good that is expressed by spores containing the plasmid in an expressible form in the lawn. The transformants are recovered by removing spores from the center of the pustule in a conventional manner and applying to an agar plate provided with YMX medium (Bacteriological Review, 31, p.

373 (1967)). 30373 (1967)). 30

(2) Rücktransformation zu Escherichia coli K12 C600R.-M,-:(2) Reverse transformation to Escherichia coli K12 C600R.-M, -:

Die Sporen werden wie oben unter (1) beschrieben gesammelt, dann jedoch zur Beimpfung von 50 ml TSB verwendet, das mit 0,4 % Glycin ergänzt ist. Man läßt die Kultur 20 Stunden bei 30⁰C wachsen, worauf man die Zellen erntet und die DNA isoliert. Die Isolierung wird wie in BeispielThe spores are collected as described above under (1), but then used to inoculate 50 ml of TSB supplemented with 0.4% glycine. The culture is allowed to grow at 30 ^° C. for 20 hours, after which the cells are harvested and the DNA is isolated. The insulation is as in example

1B beschrieben vorgenommen, wobei man abweichend davon die Zentrifugierung mit CsCl und Propidiumiodid jedoch wegläßt. Sodann verwendet man 50 μΐ dieser DNA zur Transformierung von Escherichia coli K12 C60OR^-M - nach dem in Beispiel 7B beschriebenen Verfahren. Die in den Transformanten befindlichen Plasmide werden in herkömmlicher Weise wie in Beispiel 11 beschrieben verifiziert und identifiziert.1B except that centrifugation with CsCl and propidium iodide is omitted. Then, 50 μΐ of this DNA is used to transform Escherichia coli K12 C60OR ^ -M - according to the procedure described in Example 7B. The plasmids present in the transformants are verified and identified in a conventional manner as described in Example 11.

10 Beispiel 20 10 Example 20

Konstruktion von Streptomyces griseofuscus/pJL114, Streptomyces griseof uscus/pJLI 21, Streptomyces griseofuscus/pJL·- 125» Streptomyces griseofuscus/pJLI80 und StreptomycesConstruction of Streptomyces griseofuscus / pJL114, Streptomyces griseofuscus / pJLI 21, Streptomyces griseofuscus / pJL · - 125 »Streptomyces griseofuscus / pJLI80 and Streptomyces griseofuscus/pJLI81griseofuscus / pJLI81

Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch unter Anwendung des in Beispiel 20 beschriebenen Verfahrens einzeln durchgeführt, selektiert und gewonnen, wobei man abweichend davon für die jeweilige Konstruktion jedoch die Plasmide pJLi14, pJL121, pJL125, pJL180 und pJL181 verwendet, und nicht das Plasmid pJL120.The desired constructions are carried out, selected and recovered in practice using the method described in Example 20, except that for the respective construction, however, the plasmids pJLi14, pJL121, pJL125, pJL180 and pJL181 are used, and not the plasmid pJL120.

Beispiel 21 25 Example 21 25

Konstruktion von Streptomyces griseofuscus/pJL190Construction of Streptomyces griseofuscus / pJL190

A. TransformationA. Transformation

Die gewünschte Transformation wird praktisch wie in Beispiel 19B beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids pJL120 hier jedoch das Plasmid pJL190 verwendet.The desired transformation is carried out in practice as described in Example 19B, except that the plasmid pJL190 is used instead of the plasmid pJL120 here.

35 B. Selektion35 B. Selection

Die gewünschten Transformanten werden bezüglich ihrer Neomycinresistenz selektiert/ indem man die regenerieren-The desired transformants are selected for their neomycin resistance / by regenerating the

den Protoplasten mit R₂-Mediumoberagar überschichtet, der so viel Neomycin enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzentration von 1 μg/ml ergibt. Die erhaltenen Streptomyces griseofuscus/pJL190-Transformanten werden dann bezüglich der erwarteten Pustelmorphologie praktisch unter Anwendung des in Beispiel 2OB beschriebenen Verfahrens untersucht.The protoplasts are overlaid with R ₂ medium top agar containing neomycin sufficient to give a concentration of 1 μg / ml on the final plate. The resulting Streptomyces griseofuscus / pJL190 transformants are then assayed for expected pustular morphology using the method described in Example 2OB.

Beispiel 22 10 Example 22 10

Konstruktion von Streptomyces griseofuscus/pJLI95Construction of Streptomyces griseofuscus / pJLI95

Man führt die gewünschte Konstruktion, Selektierung undOne performs the desired construction, selection and

Gewinnung praktisch wie in Beispiel 21 beschrieben durch,Recovery practically as described in Example 21,

wobei man anstelle des Plasitiids pJLi90 hier jedoch das Plasmid pJL195 verwendet.however, instead of plasmid pJLi90, plasmid pJL195 is used here.

Beispiel 23 20 Konstruktion von Streptomyces griseofuscus/pJLI92 Example 23 20 Construction of Streptomyces griseofuscus / pJLI92

Man führt die gewünschte Konstruktion, Selektierung und Gewinnung praktisch wie in Beispiel 22 beschrieben durch, wobei man hier jedoch das Plasmid pJLi92 und beim Selektionsverfahren einen Oberagar verwendet, der so viel Neomycin enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzentration von 10 ug/ml ergibt, und nicht das Plasmid pJL195 und einen Oberagar einsetzt, der so viel Neomycin enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzen-The desired construction, selection and recovery are carried out in practice as described in Example 22, except that here the plasmid pJLi92 and the selection method used a Oberagar containing neomycin so that on the finished plate, a concentration of 10 ug / ml and does not use the plasmid pJL195 and a top agar containing neomycin enough to concentrate on the final plate.

30 tration von 1 μg/ml ergibt.30 concentration of 1 μg / ml.

Beispiel 24Example 24

Konstruktion von Streptomyces fradiae/pJLi20, Streptomyces fradiae/pJL114, Streptomyces fradiae/pJL121, Strepto myces fradiae/pJL125, Streptomyces fradiae/pJL180, Streptomyces fradiae/pJL18i, Streptomyces fradiae/pJLi90, Streptomyces fradiae/pJLi95 und Streptomyces fradiae/pJL192Construction of Streptomyces fradiae / pJLi20, Streptomyces fradiae / pJL114, Streptomyces fradiae / pJL121, Streptomyces fradiae / pJL125, Streptomyces fradiae / pJL180, Streptomyces fradiae / pJL18i, Streptomyces fradiae / pJLi90, Streptomyces fradiae / pJLi95 and Streptomyces fradiae / pJL192

t Die gewünschten einzelnen Konstruktionen, Selektionen und Gewinnungen werden praktisch wiö in den⁷ Beispielen -^₁, 19, 20, 21, 22 und 23 beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon hier jedoch Streptomyces fradiae anstelle von Streptomyces griseofuscus verwendet. Ferner wird auch das TSB-Medium zur Protoplastifizierung und zum Wachsenlassen von Streptomyces fradiae so abgewandelt, daß es lediglich 0,2 % Glycin enthält.The desired individual constructions, selections and recoveries are carried out practically as described in the ⁷ examples - ^ ₁ , 19, 20, 21, 22 and 23, but deviating from this here Streptomyces fradiae is used instead of Streptomyces griseofuscus. Further, the TSB medium for protoplastification and growth of Streptomyces fradiae is also modified to contain only 0.2% glycine.

10 Beispiel 25 10 Example 25

Konstruktion von Streptomyces lividans/pJL120, Streptomyces lividans/pJL114, Streptomyces lividans/pJL121, Streptomyces lividans/pJL125, Streptomyces lividans/pJL-180, Streptomyces lividans/pJLI81, Streptomyces lividans/ pJL190, Streptomyces lividans/pJLi95 und Streptomyces lividans/pJL192Construction of Streptomyces lividans / pJL120, Streptomyces lividans / pJL114, Streptomyces lividans / pJL121, Streptomyces lividans / pJL125, Streptomyces lividans / pJL-180, Streptomyces lividans / pJLI81, Streptomyces lividans / pJL190, Streptomyces lividans / pJLi95 and Streptomyces lividans / pJL192

Die gewünschten einzelnen Konstruktionen, Selektionen und Gewinnungen werden praktisch wie in den Beispielen 19, 20, 21, 22 und 23 beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon hier jedoch Streptomyces lividans anstelle von Streptomyces griseofuscus verwendet. Ferner wird zur Protoplastifizierung und zum Wachsenlassen von Streptomyces lividans ein Medium verwendet, wie es in Beispiel 2 der internationalen Offenlegungsschrift WO79/01169 (internationale Patentanmeldung PCT/BG79/00095) beschrieben ist.The desired individual constructions, selections and recoveries are carried out in practice as described in Examples 19, 20, 21, 22 and 23, but deviating from this, Streptomyces lividans is used instead of Streptomyces griseofuscus. Further, a medium is used for protoplastification and growth of Streptomyces lividans, as described in Example 2 of International Publication WO79 / 01169 (international patent application PCT / BG79 / 00095).

30 Beispiel 26 30 Example 26

Isolierung der Plasmidmutante pJL192, die eine hohe Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Neomycin verleihtIsolation of the plasmid mutant pJL192, which confers a high resistance to the antibiotic neomycin

Man isoliert Streptomyces griseofuscus/pJLi90 wie in Beispiel 21 beschrieben. Eine Analyse der auf Nähragar, welcher mit verschiedenen Konzentrationen an Neomycin ergänzt worden ist, gewachsenen Kolonien zeigt, daß Strep-Streptomyces griseofuscus / pJLi90 are isolated as described in Example 21. An analysis of the colonies grown on nutrient agar supplemented with various concentrations of neomycin shows that Strep

tomyces griseofuscus/pJLi90 eine Resistenz aufweist gegenüber 1/0 μ9/ΐη1 Neomycin. Streptomyces griseofuscus wird in herkömmlicher Weise auf Nähragarplatten aufgetragen/ die mit 10 ug/ml Neomycin ergänzt sind. Hierbei läßt sich eine Kolonie entdecken, die das Wachstum bei dieser hohen Konzentration an Neomycin hemmt. Nach wiederholter Analyse ergibt sich, daß diese Kolonie die oben erwähnte Resistenz aufweist, und diese Kolonie wird als Streptomyces griseofuscus/pJL192 bezeichnet. Das Plasmit pJLi92 wird in Escherichia coli K12 C600R_k-M_k~ durch Rücktransformation wie in Beispiel 19C beschrieben eingeschleust. Der Restriktionsstellenplan des Plasmids pJL192 ist anscheinend nicht unterscheidbar vom Restriktionsstellenplan des Plasmids pJL190.tomyces griseofuscus / pJLi90 has a resistance to 1/0 μ9 / ΐη1 neomycin. Streptomyces griseofuscus is applied conventionally to nutrient agar plates supplemented with 10 μg / ml neomycin. Here, a colony can be discovered that inhibits growth at this high concentration of neomycin. After repeated analysis, it is revealed that this colony has the above-mentioned resistance, and this colony is called Streptomyces griseofuscus / pJL192. The plasmid pJLi92 is introduced into Escherichia coli K12 C600R _k -M _k ~ by inverse transformation as described in Example 19C. The restriction site map of plasmid pJL192 appears to be indistinguishable from the restriction site map of plasmid pJL190.

Beispiel 27Example 27

Isolierung der Plasmidmutante pJL199, die eine hohe Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Neomycin verleiht 20 Isolation of the plasmid mutant pJL199, which confers high resistance to the antibiotic neomycin 20

Die gewünschte Isolierung wird praktisch wie in Beispiel 26 beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon jedoch Streptomyces griseofuscus/pJLi95 (hergestellt gemäß Beispiel 22) verwendet und nicht Streptomyces griseofuscus/pJL^O. Eine Kolonie, die eine hohe Resistenz gegenüber Neomycin aufweist, wird als Streptomyces griseofuscus/pJL199 bezeichnet. Das Plasmid pJL199 wird durch Rücktransformation wie in Beispiel 19C beschrieben in Escherichia coli K12 CöOOR^-M^- eingeschleust. DerThe desired isolation is carried out in practice as described in Example 26, but Deviating from it Streptomyces griseofuscus / pJLi95 (prepared according to Example 22) is used and not Streptomyces griseofuscus / pJL ^ O. A colony having a high resistance to neomycin is called Streptomyces griseofuscus / pJL199. The plasmid pJL199 is introduced by reverse transformation as described in Example 19C in Escherichia coli K12 CöOOR ^ -M ^ -. The

Restriktionsstellenplan des Plasmids pJL199 scheint vom Restriktionsstellenplan des Plasmids pJL195 nicht unterscheidbar zu sein.  Restriction site map of plasmid pJL199 appears to be indistinguishable from the restriction site map of plasmid pJL195.

Es ist für den Fachmann ohne weiteres erkennbar, daß sich das Plasmid pJLi99 auch in herkömmlicher Weise konstruieren läßt, indem man das die Neomycinresistenz verleihende Fragment des Plasmids pJL192 (hergestellt nach denIt will be readily apparent to those skilled in the art that plasmid pJLi99 may also be constructed in a conventional manner by digesting the neomycin resistance-conferring fragment of plasmid pJL192 (prepared according to the

Beispielen 15 und 27) anstelle des vom pLR4 abgeleiteten, Neomycinresistenz übertragenden Fragments des Plasmids pJL195 verwendet. Ein solcher Ersatz führt daher ebenfalls zum gewünschten Plasmid pJL199.Examples 15 and 27) in place of the pLR4-derived neomycin resistance-conferring fragment of plasmid pJL195. Such a replacement therefore also leads to the desired plasmid pJL199.

Beispiel 28Example 28

Konstruktion des Plasmids pLR2 10 A. HindiII-Verdauung des Plasmids pIJ6 Construction of plasmid pLR2 10 A. HindIII digestion of plasmid pIJ6

Man inkubiert etwa 20 μΐ (20 μg) Plasmid-pIJ6-DNA (Nature 286, 525 (1980)), 5 μΐ BSA (Rinderserumalbumin, 1 mg/ml), 19 μΐ Wasser, 1 μΐ Hindlll-Restriktionsenzym* (das 3 New England Bio Labs-Einheiten enthält) und 5 μΐ Reaktionsmischung** 2 Stunden bei 37°C. Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4m Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet, in 20 μΐ TE-Puffer suspendiert und zur Aufbewahrung bei -20⁰C eingefroren.Incubate approximately 20 μΐ (20 μg) of plasmid pIJ6 DNA (Nature 286, 525 (1980)), 5 μΐ BSA (bovine serum albumin, 1 mg / ml), 19 μΐ water, 1 μΐ HindIII restriction enzyme * (containing 3 New England Bio Labs units) and 5 μΐ reaction mixture ** for 2 hours at 37 ° C. The reaction is terminated by addition of about 50 μM 4m ammonium acetate and 200 μM 95% ethanol. The resulting DNA precipitate is washed twice in 70% ethanol, dried under vacuum, suspended in 20 μΐ TE buffer, and frozen for storage at -20 ⁰ C.

B. HindiII-Verdauung des Plasmids pBR322B. HindIII digestion of plasmid pBR322

Man inkubiert etwa 8 μΐ (4 μg) Plasmid-pBR322-DNA, 5 μΐ Reaktionsmischung, 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 31 μΐ Wasser und 1 μΐ Hindlll-Restriktionsenzym 2 Stunden bei 37⁰C. Nach Beendigung der Reaktion durch 10 Minuten langes Inkubieren bei 60⁰C gibt man etwa 50 μΐ Ammoniumacetat und 200 μΐIncubate about 8 μΐ (4 μg) of plasmid pBR322 DNA, 5 μΐ reaction mixture, 5 μΐ BSA (1 mg / ml), 31 μΐ water and 1 μΐ HindIII restriction enzyme for 2 hours at 37 ⁰ C. After completion of the reaction by Incubate for 10 minutes at 60 ⁰ C., about 50 μΐ ammonium acetate and 200 μΐ

^ow 95 %-iges Ethanol zu. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 45 μΐ Wasser suspendiert. ^ow 95% ethanol too. The resulting DNA precipitate is washed twice in 70% ethanol, dried under vacuum and suspended in 45 μΐ water.

C. Verknüpfung der mit Hindlll verdauten Plasmide pIJ6 und pBR322C. Linkage of HindIII-digested plasmids pIJ6 and pBR322

Man inkubiert etwa 20 μΐ mit Hindlll behandeltes Plasmid pIJ6 (von Beispiel 2A), 20 μΐ mit Hindlll behandeltesIncubate approximately 20 μΐ HindIII-treated plasmid pIJ6 (from Example 2A), 20 μΐ HindIII-treated

Plasmid pBR322 (von Beispiel 2B), 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 1 μΐ T4-DNA-Ligase* und 5 μΐ Verknüpfungsmischung** 4 Stunden bei 16°C. Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4m Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in TE-Puffer suspendiert. Die suspendierte DNA stellt das gewünschte Plasmid pLR2 dar.Plasmid pBR322 (from Example 2B), 5μΐ BSA (1mg / ml), 1μΐ T4 DNA ligase * and 5μΐ linkage mixture ** for 4 hours at 16 ° C. The reaction is terminated by addition of about 50 μM 4m ammonium acetate and 200 μM 95% ethanol. The resulting DNA precipitate is washed twice in 70% ethanol, dried under vacuum and suspended in TE buffer. The suspended DNA represents the desired plasmid pLR2.

10 Beispiel 29 10 Example 29

Konstruktion von Escherichia coli K12 HB101/pLR2Construction of Escherichia coli K12 HB101 / pLR2

Etwa 10 ml gefrorene leistungsfähige Zellen von Escherichia coli K12 HB101 (Gene 2, 75 bis 93 (1977)) werden durch Zentrifugation pelletisiert und dann in etwa 10 ml 0,01m Natriumchlorid suspendiert. Hierauf werden die Zellen erneut pelletisiert, in etwa 10 ml 0,03m Calciumchlorid resuspendiert, 20 Minuten auf Eis inkubiert, ein drittes Mal pelletisiert und schließlich abermals in 1,25 m\ 0,03m Calciumchlorid suspendiert. Die erhaltene Zellsuspension ist für eine anschließende Transformation leistungsfähig.About 10 ml of frozen, efficient cells of Escherichia coli K12 HB101 (Gene 2, 75-93 (1977)) are pelleted by centrifugation and then suspended in about 10 ml of 0.01M sodium chloride. The cells are then pelleted again, resuspended in about 10 ml of 0.03m calcium chloride, incubated on ice for 20 minutes, pelleted a third time, and finally resuspended in 1.25 m \ 0.03m calcium chloride. The resulting cell suspension is efficient for subsequent transformation.

Das Plasmid pLR2 in TE-Puffer (hergestellt gemäß Beispiel 2C) wird in Ethanol gefällt, in 150 μΐ 30-millimolarer Calciumchloridlösung suspendiert und in einem Teströhrchen mit etwa 200 μΐ leistungsfähigen Zellen von Escherichia coli K12 HB101 leicht vermischt. Das erhaltene Gemisch wird etwa 45 Minuten auf Eis und dann etwa 1 Minute bei 42°C inkubiert. Hierauf gibt man etwa 3 ml L-Brühe (J. Bacteriology 62, 293 (1951)) zu, die 50 μg/ml Ampicillin enthält. Das Gemisch wird unter Schütteln 1 Stunde bei 37°C inkubiert und dann auf L-Agar (Miller,The plasmid pLR2 in TE buffer (prepared according to Example 2C) is precipitated in ethanol, suspended in 150 .mu.l 30-millimolar calcium chloride solution and mixed gently in a test tube with about 200 .mu.ΐ efficient cells of Escherichia coli K12 HB101. The resulting mixture is incubated on ice for about 45 minutes and then at 42 ° C for about 1 minute. Then, about 3 ml of L broth (J. Bacteriology 62, 293 (1951)) containing 50 μg / ml ampicillin is added. The mixture is incubated with shaking for 1 hour at 37 ° C and then on L-agar (Miller,

^J0 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York) aufgezogen, der Ampicillin enthält. Die überlebenden Kolonien werden ^J0 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York) containing ampicillin. The surviving colonies will be

-53--53-

selektiert und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht. Sie stellen die gewünschten Escherichia coli K12 HB101/pLR2-Transformanten dar.selected and examined for the expected phenotype (Amp , Tet). They represent the desired Escherichia coli K12 HB101 / pLR2 transformants.

Beispiele für weitere Plasmide und Transformanten, die unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren konstruiert werden können, gehen aus den folgenden Tabellen I und II hervor.Examples of other plasmids and transformants which can be constructed using the methods described above are shown in Tables I and II below.

UiUi

coco

NJNJ

Cncn

Tabelle I Repräsentative Plasmide Table I Representative plasmids

Beispielexample Name desname of Ifogef ähre.GrößeIfo tube.Size EscherichiaEscherichia Streptomyces-Streptomyces Nr.No. Plasmidsplasmid in kbin kb coli-Prägercoli Präger PrägerPräger 3030 pJL122pJL122 24,424.4 Anp , TetAnp, Tet MM 3131 pJL123pJL123 27,827.8 Ämp^R, Tet^R Ämp ^R , Tet ^R MM 32 .32. pJL124pJL124 21,1-24,221.1 to 24.2 Amp , TetAmp, Tet H · .H · . 3333 pJL126pJL126 9,1-10,69.1 to 10.6 Amp^R, Tet^R Amp ^R , Tet ^R MM 3434 pJL176pJL176 32,532.5 Cm^R,· Tet^R Cm ^R , · Tet ^R P*P *

PJL1200PJL1200

35,835.8

3636 PJL1201PJL1201 35,835.8 37'37 ' PJL1202PJL1202 24,424.4 3838 PJL1203PJL1203 27,827.8 3939 pJL1204pJL1204 21,1-24,221.1 to 24.2 4040 PJL1205PJL1205 10,210.2 4141 PJL1206PJL1206 9,1-10,69.1 to 10.6 4242 PJL1706PJL1706 32,532.5 4343 PJL1716PJL1716 22,522.5 4444 PJL3176PJL3176 22,522.5

Amp^R, Tet^R Amp ^R , Tet ^R

p, Tet^R Amp^R, Tet^R Amp^R, Tet^R Atrp^R, Tet^R p, Tet ^R Amp ^R , Tet ^R Amp ^R , Tet ^R Atrp ^R , Tet ^R

Ainp^R, Tet^R Qn^R, Tet^R Ainp ^R , Tet ^R Qn ^R , Tet ^R

Cm^R, Tet^R Cm ^R , Tet ^R

, Tet , Tet

M M M M M M PM M M M M M P

P P*P P *

Konstruktionconstruction

Sstl-Auslöschung von pJL120 Bglll-Auslöschung von pJLi21 Pstl-Teilauslöschung von pJL120 Xorll-Teilauslöschung von pJL120SstI quenching of pJL120 BglII quenching of pJLi21 PstI partial quenching of pJL120 XorII partial quenching of pJL120

etwa 16,6 kb Pstl und fremdartiges etwa 10,0 kb Pstl von SCP2* in die Pstl-Stelle von pBR325about 16.6 kb PstI and foreign about 10.0 kb PstI from SCP2 * into the PstI site of pBR325

SCP2 EcoRI-Stelle in die pBR325 EcoRI-StelleSCP2 EcoRI site in the pBR325 EcoRI site

Umgekehrte Orientierung von pJLi200 Sstl-Auslöschung von pJLi200 BgIII-Auslöschung von pJL1201 Pstl-Teilauslöschung pJLi200 Sall-Auslöschung von pJLi201 Xorll-Teilauslöschung von pJL1200Reverse orientation of pJLi200 Sstl quenching of pJLi200 BglII quenching of pJL1201 PstI partial quenching pJLi200 Sall quenching of pJLi201 XorII partial quenching of pJL1200

etwa 10,6 kb Pstl und fremdartiges etwa 10,0 kb Pstl von SCF2 in die Pstl-Stelle vohpBR325about 10.6 kb PstI and foreign about 10.0 kb PstI from SCF2 into the PstI site vohpBR325

etwa 16,6 kb Pstl von SCP2 in die Pstl-Stelle von pBR325about 16.6 kb PstI of SCP2 into the PstI site of pBR325

etwa 16,6 kb Pstl von SCP2* in die Pstl-Stelle von pBR325about 16.6 kb PstI of SCP2 * into the PstI site of pBR325

co cnco cn

ro cnro cn

cncn

Beispiel Nr. Example no.

4545

Name des Plasmids Name of the plasmid

PJL1800PJL1800

Ungefähre. Größe in Kb Approximate. Size in Kb

12,612.6

46 .46. pJL1801pJL1801 12,612.6 4747 PJL1900PJL1900 25,925.9 4848 OJL1902OJL1902 25,925.9 4949 PJL1905PJL1905 12,112.1 5050 pJL193pJL193 6/96.9 5151 pJL196pJL196 12,112.1 5252 pJL197pJL197 13,113.1

Tabelle I (Fortsetzung) Repräsentative Pläämide Table I (continued) Representative plaemia

Escherichia coli-Präger Escherichia coli coaters

, Cm^R , Cm ^R

Streptonyces-•Präger Streptonyces • Markers

M, Neo^J M, Neo ^J

M, Neo^J M, Neo ^J

M, Neo^f M, Neo ^f

Thio*thio *

M, NeoM, Neo

Konstruktionconstruction

Neo^R,Neo ^R ,

OlidOlid

etwa 6,0 kb Sail von SCP2 in die Sall-Stelle von pBR325about 6.0 kb sail from SCP2 to the Sall site of pBR325

Utagekehrte Orientierung von pJL1800Ground-oriented orientation of pJL1800

etwa 19,0 kb EcoRI-HindlH von pJL1201 und etwa 7,7 kb EcoRI-HindlH von pLR4about 19.0 kb of EcoRI-HindIII from pJL1201 and about 7.7 kb of EcoRI-HindIII from pLR4

etwa 19,0 kb EcoRI-HindlH von pJL1201 und etwa 7,7 kb EcoRI-Hindlll von pLR4about 19.0 kb of EcoRI-HindIII from pJL1201 and about 7.7 kb of EcoRI-HindIII from pLR4

etwa 5,4 kb EcoRI-Sall von pJLi205 und etwa 7,5 kb EeoRI-Teil-Sall von pLR4about 5.4 kb of EcoRI-SalI of pJLi205 and about 7.5 kb of EeoRI partial SalI of pLR4

etwa 1,35 kb BamHE von pLR2 in BamHI von pBR328about 1.35 kb BamHE of pLR2 in BamHI from pBR328

etwa 5,4 kb EcoRI-Sall von pJL125 in etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall von pJL192about 5.4 kb of EcoRI-SalI from pJL125 into about 7.5 kb of EcoRI partial SalI from pJL192

etwa 1 kb Bell von pJL193 in Teil-BaniHI von PJL196, derartige Orientierung, daß die CIaI-Stelle des etwa 1 kb Bcll-Eragments proximal zur Sall-Stelle des pBR322-Fragnents und daß die Sall-Stelle der etwa 1 kb Bcll-Stelle proximal zum Gen für die Neoirycinresistenz Uegtabout 1 kb Bell of pJL193 in partial BaniHI of PJL196, orientation such that the CIaI site of the approximately 1 kb BcII fragment is proximal to the Sall site of the pBR322 fragment and the Sall site is the approximately 1 kb BcII site proximal to the gene for negeocin resistance Uegt

UiUi

ω οω ο

cncn

»ο ο»Ο ο

Beispiel Name des Nr. PlasmidsExample Name of the No. Plasmid

PJL1907PJL1907

PJL198PJL198

PHJL212PHJL212

PHJL213PHJL213

Ungefähre.GrößeUngefähre.Größe

inkbinkb

13> 13,1 .13,913> 13.1 .13.9

13,913.9

Tabelle I (Fortsetzung) Repräsentative Plasmide Table I (continued) Representative plasmids

Escberichia coli-Präger Escberichia coli progester

Amp^R Amp^R Amp^R Amp ^R Amp ^R Amp ^R

Strepfcomyces-Präger Strepfcomyces- Präger

M, Neo^R,M, Neo ^R ,

M, Neo^R,M, Neo ^R ,

M, Neo^R,M, Neo ^R ,

M, Neo^R,M, Neo ^R ,

Thio'thio '

Thio*thio *

Thiothio

Thio^J Thio ^J

Konstruktionconstruction

etwa 1 kb Bell von pJL193 in Teil-BamHI von pJI#1905about 1 kb Bell of pJL193 in part BamHI of pJI # 1905

gleich wie pJL197 mit der Ausnahme, daß das Bcll-Fragment umgekehrt orientiert istsame as pJL197, except that the BclI fragment is inversely oriented

etwa 1 kb Bcll-Fragment von pJL193 in das Teil-BamHI von pJL195, Orientierung und Insertion sind gleich wie bei pJL198about 1 kb Bcl fragment from pJL193 into the partial BamHI of pJL195, orientation and insertion are the same as for pJL198

gleich wie pBJL212 mit der Ausnahme, daß S Orientierung und Insertion gleich sind · wie bei pJL197same as pBJL212 except that S orientation and insertion are the same · as for pJL197

Tabelle IITable II Beispiele für TransformantenExamples of transformants

1. Streptomyces R/pR , worin R für griseofuscus, ambofaciens, fradiae oder lividans steht und R unabhängig folgende Bedeutungen hat: pJLi22, pJL123, pJL124, pJL126, pJL176, pJLi200_f pJL1201, pJLi202, pJLi203, pJL1204, pJL1205, pJL1206, pJL1706, pJL1800, PJL1801, PJL1900, PJL1902, pJL1905, PJL196, pJL197_# PJL1907, PJL198, PHJL212 undpHJL213.1. Streptomyces R / pR, wherein R stands for griseofuscus, ambofaciens, fradiae or lividans and R independently has the following meanings: pJLi22, pJL123, pJL124, pJL126, pJL176, pJLi200 _f pJL1201, pJLi202, pJLi203, pJL1204, pJL1205, pJL1206, pJL1706 , pJL1800, PJL1801, PJL1900, PJL1902, pJL1905, PJL196, pJL197 _# PJL1907, PJL198, PHJL212 and pJJL213.

2. Escherichia coli K12 R²/pR¹, worin R² für C600R.-M,-, 294, C600 oder RV308 steht und R unabhängig obige2. Escherichia coli K12 R ² / pR ¹ , wherein R ^{2 is} C600R.-M, -, 294, C600 or RV308 and R is independently the above

Bedeutungen hat.Has meanings.

Claims (18)

ErfindungsanSprüche;Invention claims; 1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinierenden DNA-Klonierungsvektors, dadurch gekennzeichnet, daß man einen funktioneilen Startpunkt eines replikationshaltigen Restriktionsfragments der Plasmide SCP2 oder SCP2* mit ein oder mehr DNA-Sequenzen verbindet, die enthalten1. A process for the preparation of a recombinant DNA cloning vector, characterized in that one connects a functional starting point of a replication-containing restriction fragment of the plasmids SCP2 or SCP2 * with one or more DNA sequences containing (a) ein Restriktionsfragment, das einen Replikationsstartpunkt von Escherichia coli enthält,(a) a restriction fragment containing an origin of replication of Escherichia coli, (b) ein oder mehr DNA-Segmente, die eine Resistenz gegenüber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in eine Zelle von Escherichia coli transformiert sind, die gegenüber dem Antibiotikum sensitiv ist, für das eine Resistenz verliehen wird, und(b) one or more DNA segments that confer resistance to at least one antibiotic when transformed into a cell of Escherichia coli that is sensitive to the antibiotic for which resistance is conferred, and 20 (c) ein oder mehr DNA-Segmente, die unabhängig eineFigure 20 (c) One or more DNA segments independently producing one Streptomyces tra-Funktion und/oder Resistenz gegenüber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in eine Zelle von Streptomyces transformiert sind, die gegenüber dem Antibiotikum sensitiv ist,Confer Streptomyces tra function and / or resistance to at least one antibiotic when transformed into a Streptomyces cell which is sensitive to the antibiotic; 25 für welches eine Resistenz verliehen wird .25 for which a resistance is conferred. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Restriktion|fragment der Plasmide SCP2 oder SCP2* das etwa 5,4 kb EcpRI-Sail-Fragment, etwa 6,0 kb Sail-Fragment, etwa 19 kb EcoRI-Hindlll-Fragment oder etwa 31 kb EcoRI-Fragment verwendet.2. Method according to item 1, characterized in that, as a restriction fragment of the plasmids SCP2 or SCP2 *, the about 5.4 kb EcpRI-Sail fragment, about 6.0 kb Sail fragment, about 19 kb EcoRI-HindIII Fragment or about 31 kb EcoRI fragment used. 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Replikationsstartpunkt von Escherichia coli den pBR322-Replikationsstartpunkt, pBR324-Replikätionsstartpunkt, pBR325-Replikationsstartpunkt, pBR327-Replikationsstartpunkt oder pBR328-Replikationsstartpunkt verwendet.3. Method according to item 1 or 2, characterized in that the replication origin of Escherichia coli used is the pBR322 origin of replication, pBR324 replication origin, pBR325 origin of replication, pBR327 origin of replication or pBR328 origin of replication. 4. Verfahren nach Punkt 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als ein oder mehr DNA-Segmente, die für eine Resistenz in Escherichia coli sorgen, DNA-Segmente verwendet, die eine Resistenz gegenüber Ampicillin,4. Method according to item 1, 2 or 3, characterized in that, as one or more DNA segments providing resistance in Escherichia coli, DNA segments are used which have resistance to ampicillin, 5 Chloramphenicol oder Tetracyclin verleihen.5 chloramphenicol or tetracycline confer. 5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als ein oder mehr DNA-Segmente, die für eine Resistenz in Streptomyces sorgen, DNA-Segmente verwendet, die eine Resistenz gegenüber Neomycin oder Thiostrepton verleihen.5. The method according to any one of items 1 to 4, characterized in that one uses as one or more DNA segments that provide resistance in Streptomyces, DNA segments that confer resistance to neomycin or thiostrepton. 6. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als DNA-Segment, das eine Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleiht, das etwa 7,7 kb EcoRI-Hindlll-Restriktionsfragment des Plasmids pJL192, das etwa 7,7 kb EcoRI-Hindlll-Restriktionsfragment des Plasmids pLR4, das etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-Restriktionsfragment des Plasmids pLR4, das etwa 1,35 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLR2 oder das etwa 1 kb Bcll-Restriktionsfragment des Plasmids pJL193 verwendet.6. The method according to any one of items 1 to 5, characterized in that, as a DNA segment which confers resistance to an antibiotic, the approximately 7.7 kb EcoRI-HindIII restriction fragment of the plasmid pJL192, which is about 7.7 kb EcoRI-HindIII restriction fragment of plasmid pLR4 using about 7.5 kb EcoRI partial SalI restriction fragment of plasmid pLR4, the about 1.35 kb BamHI restriction fragment of plasmid pLR2 or the about 1 kb BclI restriction fragment of plasmid pJL193 , 7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Plasmide pJL180, pJLi81, pJL125, pJL190, pJL192, pJLi95, pJL199, pJL122, pJL123, PJL124, pJL126, pJL176, pJLi200, pJL1201, pJLi020, pJL1203, PJL1204, pJLi205, pJL1206, pJLi706, pJL1800, PJL1801, PJL1900, pJL1902, pJL1905, pJL193, pJL196, pJL-197, pJL198, pHJL212, pHJL213 oder pJLi907 herstellt.7. Method according to one of the items 1 to 6, characterized in that the plasmids pJL180, pJLi81, pJL125, pJL190, pJL192, pJLi95, pJL199, pJL122, pJL123, PJL124, pJL126, pJL176, pJLi200, pJL1201, pJLi020, pJL1203, PJL1204, pJLi205, pJL1206, pJLi706, pJL1800, PJL1801, PJL1900, pJL1902, pJL1905, pJL193, pJL196, pJL-197, pJL198, pHJL212, pHJL213 or pJLi907. 8. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5 zur Herstellung der Plasmide pJL120 und pJL121, dadurch gekennzeichnet, daß man die EcoRI-Verdauungsprodukte der Plas-8. Method according to one of the items 1 to 5 for the preparation of the plasmids pJL120 and pJL121, characterized in that the EcoRI digestion products of the plasma ³⁵ mide SCP* und pBR325 verbindet. ³⁵ mide SCP * and pBR325 connects. -6 ΟΙ 9. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5 zur Herstellung der Plasmide pJL180 und pJL181, dadurch gekennzeichnet, daß man das etwa 6,0 kb Sall-Verdauungsprodukt des Plasmids SCP* mit dem Sall-Verdauungsprodukt des Plasmids pBR325 verbindet.9. Method according to one of the items 1 to 5 for the preparation of the plasmids pJL180 and pJL181, characterized in that one connects the approximately 6.0 kb Sall digestion product of the plasmid SCP * with the Sall digestion product of the plasmid pBR325. 10. Verfahren nach Punkt 8 zur Herstellung des Plasmids pJL125, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Teil-Sall-Verdauungsprodukt des Plasmids pJL121 einer Selbst-10. Method according to item 8 for the preparation of the plasmid pJL125, characterized in that a partial SalI digestion product of the plasmid pJL121 of a self 10 Verknüpfung unterzieht.10 links. 11. Verfahren nach Punkt 8 zur Herstellung des Plasmids pJL190, dadurch gekennzeichnet, daß man das etwa 19,0 kb EcoRI-Hindlll-Verdauungsprodukt des Plasmids pJL121 mit dem etwa 7,7 kb EcoRI-Hindlll-Fragment des Plasmids pLR4 verbindet.11. The method according to item 8 for the preparation of the plasmid pJL190, characterized in that one connects the approximately 19.0 kb EcoRI-HindIII digestion product of the plasmid pJL121 with the approximately 7.7 kb EcoRI-HindIII fragment of the plasmid pLR4. 12. Verfahren nach Punkt 11 zur Isolierung des Plasmids pJL192, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen von Streptomyces, vorzugsweise Zellen der Species griseofuscus, die mit dem Plasmid pJL190 transformiert worden sind, bezüglich einer hohen Neomycinresistenz selektiert und untersucht und das Plasmid pJL192 aus den resistenten12. The method according to item 11 for the isolation of the plasmid pJL192, characterized in that cells of Streptomyces, preferably cells of the species griseofuscus, which have been transformed with the plasmid pJL190, selected for high neomycin resistance and examined and the plasmid pJL192 from the resistant Zellen isoliert. 25Isolated cells. 25 13. Verfahren nach Punkt 10 zur Herstellung des Plasmids pJL195, dadurch gekennzeichnet, daß man das etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Fragment des Plasmids pJL125 mit dem etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-Fragment des Plasmids pLR413. The method according to item 10 for the preparation of the plasmid pJL195, characterized in that the approximately 5.4 kb EcoRI-Sall fragment of the plasmid pJL125 with the approximately 7.5 kb EcoRI partial Sall fragment of the plasmid pLR4 30 verbindet.30 connects. 14. Verfahren nach Punkt 13 zur Isolierung des Plasmids pJLi99, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen von Streptomyces, vorzugsweise Zellen der Species griseofuscus, die mit dem Plasmid pJLi95 transformiert worden sind, bezüglich einer hohen Neomycinresistenz selektiert und untersucht und das Plasmid pJLi99 aus den resistenten Zellen isoliert.14. The method according to item 13 for the isolation of the plasmid pJLi99, characterized in that cells of Streptomyces, preferably cells of the species griseofuscus, which have been transformed with the plasmid pJLi95, selected for high neomycin resistance and examined and the plasmid pJLi99 from the resistant Isolated cells. 15. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5 zur Herstellung des Plasmids pJL114, dadurch gekennzeichnet, daß man das Teil-BamHI-Verdauungsprodukt des Plasmids SCP2 mit dem etwa 4,4 kb BamHI-Fragment des Plasmids pBR32215. The method according to any one of items 1 to 5 for the preparation of the plasmid pJL114, characterized in that the partial BamHI digest of the plasmid SCP2 with the approximately 4.4 kb BamHI fragment of the plasmid pBR322 5 verbindet.5 connects. 16. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5 zur Herstellung des Plasmids pJLi93, dadurch gekennzeichnet, daß man das BamHI-Verdauungsprodukt des Plasmids pBR328 mit dem etwa 1,35 kb-Restriktionsfragment des Plasmids pLR2 verbindet.16. The method according to any one of items 1 to 5 for the preparation of the plasmid pJLi93, characterized in that one connects the BamHI digestion product of the plasmid pBR328 with the approximately 1.35 kb restriction fragment of the plasmid pLR2. 17. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5 zur Herstellung des Plasmids pJL196, dadurch gekennzeichnet, daß man das etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-Verdauungsprodukt
des Plasmids pJL192 mit dem etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Restriktionsfragment des Plasmids pJL125 verbindet.17. The method according to any one of items 1 to 5 for the preparation of the plasmid pJL196, characterized in that one comprises about 7.5 kb EcoRI partial Sall digestion product
of plasmid pJL192 with the approximately 5.4 kb EcoRI-Sall restriction fragment of plasmid pJL125. 18. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5 zur Herstellung der Plasmide pJLi97 und pJL198, dadurch gekennzeichnet, daß man das etwa 1 kb Bcll-Restriktionsfragment des Plasmids pJL193 mit dem Teil-BamHI-Verdauungsprodukt des Plasmids pJL196 verbindet.18. The method according to any one of items 1 to 5 for the preparation of the plasmids pJLi97 and pJL198, characterized in that one connects the approximately 1 kb BcII restriction fragment of the plasmid pJL193 with the partial BamHI digest of the plasmid pJL196. 19. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5 zur Herstellung der Plasmide pHJL212 und pHJL213, dadurch gekennzeichnet, daß man das etwa 1 kb Bcll-Restriktionsfragment des Plasmids pJL193 mit dem Teil-BamHI-Verdauungsprodukt des Plasmids pJL195 verbindet.19. The method according to any one of items 1 to 5 for the preparation of plasmids pHJL212 and pHJL213, characterized in that one connects the approximately 1 kb BcII restriction fragment of the plasmid pJL193 with the partial BamHI digest of the plasmid pJL195.