DD207264A1 - Verfahren und elektrode zur konzentrationsbestimmung von stoffwechselprodukten in untersuchungsfluessigkeiten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Konzentrationsbestimmung von Stoffwechselprodukten in unterschiedlichen Massloesungen mit einem elektornischen Geraet und einer amperometrischen Enzymelektrode. Eas hat zum Ziel, ohne Veraenderungen an Enzymsensor oder Messanordnung nacheinander der Serien verschiedener physiologischer Fluessigkeiten im Wechseleinfach und oekonomisch und geraetetechnisch guenstig zu bestimmen. Die Erfindung loest die Aufgabe mittels Polarisationsumschaltung der Elektrode ueber das elektronische Geraet, ohne Verwendung einer zusaetzlichen Elektrode, Differenzmessung oder spezielle selektive Membran, indem je nach Art der zu messenden Fluessigkeiten das geeignetste Messsignal ueber die Elektrodenpolarisation ausgewaehlt wird und der maximale Anstieg der Strom-Zeit-Kurve selbst oder ein stationaerer Stromwert als Messsignal dient. Die amperometrische Enzymelektrode ist in an sich bekannter Weise aufgebaut und befindet sich in thermostatierter, geruehrter Messzelle oder Durchflusskammer.

Description

Verfahren und Elektrode 2ur Sonzentrationsbestlnrcnnng von Stoffwechselprodukten. in Ilntersuchurigsflüssigkeiten«

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung· betrifft ein-elektrochemisches Verfahren über eine Elektrode zur Bestimmung von Stoffwechselprodukten vor allem in biologischen Materialien wie verdünntem Serum, Plasma ode? _r Vollblut und in Urin ohne Veränderung des Sensors, Sie eignet sich für die Konzentrationsbestimmung z. B. von G-lukcse im mikrobiologischen und im klinischen Laboratorium besonders bei häufiger Änderung der üntersuchungsaaterialien (2. B* Vollblut/Urin).

Charakteristik der bekannten technischen Lo*sangen

3nzymel©ktroden und komplette Gerätevarianten mit solchen Sensoren: gewannen in den letzten Jahren zunehmende Bedsötung in verschiedenen Bereichen der angewandten analytischen' Chemie (klAöisch-chemische Laboratorien, Labors der liahiungsgüterwirtschaft etc.

Б. Gray, M. Keyes, B. ,"atson; Änalyt. Chem. 49, 1067 (1977)), Dennoch sind Störungen durch verschiedene Komponenten der entsprechenden Untersuchungsflüssigkeiten nicht auszuschließen* die meist durch das elektrochemische Prinzip selbst bedingt sind (Höhe des Gxydationspotentials) in Verbindung mit den iermeabilitätseigenschaften der eingesetzten βübstrat- bzw. cpfiib st rat durchlässigen Membran. Dias läßt sich vermeiden durch

a) Auswahl des Potentials des elektrochemischen Verfahrens

b) Auswahl des Meßprinzips (kinetisch, -Mf^eienzmessung)

c) Auswahl der entsprechenden Membranen (möglichst nur durchlässig für die nachzuweisende llomponeirb-ß}

Bei Messungen mit Enzymelektroden z. 3. auf der Basis von Oxidoreduktasen ist die Variationsbreite nach a) nur begrenzt möglich, da sie durch die Messung' der nachzuweisenden Komponente Jjz» 3. Op, iUQp) bereits limitiert ist. Bei der anodischen H₃O₂-Messung (s. B. bei + 0,6V vs. Ag/AgQl) erfaßt man jedoch zahlreiche Störsubstanzen z. 3. in verdünnten Bluten. Über b) lassen sich dabei wesentliche Verbesserungen erzielen:

So ergibt die kinetische Messung der maximalen Stromänderungsgeschwindigkeit auch in komplexen IJntersüchungsflü'ssigkeiten wie Blut richtige und reproduzierbare Ergebnisse s. 3. von Harnsäure oder Glukose über E₀O₀ (P. Scheller et al., ББЕ-Pat ent schrift

Біпе kompliziertere Losung stellt "die Differenzmeö-sung mit zwei Elektroden dar (ЗНБ-Patentschrift 1593 235). -"Зіае katodische O_n -Messung hinter der ЗпзѵатешЪran bei Sjzjss-lektroden z. 3. mit Oxidoreduktasen bringt swar Torteile bezüg lich der ~3rfassuiig von 'Störsubstanzen (z. B. bei einem' £atodenpotential von - 0,5 7 vs. Ag/AgCl) bzw. durch den Einsatz einer nur 0«-permeablen ИетЬгап vor der 2Catode entsprechend a), jedoch, ist hierbei auf gleichen ö^-G-eÜäit inilsrtsrsuc-äangs^lü'ssigkeit und Vorlage (Terdüiinungs™-) lo^xaig 'sü achten,was auch durch Siüleiten von G in die lueßflüssigkeit, z. -B. ^:3itutV^: nur Ъegrenst möglich ist (2. tent-seBäcift 127 361). Dennoch stellt die 'К с): еізШі wicht igen Schritt zur Verbesserung dör- analj/^tisehen 'Quali#ät^¥ Messungen dar, ѵ?іѳ 4er Einsät ζ ζ, 3-. einer H^O^-durchlüssigen Membran zeigt (US-Patentschrift 3,979 274) Jedoch uQ£tg#igt·-man je nach i-reBflüssigkeit-einen"Бansor mit spesie-llem^Membransysteia, '3, 3. für die Messung "Ѵ-Фа G-iukose in Blut eine '-BUO^-sensitive ShsTmeiektröäe-f hingegen -für genaue *Шзsengen in Urin eine O₅-sensitive 3nz^ßLeXo^iiouQ mi z, 3.·" 'einer -zusätzlichen "rol^äthylenmembran, Aufgliund-sol-

clier Storsubstanzen wie Askorbinsäure ist eine Glukosemessung in Urin besonders bei kleinen Glukosekonzentrationen ohne diese zusätsuche Membran nicht möglich (1Ί. Jänchen st al,, 2. med. Labor.-Diagn. 21, 325-332 (1930)). Andererseits wird eine Blutmessung über den 0_o-Verbrauch, trotz zusätzlicher ЫетЬ ran durch die 0«-Bindungskapazität der"Erythrozyten verfälscht.

Ss ist daher Verständlich, daß verschiedene Geräte mit Ensymelekt roden z. B. für Glukose nur für Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum oder Plasma geeignet sind, nicht jedoch für Flüssigkeiten wie Urin.

Ziel der Erfindung;

Das Ziel der Erfindung besteht darin, Verfahren und Slektrodenzur elektrochemischen Sonzentrationsbestimmung von Stoffv/echselprodukten in%ghjgipj.pgisehen oder mikrobiologischen besungen zu entwickeln, die unabhängig von der unterschiedlichen Zusammensetzung dieser Losungen eine· Messung mit einem Sensor gestatten, ohne diesen zu verändern oder auszutauschen. Dadurch wird eine breitere und ökonomischere Anwendbarkeit solcher Sensoren bzw. von Geräten mit solchen Sensoren bewirkt.

Darlegung; des . Wesens der Erfindung.

Auf gab©...dejr Erfindung ist es, ein 7er fahr en _ zur-Bestimmung von vorwiegend biochemischen Substanzen mit modifizierter Og-Elektroue bzw. mit Ensymelektroden oder anderen amperometrlscben Sensoren zu entwickeln, das auf der Grundlage einer Strommessung ohne Spezialmembran oder Differenzmessung eine jiessTa&g in unterschiedlichen Flüssigkeit en nacheinander gestattet, was -bisher nur durch. Wechsel des Sensors- oder einen, zweiten Sensor nacheinander möglich war· Die. Aufgabe wird^ifflit einem Verfahren ^щ? elektrochemischen Sonz^afeagat i on so est iramung von St of fwechs eiprodukt en mittels mouixisierter Sauerstoffelektrode roder Snsymelektrode und elektronischem Gerät erfindun£Sf?eiaäjS.dadurch gelöst, däJ3

unterschiedliche Untersuchungsflüssigkeiten ohne Veränderung am Sensor oder Verwendung einer zweiten Elektrode durch Umschalten der Polarisationsspannung der modifizierten Sauerstoffelektrode oder Enzymelektrode der stationäre Strom oder der Anstieg der Strom-Zeit-Kurve nach Zugabe der zu untersuchenden Probe gemessen wird, während die Elektrode in bekannter Weise in eine temperierte Meßzelle oder in eine Durchflußkammer eintaucht. Hierbei erfolgt die Strommessung zweckmä-ßigerweise kinetisch.

Je nach Slektrodenpolarisation und Untersuchungsmaterial wird die wachsende HpOp-Konsentration oder der Op-Abfall gemessen (über den entsprechenden maximalen Inodenstromanstieg/ Zeiteinheit bei positiver Elektrodenpolarisation, z. B. + 600 mT gegen eine Ag/AgCL Gegen- und Vergleichselektrode oder gegen den entsprechenden maximalen Satodenstromabfall/ Seiteinheit bei negativer Slektrodenpolarisation, z.B. - 600 mV).

Бег MöStfert stellt sich bei diesem KeBprinzip bei positiver !Polarisation vorwiegend dadurch richtig ein, daß störende, сигеЖ die unspesif ische Membran zur Elektrode gelangende elektrochemisch aktive Substanzen den Sensor später erreichen als das nachzuweisende HpOp» das proportional dem zu bestimmendenenzymatisch umgesetzten Substrat entsteht. Die Elektxöue zur Durchführung des Verfahrens wird erfindungsgemaß mit einer Celluloseacetatfolie von 10 bis 100/um Sicke "von einer Snzymmembran begrenzt, hinter der das Enzym in гттасЩіізі ert er Form oder gelöst liegt. Zur- Arbeitselektrode hin ist das Enzym mit einer weiteren Celluloeeaoetatfolie abgetrennt. Die Arfeeiteelelitrode besteht aus Pt, Au, Glaskohle, Graphit oder anderen elektrisch leitenden: Materialien.

Die Ceiluloseacetatfolie läßt H₂O₂, ^Q ₂ und weitere niedermoleku3»are Stoffe permeiren, nicht jedoch höhermdlekulare StofCfisWje. 55·.. 3.· Proteine. Als Enzyme dienen vorwiegend--Oxidarsouktasen, also O₂-verbrauchende bzTfi Щй^ -erzeugende Enzyme^ beispielsweise Glukoseoxidase oder Uricase oder En-

zymsysteme (Zellen, Organellen, mehrere Enzyme). Ist nach Art der zu untersuchenden Lösung die Notwendigkeit einer H₂O₂-Messung durch zusätzliche Sinflußfaktoren nicht gegeben, so kann man durch Umschalten des Elektrodenpotentials am Enzymelektroden-Meßgerät sofort dan Og-Aofäll messen ohne zusätzlichen Membranwechsel am Sensor, wobei bei dem negativen Potential die bei positiver Polarisation störenden Substanzen elektrochemisch inaktiv sind«

Ausfuhxungsb e i sp iele

Die Erfindung soll nachstehend an zwei Ausführungsbeispielen erläutert werden:

'Beispiel -1 ϊ

Elektrode und Meßgerät:

Das Meßgerät zur elektrochemischen Slukosebestimmung vorwiegend in biologischen Materialien hat als Sensor eine Enzymelektrode mit immobilisierter (zum Beispiel immobilisiert in Gelatine) Glukoseoxidase. Fach Präparation der Ensynmembran wird diese vor einer Elektrode nach Art einer üblichen CU-Stabmeßzelle befestigt. Dazu wird ein rundes Enzyrmemb.rjm»- stüek von einigen mm Durchmesser zwischen zwei Gelluloseacetatfolien (1β/um Dicke) dergestalt gespannt, daß es vor der Arbeltselektrode (Pt-Draht mit .0,5 щщ Durchmesser) fixiert, von dieser aber durch die hintere Gelluloseacetatfolie getrennt wird. Es ergibt sich somit folgender Aufbau:

Meßlöfinmg/ Celluloseacetatfolie 1/ immobilisierte Glukoseoxidase/ Gelluloseacetatfolie 2/ Pt-Draht-Elektrode

Die mechanische Spannung des Membransystems-wird- durch straffe halterung der zwei Gelluloseacetatfolien zwischen Slek- - und -außenmantel gesichert sowie durch Druck

Stabelektrode gegen das Membransystern. 2ur

Stabelektrode gehört eine Ag/AgCl.Gegen- bzw. Heferenzelektro4e,_r die in einer hinter den Membranen befindlichen XCl-

Lösung das Aufrechterbalten der Polarisationsspannung der Pt-Elektrode gewährleistet. Die gesamte Elektrode ist fest verbunden mit einer Meßzelle dergestalt, daß die Stirnseite der Elektrode mit Membransystem und dahinterliegendem Slektrodendraht in die Meßzellenflüssigkeit hineinragen. Die Meßzelle wird temperiert (25 ⁰G) und enthält eine Vorrichtung zum Hühren der Meßflüssigkeit (2 ml Grundlösung und zugegebene Meßlösung*50 /ul unverdünnt oder 500 /ul 1 : 10 verdünnt) .

Die Dosierung von G-rundlösung und Meßlösung erfolgt manuell oder mechanisiert. Beide Lösungen werden im Wechsel nach der vorangegangenen.Messung zugegeben, dazwischen erfolgt eine Spülung der Meßzelle mit 2 ml G-rundlösung.

Die Elektrode ist an ein elektronisches Meßgerät angeschlossen, das die Arbeitselektrode wahlweise über einen Umschalter auf +600 mV oder - 600 mY gegenüber der Ag/AgCl-Gegenelektrode" polarisiert, die Strom-Zeit-Kurve differenziert und die maxiaale 5trom/Seit-änderung sowohl digital anzeigt als auch еілѳ analoge Schreiberauswertung gestattet»

iießvorgang:

Die Messung soll zunächst einer Bestimmung von Blutglukose, danach, einer Bestimmung- von Glukose in Urin dienen. Dazu stellt man am bereits eingeschalteten Meßgerät und angeschlossener präparierter Elektrode eine Polarisation von + 600-mV der Arbeitselektrode ein und wartet, bis der Ö-v/ert der Anzeige "erreicht ist. In der Meßzelle befindet sich die Grundlösung - xhosphatpuffer mit Zusätzen zur Gewährleistung des gleichen kolloidosmotischen Druckes wie bei der Blut-Meß-lösung. Hierauf erneuert man die Grundlösung (2 ml) und gibt 50/Ul eines Blutes zu. Eine Zugabe von entsprechend mehr verdünnter Blutlösung, wie Oxalat/IFluorid-Lcsung, ist möglich. Eine direkte Ablesung des Meßwertes an der Digitalanzeige des Gerätes erfolgt durch vorherige Sichung mit Sichstandards und entsprechende Einstellung der Anzeige über ein Potentiometer in mmol/1. Nach Messung der Blutproben (ca.

1 min топ Messung zu Messung) sollen unmittelbar genaue Uringlukoseme-ssung-en durchgeführt v/erden. Dazu schältet man das Gerät über einen Umschalter auf - 6CC m7 Polarisationsspannung der Arbeitselektröde um und wartet erneut auf Einstellung des Q-Wertes (ca. 5·.»10 min). Hierauf wird nach Neueichung diö -Messung von Urinen in analoger Weise wie für¹ Blut aügegebtn vorgenommen, wobei ebenfalls eine Prooenvorverdünnung möglich bzw, bei hohen Grlukosegehalten nötig ist. ITach Durchführung der Messungen der verschiedenen Urinproben kann nach entsprechender Umschaltung am Heßgerät erneut eine Messung im Blut erfolgen.

BeisOiel 2:

und Gießgerät:

Eine ilikromeßkammer (73B lietra Hadebeul) wird so präpariert, daß ein 31e3ctrodenaufbau wie im Beispiel 1. entsteh

t:

über den" Spannring wird eine Celluloseacetatfolie aufgebracht, darübei "eine G-lukoseosiidase-IBnsymmembran von ca. 3 sä Durchmesser gelegt und darüber eine weitere 'Celluloseacetat^olie (16/ua Dicke) gespannt. Der so präparierte Hing wird in die ließzellenöffnung eingeführt. Danach wird eine KCl-Lösung. aufgetropft, der Elelrtrodenkörper aufgesetzt und mittels einer Überwurfmutter angedrückt.

Die Slejctrode wird an das im Beispiel 1 beschriebene elektronische Meßgerät angeschlossen und die Polarisationsspannung so gewählt, daJ die Pt-Indikatorelektrode auf + β.ΟΟ m? vs. Ag/AgCl gebracht wird (HpO_p-Messung).

Meßvorgang:

nach Temperierang auf 25 ⁰C wird diese Meßzelle, "mit Elektrode über eine peristaltische Pumpe an einen automatischen Probespeicher angeschlossen, in dem sich Blutproben (1 : 10 bis 1 : 5Q verdünnt) "üefindan. Diese werden abwechselnd mit der Spüllösung "(Phosphatpuffer mit verschiedenen Zusätzen) in das Durchflußsystem eingegeben und über einen Schreiber,, der

an das Gerät angeschlossen ist, gemessen (Strom-2eit-Kurve)· IJach Abarbeitung der Blutproben stellt man das Meßgerät auf - 600 mV Polarisationsspannung der Blektrode um und mißt nach ca. 5 - Ю min verschiedene Urinproben (ebenfalls 1 : bis 1 : 50 verdünnt) im Durchflußsystem.·Diese Verfahrensweise läßt sich beliebig oft fortführen.

Claims (2)

1. Erfindungsanspruch

   1. Verfahren zur elektrochemischen Konzentrationsbestimmung von Stoffwechseiprodukten mittels modifizierter Sauerstoff elektrode und elektrochemischem Gerät _t dadurch gekennzeichnet, daß nacheinander unterschiedliche Untersuchangsflüssigkeiten ohne 7eränderungen am Sensor oder Verwendung einer zweiten Elektrode durch Umschalten der Polarisationsspannung über den stationären Strom oder den Anstieg der Strom-Zeit-Kurre nach Zugabe der zu untersuchenden Probe gemessen werden, während die Elektrode in bekannter Weise in eine temperierte Meßzelle mit Rührer oder in eine Durchflußkammer hineinragt.
2. 2. Sauerstoffelektrode zur Durchführung des Verfahrens nach Pkt. 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sauerstoffelektrode mit einer Gelluloseacetatfolie топ 10 bis 100/um Dicke тог der Enzymmembran bespannt ist, hinter der das Snsym in immobilisierter ?orm oder gelöst тогliegt, das zur Ärbeitselektroda hin mit einer weiteren Celluloseacetatfolie abgetrennt ist, wobei die irbeitselektrode aas Ptj Aa, Glaskohle, Graphit oder anderen elektrisch leitenden Materialien besteht.