DD202620A1 - Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen behandlung pektinhaltiger fluessigkeiten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen Behandlung von pektinhaltigen Fluessigkeiten, vorzugsweise von Frucht- und Gemuesesaeften. Das Verfahren gestattet die Herstellung von klaren Saeften und von hochwertigen Saftkonzentraten. Darueber hinaus ist es auch zur Herstellung von Pektinhydrolysaten, die bestimmte oligomere Galakturonsaeuren enthalten, einsetzbar. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahrenbedingungen zur Erhoehung der Wirksamkeit von traegerfixierten unloeslichen pektinolytischen Enzymen fuer den kontinuierlichen Pektinabbau aufzuzeigen. Erfindungsgemaess wird ein auf einem Traeger fixiertes Enzymgemisch mit einem Aktivitaetsverhaeltnis von 00,2 bis 2,0 vorzugsweise 0,5 bis 1,0 der Hauptwirkkomponenten Polygalakturonase und Pektinesterase eingesetzt.

Description

Erfinder: Dr. Willy Bock

Hans-Joachim Schawaller Dr. Christian Flemraing Dr. Anton Gabert

Verfahren zur kontinuierliches enzymatischen Behandlung

pektinhaltiger Flüssigkeiten

Anwendungsgebiet der Brfinduag

Pektinhaltige Flüssigkeitea, vorzugsweise Frucht- und Gemüsesäfte, weisen aufgrund makromolekularer Pektininhaltsstoffe eine relativ hohe Viskosität auf« Diese erschwert bzw. verhindert die Abtrennung von kolloiden Trübbestandteilen, das sogenannte Klären, die Filtration zu klaren Säften und insbesondere die Produktion τοη hochwertigen Saftkonzentraten durch Wasserverdampfung für die Herstellung von Getränken sowie das Vermischen von Säften bzw. Saftkonzentraten mit Alkohol ohne Niederschlagsbildung für die Herstellung von speziellen Spirituosen.

In all diesen Fällen ist ein Pektinabbau bis zu einer bestimmten Restviskosität erforderlich, der durch das erfindungsgemäße Verfahren gewährleistet wird. Darüber hinaus kann das Verfahren auch zur Herstellung von Pektinhydrolysaten, die bestimmte oligomere Galakturonsäuren, beispielsweise für analytische Zwecke, enthalten, eingesetzt werden·

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Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Klärung bzw. Depektinisierung von Fruchtsäften und die Herstellung von Pektinhydrolysaten erfolgt in der Regel durch die behandlung der Substrate mit pektinolytischen Easympräparatexs aus Schirme!pilzen (Aspergillus spec) Tor allem mittels sogenannter Pektinasen oder Klärenzyme. Der erforderliche Pektinabbau wird gewährleistet durch die Hauptwirkkomponenten Polygalakturonasen (EC 3.2*1.15) und Pektinesterasen (EC 3.1.1.11). Pektinesterasen sind bekanntlich allein zum Pektinabbau nicht in der Lage. Gebräuchlich sind verschiedene lösliche Klärenzyme, die bisher hauptsächlich in diskontinuierlichen technischen Prozessen des Pektinabbaus eingesetzt werden.

Der Einfluß und die Bedeutung der ^Hauptwirkkomponenten für einzelne pektinolytische Enzymsysteme ist unter definierten Substratbedingungen weitgehend bekannt. Außer den Klärenzymen sind aber auch noch Maiseheenzyme und Mazerier enzyme, sogenannte Mazerasen, handelsüblich* Für den ratio neuen Einsatz der pektinolytischen Enzyme ergeben sich für den Fachmann insbesondere Probleme aus der Vielfalt der angebotenen Handelspräparate, die wiederum aus mehreren Sinze!enzymen mit unterschiedlicher Aktivität bestehen und verschiedene Pektinpolysaccharide als Substrate bevorzugen.

Bekannt ist auch die Modifizierung von löslichen pektinolytischen Enzymen durch Zumischung einer anderen Enzym- ^ komponente» Dazu gehört der Zusatz von Pektinesterase zur Wirkungsverstärkung eines Enzympräparates (US P 2 457 560) bei der Hydrolyse der glykosidischen Bindung von PoIygalakturoniden in einer Menge von etwa 0,085 bis etwa 2,360 Teilen pro Teil Enzympräparat. Gesicherte Kenntnisse über den Einfluß und die Bedeutung von bestimmten Aktivitätsverhältnissen der zum Einsatz kommenden Enzyme für eine kontinuierliche ensymatische Behandlung pektinhaltiger Flüssigkeiten sind daraus jedoch nicht zu entnehmen«

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Das "betrifft sowohl die Art und Zusammensetzung der Ausgangsenzympräparate als auch ihre Aktivitäten und Einsatzbedingungen.

Bei den vorgeschlagenen kontinuierlichen Verfahren zum Pektinabbau.werden handelsübliche Kläreaayme aus Schimmelpilzen ;ln löslicher oder in trägerfixierter Form verwendet, wobei die zu behandelnden pektinhaltigen Flüssigkeiten, wie Frucktsafte oder Gemüsesäfte oder Pektinsäurelösungen, eine Festbettkolonne oder einen gerührten Reaktor bzw. Kaskadenreaktor, gesteuert über eine Viskositätsmessung, durchfließen.

Die vorgeschlagenen kontinuierlichen Verfahren, hängen generell hinsichtlich ihrer Effektivität nach Xeistung pro Zeiteinheit und nach dem erforderlichen Anlagenaufwand entscheidend von der Wirksamkeit des enzymatischen Pektinabbaus ab. Dies trifft sowohl für den Einsatz löslicher Enzyme als auch in weit stärkerem Maße für den Einsatz an unlösliche Trägermaterialien fixierter Enzyme zu. Bei letzteren ist das im löslichen Zustand .vorhandene -Zusammenwirken der jeweils eingesetzten Einzelenzyme und die aufeinander abgestimmte Wirksamkeit beim Pektinabbau, wie umfassende Untersuchungen gezeigt haben, nicht ohne weiteres gewährleistet. Ursachen dafür sind verschiedene Einflußbedingungen, die mit der Trägerfixierung der pektinolytischen Enzyme im Zusammenhang stehen, wie eine Substratbehinderung und/oder eine Veränderung in der Spaltungsweise in Abhängigkeit von der Porosität des Trägermaterials, der Fixierungsart und der spezifischen Aktivität der Enzym-Trägerkomplexe. Der bisher stets auftretende generelle Effektivitätsverlust der eingesetzten trägerfixierten Enzyme gegenüber den lSsliehen Enzymen muß daher duröh eine möglichst hohe Wirksamkeit beim Pektinabbau sowie durch die Mehrfachnutzung der Enzym-Trägerkomplexe kompensiert werden.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, in einem Enzymreaktor, einen mögliehst schnellen kontinuierlichen Pektinabbau in pektinhal-

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tigen Flüssigkeiten mit eisern trägerfixierten unlöslichen pektinolytischen Enzymgemisch zu erreichen,

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufagbe zugrunde₅ Terfahreasoediiygungen aufzuzeigen, welche die Wirksamkeit der trägerfixierten unlöslichen pektinolytischen Enzyme beim kontinuierlichen Pektinabbau so erhöhen, daß ihre Anwendung in einem Enzymreaktor die erforderliche Reaktionsgeschwindigkeit an den zu behandelnden Säften oder Pektinl§sungen gewährleisten.

Es wurde gefunden, daß dies erreicht wird, wenn der Pektinabbau in pektinhaltigen Flüssigkeiten, vorzugsweise Frucht- und Gemüsesäften sowie Pektinlösungen, mit einem trägerfixie; ten unlöslichen pektinolytischen Enzymgemisch, welches ein Aktivitätsverhältnis der Hauptwirkkomponenten Polygalakturonaaen (EC 3.2.1.15) und Poktinesterasen (SC 3,1.1.11) von 0,2 bis 2,0, Torzugsweise 0,5 bis 1,0, aufweist, unter turbulenten Strömungsbedingungen vorgenommen wird«

Derartig hochwirksame Polygalkturonase/Pektinesterase-Aktivitätsverhältnisse werden bisher von handelsüblichen pektinolytischen Enzympräparaten aus Schimmelpilzen nicht erreicht. Die bisher bekannten Arbeitsweisen beruhen daher auf einer gegenüber der tatsächlich erfindungsgemäß erreichbaren Geschwindigkeit beim Pektinabbau auf einer gering ren Wirksamkeit der gebräuchlichen Enzympräparate·

Zur Festlegung der erfindungsgeraäß entscheidenden Aktivitätsverhältnisse wird die Aktivität beider Hauptwirkkomponenten bei pH 4,5 und 30 ⁰C in internationalen Enzymeinheiten mit standardisierten Substraten bestimmt. Diese standardisierten Substrate sind für Polygalakturonase aus Aspergillus spec, gereinigte Citruspektinsäure mit einem Galakturonangehalt von mindestens 80 #, einem Aschegehalt kleiner als 1,0 fo und einer Grenzviskositätszahl [^J von 75 bis 100 ml pro g Galakturonan sowie für Pektinesterase verschie-

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dener Herkunft gereinigtes Citruspektin mit einem Veresterungsgrad von 55 bis 65 %.

Für die Bestimmung der Aktivität der Polygalakturonase werden eine 1 $ige'Pektinsäurelösung, bezogen auf Galakturonaa, in 0,1 Citratpuffer von pH 4,5 verwendet und die freigesetzten reduzierenden Endgruppen in mol pro min im linearen Reaktionsbereich nach, der jodoraetrischen Methode durch Titration mit 0,025 N Natriumthiosulfat-Lösung quantitativ ermittelt.

Zur Bestimmung der Aktivität der Pektinesterase werden eine 0,5 %ige Pektinlösung bezogen auf Galakturonan, von pH 4,5 in destilliertem Wasser verwendet und die freigesetzten Carboxylgruppen in mol pro min im linearen Reaktionsbereich nach der pH-stat-Methode durch Titration mit 0,05 M Natronlauge quantitativ ermittelt. (PHAFF, H.J, bzw» KSRTESZ, Z.I., Methods in Enzymology, 8 (1966) bzw. 1_ (1955) 159).

Für den effektiven Einsatz an unlösliche Trägermaterialien, fixierter pektinolytiseher Enzyme ist die Erreichung des erfindungsgemäßen Polygalakturonase/Pektinesterase-Aktivitätsverhältnisses auf der Trägeroberfläche bei der Trägerfixierung der beiden Hauptwirkkomponenten, gegebenenfalls unter Einsatz von Pektinesterasen unterschiedlicher Herkunft, von entscheidender Wichtigkeit.

Es wurde weiterhin gefunden, daß eine schrittweise Trägerfixierung der Pektinesterase sich auf die Wirksamkeit der Enzym-Trägerkomplexe sowie auf das Zusammenwirken von Polygalakturonasen und Pektinesterasen günstig auswirken. Dabei ist es gleichgültig, ob im ersten Schritt Pektinesterase aus Schimmelpilzen oder aus höheren Pflanzen, z, B. aus Orangen, Tomaten, Weißkohl, an einem technisch relevanten porösen bzw. gelartigen organischen oder anorganischen Träger, in an sich bekannter Weise fixiert wird. Wesentlich ist, daß die Pektinesterase mehr in den inneren Be-

S reichen der Porenoberfläche gebunden vorliegt.

Eine weitere Effektivitätssteigerung wird erreicht, wenn nicht die gesamte für die Trägerfixierung nutsbare Oberfläche mit dem Zweienzymsystera, gemessen als maximale spezifische Aktivität der PolygalakturoDase pro g bzw. ml trägermaterial, besetzt ist· Unter Berücksichtigung, auch ökonomischer Gesichtspunkte, sind spezifische Aktivitäten von 10 bis 60 <%> der maximal erreichbare spezifischen Aktivität für eine Bindungsart und ein Trägermaterial vorteilhaft. Erfindungsgemäß bevorzugt werden sowohl für poröse als auch für gelartige Trägermaterialien spezifische Akti- C vitaten um 30 #·

Für den kontinuierlichen Pektinabbau, insbesondere in Fruchtsäften oder Pektinlösungen ist ferner von Bedeutung, daß dieser in eines»' gesteuerten Reaktor unter turbulenten Strämungsbedingungen erfolgt. Dadurch wird gewährleistet_? daß der Pektinabbau nicht durch Substratmangel bzw, durch lokale Anhäufung von weniger schnell spaltbaren Pektinabbauprodukten sich vorzeitig verlangsamt.

Sine,:für die Ausübung des erfindungsgemäßen Verfahrens benötigte Trägerfixierung des SnzymgemisGh.es mit dem*ge·? wünschten Aktivitätsverhältnis ist relativ einfach zu er~ Γ-- rei&hen. Als ein technisch relevanter Träger wird beispielsweise ein poröses Polystyrol eingesetzt· Zunächst erfolgt dabei eine Aktivierung der Trägermatrix, danach die Bindung der vorgesehenen Enzyme. Weitere geeignete Enzym-Trägerkomplexe werden durch Kupplung der Enzyme an BrCN-Aktivierte-SEPHAROSE in an sich bekannter Weise erhalten. Beim Arbeiten mit einem Polystyrolträger wird im allgemeinen wie folgt verfahren:

1 Teil trockenes kugelförmiges Polystyrol G 8 TEPA wird * _t mit 0,2 Teilen Benzoehinon, die in 8 Teilen Dioxan gelöst sind, 20 bis 30 min bei Zimmertemperatur gerührt oder ge-*-·. schüttelt. Anschließend wird, : 5mal jeweils; 15 min mit Etha-» nol oder Dioxan und danch. 3mal je 10 min mit Wasser bzw.

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Kupplungspuffer gewaschen. Der Waschvorgang ist beendet, wenn im Waschwasser kein Chinoin mehr nachweisbar ist (im anderen Fall tritt nach Zusatz von einigen Tropfen Ethanolamin eine rotbraune Farbe auf). Abschließend wird der aktivierte Polystyrolträger durch. Absaugen erhalten* Die Enzymbindung erfolgt zweckmäßiger Weise wie folgt:

Das zu bindende Einzelenzym bzw. Enzymsystem wird in 0,1 M Phosphatpuffer von pH 7,4 oder in einem anderen Aminogruppen—freien Kupplungspuffer gel©st (5 bis 10 Teile) und bei Raumtemperatur mindestens 2 h oder bei 4 ⁰C mindestens 12 h mit dem aktivierten Polystyrolträger geschüttelt. Die Bindung ist auch bei niedrigeren pH-Werten unter Verlängerung der Reaktionszeit möglich. Zur Abtrennung der nur lose adsorptiv gebundenen Enzyme werden die Enzym-Trägerkomplexe mehrfach jeweils 20 min mit 0,025 M Acetatpuffer von pH-4,5, der 0,5 M an NaCl enthält, oder mit Pektinsubstratlösung gewaschen (ca, 20 Teile). Die Snzym-Trägerkomplexe können im feuchten Zustand bei ca. 4 ⁰C längere Zeit ohne Aktivitätsverlust gelagert werden.

Unter der beispielhaft angegebenen Immobilisierungsbedingungen werden die beiden erfindungsgemäß eingesetzten Hauptenzyme, Polygalakturonase und Pektinesterase, zu über 90 % kovalent an die Trägermatrix gebunden. Zur Erzielung des erfindungsgemäßen Polygalakturonase/ Pektinesterase—Aktivitätsverhältnisses wird das gelöste Enzymsystem, als ein Snzymgemisch vorliegend, zum gewünschten Aktivitätsverhältnis unmittelbar oder unter vorgeschalteter Bindung der Pektinesterase und nachgeschalteter Bindung von Polygalakturonase öder eines Enzymsystems, das von vornherein Polygalakturonase und Pektinesterase als Hauptwirkkomponenten enthält, trägerfixiert.

Anstelle des bereits erwähnten Phosphatpuffers haben sich auch Acetat-, Citrat- und Boratpuffer von pH 6,5 bzw.· 7,0 für die Enzymkupplung gut bewährt. Für die Trägerfixierung der Pektinesterase erweisen sich Kupplungspuffer, die biva-

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lente Metallkationen enthalten₃ aufgrund ihrer Enzym stabilisierenden Wirkung als "besonders geeignet.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend an zwei Ausführungsbeispielen sowie in Figur 1 näher erläutert·

Ausführungsbe!spiele Beispiel 1

Die partielle Depektinisierung von Apfelsaft erfolgt in einem thermostatierbaren Rührreaktor (continuous stirred tank reactor) "bei 30 bis 50 C, Der Pektinabbau wird mit einem automatischen Viskosimeter, das dem Reaktionsgefäß nachgeschaltet ist_; über die Dämpfung einer Ultraschallschwingung zeitlich verfolgt· Die Steuerung des Prozesses wird über die Durchflußgeschwindigkeit mittels eines Stell-Tentils -vorgenommen« In dem Reaktor befindet sich ein En— zym-Trägerkomplex mit einem Aktivitätsverhältnis der PoIygalakturonase/Pektinesterase von 1,9 und einer Halbwertszeit von 20 Tagen in einer Menge von 2,5 Kilogramm pro 1000 Liter Reaktorvolumen. Der eingesetzte Apfelsaft wird mit einer Viskosität von 5,24 mPa.s innerhalb von 1-5 bis 60 min im stationären Betrieb auf eine Endviskosität von 1,20 bis 1,63 mPa.s gebracht*und anschließend in an sich bekannter Weise für die Konzentsatherstellung geklärt. Der Einfluß des Polygalakturonase/Pektinesterase-Aktivitätsverhältnisses auf die Geschwindigkeit des: Pektinabbaus geht unmittelbar aus der Figur 1 hervor. Darin ist der jeweils ermittelte Pektinabbau auf ein Polygalakturonan/Pektinesterase-Aktivitätsverhältnis «1 : 1 bezogen· Man erkennt die bedeutende Zunahme der Wirksamkeit bei kleinen Zahlenwerten des Aktivitätsverhältnisses im Bereich um 1 ·

Beispiel 2

Unter den im Beispiel 1 angegebenen Verfahrensbedingungen wird eine 0,5 °/o Apfelpektinlösung mit einem Veresterungsgrad von 60 f> bei 30 ⁰C und pH 4,5 (0,02 M Cit ratpuff er)

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kontinuierlich zu oligoiaeren Spaltprodukteη angebaut· Der Prozeß wird über deD Viskositätsverlust und die jodometrisch ermittelte Rate an gespaltenen CC(I-*4)— glykosidi*- sehen Bedingungen kontrolliert. Gegen Ende der Reaktion werden ebenfalls, wie bei der Anwendung löslicher Enzyme, Hydrolysegrade um 40 ίο erreicht· Die Hydrolysate setzen sich dann im wesentlichen aus Mono-, Di- Trigalakuronsäure zusammen und sind nicht mit dem Enzympräparat verunreinigt.

Claims (2)

1. Erfindungsanspruche

   1· Verfahren zur kontinuierlichen enzyraatischen Behandlung pektinhaltiger Flüssigkeiten, vorzugsweise von Frucht- und Gemüsesaften sowie Pektiulösungen, mittels pektiaolytischer Enzyme aus Aspergillus speo. und gegebeaenfall, unter Zusatz von Pektinesterase in einem Enzyrareaktor, unter turbulenter» Strb'raungs"bedinguDgen, dadurch, gekennzeichnet, daß auf einem Träger fixiert ein Enzymgemisch mit einem "bei pH 4,5 und 30 ⁰G gemessenen Aktivitätsverhältnis der Hauptwirkkomponenten Polygalakturonase (SC 3.2.1.15) und Pektinesterase (EC 3.1.1.11) von 0,2 bis 2,0, vorzugsweise von 0,5 bis 1,0, eingesetzt wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß in einem ersten Schritt Pektinesterase und anschließend Polygalakturonase oder gleichzeitig das pektinolytische Enzymsystem aus Aspergillus spec, das Polygalakturonase und Pektinesterase als HauptwirkkompoDeuten enthält, auf den Träger fixiert werden.

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