DD150199A1 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF NEW PEPTIDE MATERIALS - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen Peptidwirkstoffen, die sowohl cyclische als auch lineare Strukturen im Molekuel enthalten. Das Ziel der Erfindung besteht in der Herstellung von biologisch aktiven Wirkstoffen mit verbesserten Eigenschaften, insbesondere einer Wirkungsverstaerkung, Erhoehung der Stabilitaet, Verbesserung der Transporteigenschaften sowie einer Beeinflussung der pharmakologischen und physiologischen Eigenschaften. Die Aufgabe, solche Wirkstoffe zu entwickeln, wurde dadurch geloest, dasz Peptidwirkstoffe bzw. biologisch aktive Analoga, darunter verkuerzte oder modifizierte Teilsequenzen, durch Saeureamidbindungen - entweder ueber freie Alpha-oder Omega-Amino- bzw.Carboxylgruppen oder ueber Brueckenreagenzien - kovalent an cyclische Peptide gebunden werden. Die Erfindung ist von Bedeutung fuer die pharmazeutische Industrie, die klinische Pharmakologie und Diagnostik.The invention relates to a process for the preparation of novel peptide active ingredients which contain both cyclic and linear structures in the molecule. The object of the invention is the production of biologically active substances having improved properties, in particular an increase in activity, an increase in stability, an improvement in the transport properties and an influence on the pharmacological and physiological properties. The task of developing such active substances has been solved by Dasz peptide active ingredients or biologically active analogs, including truncated or modified partial sequences, by acid amide bonds - either by free alpha or omega-amino bzw.Carboxylgruppen or by Brueckenreagenzien - covalently bound to cyclic peptides be bound. The invention is of importance to the pharmaceutical industry, clinical pharmacology and diagnostics.

Description

Ve r fan r en zu r Hers te 11 u nc;. yo_n_ji eii e η Pep ti dwi rk st ο f_uf e η ^T o o u r th e rs 11 u nc ;. yo_n_ji eii e η Pep ti dwi rk st ο f _u fe η ^

Anwendungsgebiet dor Erf.in..du_TngField of application of Erf.in..du _T ng

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Peptidwirkstoffen , die sowohl cyclische als auch lineare Strukturen im Molekül enthaltene Durch die erfindungsgemäße Bindung von linearen Peptidwirkstoffen bzw«, biologisch aktiven Wirkstoff analoga , darunter verkürzten oder modifizierten Teilsequenzen (im folgenden auch als Wirkstoff bezeichnet), an cyclische Peptidstrukturen werden Wirkstoff-Cyclopcptid-Konjugate mit potentieller Wirkungsverstärkung, einschließlich einer prologierten bzw. differenzierten biologischen Aktivität, erhalten, die durch Substitution an bestimmten funktionellen Gruppierungen über ein weites Spektrum modifiziert werfen können Die Erfindung ist von Bedeutung für die pharmazeutische Industrie, die klinische Pharmakologie und Diagnostik.The invention relates to a process for the preparation of new peptide drugs, which contained both cyclic and linear structures in the molecule of the inventive binding linear peptide active ingredients or "analogues biologically active agent, including truncated or modified partial sequences (hereinafter also referred to as active ingredient) to cyclic peptide structures are drug Cyclopcptid conjugates having potential effect amplification, including a prologierten or differentiated biological activity is obtained, which can throw modified by substitution of certain functional groups over a wide spectrum, the invention is of importance for the pharmaceutical industry, the clinical Pharmacology and diagnostics.

Es ist eine große Zahl von Verfahren zur Knüpfung von Peptidbindungen bekannt. Auch sind Verfahren beschrieben, die zur Cyclisierung linearer Peptide führen (vgl. E. Wünsch, Synthese von Peptiden - Houben - Weyl Bd. 15/1 und II, Methoden öer organischen Chemie, Ed» E* Müller, Georg Thiems Verlag Stuttgart , 1974).There are a large number of methods for the formation of peptide bonds known. Also, methods are described that lead to cyclization of linear peptides (see E. Wünsch, synthesis of peptides -. Houben -. Weyl Vol 15/1 and II, methods Oer organic chemistry, Ed "E * Müller, Georg Thiems Verlag, Stuttgart, 1974 ).

Obwohl eine Verankerung von Wirkstoffen, darunter pharmakologischer und agrochemischer Art, an polymere Träger vor allemAlthough an anchoring of active ingredients, including pharmacological and agrochemical type, to polymeric carriers in particular

mit immunologischer Aufgabenstellung und zur Depotwirkung, seit längerem bekannt ist (G.E. Allan et al., Nature ,234^ 349 (1971); H .G. ßatz et al., Angew. Chem. 84, 1189 (1972); K. Hofmann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73, 3516 (1976), ist eine kovalente Fixierung von Peptidwirkstoffen an cyclische Peptidstrukturen mit der Zielstellung einer Wirkungsverstärkung bisher in der Literatur nicht beschrieben worden.with immunological task and depot effect, has been known for some time (GE Allan et al., Nature, 234-349 (1971); HG Gatz et al., Angew. Chem. 84, 1189 (1972); K. Hofmann Acad., U.S.A. 73, 3516 (1976), a covalent fixation of peptide drugs to cyclic peptide structures with the goal of enhancing activity has not previously been described in the literature.

Das Ziel der Erfindung besteht in der Herstellung von Peptidwirkstoffen bzw. biologisch aktiven Wirkstoffanaloga mit verbesserten Eigenschaften, insbesondere einer Wirkungsverstärkung, Erhöhung der Stabilität, Verbesserung der Transporteigenschaften sowie einer Beeinflussung der pharmakologischen und physiologischen Eigenschaften.The object of the invention consists in the production of peptide active agents or biologically active active substance analogues with improved properties, in particular an increase in activity, increase in stability, improvement in transport properties and an influence on the pharmacological and physiological properties.

Darlequna des Wesens der ErfindunaLoan of the essence of the invention

mn »Μ ιι —ιιιιιιιιΛ ι ι ι ιΐ mi* V.i.ninn ι ιι.ιι» .μ »μ .im t.mmimimi... ιι ι im μπιιμ ι ι mi ιι n 11. ιιι ι Πιι'ι mn »Μ ιι -ιιιιιιιιΛ ι ι ι ιΐ mi * V.i.ninn ι ιι.ιι" .μ »μ .im t.mmimimi ... ιι ι in μπιιμ ι ι mi ιι n 11 ιιι ι Πιι'ι

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Peptidwirkstoffe bzvj. biologisch aktive Wirkstoffanaloga zu entwickeln, die folgende Vorteile aufweisen:The invention is based on the object bzvj Peptidwirkstoffe. to develop biologically active drug analogues which have the following advantages:

a) Potentielle Wirkungsverstärkung des betreffenden Wirkstoffes, einschließlich prolongierter bzw. differenzierter biologischer Wirkungen infolge Änderung der Molekülparameter, besonders dor Hydrophobie der Molekülstruktura) Potential effect amplification of the respective test compound, including prolonged or differentiated biological effects due to change of the molecular parameters, especially dor hydrophobicity of the molecular structure

b) Potentielle Verbesserung der Transporteigenschaften des betreffenden Wirkstoffesb) Potential improvement of the transport properties of the active substance concerned

c) Beeinflussung der pharmakologischen und physiologischen Eigenschaften des betreffenden Wirkstoffes durch entsprechende Substitution an geeigneten funktioneilen Gruppenc) influencing the pharmacological and physiological properties of the active substance in question by appropriate substitution on suitable functional groups

der Peptidketten, die die Lipophilie der Molekülstruktur und andere physiko-chemische Parameter gezielt verändernthe peptide chains that alter the lipophilicity of the molecular structure and other physico-chemical parameters

d) Erhöhung der Stabilität des betreffenden Wirkstoffes gegenüber enzymatischem Abbau»d) Increasing the stability of the active substance concerned against enzymatic degradation »

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß Peptidwirkstoffe bzwThe object has been achieved by peptide active substances or

biologisch aktive Analoga, darunter verkürzte oder modifizierte Teilsequenzen, durch Säureamidbindungen - entweder über freie c£ - oder έ^-Amino- bzw. Carboxylgruppen oder über Brückenreagenzien - kovalent an cyclische Peptide gebunden werdenbiologically active analogues, including truncated or modified subsequences, are covalently bound to cyclic peptides by acid amide linkages-either via free c £ or έ -amino or carboxyl groups, or via bridging reagents

Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellten Verbindungen sind durch die allgemeinen Formeln I bis IV The compounds represented by the process according to the invention are represented by the general formulas I to IV

L_x. (X)_n- _YJL _x . (X) _n - _Y J

- -w- -w

Z -(X)_nTT] IIIZ - (X) _n TT] III

Z - (X)_n - Y - W^;. IVZ - (X) _n - Y - W ^; , IV

gekennzeichnet, worinin which

W - für die Aminosäuresequenz eines Wirkstoffes X - für einen beliebigen AminosäurerestW - for the amino acid sequence of an active ingredient X - for any amino acid residue

Y - für Asp, GIu (Verbindungstyp I bis III), Lys, Orn, Dab (Verbindungstyp I, III, IV) (Abkürzungen für Aminosäuren und Peptidderivate vgl. IUPAC-Y - for Asp, Glu (compound type I to III), Lys, Orn, Dab (compound type I, III, IV) (abbreviations for amino acids and peptide derivatives, see IUPAC)

IUB Commission on Biochemical Nomenclature - 0. Biol. Chem. 247, 977 (1972)IUB Commission on Biochemical Nomenclature - 0. Biol. Chem. 247, 977 (1972)

Z- im Falle von Y «= GIu, Asp, Lys, Om, Dab für Lys, Om und Dab (Verbindungstyp III) und im Falle von Y ·= Orn, Lys, Dab für GIu und Asp (Verbindungstyp IV)Z- in the case of Y «= Glu, Asp, Lys, Om, Dab for Lys, Om and Dab (compound type III) and in the case of Y · = Orn, Lys, Dab for Glu and Asp (compound type IV)

stehen undstand and

η - die Bedeutung O, 1, 2, 3, 4, 8, 10 besitzt.η - has the meaning O, 1, 2, 3, 4, 8, 10.

Die lineare Vorstufe der gewünschten cyclischen Peptidstruktur mit selektiv geschützter Seitenkettenfunktion (Verbindungstyp I und III) bzw. mit selektiv geschützter C-terminaler Carboxylgruppe an Y (Verbindungstyp II und IV) wird nach den bekannten Verfahren der Peptidchemie aufgebaut (vgl. E* Yi/ünsch, s.o.), danach in eine für die beabsichtigte CyclisierungsstrategieThe linear precursor of the desired cyclic peptide structure having selectively protected side chain function (connection type I and III) or with selectively protected C-terminal carboxyl group of Y (compound of type II and IV) is established by the known methods of peptide chemistry (see. E * Yi / ünsch , so), then into one for the intended cyclization strategy

DCCI-Verfahren mit Zusatzkomponenten (A) Mischanhydrid-Methode (B) - Azidverfahren (C)DCCI process with additional components (A) mixed anhydride method (B) - azide process (C)

Aktivesteraminolyse (D)Active ester aminolysis (D)

erforderliche Struktur der allgemeinen Formeln V bis VIII RRS ι * ιrequired structure of the general formulas V to VIII RRS ι * ι

H₂N - X - (X)_n - Y - T (V)H ₂ N - X - (X) _n - Y - T (V)

RRT • · IRRT • · I

H₂N - X .- (X)_n -Y-S (VI)H ₂ N - X - (X) _n -YS (VI)

H₀N R S. I : l H ₀ NO p. I: l

S-Z- (X)_n - Y - T (VII)SZ- (X) _n -Y-T (VII)

- 5 - d ZX T R NH₀ - 5 - d ZX TR NH ₀

1:11: 1

S-Z- (X)_n - Y - S (VIII)₁ SZ- (X) _n -Y-S (VIII) ₁

worin X₁ Y, Z und η wie zuvor definiert" sind und R, S_t T folgende Bedeutungen besitzen:in which X ₁ Y, Z and η are as defined above "and R, S _t have the following meanings:

R - in Abhängigkeit der Synthesestrategie eventuell erforderlicher Seitenkettenschutz bei trifunktionellen AminosäurenR - depending on the synthetic strategy possibly required side chain protection in trifunctional amino acids

S - entsprechend der Festlegung für Y und Z eine ei— oder to -Amino- bzw. °6 - oder Co -CarboxylschutzgruppeS - according to the definition of Y and Z is an ovoid or to amino or 6 ° - or Co -Carboxylschutzgruppe

T - OH (Cyclisierungsvariante A bzw. B) NH-NH„ (Cyclisierungsvariante C) , Überführung ins Azid aktivierter Ester (Cyclisierungsvariante D)T - OH (cyclization variant A or B) NH-NH "(cyclization variant C), conversion into the azide-activated ester (cyclization variant D)

überführt und nach einer der genannten Strategien der Ring-ίchlußreaktion unterworfen. Man erhält nach Reinigung an Ionenaustauschern und Sephadex-Gelfiltration als Zwischenproduktedie cyclischen Peptide der allgemeinen Formeln ,IX bis XIItransferred and subjected to one of the above strategies of the ring-closing reaction. After purification on ion exchangers and Sephadex gel filtration as intermediate, the cyclic peptides of the general formulas IX to XII are obtained

(IX)(IX)

• 11 ι• 11 ι

RRSRRS

U ~ (X)_n - Y - S (X)U ~ (X) _n - Y - S (X)

I fI f

1 η1 η

R R R R

S-Z- (X)_n - Y-J (XI)SZ- (X) _n - YY (XI)

j Ij I

RSRS

S-Z- (X)_n - Y - S (XII) ,SZ- (X) _n -Y-S (XII),

R .R.

worin X, Y, Z, R₁ S und η die oben genannte Bedeutung haben.wherein X, Y, Z, R ₁ S and η have the abovementioned meaning.

Nach selektiver Freisetzung der Seitenkettenfunktion an Y wird an das cyclische Peptid der vorgesehene lineare Peptidwirkstoff kovalent gebunden. Dabei können auch verkürzte oder modifizierte Teilsequenzen des linearen Peptidv/irkstoffs eingesetzt werden. Man verwendet Sequenzen, die für die kovalente Bindung geeignete teilgeschützte Strukturen besitzen und knüpft die Bindung über eine freie N-terminale Amino- bzw« C-terrainale Carboxylgruppe bzw. eine freie ζύ -Amino- oder Carboxylfunktion in der Seitenkette oder über sogenannte Brückenreagenzien, wie Dicarbonsäuren bzw. Alkyldiamine unterschiedlicher Kettenlänge, nach den üblichen Methoden der Peptidchemie*Upon selective release of the side chain function at Y, the intended linear peptide drug is covalently attached to the cyclic peptide. It is also possible to use shortened or modified partial sequences of the linear peptide active substance. Use is made of sequences which have partially protected structures suitable for covalent bonding and binds via a free N-terminal amino or C-terrainal carboxyl group or a free ζύ- amino or carboxyl function in the side chain or via so-called bridging reagents, such as Dicarboxylic acids or alkyldiamines of different chain length, according to the usual methods of peptide chemistry *

Anschließend werden die verbliebenen Schutzgruppen unter den in der Peptidchemie üblichen Bedingungen durch Acidolyse, Hydrogenolyse, alkalische Hydrolyse oder Hydrazinolyse entsprechend der Zielstellung vollständig oder teilweise entfernt. Nach Reinigung, vorzugsvjeise durch Säulenchromatographie an Kieselgel bzw. Sephadex wird das gewünschte Wirkstoff-Cyclopeptid-Konjugat der allgemeinen Formeln I bis IV erhalten. Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen weisen eine erhöhte bzw. prolongierte oder differenzierte biologische Aktivität auf «Subsequently, the remaining protecting groups under the usual in peptide chemistry conditions by acidolysis, hydrogenolysis, alkaline hydrolysis or hydrazinolysis according to the target position are completely or partially removed. After purification, preferably by column chromatography on silica gel or Sephadex, the desired active compound-cyclopeptide conjugate of the general formulas I to IV is obtained. The compounds produced according to the invention have increased or prolonged or differentiated biological activity.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The invention will be explained below with reference to exemplary embodiments.

Es.werden folgende Abkürzungen verwendet:The following abbreviations are used:

— 7 —- 7 -

Aminosäuresymbole entsprechend IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, 0. Biol. Chem« 247, 977 (1972)Amino Acid Symbols According to IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, 0. Biol. Chem. 247, 977 (1972)

AcOH EssigsäureAcOH acetic acid

Boc tert .-ButyloxycarbonylBoc tert-butyloxycarbonyl

DC Dünnschichtchromatogramm, -chromatoTLC thin-layer chromatogram, chromatogram

graphischgraphic

DCCI N ,N'.-Dicyclohexylcarbodiimid _f DCCI N, N'-dicyclohexylcarbodiimide _f

DHF Dimethylformamid DHF dimethylformamide

HE EssigsäureethylesterHE ethyl acetate

Fp SchmelzpunktMp melting point

i. Vak. , im Vakuumi. Vak. in a vacuum

fiin* Minutenfiin * minutes

OBut terto ButylesterOBut terto butyl ester

OMe MethylesterOMe methyl ester

OPfp PentafluorphenylesterOPfp pentafluorophenyl ester

RT RaumtemperaturRT room temperature

TFA ' TrifluoressigsäureTFA 'trifluoroacetic acid

THF TetrahydrofuranTHF tetrahydrofuran

Z BenzyloxycarbonylZ is benzyloxycarbonyl

Folgende Laufmittelsysteme (in Volumenanteilen) zur Dünnschichtchromatographie auf Silicagel-Fertigplatten (Silufol UV 254, CSSR) wurden verwendet :The following solvent systems (by volume) for thin layer chromatography on silica gel precast panels (Silufol UV 254, CSSR) were used:

BAW 2-Butanol-Ameisensäure-Wasser 80+20+20BAW 2-butanol-formic acid-water 80 + 20 + 20

BEW I-Butanol-Essigsäure-Wasser 75 + 13,5 + 11,5BEW I-butanol-acetic acid-water 75 + 13.5 + 11.5

CM Chloroform-Methanol 90+10CM chloroform-methanol 90 + 10

EPEW Essigester-Pyridin-Essigsäure-Wasser 10 + 10 + 10 +EPEW ethyl acetate-pyridine-acetic acid-water 10 + 10 + 10 +

Bei den Aminosäureanalysen stellt die mit *) gekennzeichnete Aminosäure den Bezugsviert dar.In the amino acid analyzes, the amino acid marked with *) represents the reference fourth.

Beispiel IExample I

Kovalente Bindung von Substanz P (7-11) ~ Pentapeptid an cyclo (Glu-Pro)Covalent binding of substance P (7-11) ~ pentapeptide to cyclo (Glu-Pro)

cyclo (GIu - Pro)cyclo (Glu - Pro)

^x I—phe - Phe - GIy - Leu - Met - NH₂ ^x I-phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH ₂

I» 1. cyclo (GIu - Pro)I »1. cyclo (GIu - Pro)

OHOH

Von 4,5 g (10 mMol) Z-Glu(OBut)-Pro~OMe in Methanol wird mit Pd/Kohle (10%) die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe bei 30⁰C hydrogenolytisch entfernt. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat i· Vak. auf ca. 30 ml eingeengt. Nach Zugabe einiger Tropfen 32%-iger Ammoniaklösung wird der Ansatz 24 h bei ca. 45 C stehen gelassen, anschließend i. Vak eingeengt, mit Ether verrührt, abfiltriert und der erhaltene Rückstand zur Entfernung der tert. Butylestergruppe mit 20 ml Trifluoressigsäure bei RT behandelt. Nach 45 Min. wird das Spaltreagenz i. Vak. abgezogen und der ölige Rückstand mit Ether digeriert, abgesaugt, mit Ether gewaschen und über getrocknet«,4.5 g (10 mmol) of Z-Glu (OBut) -Pro ~ OMe in methanol is treated with Pd / carbon (10%), the benzyloxycarbonyl protecting group at 30 ⁰ C removed by hydrogenolysis. Thereafter, the catalyst is filtered off and the filtrate i · Vak. concentrated to about 30 ml. After adding a few drops of 32% ammonia solution, the mixture is allowed to stand for 24 h at about 45 C, then i. Concentrated, concentrated with ether, filtered off and the residue obtained to remove the tert. Butylestergruppe treated with 20 ml of trifluoroacetic acid at RT. After 45 minutes, the cleavage reagent i. Vak. stripped off and the oily residue was digested with ether, filtered off with suction, washed with ether and dried over,

Ausbeute: 0,85 g (38 % d. Th., über 3 Stufen) Fp: 173 - 175⁰CYield: 0.85 g (38% of theory, over 3 steps.). Mp: 173-175 ⁰ C.

DC: einheitlich in BEW, CM, EPEWDC: uniform in BEW, CM, EPEW

₄ (226,33) Ber· C 53,09 H 6,24 N 12,38 ' Gef. C 52,89 H 6,58 N 12,70 ₄ (226.33) Ber · C 53.09 H 6.24 N 12.38 'Gef. C 52.89 H 6.58 N 12.70

I. 2« H- Phe - Phe - GIy- Leu - Met - NH_£ . HClI. 2 "H-Phe - Phe - Gly-Leu-Met-NH _£ . HCl

Der Aufbau des Pentapeptids erfolgte ausgehend von 3,0 g (10 EiMoI) H-Lou-Mot-NHg.HCl -(H.-D. Dakubke, Ch. Kleßen, K. Neubert; 3. prakt. Chem. ,319,, 640 (1977) durch schrittweise Anknüpfung der entsprechenden tert .«Butyloxycarbonylamino~ säure-pentafluorphenylester (13 mMol) in DMF (K. Neubert, B. Hartrodt, S. Koch, M. Bienert, E. Klauschenz, H.-D. Dakubke; Die Pharmazie, im Druck). Zur Deblockierung der N^-Aminoschutzgruppen diente jeweils 1,1 η HCl/AcOH - 30 Min. bei RT.The construction of the pentapeptide was carried out starting from 3.0 g (10 EiMoI) of H-Lou-Mot-NHg.HCl - (H.-D. Dakubke, Ch. Kleßen, K. Neubert, 3. prakt. Chem., 319, , 640 (1977) supported by gradual attachment of the corresponding. "butyloxycarbonylamino ~ acid pentafluorophenyl ester (13 mmol) in DMF (K. Neubert, B. Hartrodt, S. Koch, M. Bienert, E. Klauschenz, H.-D. Dakubke, The Pharmacy, in press.) For the deblocking of N ^ -Aminoschutzgruppen each served 1.1 η HCl / AcOH - 30 min. At RT.

Ausbeute: 5,2 g (80 % d. Th.) Fp : Zers . ab 140⁰CYield: 5.2 g (80 % of theory ) mp: decomp. from 140 ⁰ C

: - 77,6 ^w (c-1,: 77.6 ^w (c-1,

DC: einheitlich in BEW, EPEWDC: uniform in BEW, EPEW

I. 3. cyclo (GIu - Pro)I. 3. cyclo (Glu - Pro)

- Phe - GIy » Leu - Met -- Phe - GIy »Leu - Met -

a) Koyalente Bindung nach der Mischanhydrid-Tec^hnik.a) Koyalente bond after the mixed anhydride Tec hnik.

0,4 g (1,77 mMol) cyclo (GIu - Pro) werden in 20 ml THF/DMF (4:1) gelöst und nach Abkühlen auf -15°C mit 0,22 ml (1,77 mMol) N-Ethylmorpholin versetzt* Unter Rühren gibt man 0,23 ml (1,77 mMol) Chloraneisensäureisobutylester zur Lösung« Nach 8 Min. fügt man 0,13 ml (1,42 mMol) N-Ethylmorpholin und sofort danach 0,92 g (1,42 mMol) H-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NHg.HCl in 10 ml0.4 g (1.77 mmol) of cyclo (Glu-Pro) are dissolved in 20 ml of THF / DMF (4: 1) and after cooling to -15 ° C. with 0.22 ml (1.77 mmol) of N- Ethylmorpholine is added to the solution. 0.23 ml (1.77 mmol) of isobutyl chloroformate are added to the solution. After 8 minutes, 0.13 ml (1.42 mmol) of N-ethylmorpholine are added and immediately afterwards 0.92 g (1, 42 mmol) of H-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NHg.HCl in 10 ml

THF hinzu. Man rührt 2 h bei -15°C und 12 h bei RT. Danach wird das Lösungsmittel i. Vak. abgezogen, der Rückstand mit Wasser ausgerührt, abgesaugt und auf öer Fritte nacheinander mit 5%iger KHSO^-Lösung, V/asser, gesättigter NaHCOg-Lösung und Wasser gewaschen und i. Vak«über PoOc- getrocknet» Anschließend wirdTHF added. The mixture is stirred for 2 h at -15 ° C and 12 h at RT. Thereafter, the solvent is i. Vak. The residue was stripped with water, filtered off with suction and washed successively with 5% strength KHSO 4 solution, water, saturated NaHCO 3 solution and water on a frit, and i. Vak «over PoOc dried» Subsequently

- 10 -- 10 -

das Rohprodukt jeweils 2 mal mit 25 ml Methanol und Ether extrahiert und aus Essigsäure/Ether umgefällt.the crude product is extracted twice each with 25 ml of methanol and ether and reprecipitated from acetic acid / ether.

Ausbeute: 0,44 g (38 % d. Th.) Fp: 172,5 - 173,5⁰C Md^2; ~ 43,2° (c-1, AcOH) DC: einheitlich in CM, EPEWYield: 0.44 g (38 % of theory ) mp: 172.5-173.5 ⁰ C Md ^2; ~ 43.2 ° (c-1, AcOH) DC: uniform in CM, EPEW

Aminosäuren-Analyse: GIu Pro Phe GIy Leu MetAmino Acids Analysis: GIu Pro Phe GIy Leu Met

Ber· 112 11 1 Gef. 0,89 0,92 2,04 1,00 1,00 0,87Ber · 112 11 1 Gef. 0.89 0.92 2.04 1.00 1.00 0.87

Bi o-lοqische^Testu^a : Kontraktion am isolierten MeerscbweinBi o-lοqische ^ Testu ^ a: contraction on isolated Meerscbwein

chen-Ileumchen-ileum

Relative Aktivität: 27 % (Substanz P £ 100 %) Vergleichswert für Substanz P (7~11)-Pentapeptid : 1,4 %Relative activity: 27 % (substance P £ 100 %) Comparative value for substance P (7~11) -pentapeptide: 1.4%

b) j^ya^njtLg__j^b) j ^ ya ^ njtLg__j ^

Zu einer auf -5 C gekühlten Lösung von 0,3 g (1,33 mMol) cyclo(Glu-Pro) , 0,84 g (1,3 mMol) H-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NI-^.HCl, 0,17 ml (1,3 .mMol) N-Ethylmorpholin und.0,2 g (1,46 mMol) N-Hydroxybenzotriazol in 8 ml DMF gibt man O,3 g (1,46 mMol) DCCI in 2 ml DMF hinzu und läßt den Ansatz 0,5 h bei -5⁰C, 2 h bei O⁰C und 12 h bei RT rühren. Nach Zugabe einiger Tropfen AcOH wird die Reaktionsmischung auf O⁰C abgekühlt, der sich gebildete Dicyclohexylharnstoff abgetrennt, i. Vak. eingeengt und das Rohprodukt durch Zugabe von 5%iger KHSO.-Lösung ausgefällt. Der Feststoff wird wie unter a) beschrieben aufgearbeitet.To a cooled to -5 C solution of 0.3 g (1.33 mmol) cyclo (Glu-Pro), 0.84 g (1.3 mmol) of H-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NI- ^ .HCl, 0.17 ml (1.3 μmol) of N-ethylmorpholine and.0.2 g (1.46 mmol) of N-hydroxybenzotriazole in 8 ml of DMF are added O, 3 g (1.46 mmol) DCCI in 2 ml of DMF and the mixture is stirred for 0.5 h at -5 ⁰ C, 2 h at ^{0 0} C and 12 h at RT. After addition of a few drops of AcOH, the reaction mixture is cooled to ⁰ ° C., the dicyclohexylurea formed is separated, i. Vak. concentrated and precipitated the crude product by addition of 5% KHSO.-solution. The solid is worked up as described under a).

Ausbeute: 0,35 g (33 %.d.Th.) Fp: 172.- 174 ⁰CYield: 0.35 g (33% .d.Th.) Mp: 172.- 174 ⁰ C.

ψ ι - .43,0° (C-I, AcOH) einheitlich in CMj EPEW _ΛΛ ψ ι - .43.0 ° (CI, AcOH) uniformly in CMj EPEW _ΛΛ

- αϊ - *- αϊ - *

Seispiel IISeismic II

Kovalente Bindung von Substanz P (6-ll)~Hexapeptid an cyclo (Glu-Pro)Covalent binding of substance P (6-ll) ~ hexapeptide to cyclo (Glu-Pro)

cyclo (Glu-Pro)cyclo (Glu-Pro)

- Phe - Phe - GIy - Leu - Met - NH₂ - Phe - Phe - Gly - Leu - Met - NH ₂

0,23 g (1 mMol) cyclo(Glu-Pro) werden unter Rühren in 12 ml THF/DMF (3:1) gelöst und bei -15⁰C mit 0,13 ml (1 mMol) N-Ethylmorpholin und 0,13 ml (1 mMol) Chlorkohlensäureisobutylester versetzt. Nach 8 Min« gibt man 0,1 ml (0,8 mMol) N-Ethylmorpholin und sofort danach 0,62 g (0,8 mMol) H-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met, -ΝΗ₂·Η0ί (erhalten nach 1.2. durch Umsetzung von H~Phe-Phe-Gly-Leu~Met-NH₂ mit Boc-Gln-QPfp und anschließende Deblockierung mit 1,1 η HCl/AcOH ~ 10 Min. bei 1O⁰G, ümkristallisiert aus Methanol/EE; Fp: 228 - 233⁰C,0.23 g (1 mmol) of cyclo (Glu-Pro) are dissolved with stirring in 12 ml of THF / DMF (3: 1) and at -15 ⁰ C with 0.13 ml (1 mmol) of N-ethylmorpholine and 0, 13 ml (1 mmol) Chlorobohlensäureisobutylester added. After 8 minutes, 0.1 ml (0.8 mmol) of N-ethylmorpholine is added immediately followed by 0.62 g (0.8 mmol) of H-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met, -ΝΗ ₂ × Η0ί (obtained after 1.2. By reaction of H ~ Phe-Phe-Gly-Leu ~ Met-NH ₂ with Boc-Gln-QPfp and subsequent deblocking with 1.1 η HCl / AcOH ~ 10 min. At 10 ⁰ G, U-crystallized from methanol / EA, mp: 228 - 233 ⁰ C,

p: - 43,0 ° (c~0,5;DMF) in 10 ml DMF) hinzu. Der Ansatz wird 2 h bei -15°C und 12 h bei RT gerührt und wie unter 1.3.a) beschrieben aufgearbeitet.p: - 43.0 ° (c ~ 0.5, DMF) in 10 ml of DMF). The mixture is stirred for 2 h at -15 ° C and 12 h at RT and worked up as described under 1.3.a).

Ausbeute: 0,32 g (42 % d. Th.) Fp: 209 - 210,5⁰CYield: 0.32 g (42% of theory.). Mp: 209 to 210.5 ⁰ C

²: ~ 56,3 ° (c-0,5; AcOH) DC: einheitlich in CM, EPEW ² : ~ 56.3 ° (c-0.5; AcOH) DC: uniform in CM, EPEW

Aminosäuren-Analyse: GIu Pro Phe GIy Leu MetAmino Acids Analysis: GIu Pro Phe GIy Leu Met

Bar .2 1 2 11 1 Gef_s 2,00 0,91 2,07 1,00 1,00 0,85Bar .2 1 2 11 1 Gef _s 2.00 0.91 2.07 1.00 1.00 0.85

S^SiSEä^EilS-Xf-äiidilS-i Kontraktion am isolierten Meerschvieinchen·S ^ SiSEa ^ EilS-Xf-alidilS-i contraction on isolated guinea pig

Ileumileum

Relative Aktivität: 227 % (Substanz P £> 100 %) Vergleichswert für Substanz P (6->ll)~Hexapeptid : 50 % Relative Activity: 227 % (substance P £> 100 %) Comparative value for substance P (6-> ll) ~ hexapeptide: 50 %

Claims (3)

Erfindungs ansp ruchInvention claim 1, Verfahren zur Herstellung von neuen Peptidwirkstoffen, die sowohl cyclische als auch lineare Strukturen im Molekül enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß Wirkstoff-Cyclopeptid-Konjugate der allgemeinen Formeln I bis IV1, Process for the preparation of novel peptide active ingredients which contain both cyclic and linear structures in the molecule, characterized in that active compound-cyclopeptide conjugates of the general formulas I to IV L_x _ _(X)_n _ yJ L_x _ _(x)n „ _Y L _x _ _(X ) _n _yJ L _x _ _{(x) n} " _Y IIII III IVIII IV worinwherein Vi - für die Atainosäurefrequenz eines Wirkstoffes X - für einen beliebigen AminosäurerestVi - for the atainic acid frequency of an active ingredient X - for any amino acid residue Y - für Asp, GIu (Verbindungstyp I bis III), Lys , Orn, Dab (Verbindungstyp I, III, IV)Y - for Asp, GIu (compound type I to III), Lys, Orn, Dab (compound type I, III, IV) Z - im Falle von Y« GIu, Asp, Lys, Orn, Dab für Lys, Orn und Dab (Verbindungstyp III) und im Falle von Y» Orn, Lys, Dab für GIu und Asp (Verbindungstyp IV)Z - in the case of Y << GIu, Asp, Lys, Orn, Dab for Lys, Orn and Dab (compound type III) and in case of Y »Orn, Lys, Dab for GIu and Asp (compound type IV) stehen undstand and η - die Bedeutung O, 1, 2, 3, 4, 8, 10 besitzt, aus cyclischen Peptiden der allgemeinen Formeln IX bis XII, die durch Ringschluß linearer Strukturen der allgemeinen Formeln V bis VIII entstehenη - has the meaning O, 1, 2, 3, 4, 8, 10, of cyclic peptides of the general formulas IX to XII, which arise by ring closure of linear structures of the general formulas V to VIII RRS RRTRRRS RRT X-(X)_n-Y-T H₂M-X-(X)_n-Y-SX- (X) _n -YT H ₂ MX (X) _n -ys V VIVI ~ 2~ 2 NH^ RNH ^ R S- Z - (X)_n- Y-TS - Z - (X) _n - YT VIIVII R NH₀ R NH ₀ :1:1 S-Z- (X)_n - Y - SSZ- (X) _n -Y-S VIIIVIII - γ - S- γ - S S_ y _S_ y _ XIXI „., γ ! "., Γ! R SRs S-Z- (X)_n - Y - SSZ- (X) _n -Y-S XII,XII, worin X, Y, Z und η wie zuvor definiert sind undwherein X, Y, Z and η are as defined above and fi-~ in Abhängigkeit der Synthesestrategie eventuell erforderlicher Seitenkettenschutz bei trifunktionallen Aminosäurendepending on the synthetic strategy, any necessary side chain protection for trifunctional amino acids S - entsprechend der Festlegung für Y und Z eine dL - oder 0 -Amino- bzw. o£- oder fo -CarboxylschutzgruppeS - according to the definition of Y and Z is a dL - or 0 amino or o £ - or fo -Carboxylschutzgruppe T - OH, NH - NH₀, aktivierter EsterT - OH, NH - NH ₀ , activated ester bedeuten,mean, und linearen Peptidvjirkstoffen bzw. biologisch aktiven Analoga, darunter verkürzten oder modifizierten Teilsequenzen, durch kovalente Verknüpfung gewonnen werden*and linear peptide agents or biologically active analogs, including truncated or modified partial sequences, by covalent linkage * 2* Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die cyclischen Peptide mit in Abhängigkeit von äer Aminosäuresequenz und unter Berücksichtigung essentieller Strukturelemente partialgeschützten Peptidwirks.toffen bzw. biologisch aktiven Analoga, darunter verkürzten oder modifizier·2 * Method according to item 1, characterized in that the cyclic peptides with partially protected depending on äer amino acid sequence and taking into account essential structural elements Peptidwirks.toffen or biologically active analogs, including shortened or modifizier - 3- 3 -IB--IB- ten Teilsequenzen, über eine .freie N-terminale Amino- bzw* C-terminale Carboxylgruppe bzw. eine freie CO -Amino- oder Carboxylfunktion in der Seitenkette oder über Brük- kenreagenzien, wie Dicarbonsäuren oder Alkyldiamine, über Säureamidbindungen verknüpft, anschließend die verbliebenen Schutzgruppen vollständig oder partiell entfernt werden und nach Reinigung die Wirkstoff-Cyclopeptid-Konjugate erhalten werden.partial subsequences, linked via a .free N-terminal amino or * C-terminal carboxyl group or a free CO amino or carboxyl function in the side chain or via bridging reagents , such as dicarboxylic acids or alkyldiamines, via acid amide bonds, then the remaining protective groups be completely or partially removed and after purification, the drug-cyclopeptide conjugates are obtained. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die cyclischen Peptide der allgemeinen Formeln IX bis XII durch Ringschluß der linearen Strukturen V bis VIII gebildet werden, wobei als Cyclisierungsstrategie das DCCI-Verfahren mit Zusatzkomponenten oder die Mischanhydrid-Methode gewählt werden, wenn T für OH steht, das Azidverfahren gewählt wird, wenn T für NH - NH₂ steht und die Aktivesteraminolyse gewählt wird, wenn T für aktivierter Ester steht.3. The method according to item 1, characterized in that the cyclic peptides of the general formulas IX to XII are formed by ring closure of the linear structures V to VIII, being selected as the cyclization strategy, the DCCI process with additional components or the mixed anhydride method, if T OH is the azide method chosen when T is NH - NH ₂ and active ester aminolysis is chosen when T is activated ester.