DD140459A5 - PROCESS FOR PREPARING 2,5-DIKETOGLUCONE ACID - Google Patents

Description

Verfahren zur Herstellung von 2,5-DiketogluconsäureProcess for the preparation of 2,5-diketogluconic acid

Anwendungsgebiet der Erfindung: Field of application of the invention:

Pie· Erfindung betrifft die Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure, von 2-Ketogulonsäure und 2-Ketoglu.consäure.Pie invention relates to the preparation of 2,5-diketogluconic acid, of 2-ketogulonic acid and 2-Ketoglu.consäure.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:Characteristic of the known technical solutions:

2,5-Diketogluconsäure ist ein brauchbares Zwischenprodukt bei der Synthese von Vitamin C. Bislang wurde 2,5-Diketoglucons&ure von mehreren unterschiedlichen Arten von Bakterien wie Acetobacter melanogenum, Acetobacter aurantiuin, Gluconoacetobacter rubiginosus, Gluconoacetobacter liquifaciens und Pseudomonas sesami gebildet. Die Verwendung dieser Mikro-' Organismen ist jedoch vom technischen Standpunkt aus nicht2,5-diketogluconic acid is a useful intermediate in the synthesis of vitamin C. So far, 2,5-diketogluconic acid has been produced by several different types of bacteria such as Acetobacter melanogenum, Acetobacter aurantiuin, Gluconoacetobacter rubiginosus, Gluconoacetobacter liquifaciens and Pseudomonas sesami. However, the use of these microorganisms is not technically

vollständig zufriedenstellend wegen der großen Mengen an braunen oder gelblich-braunen Pigmenten als Nebenprodukten der Kultivierung, wodurch die Reinheit der gleichzeitig gebildeten 2,5-Diketogluconsäure vermindert wird.completely satisfactory because of the large amounts of brown or yellowish-brown pigments as by-products of the cultivation, whereby the purity of the co-formed 2,5-diketogluconic acid is reduced.

In der US-Patentschrift 3 790 444 ist die Bildung von 2,-5-Diketoglucon'säure ohne begleitendes, braunes Pigment durch eine neue Species, welche als Acetobacter fragunr bezeichnet wird, beschriebenU.S. Patent 3,790,444 discloses the formation of 2, 5-diketogluconic acid without accompanying brown pigment by a novel species called Acetobacter fragunr

.Ziel der Erfindung;.The aim of the invention ;

Die vorliegende Erfindung betrifft ein wirtschaftliches Verfahren auj? .Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure unter Verwendung von leicht zugänglichen, öffentlich aufbewahrten Stämmen von Acetobacter cerinus. Zwei dieser Stämme , nämlich IFO 3263 und J266,bilden 2,5~Diketogluconsäure in Ausbeuten von > 95 %» · bezogen auf Glucose.The present invention relates to an economical method auj? Preparation of 2,5-diketogluconic acid using readily available, publicly stored strains of Acetobacter cerinus. Two of these strains, namely IFO 3263 and J266, form 2,5-diketogluconic acid in yields of > 95% with respect to glucose.

Darlegung des Wesens der Erfindung: Darlegun g of W esens de r Fiction invention:

2,5~2iketogluconsäure ist als Zwischenprodukt zur Herstellung von Ascorbinsäure brauchbar. Eine wäßrige Lösung von 2,5~I⁾iketcgluconsäure kann selektiv reduziert werden, um ein Gemisch von 2~Ketogulonat und 2-Xetogluccnat zu bilden, welche zu Ascorbinsäure und Erythrobinsäure (Isoascorbinsäure) umgewandelt werderkönnen. . .2,5-2-ketogluconic acid is useful as an intermediate for the production of ascorbic acid. An aqueous solution of 2.5 ~ ^I) iketcgluconsäure can be selectively reduced to form a mixture of 2 ~ ketogulonate and 2-Xetogluccnat, Werder can be converted which (to ascorbic acid and erythorbic isoascorbic acid). , ,

2,5~Diketogluconsäure wird einfach durch die bakterielle Wirkung auf Glucose gebildet, wobei gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren leicht zugängliche Stämme von Acetobacter cerinus eingesetzt werden. Alle die aufgeführten, öffentlich gehaltenen Stämme von Acetobacter cerinus wurden untersucht und zeigten bei dieser Untersuchung, daß sie Ketosäuren in einer Ausbeute von 50 bis 95 %» bezogen auf Glucose, bilden. Venn Acetobacter cerinus IFO 3263 oder 3266 verwendet wird, besteht die gebildete Ketosäure vollständig aus der gewünschten 2,5-Diketogluconsäure in Ausbeuten von > 95 %» bezogen auf Glucose. Die zugänglichen, Öffentlich gehaltenen Stämme von Acetobacter cerinus sind wie folgt:2,5-diketogluconic acid is readily formed by the bacterial action on glucose, using easily accessible strains of Acetobacter cerinus according to the method of the invention. All of the listed publicly available strains of Acetobacter cerinus were examined and showed in this study that they form keto acids in a yield of 50 to 95% based on glucose. When Acetobacter cerinus IFO 3263 or 3266 is used, the keto acid formed consists entirely of the desired 2,5-diketogluconic acid in yields of> 95% with respect to glucose. The accessible, publicly held strains of Acetobacter cerinus are as follows:

08 8608 86

IFO 5262 (ATCG 12503)IFO 5262 (ATCG 12503)

5265 .5265.

5264-5264-

3265 5266 3267 5268 32693265 5266 3267 5268 3269

Diese Stämme von Acetobacter ceri'nus werden in einem Medium besuchtet, dessen Hauptkohlenstoffquelle Glucose ist. Diese .Mikroorganismen erfordern keine kostspieligen Quellen für organischen Stickstoff wie Pepton oder Fleischextrakt. Wenn Harnstoff und Quellen für anorganischen Stickstoff wie Anrmonium-sulfat, Ammoniumnitrat oder Ammoniumphosphat verwendet werden, •wird Nikotinsäure als essentieller Wachsturasfaktor zügesetst. . These strains of Acetobacter ceri'nus are visited in a medium whose main source of carbon is glucose. These microorganisms do not require expensive sources of organic nitrogen such as peptone or meat extract. When urea and inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium nitrate or ammonium phosphate are used, nicotinic acid is added as an essential growth factor. ,

Die Glucosekonzentration in dem Medium variiert 'zwischen 2,5 vmu 20 %i vorzugsweise zwischen 10 und 12.%, um 2,5-Diketogluconsäure in besonders wirtschaftlicher V/eise zu erhalten. Die Ferroentationstemperatur liegt zwischen 20 ⁰C und 35 ⁰C und vorzugsweise zwischen 25 und 30 C, ganz besonders bevorzugt in der 'Nähe von 28 ⁰C. Der.Anfangs-pH-Vert des Kulturmediums kann· von" 5λ5 bis 7>5 ¹^d vorzugsweise von 5 bis 6 variieren. Im Verlauf der Fermentation wird der pH-Wert bei etwa 5>5 durch Zugabe von Jiötriumhydroxidlösung gehalten. Calciumcarbonat kann zur pK-Steuerung verwendet werden, und es wird in einem Ansatzmedium i>ech der Autoklavenbehandlung in einer Menge von 30 g pro 110 g zugesetzt.The concentration of glucose in the medium varies between 2.5 and 20%, preferably between 10 and 12%, in order to obtain 2,5-diketogluconic acid in a particularly economical manner. The Ferroentationstemperatur is between 20 ⁰ C and 35 ⁰ C and preferably between 25 and 30 ° C, very particularly preferably in the 'vicinity of 28 ⁰ C. Der.Anfangs pH of the culture medium can Vert · of "5λ5 to 7> 5 ¹ Preferably, the pH varies from 5 to 6. In the course of the fermentation, the pH is maintained at about 5> 5 by the addition of iodonium hydroxide solution. Calcium carbonate can be used for pK control and is applied in a batch medium in autoclave treatment an amount of 30 g per 110 g added.

dem Impfen wird das Pementationsmedium mit einem mechanischen Rührer bei etwa 17ΟΟ IJpm gerührt, und es wird in einer Rate von 0,5 bis 1 Volumen Luft pro Volumen der Brühe pro* Minute belüftet.for seeding, the pemtation medium is stirred with a mechanical stirrer at about 17ΟΟIJpm, and it is aerated at a rate of 0.5 to 1 volume of air per volume of broth per minute.

der Verwendung von Acetobacter cerinus IFO 3263 oder 3266 wird die Fermentat-ion solange durchgeführt, bis eine Ausbeutethe use of Acetobacter cerinus IFO 3263 or 3266, the fermentation-ion is carried out until a yield

von 2,5-Diketogluconsäure von wenigstens 90 %, bezogen auf Glucose, erhalten wird, wobei dies üblicherweise 56 bis 40 Stunden erfordert.of 2,5-diketogluconic acid of at least 90%, based on glucose, which usually requires 56 to 40 hours.

Papierchromatografisch wurde bestimmt, daß die Umwandlung von Glucose zu 2,5~Diketogluconsäure auf folgenden Wegen verläuft:It was determined by paper chromatography that the conversion of glucose to 2,5-diketogluconic acid proceeds in the following ways:

Glucose —δ* 2-Ketogluconsäure ~-S> 2,5-Diketogluconsäure Glucose -9* 5-Ketogluconsäiire — > 2_ip-Diketogluconsäure.Glucose-δ * 2-ketogluconic acid ~> 2,5-diketogluconic acid glucose-9 * 5-ketogluconic acid -> 2 _i p-diketogluconic acid.

Als Chromatografierpapier wurde handelsübliches Filterpapier (Whatman Mo«. 1 und No. 4) verwendet, als Lösungsmittelsysteia MethyläthylketonjAcetonrAmeisensäureiWasser (80:6:2:12). Die Flecken der Säure wurden durch Besprühen mit einer 0,2 %igen äthanolischen Lösung von o-Phenylendiamin, welche 1 % Salpetersäure enthielt, und Erwärmen auf etwa ?0 ⁰C lokalisiert, wobei 5-Eetogluconsäure eine blaue Färbung, 2-Ketogluconsäure eine gelbe Färbung und 2,5-Diketogluconsäure eine grüne Färbung ergeh. Zur Identifizierung kann ebenfalls die Hochdruckflüssigkeit schromatografie eingesetzt werden.The chromatographic paper used was commercial filter paper (Whatman Mon. 1 and No. 4), as the solvent system methyl ethyl ketone / acetone / formic acid / water (80: 6: 2: 12). The spots of the acid was carried out by spraying with a 0.2% ethanolic solution of o-phenylenediamine, containing 1% nitric acid, and heating to about? 0 ⁰ C localized to give 5-Eetogluconsäure a blue color, 2-ketogluconic a yellow Staining and 2,5-diketogluconic acid a green color. For identification, the high pressure liquid chromatography can also be used.

2_S5-I⁾ike1;ogluconsäure kann aus der zum Schluß erhaltenen Fermentationsbrühe nach jeder beliebigen, dem Fachmann an sich bekannten, konventionellen Arbeitsweise abgetrennt und gewonnen werden. Pie filtrierte Fermentationsbrühe kann als solche durch Behandlung mit einem Borhydrid weiterverarbeitet werden, und das erhaltene Gemisch von 2-Zetogluconsäure und 2-Ketogulonsäure kann unter Bildung von Ascorbinsäure und Erythorbinsäure hydrolysiert werden.2 _S 5-I ⁾ ogluconic acid can be separated and recovered from the finally obtained fermentation broth by any conventional procedure known per se to the person skilled in the art. Pie filtered fermentation broth can be further processed as such by treatment with a borohydride, and the resulting mixture of 2-zetogluconic acid and 2-ketogulonic acid can be hydrolyzed to form ascorbic acid and erythorbic acid.

A us f ühruji gsbe i spiele: .F ettings:.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutertThe invention will be explained in more detail with reference to the following examples

Das folgende wäßrige Impfmedium wurde'hergestellt:The following aqueous seed medium was prepared:

Bestandteil · g/lComponent · g / l

Glucose 25Glucose 25

Maisquellwasser · 5Corn steep liquor · 5

PO₄ . 0,5PO ₄ . 0.5

K₂HPO₄ 0,5K ₂ HPO ₄ 0.5

0,2 pH =6,20.2 pH = 6.2

Eine Schütuelflasche, welche 1 1 des Mediums enthielt, wurde 30 Minuten "bei 121 ⁰C im Autoklaven behandelt. Der pH-Wert des abgekühlten Mediums lag bei 5iO. Zellen von Acetcbacter cerinus IFO 3263 aus einer Iiähragar/Schrägplatte (5 nil einer 20 ml sterilen, wäßrigen Suspension) wurden in die Flasche gegeben, die dann auf einem Drehschuttier bei etwa 28 ⁰C für etv:a 2M- Stunden geschüttelt wurde.A Schütuelflasche containing 1 1 of the medium was treated for 30 minutes, "at 121 ⁰ C in the autoclave. The pH of the cooled medium was 5iO. Cells of Acetcbacter cerinus IFO 3263 from a Iiähragar / bevel plate (5 nil of a 20 ml sterile aqueous suspension) were added to the bottle, which then on a Drehschuttier at about 28 ⁰ C for etv: a 2M hours was shaken.

Eine Teilmenge der Kulturzüchtungsbrühe, welche zur Bereitste lung einer 5 Vol./Vol.-% Impfmenge ausreichte, wurde in einen 4-1-Permenta.tor gegeben, der 2 1 des folgenden Produktionsniedrums enthielt:A subset of the culture broth, sufficient to provide a 5 v / v% inoculum, was added to a 4-1 permenta port containing 2 l of the following production level:

Bestandteil g/lComponent g / l

Glucose 110 Haisquellwasser 0,5Glucose 110 Shark water 0.5

(NH₄)₂HP0^ 0,58(NH ₄ ) ₂ HP0 ^ 0.58

KH₂PO₄ 1,5KH ₂ PO ₄ 1.5

MgSO₄.7H₂O 0,5MgSO ₄ .7H ₂ O 0.5

Harnstoff 0,5Urea 0.5

CuSO₄.5H₂O * 1 mgCuSO ₄ .5H ₂ O * 1 mg

Nikotinsäure 500'ug,. pH e. 6,0Nicotinic acid 500'ug ,. pH e. 6.0

Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von etwa 28 ⁰C unter Rühren bei i?00 Upm und Belüftung mit einer Rate von 0,75 VolumenThe fermentation was carried out at a temperature of about 28 ⁰ C under stirring at i? 00 rpm and aeration at the rate of 0.75 volume

pro Volumen der Brühe pro Hinute durchgeführt« Nach einer Fermentationsperiode von etwa 20 Stunden wurde sterile Glucose (5> g/i) zugesetzt ο Der pH-Wert .'wurde-auf 5» 5 durch Zugabe von Hatriumhydroxidlösung gehalten» Die Fermentation wurde fortgeführt , bis eine Ausbeute von 2,5~Diketogluconsäure von > 95 %» bezogen auf Glucose, erreicht war. .After a fermentation period of about 20 hours, sterile glucose (5 g / i) was added. The pH was kept at 5-5 by the addition of sodium hydroxide solution. The fermentation was continued. until a yield of 2.5 ~ diketogluconic acid of> 95%, based on glucose, was reached. ,

Die -Arbeitsv;eise von Beispiel 1 wurde rut. vergleichbaren Ergebnissen wiederholt, viobei Acetobacter cerinus IFO 5266 eingesetzt wurde. ·The work of Example 1 was rut. similar results using Acetobacter cerinus IFO 5266 was repeated. ·

Claims (2)

Erf indungsanspriichErfindungsanspriich 1. Verfahren zur Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure, dadurch gekennzeichnet., daß Acetobactei· cerinus in einem Glucosemedium aerob vermehrt wird und dann die erhaltene 2,5~Diketogluconsäure gewonnen wird oder die Fermentaticnsbrühe durch selektive Reduktion unter Bildung von 2-Ketogulonsäure und 2-Xetogluconsäure verarbeitet wird,1. A process for the preparation of 2,5-diketogluconic acid, characterized in that Acetobactei · cerinus is aerobically propagated in a glucose medium and then the obtained 2,5 ~ diketogluconic acid is obtained or the fermentation broth by selective reduction to form 2-ketogulonic acid and 2-Xetogluconic acid is processed, 2· Verfahren nach 3?unkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Glucosekonzentration im Medium von 2,5 bis 20 % beträgt, die Fermentationstemperatur von 20 ⁰C bis 35 ⁰C ist, der anfängliche pH-Wert von 3*5 "bis 7_?5 beträgt und der pH-Vert während der Permentation bei etwa 5,5 gehalten wird.Method according to claim 3, characterized in that the glucose concentration in the medium is from 2.5 to 20%, the fermentation temperature is from 20 ^° C. to 35 ^° C., the initial pH is from 3 * 5 "to 7 _? 5 and the pH-Vert is maintained at about 5.5 during the perforation. J. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Acetobacter cerinus der Stamm IFO 3263 verwendet wird.J. Method according to item 1 or 2, characterized in that the strain IFO 3263 is used as Acetobacter cerinus. 4. Verfahren nach . Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Acetobacter cerinus der Stamm IFO 3266 verwendet wird.4. Method according to. Item 1 or 2, characterized in that the strain IFO 3266 is used as Acetobacter cerinus.