DD139859A5 - PROCESS FOR PREPARING 21-HYDROXY-20-METHYLPREGNANESE - Google Patents

PROCESS FOR PREPARING 21-HYDROXY-20-METHYLPREGNANESE Download PDF

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DD139859A5 DD78209813A DD20981378A DD139859A5 DD 139859 A5 DD139859 A5 DD 139859A5 DD 78209813 A DD78209813 A DD 78209813A DD 20981378 A DD20981378 A DD 20981378A DD 139859 A5 DD139859 A5 DD 139859A5
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fermentation
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Alfred Weber
Mario Kennecke
Rudolf Mueller
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Schering Ag
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/005—Degradation of the lateral chains at position 17
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane

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Description

- A- - A-

Berlin, den 21.11.1978 54Berlin, 21.11.1978 54

Verfahren zur Herstellung von 21-Hydroxy-20-methylpregnanenProcess for the preparation of 21-hydroxy-20-methylpregnanen

Anwendun.gjs^ebiet,,der ErfindungApplication of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 21-Hydroxy-20-methylpregnanen.The invention relates to a process for the preparation of 21-hydroxy-20-methylpregnanen.

Charakteristik der bekannte^JLechnisehen{LösungenCharacteristic of the known ^ {JLechnisehen solutions

Es ist bekanntj daß Kulturen von Mycobacterium spec. KIlRL B-3683 und NRRL B-38O5 die Fähigkeit besitzen, aus Zoo- oder Phytosterinen 21~Hydroxy~20-methyl-pregnan-Derivate der allgemeinen Formel I zu bilden (Applied. Microbiology 2J3, 1972, 72 ff. und Applied and Enviromental Microbiology £2, 1976» 310 ff.). Diese Verbindungen werden aber nur spurenweise oder in sehr geringen Ausbeuten gebildet, so daß das bekannte Verfahren technisch kaum anwendbar ist·It is known that cultures of Mycobacterium spec. KIlRL B-3683 and NRRL B-38O5 have the ability to form from zoon or phytosterols 21 ~ hydroxy ~ 20-methyl-pregnane derivatives of the general formula I (Applied, Microbiology 2J3, 1972, 72 ff and Applied and Enviromental Microbiology £ 2, 1976 »310 et seq.). However, these compounds are formed only by trace or in very low yields, so that the known method is technically hardly applicable ·

Ziel der ErfindungObject of the invention

Es ist Ziel der Erfindungj signifikant höhere Ausbeuten an 21-Hydroxy-20-methyl-pregnan-Derivaten der allgemeinen Formel I zu erzielen.It is an object of the invention to achieve significantly higher yields of 21-hydroxy-20-methyl-pregnane derivatives of general formula I.

21.11.1978 20 9 81 3 " 2 " 54 491/1221.11.1978 20 9 81 3 " 2 " 54 491/12

Darlegung deg Wesens der ErfindungExplanation of the nature of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde. Verfahren zur Herstellung von 21-Hydroxy~20~methylpregnanen zu entwickeln. The invention is based on the object. To develop processes for the preparation of 21-hydroxy-20-methylpregnanen.

Erfindungsgemäß gelingt dies mit Hilfe von Zoo- oder Phytosterinen mit einer Kultur von Mycobacterium spec. MRL B-3683 oder HRRL B-3805 oder seiner Varianten und Mutanten in Gegenwart von Borationen oder organischen Borverbindungen*According to the invention, this is achieved with the help of zoo or phytosterols with a culture of Mycobacterium spec. MRL B-3683 or HRRL B-3805 or its variants and mutants in the presence of borate ions or organic boron compounds *

Geeignete Zoo- oder Phytosterine für die Fermentation sind beispielsweise Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin» Brassicasterin oder die Sitosterine, die 3-Acylverbindungen - wie sum Beispiel die Acetate dieser Sterine oder die aus diesen Sterinen durch Oppenauer-Oxydation erhaltenen 3-Keto- Δ^-steroide, wie zum Beispiel 4-Gholesten-3-on, 4-Stigmasten-3~onj 4-Sitosten~3-on oder 4-Campesten-3-on·Suitable zoological or phytosterols for the fermentation are, for example, cholesterol, stigmasterol, campesterol »brassicasterine or the sitosterols, the 3-acyl compounds-such as, for example, the acetates of these sterols or the 3-keto-Δ ^ obtained from these sterols by Oppenauer oxidation. steroids, such as 4-Gholesten-3-one, 4-Stigmasten-3 ~ onj 4-Sitosten ~ 3-on or 4-Campesten-3-one ·

Erfindungsgemäß wird die Fermentation in Gegenwart von Borationen oder organischen Borverbindungen durchgeführt. Geeignete Borverbindungen sind beispielsweise Borsäure, Hatriummetaborat, Dinatriumtetraborat, CaIciummetaborat oder Triphenylborat» Die Fermentation wird vorzugsweise in Gegenwart von:0,1 % bis 0,5 % Borationen liefernde Agenzien durchgeführt» Die Zugabe der Borationen liefernden Agenzien erfolgt vorzugsweise 10 bis 30 Stunden nach Fermentationsbeginn«According to the invention, the fermentation is carried out in the presence of borate ions or organic boron compounds. Suitable boron compounds are, for example, boric acid, sodium metaborate, disodium tetraborate, calcium metaborate or triphenylborate. The fermentation is preferably carried out in the presence of: 0.1 % to 0.5 % borate-providing agents. The addition of the boration-providing agents is preferably carried out 10 to 30 hours after the start of fermentation "

Bei der Zugabe der Borationen liefernden Agenzien istWhen adding the Borationen supplying agents

2.1.11.1978 209 81 3 - 3 - 54 491/122.1.11.1978 209 81 3 - 3 - 54 491/12

darauf zu achten, daß der pH-Wert der Fermentationskultur in üblicher Weise auf einen Wert zwischen 6,0 und 8,0 eingestellt wird.make sure that the pH of the fermentation culture is adjusted in the usual way to a value between 6.0 and 8.0.

Ansonsten wird die Fermentation unter den üblichen Bedingungen durchgeführt. Die Mikroorganismen werden in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man den Kulturen das Substrat (in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst oder vorzugsweise in emulgierter Form) .zu und fermentiert, bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist (ca. 96 - 160 Stunden).Otherwise, the fermentation is carried out under the usual conditions. The microorganisms are grown in a suitable nutrient medium while aerating submerged cultures. The substrates are then added to the cultures (dissolved in a suitable solvent or preferably in emulsified form) and fermented until a maximum substrate conversion is achieved (about 96-160 hours).

Geeignete Substratlösungsmittel sind beispielsweise Methanol, Äthanol, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd). Die Emulgierung des Substrats kann beispielsweise bewirkt werden, indem man dieses in mikronisierter Form oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (wie Methanol, Äthanol, Aceton, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd) gelöst unter starker Turbulenz in (vorzugsweise entkalktem) Wasser, welches die üblichen Emulgationshilfen enthält, eindüst. Geeignete Emulgationshilfen sind nichtionogene Emulgatoren, wie zum Beispiel Äthylenoxydaddukte oder Fettsäureester von Polyglykolen. Als geeignete Emulgatoren seien die handelsüblichen netzmittel Tegin^, Tagat'R', Tween' ' und Span^ ' beispielsmäßig genannt«:Suitable substrate solvents are, for example, methanol, ethanol, glycol monomethyl ether, dimethylformamide or dimethyl sulfoxide). The emulsification of the substrate can be effected, for example, by dissolving it in micronized form or in a water-miscible solvent (such as methanol, ethanol, acetone, glycol monomethyl ether, dimethylformamide or dimethyl sulfoxide) with strong turbulence in (preferably decalcified) water, which is the usual Contains emulsifying aids. Suitable emulsifying aids are nonionic emulsifiers, such as, for example, ethylene oxide adducts or fatty acid esters of polyglycols. As suitable emulsifiers, the commercially available wetting agents Tegin®, Tagat ' R ', Tween '' and Span ^ 'may be mentioned by way of example.

Bei der Fermentation ermöglicht die Emulgierung der Substrate oft einen erhöhten Substratdurchsatz und somit eine Steigerung der Substratkonzentration. Es ist aber selbstverständlich auch möglich, bei dem erfindungsgemäßenIn the fermentation, the emulsification of the substrates often allows an increased substrate throughput and thus an increase in the substrate concentration. But it is of course also possible in the inventive

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Verfahren andere Methoden zur Steigerung des Substratdurchsatzes, wie sie dem Permentationsfachmann wohl bekannt sind, anzuwenden. ,Methods other methods for increasing the substrate throughput, as well known to the person skilled in the art of purging, apply. .

Die optimale Subatratkonzentration, Substratzugabezeit und Fermentationsdauer ist von der Struktur des verwendeten Substrates abhängig. Diese Größen müssen, wie dies bei mikrobiologischen Steroidumwandlungen allgemein erforderlich ist, im Einzelfall durch Vorversuche f wie sie dem Fachmann geläufig sind, ermittelt werden.The optimum subatrate concentration, substrate addition time and fermentation time depend on the structure of the substrate used. These values, as is generally necessary in microbiological steroid conversions, be determined by preliminary tests f as are familiar to the skilled person in each individual case.

Eine v/eitere Steigerung an Verfahrensprodukten läßt sich erzielen, wenn man die Mycobacterien Species in üblicher Weise selektiert oder mutierteA further increase in process products can be achieved by selecting or mutating the Mycobacteria species in the usual way

So kann man beispielsweise Mycοbacterium spec. IiRRL B-3805 - zweckmäßigerweise nach Behandeln mit Mutagenen - auf Blut-Agar-Platten ausplatten und erhält Einzelkolonien von unterschiedlichem morphologischen Aussehen. Isoliert man diese Einzelkolonien und prüft sie auf ihre Fähigkeit zur Bildung von 21-Hydroxy-20-methyl~pregnan*-Derivaten der allgemeinen Formel I, so findet man, daß inabesondere unter den Selektionsstämmens die runde Kolonien bilden, oft Stämme sind, die eine 1S5 bis 3-fach höhere Ausbeute an 21«Hydroxy-20-methyl~pregnan~Derivaten bilden als der nichtselektierte Stamm«For example, Mycobacterium spec. IiRRL B-3805 - expediently after treatment with mutagens - plate out on blood agar plates and receives single colonies of different morphological appearance. Isolating these single colonies and testing for their ability to form 21-hydroxy-20-methyl-pregnane * derivatives of general formula I, it is found that in particular among the selection strains s form round colonies, often strains are a 1 S 5-3-fold higher yield of 21 "hydroxy-20-methyl pregnan ~ ~ derivatives form than the non-selected strain"

Die 21-Hydrosy~20-methyl~pregnan-Derivate der allgemeinen Formel I sind wertvolle Zwischenprodukte zur Synthese pharmakologisch wirksamer Steroide. So ist es beispielsweise möglich^ diese Verbindungen zu den entsprechenden Pregnan-20-carbonsäuren der allgemeinen Formel III zuThe 21-hydrosyl-20-methyl-pregnane derivatives of general formula I are valuable intermediates for the synthesis of pharmacologically active steroids. For example, it is possible to add these compounds to the corresponding pregnane-20-carboxylic acids of general formula III

13 -13 -

21.1T.197821.1T.1978

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oxydieren, welche nach dem von H. Ruschig et al. (Chem. Ber. 88, 1955, 883 ff) beschriebenen Verfahren in die entsprechenden Pregnan-3,20-dion-Derivate der Formel IV überführt werden können.which oxidize according to the method described by H. Ruschig et al. (Chem. Ber. 88, 1955, 883 ff) described in the corresponding pregnane-3,20-dione derivatives of formula IV can be converted.

H3C CH2OHH 3 C CH 2 OH

COOHCOOH

IIIIII

CH3 C=OCH 3 C = O

(Y = Wasserstoff oder 1?c*-Hydroxy)(Y = hydrogen or 1? C * -hydroxy)

Die so erhaltenen Verbindungen zeichnen sich bekanntlich durch ihre gestagene Wirksamkeit aus und sind darüber hinaus wertvolle Zwischenprodukte zur Synthese zahlreicher pharmakologisch wirksamer Steroide.The compounds thus obtained are known for their gestagenic activity and are also valuable intermediates for the synthesis of numerous pharmacologically active steroids.

21.11.1978 f 3 - 6 - 54 491/1221.11.1978 f 3 - 6 - 54 491/12

Erfindungsbei spie 1 ' ..-.'.Erfindungsbei spie 1 '..-.'.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.The following examples serve to illustrate the invention.

Beispiel 1example 1

a) Ein 2 1 Erlenmeyerkolben mit 500 ml sterilem Nährmedium enthaltend 1 % Hefeextrakta) A 2 1 Erlenmeyer flask containing 500 ml of sterile nutrient medium containing 1 % yeast extract

0,45 % Mnatriumhydrogenphosphat 0,34 % Kaliumdihydrogenphosphat 0,2 % TagatR02 - eingestellt auf pH 6,7 -0.45 % sodium hydrogen phosphate 0.34 % potassium dihydrogen phosphate 0.2 % Tagat R 02 - adjusted to pH 6.7 -

wird mit einer Abschwemmung einer Trockenkultur von Mycobacterium spec. URHL B-3805 beimpft und 3 Tage . mit 190 Umdrehungen pro Minute bei 3O0C geschüttelt.is washed off with a desiccation of a dry culture of Mycobacterium spec. URHL B-3805 inoculated and 3 days. Shaken at 190 revolutions per minute at 3O 0 C.

b) 22 g Sitosterin v/erden mit 4,4 g Teginv ' und 430 ml Wasser bei 950C mit einem Intensivrührer (ültra-Turrax) 25 Minuten emulgiert und anschließend auf 513 g mit Wasser aufgefüllt. Man sterilisiert die Emulsion 20 Minuten lang bei 1200C.b) 22 g sitosterol v / erden with 4.4 g of Tegin v 'and 430 ml of water at 95 0 C with an intensive stirrer (ültra-Turrax) emulsified for 25 minutes and then made up to 513 g with water. The emulsion is sterilized at 120 ° C. for 20 minutes.

c) Bin 500 ml Erlenmeyerkolben mit 65 ml sterilem Nährmedium -c) Bin 500 ml Erlenmeyer flask with 65 ml of sterile nutrient medium -

enthaltend 2 g Cornsteep liquorcontaining 2 g Cornsteep liquor

0,3 g Diammoniumhydrogenphosphat0.3 g diammonium hydrogen phosphate

0,25 g Tagat(R)020.25 g of Tagat (R) 02

- eingestellt auf pH 6,5 -- adjusted to pH 6.5 -

wird mit 5 ml der Mycobacterium spec..Anzuchtskultur beimpft« Dann werden 28 ml der unter Ib) hergestellten Suspension (dies entspricht 1,2 g Sitosterin) und nach 24 Stunden 4 ml 4 %ige wäßrige Natriumtetra-is inoculated with 5 ml of the Mycobacterium spec. cultivation culture. Then 28 ml of the suspension prepared under Ib) (this corresponds to 1.2 g sitosterol) and after 24 hours 4 ml of 4 % aqueous sodium tetra-

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boratlösung zugegeben und weitere 120 Stunden lang bei 300C unter Schütteln fermentiert.borate solution and fermented for a further 120 hours at 30 0 C with shaking.

Nach erfolgter Fermentation wird die Kulturbrühe 2 mal mit je 100 ml Äthylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Äthylenchloridextrakte werden sodann mit 11g Aktivkohle versetzt und über ein Faltenfilter filtriert. Das Filtrat wird anschließend bei 400C im Rotationsverdampfer eingeengt und an Aluminiumoxid chromatographiert. Nach erfolgter Chromatographie erhält man 135 mg 21-Hydroxy-20~methyl-4-pregnen-3-on vom Schmelzpunkt HO - 1410C (aus Äthylacetat).After fermentation, the culture broth is extracted twice with 100 ml of ethylene chloride. The combined Äthylenchloridextrakte are then mixed with 11 g of activated carbon and filtered through a pleated filter. The filtrate is then concentrated at 40 0 C in a rotary evaporator and chromatographed on alumina. After the chromatography, 135 mg of 21-hydroxy-20 ~ methyl-4-pregnen-3-one of melting point HO - 141 0 C (from ethyl acetate).

Führt man die Reaktion unter den gleichen Bedingungen, aber ohne Zusatz von l'Tatriumtetraborat lösung durch, so erhält man 45 mg 21-Hydroxy-20-methyl~4-pregnan~3-on.Performing the reaction under the same conditions, but without the addition of l'tatrium tetraborate solution, we obtain 45 mg of 21-hydroxy-20-methyl-4-pregnan-3-one.

Bej!spJ:el_J>Bej ! spJ : el_J>

a) Aus 22 g 4~Cholesten-3-on wird wie im Beispiel 1b beschrieben, 513 g Emulsion hergestellt.a) From 22 g of 4 ~ cholesten-3-one is prepared as described in Example 1b, 513 g of emulsion.

b) Unter den Bedingungen des Beispiels 1c werden 70 ml einer Mycobacterium spec. MRRL B-3805 Kultur angezüchtet, mit 28 ml der 4-Cholesten-3~on-3mulsion und nach 24 Stunden mit 4 ml 4 %iger wäßriger IJatriumtetraboratlösung versetzt und weitere 120 Stunden lang bei 3O0C unter Schütteln fermentiert.b) Under the conditions of Example 1c, 70 ml of a Mycobacterium spec. MRRL B-3805 grown culture with 28 ml of 4-cholesten-3 ~ on-3mulsion and after 24 hours with 4 ml of 4% aqueous IJatriumtetraboratlösung added and a further 120 hours fermented at 3O 0 C with shaking.

Man arbeitet den Fermentationsansatz auf, wie im Beispiel 1c beschrieben und erhält 95 mg 21-Hydroxy-20-methyl-4-pregn<?rn-3=on vom Schmelzpunkt 142 - 1440C.The fermentation mixture is worked up as described in Example 1c and receives 95 mg of 21-hydroxy-20-methyl-4-pregn <? r n-3 = on of melting point 142 - 144 0 C.

21.11.1978 - 8 - ' 54 491/1221.11.1978 - 8 - '54 491/12

Führt man die Reaktion unter den gleichen Bedingungen, aber ohne Zusatz von Katriumtetraboratlösung aus, so erhält man 40 mg 21-Hydroxy-20~methyl-4~pregnen--3-on.Carrying out the reaction under the same conditions, but without the addition of Katriumtetraboratlösung, we obtain 40 mg of 21-hydroxy-20 ~ methyl-4 ~ pregnen-3-one.

Beispiel! ·Example! ·

28 ml der gemäß Beispiel 1b hergestellten Sitosterin-Emulsion werden wie im Beispiel 1c beschrieben mit 70 ml einer Mycobacterium spec. HRRL B-3305 Kultur fermentiert, wobei man anstelle der wäßrigen üTatriumtetraboratlösung einen Zusatz von 6 ml 4 %iger Kaisiummetaboratsuspension in Wasser verwendet*28 ml of the prepared according to Example 1b sitosterol emulsion are as described in Example 1c with 70 ml of a Mycobacterium spec. HRRL B-3305 fermented culture, using instead of the aqueous üTatriumtetraboratlösung an addition of 6 ml of 4% Kaisiummetaboratsuspension in water *

Nach Aufarbeitung des Fermentationsansatzes, wie im Beispiel 1c beschrieben, erhält man 120 mg.21-Hydroxy~20-methyl-4-pregnen-3-on vom Schmelzpunkt 14*1 ..- 1430C*After working up of the fermentation batch, as described in Example 1c, 120 mg of 21-hydroxy-20-methyl-4-pregnen-3-one of melting point 14 * 1 ..- 143 0 C *

28 ml der gemäß Beispiel 1b hergestellten Sitosterin-Emulsion werden, wie im Beispiel Ic beschrieben, mit 70 ml einer Mycobacterium spec. IRRl B-3805 Kultur fermentiert, wobei man anstelle der wäi3rigen Eatriunitetraborat lösung einen Zusatz von 5 ml einer 4 $igen Triphenylboratlb'sung verwendet*28 ml of the prepared according to Example 1b sitosterol emulsion, as described in Example Ic, with 70 ml of a Mycobacterium spec. IRRl B-3805 culture using instead of the aqueous sodium triturate solution an addition of 5 ml of a 4% triphenylborate solution *

ÜTach Aufarbeitung des Permentationsansatzes, wie im Beispiel 1c beschrieben, erhält man 125 mg/21-Hydroxy-20-methyl«4-pregnen-3-on vom Schmelzpunkt 142 - 1430C.After workup of the Permentationsansatzes, as described in Example 1c, there are obtained 125 mg / 21-hydroxy-20-methyl-4-pregnen-3-one of melting point 142 - 143 0 C.

Beispiel!?Example!?

a) Unter den Bedingungen des Beispiels 1a wird eine Mycobacterium spec. NRRL B~3β83 Kultur angezüchtet.a) Under the conditions of Example 1a, a Mycobacterium spec. NRRL B ~ 3β83 culture.

21.11.1978 13-9- 54 491/1221.11.1978 13-9- 54 491/12

b) 65 ml des im Beispiel 1c beschriebenen Mahrmediums werden mit 5 ml der Mycobacterium sp*ec. IRRL B-3683 Anzuchtskultur versetzt· Dann setzt man von der Kultur 28 ml der im Beispiel 1b beschriebenen Sitosterin-Emulsion und nach 24 Stunden 4 ml 4 %ige Uatriumtetraboratlösung zu und fermentiert weitere 120 Stunden lang» Man arbeitet den Fermentationsansatz auf, wie im Beispiel 1 c beschrieben, und erhält 90 mg 21-Hydroxy~20-methy1-1, 4-pregnadie*i-3~on vom Schmelzpunkt 180 - 1820C (aus Äthylacetat-Aceton).b) 65 ml of Mahrmediums described in Example 1c with 5 ml of Mycobacterium sp * ec. IRRL B-3683 seed culture. Then, 28 ml of the sitosterol emulsion described in Example 1b are added and 4 ml of 4% sodium tetraborate solution are added after 24 hours and fermented for a further 120 hours. The fermentation batch is worked up as in the example 1 c, and receives 90 mg of 21-hydroxy-20-methyl-1, 4-pregnadie * i-3-one of melting point 180 - 182 0 C (from ethyl acetate-acetone).

Beispiel G1 Example G 1

40 ml einer Anzuchtskultur von Mycobacterium spec. ERRL B-3805 - hergestellt nach Beispiel 1a - werden mit 4000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert.40 ml of a seed culture of Mycobacterium spec. ERRL B-3805 - prepared according to Example 1a - are centrifuged at 4000 revolutions per minute.

Die so erhaltene Bakterienmasse wird dann zweimal mit einer auf pH 6 abgepufferten Salzlösung, enthaltend 0,5 % Natriumchlorid, 0,012 % Magnesiumsulfat (Heptahydrat) und 1,36 % Kaliumdihydrogenphosphat gewaschen, in 40 ml dieser Salzlösung suspendiert und mit 10 ml einer 0,5 /Sigen 1-Methyl-3-nitro~1-nitrosoguanidin versetzt.The bacterial mass thus obtained is then washed twice with a saline solution buffered to pH 6 containing 0.5 % sodium chloride, 0.012 % magnesium sulfate (heptahydrate) and 1.36 % potassium dihydrogen phosphate, suspended in 40 ml of this brine and treated with 10 ml of a 0.5 / Sigen 1-methyl-3-nitro added ~ 1-nitrosoguanidine.

Man inkubiert die Bakteriensuspension eine Stunde lang bei 3O0C, zentrifugiert die Bakterien ab, wäscht sie zweimal mit der obengenannten Salzlösung und plattet sie auf Blut-Agar-Platten aus. Von den gebildeten Einzelkolonien werden jeweils diejenigen ausgewählt, die runde Kolonien bilden und aus diesen jeweils Anzuchtskulturen hergestellt, wie im Beispiel la beschrieben. Die Anzuchtskolonien dienen jeweils dazu, die imIncubating the bacterial suspension for one hour at 3O 0 C, the bacteria centrifuged off, washed twice with the above brine and flattens it out on blood agar plates. Of the individual colonies formed, those are selected which form round colonies and are produced from these in each case seed cultures, as described in Example 1a. The breeding colonies serve each, the in the

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Beispiel Ic beschriebene Fermentation durchzuführen, mit folgendem Ergebnis:Example Ic to carry out fermentation, with the following result:

Anzahl der ge testeten Selek tionsstämmeNumber of tested selection strains Ausbeute an 21-Hyd 4~pregnen-3-on ohne Zusatz von NatriumtetraboratYield of 21-hyd 4 ~ pregnen-3-one without addition of sodium tetraborate roxy-20-methyl- mit Zusatz von Fatriumtetraboiatroxy-20-methyl with added tetraboiate 1919 0 - 200 mg0-200 mg 88th 201 - 400 mg201-400 mg mm φ mmmm φ mm 9494 401 - 600 mg401-600 mg 35  35 601 - 800 mg601 - 800 mg — » —- »- 77 801 -1000 mg801 -1000 mg 1550 - 2100 mg1550 - 2100 mg 00 1001 -1020 mg1001 -1020 mg 66 1021 -1040 mg1021-1040 mg 1900 .- 3000 mg1900 .- 3000 mg 11 1041 -1060 mg (150 mg)1041-1060 mg (150 mg) 2900 mg2900 mg 00 1061 -1080 mg1061-1080 mg 11 1081 -2000 mg (195 mg)1081-2000 mg (195 mg) 3450 mg3450 mg

Claims (6)

ErfindungsanspruohErfindungsanspruoh worin die Bindung ..... eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung bedeutet, durch Fermentation von-Zoo- oder Phytosterinen mit einer Kultur von Mycobacterium spec. HRRL B-3633 oder URRL B-3805 oder seiner Varianten und Mutanten, gekennzeichnet dadurch, daß man die Fermentation bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0 in Gegenwart von Borationen oder organischen Borverbindungen durchführt. wherein the bond ..... denotes a single bond or a double bond, by fermentation of zoo or phytosterols with a culture of Mycobacterium spec. HRRL B-3633 or URRL B-3805 or its variants and mutants, characterized in that the fermentation is carried out at a pH of 6.0 to 8.0 in the presence of borate ions or organic boron compounds. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Zoo- oder Phytosterin der allgemeinen Formel II2. The method according to item 1, characterized in that a zoo or phytosterol of the general formula II 21.11.1973 54 491/1221.11.1973 54 491/12 H,CH, C (II),(II) worin die Bindungen »^^^ Einfaohbindungen oder Doppelbindungen} X eine Oxogruppe oder ein Wasserstoffatom und It, ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Äthylgruppe darstellen, fermentiert·in which the bonds "monohydric bonds or double bonds " X represent an oxo group or a hydrogen atom and are It, a hydrogen atom, a methyl group or an ethyl group, fermented · 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daS man als Borationen lieferndes Agens Orthoborsäure, Metaborsäure, Polyborsäure oder deren Alkali- oder Erdalkalimetallsalze verwendet*3. The method according to item 1 and 2, characterized in that one uses borate as supplying agent orthoboric acid, metaboric acid, polyboric acid or their alkali or alkaline earth metal salts * 4» Verfahren nach Punkt 1 bis 3* gekennzeichnet dadurch, daß man als organische Borverbindung Triphenylborat verwendet·4 »Process according to items 1 to 3 *, characterized in that triphenyl borate is used as organic boron compound · 5. Verfahren nach Punkt 3» gekennzeichnet.dadurch, daß man pro Liter Mycobacterium spec. Kultur 1 g bis 5 g Borationen lieferndes Agens verwendet«5. The method according to item 3 »characterized.dadurch that one per liter Mycobacterium spec. Culture 1 g to 5 g of borate-providing agent used « 6. Verfahren nach Punkt 5» gekennzeichnet dadurch, daß man das Borationen liefernde Agens 10 bis 30 Stunden nach Fermentationsbeginn zusetzte6. The method according to item 5 », characterized in that the borate-supplying agent was added 10 to 30 hours after the start of fermentation
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