CZ419391A3 - ) Způsob izolace plasminogenových aktivátorů použit elných jako terapeutická a diagnostická činidla - Google Patents

Abstract

) Způsob izolace plasminogenových aktivátorů použit elných jako terapeutická a diagnostická činidla

Description

Dosavadní stav techniky ^lo zjištěno, že aktivátory plasminogenu jsou použitelné pro léčbu krevních sraženin. svedením takového aktivátoru do krevního proudu člověka v dostatečném množství & po dobu dostačující k tomu, že se krevní sraženina rozpustí.

Postupy dříve používané pro izolaci aktivátorů plasminogenu se vyznačovaly svojí složitostí a nákladností, ^apríklad v případě urokinázy, aktivátoru plasminogenu nalezené v moči, je výtěžek známých postupů tak nízký, že musí být shromážděno a zpracováno velké množství moči pro léčbu jednoho pacienta. Izolace urokinázy s jiných zdrojů, jako z kultivačního media tkáně ledvin, nebo izolace jiných aktivátorů plasminogenu jako je streptov V linasa, zahrnují rovněž mnoho stupňů, které gsou bud

Z r nákladné nebo mohou být spojeny s nežádoucími imunologickými reakcemi. Navíc je o obchodně dostupných aktivátorech pro klinické použití /abbokinasa a streptokinasa/ zná mo, že mají nízkou afinitu k fibrinovým vměstkům a nejsou proto optimálně účinné a nebo mohou být spojeny s nežádoucími vedlejšími účinky díky vzniklé proteolýze.

Práce, týkající se předchozí izolace, urokinasy jsou následující:

-2a/ White W.F.j Barlow G.H,, Mozen M.m. _t The. Isolation and Characterization of Plasminogen Activators /Urokinase/ from Human Urine. Biochemistry, díl 5,str. 2160-2169, 1966, b/ Pye E.K., Maciag T., Kelly P., Iyznger M.R., Purification of Urokinase by Affinity Chromatography In Thrombosis and G_rokinase, vyd R.Paoletti a S. Sherry. .Academie Press, Londýn, New York, San Prancisco 1977·

Podstata vynálezu

Předložený vynález překonává výše uvedené problémy a umožňuje izolovat relativně velká množství aktivátoru plasminogenu z poměrně malých množství výchozího materiálu. Vynález také poskytuje novou skupinu terapeutických a diagnostických činidel ve formě aktivátoru plasminogenu, charakterizovaných silnou afinitou k fibrinu.

Podle předloženého vynálezu se aktivátor plasminogenu izoluje z moči nebo tkáňového kultivačního media tak, že se připraví pevná, adsorpční matrice /výhodně diatomická hlinka/, mající na svém povrchu fibrin, matrice se vystaví působení matečných louhů na bázi moči nebo kultury, obsahující fibrin, přičemž molekuly aktivátoru plasminogenu v matečných louzích, mající afinitu k fibrinu se navážou na molekuly fibrinu, odstraní se matečný louh a aktivátor plasminogenu se oddělí z matrice, obsahující fibrin.

Vynález je založen na objevu, že fibrin vysrážený na pevné adsorpční matrici si uchovává značnou afinitu pro určité aktivátory plasminogenu, zejména pro druhy urokinasy, které jsou zde označené jako mající vysokou afini-3tu. Oproti tomu, je-li fibrin kovalentně připojen k aktivované agarose /tj. agarose aktivované bromkyanem/ nebyla taková afinita pro aktivátor plasminogenu zjištěna. Jelikož původ tohoto rozdílu není experimentálně zjištěn, očekávalo se nyní, že fibrin srážený na adsorpční matrici bez kovalentních vazeb ponechává volné určité £ -aminoskupiny lysinových zbytků fibrinu. V těchto -aminoskupinách lysinových zbytků se očekává, že budou přispívat k nově objevené afinitě. Naopak, je-li fibrin kovalentně připojen k aktivované agarose, mohou £ -aminokyseliny lysinových zbytků být kovalentně připojeny k agarose takovým způsobem, že v podstatě blokují afinitu. Z těchto důvodů je zřejmé, že existence vysoce afinitní urokinasy byla přehlížena.

Ve výhodných provedeních způsobu izolace podle vynálezu je výhodných mnoho podmínek. Aktivátor plasminogenu se vystaví matrici, obsahující fibrin mícháním fibrinových pevných částic v lázni kapaliny, ve které je přítomen aktivátor plasminogenu. K fibrinu navázaný aktivátor vysrážený na pevné matrici se eluuje z fibrinového povrchu. Eluát, obsahující aktivátor plasminogenu eluovaný z fibrinového povrchu se nechá projít kolonou pro gelovou filtraci pro oddělení vysoce afinitního aktivátoru plasminogenu z elučních činidel a kontaminantů fibrinu.

Výhodně se pro získání pevné matrice s fibrinem na povrchu., zpracuje fibrinogen s thrombinem za přítomnosti matrice způsobem srážení fibrinu na matrici. Výhodně se toto provede vystavením povrchu adsorpční matrice přebytku fibrinogenu v pufru a pak zavedením thrombinu do pufru se převede fibrinogen na fibrin, přičemž adsorpční povrch může být účinně úplně obsazen fibrinem.

-4Dále podle specifického aspektu vynálezu pro vysoce afinitní urokinasy, zahrnuje vynález poskytnutí adsorpční pevné matrice, výhodně částic diatomické hlinky, vysrážením fibrinu na svém povrchu zpracováním fibrinogenu s thrombinem za přítomnosti matrice, působením moči nebo tkáňového kultivačního media na matrici, obsahující fibrin, přičemž urokinasa druhu, který byl objeven jako vysoce afinitní k fibrinu se k ní naváže, nenavázaný materiál se odstraní roztokem pufru, vysoce afinitní urokinasa se oddělí oď fibrinového povrchu elučním činidlem, obsahujícím látky; ze skupiny, zahrnující arginin, lysin a kyselinu £ -aminokapronovou ve vodném roztoku a potom se urokinasa oddělí od činidla.

V tomto způsobu se výhodně moč nebo tkáňové kultivační medium vystaví matrici nesoucí fibrin mícháním částic s močí nebo tkáňovým kultivačním mediem a kapalina se odstraní dekantací a filtrací s následujícím opakovaným promýváním fibrinové matrice a navázaného aktivátoru pufrem.

Nový produkt podle vynálezu je vysoce afinitní aktivátor plasminogenu z moči a kultur, získaný výše uvedeným způsobem.

Zlepšené thrombolytické činidlo podle vynálezu obsahuje v podstatě urokinasu, která je vysoce afinitní k fibrinu a je dostupná lékařům v lyofilizované formě.

Je poskytnut specifický nový produkt, obsahující aktivátor plasminogenu izolovaný z biologického zdroje jako je moč nebo kultura. Tento nový produkt je charakterizován molekulovou hmotností asi 56000 Daltonů, specifickou aktivitou 40000 až 50000 CTA jednotek/mg při zkoušce na fibrinové plotně a zjištěním jednoretězcové struktury, odpovídající molekulové hmotnosti 56000 Daltonů jak je

-5zřejmé z jednoho pruhu proteinu na 7,5%ním poIyakrylamidovém gelu při provádění elektroforézy dodecylsulfát-gel nového produktu v neredukovaném stavu. Aktivátor plasminogenu si udržuje strukturu jednoho řetězce jak je zřejmé z jediného pruhu na 7,5%ním pólyakrylamidovém gelu, jestliže se provádí elektroforéza dodecylsulfát sodný-gel plasminogenového aktivátoru, který byl redukován O,1M dithiothreitolem. ^ejdůležitější je, že aktivátor plasminogenu projevuje podstatnou vazebnou afinitu pro fibrin jak je zřejmé z jeho vysoké afinity pro celitový fibrin. Vysoká afinita, kterou má aktivátor plasminogenu k fibrinu je vlastnost, která jej činí, je-li radioaktivně značen, novým diagnostickým činidlem pro specifickou detekci fibrinových thrombů nukleárním zjištováním.

Postup využívá vlastností určitých aktivátorů plasminogenu vázat fibrin. Tento princip je aplikován v příkladech uvedených dále pro izolaci aktivátoru plasminogenu z moče, který má vysokou afinitu vůči fibrinu /High Affinity Urokinase, HAUK/, ale je také použitelný pro extrakci vysoce afinitních aktivátorů plasminogenu z jiných zdrojů jako jsou extrakty kultivačního media ledvinové tkáně.

Postup využívá matrici, obsahující materiál s vlastností absorbovat fibrinogen. Ve výhodném příkladu dále se ukázala diatomická hlinka Celite, být pro tento účel vhodná. účelem získání velkého specifického povrchu se použije práškovaná forma tohoto materiálu. Po tom se tato matrice smísí s fibrinogenem, tento se převede na fibrin působením thrombinu, což vede k vysrážení fibrinu na matrici. Tato matrice zabraňuje tvorbě gelu, který se normálně vytváří, jestliže je fibrinogen vystaven působení thrombinu. Jestliže se fibrin-celit míchá v moči, je HAUK vázána na afinitní matrici. Potom se navázaný aktivátor

-6odstraní z fibrin-celitu promytím eluantem. Eluovaná HAUK je kontaminována pouze malým množstvím fibrinu, vymyta ze sloupce eluantem a od elučního materiálu je snadno oddělena gelovou filtrací. Finální roztok, obsahující aktivátor se pak lycfilízuje.

Příklady provedení vynálezu

Metoda g práškované diatomické hlinky /Celíte Analytical filter aid, Fisher Scientific Co./, matrice, se promyje destilovanou vodou a smísí se 2 procenty lidského fibrinogenu /Kabi, Stockholm, Švédsko/ ve 25 ml pufru /0,05M fosforečnan sodný, pH 7,4, obsahující O,1M NaCl a 1 m M EDTA/· Thrombin /Parke Davis, Bovine topičal/ 100 /U v 1 ml pufru se přidá za konstantního míchání při teplotě místnosti pro dosažení dobrého promísení pro prevenci vysrážení na matrici s fibrinem. Po 30 minutách se matrice s fibrinem zfiltruje přes sintrovanou skleněnou nálevku a promyje se pečlivě stejným pufrem /1 litr/ a dále pufrem, obsahujícím Q,2M argininu. Konečné promytí se provede 0,05M pufrem fosforečnanu sodného, pH 7,4, obsahujícím 1 m M EDTA a υ,βΜ NaCl. Promytá matrice s fibrinem /15 ml usazeného objemu/ se přidá k 1 litru čerstvé lidské moči a směs se míchá 1 hodinu za chladu /4 °C/. Po filtraci se matrice s fibrinem umístí do kolony, prorayje se ekvilibračním pufrem /8-10 objemů sloupce/. Aktivátor se pak eluuje z fibrinu arginimem /0,2M ve výše uvedeném pufru/ v jednom ostrém píku. Alternativně může být eluce provedena lysinem nebo £ -aminokapronovou kyselinou. Arginin a jakékoliv fibrinové deriváty kontaminující aktivátor se pak odstraní gelovou filtrací na Sephadexu G-100 /Pharmacia Chemicals, Upsala, Švédsko/ a pak se roztok, obsahující aktivátor lyofilizuje.

-7Výsledky

Přibližně 12,00-30,00 CTA jednotek HAJK se získá z 1 litru čerstvé lidské moči. Molekulová hmotnost HAUK byla stanovena přibližně 56000 Dáltonů gelovou filtrací na Gephadexu G-200 superfine / technika viz P.Andrews, ^iUethods Biochem. Anal. 8, 1-53 /1970//. HAUK materiál převá dí plasminogen na plasmin jak je demonstrováno chromogenním syntetickým substrátem, na plasminogen-bohaté fibrinové plotně indukuje rychlou lýzi fibrinu. ^rrokazuje specifickou aktivitu 40000-50000 CTA jednotek/mg při studii na fibrinové plotně /technika viz P.Bpakman, Fibrinolysis: A Standardized Fibrin Plate Method and a Fibrinolytic Assay of Plasminogen, publikováno Scheltima a Hol kema, Amsterodam, str.1-124 /1967//·

Porovnání HAUK s komerční urokinasou /Abbott/

Pyly nalezeny dva základní rozdíly a jedna stejná vlastnost, které jsou shrnuty v tabulce dále.

Tabulka vysoce afinitní urokinasa HAUK urokinasa /podle^ /Abbott/vynálezu/

molekulová hmotnost	36000	56000
/Dalton/
navázání fibrinu	<5 %	100 %
/fibrin-celit sloupec/
navázání k sepharose	< 1 %	1 %

Navíc bylo zjištěno více účinných lýzí fibrinu za fyziologických podmínek pro HAUK ve srovnání s komerční urokinasou.

-8Komerční urolinasa /Abbott/ obsahuje hlavně formu nízké molekulové hmotnosti, -rskce urokinasy vysoké Molekulové hmotnosti, nalezená v komerční urokinase /Abbott/ se jeví jako dvouřetězcová struktura, jak je zřejmé ze dvou proteinových pruhů /viz K. Weber a il.Osborn, The £roteins, vyd. Neurath K. and Hill L.l. /Academie Press, New York/, díl 1, str.179-223 /1975//. lato forma urokinasy s vysokou molekulovou hmotností má nízkou afinitu k fibrinu, zatímco urokinasa s nízkou molekulovou hmotností nemá žádnou. Souhrnně o komerčních směsích urokinasy vysoké s nízké molekulové hmotnosti je známo, že mají velmi nízkou afinitu k fibrinu, jak je uvedeno výše.

HAUK mó molekulovou hmotnost asi 56000 Daltonů, což je srovnatelné s formou komerční urokinasy vysoké molekulové hmotnosti. Nicméně HAUK se jeví jako jednořetězcová struktura jak je zřejmé z jednoho proteinového pruhu po redukci s 0,1M dithiothreitolem a elektroforéze dodecylsulfát sodný-gel na 7,5% pólyakrylamidovém gelu /ibid Weber a spol./.

Navázánígí HAUK, druhu urokinasy podle vynálezu s vysokou molekulovou hmotností a jedním řetězcem k fibrinovému celitu za podmínek použitých pro jeho adsorpci, indikuje jeýl vysokou afinitu k fibrinu.

Předpokládá se, že HAUK, která byla nejprve izolována, v

si udržuje nativní molekulovou formu, iíálo stupňů, rychlá metoda izolace umožňuje zachování jednořetězcové struktury.

v ^A'aopak sr relativně pomalém, mnoho stupňovém postupu podle známého stavu techniky se předpokládá, že vede k degradaci molekuly a k dvouřetězcové struktuře a nízké afinitě pro fibrin.

_G_

Předložený postup má mnoho výhod proti postupům stávajícím:

1. rychlý, jednostupňový místo dlouhého vícestupňového izolačního postupu. Dlouhý způsob obvykle přináší nežádoucí znečištění, autodegradaci, nebo degradaci urokinasy jinými proteolytickými enzymy,

2. metoda odděluje vysoce afinitní aktivátor plasminogenu od nízkoafinitního a stanoví ponejprv, že čerstvá moč obsahuje vysoce afinitní urokinasu /40 až 80 % celkové urokinasy v závislosti na subjektu/,

3· metoda poskytuje vysoký výtěžek /asi 60 76/ HAUK v moči a není zde přítomna žádná nízkoafinitní urokinasa. Na rozdíl od obchodně dostupné urokinasy /Abbokinase, Abbott/, je v podstatě HAUK a je nízkoafinitním aktivátorem plasminogenu.

Aplikace

I. Obecně

Protože popsaná metoda je ekonomická a rychlá, měla by poskytovat relativně levnou a hojnou zásobu aktivátoru lidského plasminogenu charakterizovanou vysokou aktivitou k fibrinu jak pro vědecký výzkum tak pro klinické účely.

II. Terapie

Dva obchodně dostupné aktivátory plasminogenu - Střep tokinase /Hoechst and Kabi/ a Urokinase /Abbott/, které byly přijaty EDA pro thrombolytickou léčbu pulmonární embolie, jsou nízko afinitními aktivátory. V důsledku toho musí být provedena infuze velkého množství aktivátoru /100000 - 200000 CTA^u/h/ pro dosažení lýze sraženiny.

-10Protože plasmin je enzym se širokou specifitou, účinek infuze těchto aktivátorů je nežádoucí stav vzniklé proteolýzy, která degraduje některé plasmové proteiny /fibrinogen, faktory V a VIII/.

^aaproti tomu HAUK objevená a úspěšně izolovaná podle předloženého vynálezu vzhledem k její afinitě k fibrinu, bude poskytovat specifičtější fibrinolýzu při nižší koncentracích aktivátoru.

III. Diagnóza

Vazebné vlastnosti fibrin-HAUK mohou také být využity při detekci intravaskulárních sraženin nebo thrombů. Zapojením vhodného radioaktivního isotopu /např. ²³jodu nebo technecia/ do molekuly a pak intravenosní injekcí radioaktivně značené HM je možné identifikovat intravaskulární fibrin, pojjmocí nukleární analýzy. Například značená HAUK může být použita pro specifické detekce pulmonární embolie /plicní vmetek/ při prohlídce plic. ^ato diagnosa, je nesnadno běžnými metodami proveditelná, protože tyto nejsou specifické.

Dřívější snahy použít radioaktivně značené aktivátory plasminogenu pro radionukleární zkoumání byly relativně neúspěšné, protože použité aktivátory · plasminogenu nemají podstatnou vlastnost - vysokou afinitu k fibrinu. Odkazy aa takové předchozí práce zahrnují /a/Millar W.T. aSmith J.F., Localization of Deepvenous Thrombosis ^sing Technitium 99 m - labelled Jrokinase /preliminary communication/, Lancet sv.2, str.695-696, 1974, /b/ Kempi V®,

Van DerLinden V/., a van Scheele C., Diagnosis of Deep Vein Thrombosis with 99 mTc-sterptokinase, A Cilme al Cor?.parison vir.h Phlebcgr aphy, British Médie al Journal, sv.2,str.748-749, 1974.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ N A*R O X Ϊ

   1. Způsob izolace aktivátoru plasminogenu z moči nebo media kultury, vyznačující se tím, že zahrnuje.

   poskytnutí adsorpční matrice, mající na svém povrchu vysrážený fibrin, působení matečných louhů na bázi moči nebo media kultury a obsahujících aktivátor plasminogenu s vysokou afinitou k fíhrimi na matrici, obsahující fibrin, čímž se molekuly aktivátoru plasminogenu, které mají vysokou afinitu navážou na molekuly fibrinu, odstranění zbylého matečného louhu a oddělení aktivátoru plasminogenu z fibrinu.
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t í m, že se aktivátor plasminogenu eluuje z fibrinového povrchu elučním činidlem, obsahujícím činidlo ze skupiny, kterou tvoří arginin, lysin a < -amino-kapronová kyselina.
3. 3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t í m, že použitou matrici tvoří diatomická hlinka.
4. 4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že pro poskytnutí uvedené matrice s fibrinem na jejím povrchu, se fibrinogen zpracuje s thrombinem za přítomnosti uvedené matrice způsobem, vyvolávajícím, že se fibrin sráží na uvedené matrici bez tvorby gelu.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se t í m, že se na adsorpční povrch uvedené matrice působí fibrinegenem v množství dostačujícím pro účinné povlečení uvedeného adsorpčního povrchu, potom se zavede thrombin pro převedení uvedeného adsorbovaného fibrinogenu na fibrin,

   -12— přičemž je uvedený adsorpční povrch účinně plně obsazen, adsorbovaným fibrinem.
6. 6. Způsob izolace urokinasy, vyznačující se t í m, že se připraví pevná matrice s fibrinem zpracováním fibrinogenu s thrombinem za přítomnosti uvedené matrice, takže fibrin je na uvedeném substrátu v absorbovavaném stavu, na substrát se působí moči nebo kultivačním mediem, přičemž se druh urokinasy, který má afinitu vůči fibrinu naváže k fibrinu, odstraní se nenavázaný materiál promytím roztokem pufru, oddělí se urokinasa z fibrinu nejprve eluci urokinasy z fibrinového povrchu elučním činidlem ze skupiny, zahrnující arginin, lysin, g -amino-kapronovou kyselinu, a potom se uvedená urokinasa oddělí od tohoto činidla.
7. 7· Způsob podle nároku 1 nebo 6, vyznačující se t í m, že uvedená matrice obsahuje částice, přičemž se kapalina vystaví matrici, nesoucí fibrin smísením uvedených částic s uvedenou kapalinou.
8. 8. Způsob podle nároku 1 nebo 6, vyznač ujíc í se t í m, že uvedená kapalina se odstraní dekantací a filtrací s následujícím promytím pufrem.
9. 9. Enzymový koncentrát aktivátoru plasminogenu izolovaný z biologického zdroje jakýmikoliv metodami podle nároků 1 až 6 a zahrnující urokinasu /lidskou/ molekulové hmotnosti asi 56000 Daltonů, mající vysokou afinitu pro navázání k fibrinu na adsorpční matrici a mající zjevnou jednořetězcovou molekulovou strukturu.
10. 10. Urokinasový plasminogenový aktivátor izolovaný z moči nebo kultury, obsahující v podstatě urokinasu /lidskou/, charakterizovaný tím, že /a/ má molekulovou hmotnost asi 56000 Daltonů, jak bylo

    -13stanoveno gelovou filtrací, /b/ objevuje se jako jediný proteinový pruh, odpovídající molekulové hmotnosti asi 56000 Daltonů na 7,5 procentním pólyakry1amidovém gelu při provádění elektrofořezy dodecylsulfát sodný-gel se neradokovanou urokinasou, /c/ udržující si tuto vlastnost, jestliže se uvedená elektroforeza provádí na urokinase^ která byla redukována O,1M dithiothreitolem, čímž se prokazuje její struktura jednoho řetězce a /d/ vykazuje vysokou vazebnou afinitu k fibrinu vysráženému na diatomické hlince.