CZ381996A3 - Simultání detekce, identifikace a diferenciace eubakteriálních taxonů za použití hybridizačního testu - Google Patents

Description

1 1Jt/ 5’gi>9-9£

Simultání detekce, identifikace a diferenciace eubakteriálních taxonů za použití hybridizačniho testu

Oblast techniky Předkládaný vynález se týká nukleokyselinových prob z intergenového regionu mezi 16S a 23S ribosomálních ribonukleokyselinových (rRNA) genů, které sou použity pro specifickou detekci eubakteriálních organismů v biologickém vzorku hybridizačním postupem, stejně jako se týká nukleokyselinových primerů, které jsou použity pro amplifikaci uvedeného intergenového regionu eubakteriálního organismu v biologickém vzorku. Předkládaný vynález se také týká nových sekvencí intergenového regionu, od kterých mohou být uvedené proby nebo primery odvozeny.

Dosavadní stav techniky

Od příchodu polymerasové řetězové reakce a některých jiných technik amplifikace nukleových kyselin vliv DNA-probové technologie v diagnostice mikroorganismů v biologických vzorcích všech druhů narůstá. Vzhledem k tomu, že jsou více specifické a potenciálně více sensitivní - pokud je použit adekvátní amplifikační a/nebo detekční systém - může přístup za použití DNA prob eventuálně nahradit konvenční techniky identifikace.

Spolehlivost testů založených na nukleových kyselinách zásadně závisý na sensitivitě a/nebo specificitě použitých prob a/nebo primerů. Tak je úhelným kamenem tohoto typu testů identifikace sekvencí nukleových kyselin, které jsou jedinečné 2 ♦ ···· 2 ♦ ···· ··· · « >· » ve skupině požadovaných organismů. Většina z testů založených na nukleových kyselinách, buď popsaných v literatuře a/nebo komerčně dostupných má za cíl detekci právě jednoho určitého organismu v biologickém vzorku. Protože většina biologických vzorků může obvykle obsahovat velké množství klinicky relevantních mikroorganismů, musí být provedeno mnoho oddělených testů pro detekci relevantních organismů, které mohou být přítomny. Tento přístup je velmi nákladný, drahý a časově náročný. V důsledku toho je počet aktuálně prováděných testů ve většině diagnostických laboratoří v jednom určitém vzorku omezen na detekci pouze několika nejvíce relevantních organismů. Proto by bylo mimořádně vhodné mít přístup k systému, který umožňuje rychlou, snadnou a simultání detekci mnoha různých organismů. Čím více bude organismů, které mohou být vyšetřovány ve stejném testu, tím bude postup finančně výhodnější.

Jak bylo uvedeno ve dříve publikovaných dokumentech, intergenový region situovaný mezi 16S rRNA a 23S rRNA genem, který je také označován jako interní transkribovaný intergen (ITS), je výhodným cílovým regionem pro vývoj prob pro detekci patogenů bakteriálního původu (Mezinárodní přihláška WO 91/16454; Rossau et al., 1992; EP-A-0 395 292).

Jednou z nejvíce ceněných výhod je, že sekvence jedinečné pro velké množství bakteriálních taxonů může být nalezena ve velmi omezené oblasti bakteriálního genomu. Tato charakteristika umožňuje výhodné naplánování "panelů prob" umožňujích simultání detekci sady organismů, které mohou být přítomny v určitém typu biologického vzorku. Kromě, vzhledem k tomu, že jsou obklopeny kvaši-universálními nukleotidovými sekvencemi - přesněji umístěnými na 3'-části 16S rRNA genu a 5'-části 23S rRNA genu v příslušném pořadí - mohou být téměř všechny intergeny simultáně amplifikovány za použití omezené sady amplifikačních primerů. Alternativně, specifické sady primerů mohou být odvozeny od intergenových sekvencí samotných, což umožní druhově- nebo skupinově- specifické amplifikace. 16S - 23S rRNA intergenový region je relativně krátký (okolo 200 - 1000 párů baží) úsek DNA přítomný v jedné nebo v mnoha kopiích genomu téměř všech eubakteriálních organismů. Pokud je v genomu jedné bakterie přítomno mnoho kopií, pak mohou být tyto kopie buď identické (jak je tomu pravděpodobně u druhů Neisseria), nebo se mohou lišit jedna od druhé (jak je tomu v případě E. coli). Tato odlišnost může být omezena na několik nukleotidů, ale také mohou být přítomny delece a inserce větší délky.

Doposud, intergenové proby jsou popsány a dostupné pouze pro omezený počet organismů a mnoho z nich bylo popsáno v mezinárodní přihlášce WO 91/16454. Jak bylo popsáno výše, bylo by výhodné, kdyby bylo možné simultáně detekovat panel patogenů: např. panel patogenů, jejichž přítomnost ve stejném typu biologických vzorků je možná, nebo panel patogenů, které mohou způsobovat stejný typ příznaků onemocnění, které je obtížně odlišitelné klinicky a/nebo biochemicky, nebo panel patogenů náležících ke stejnému taxonu. Pro vytvoření různých panelů tak kompletních jak je možné, jsou potřeba další proby a sady prob umístěných v intergenovém regionu a umožňují identifikaci alespoň následujících bakteriálních skupin a druhů:

Mycobacterium species Listeria species Chlamydia species Acinetobacter species Mycoplasma species Streptococcus species Staphylococcus species Salmonella species Brucella species Yesinia species Pseudomonas species

Tyto další intergenové proby musí být pečlivě projektovány tak, aby mohly být použity simultáně s alespoň jednou jinou probou, za stejných hybridizačních a promývacích podmínek, což umožní detekci určitého panelu organismů.

Proto je cílem předkládaného vynálezu vybrat proby nebo sady prob, které mají jako cíl 16S-23S rRNA intergenový region a které umožňují detekci alespoň jednoho, a preferovaně více než jednoho, z výše uvedených mikroorganismů. Proby nebo sady prob jsou takovým způsobem, že'mohou být použity v kombinaci s alespoň jednou jinou probou, preferovaně pocházející také z 16S-23S rRNA intergenového regionu, za stejných hybridizačních a promývacích podmínek, což umožní simultání detekci několika mikrorganismů ve vzorku.

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout selekční metodu pro použití v selekci uvedených intergenových prob nebo sad prob.

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout rychlou a spolehlivou hybridizační metodu pro detekci a identifikaci alespoň jednoho mikroorganismu ve vzorku, nebo pro simultání detekci a identifikaci několika mikroorganismů ve vzorku. Přesněji, je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout hybridizační metodu umožňující simultání detekci a identifikaci sady mikroorganismů, které mohou být přítomny v určitém typu vzorku. Přesněji, je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout prob nebo sad prob pro umožnění simultání detekce mikroorganismů ve vzorku pocházejícím z respiračního traktu.

Jiným jednotlivým cílem předkládaného vynálezu je poskytnutí prob nebo sad prob pro umožnění simultání detekce mikroorganismů ve vzorku pocházejícím z mozkomíšního moku.

Ještě jiným jednotlivým cílem předkládaného vynálezu je poskytnutí prob nebo sad prob pro umožnění simultání detekce mikroorganismů ve vzorku pocházejícím z urogenitálního traktu.

Ještě jiným jednotlivým cílem předkládaného vynálezu je poskytnutí prob nebo sad prob pro umožnění simultání detekce mikroorganismů ve vzorku odebraného z gastrointestinálního traktu pacienta.

Ještě jiným jednotlivým cílem předkládaného vynálezu je poskytnutí prob nebo sad prob pro umožnění simultání detekce mikroorganismů ve vzorku pocházejícího z potravy nebo prostředí. ·· ···· • ·

Kromě toho je cílem předkládaného vynálezu poskytnutí metod pro detekci a identifikaci určitého taxonu ve vzorku, nebo sady určitých taxonů, kde uvedený taxon je buď kompletní rod, nebo podskupina v rodu, druh nebo i subtypy v druhu (poddruhy, serovary, sequeary, biovary...).

Podrobnějším jednotlivým cílem předkládaného vynálezu je poskytnutí prob nebo sad prob pro detekci Mycobacterium druhů a poddruhů, přesněji pro detekci komplexu kmenů M. tuberculosis, Mycobacterium kmenů z MAIS-komplexu, M. avium a M. paratuberculosis, M. intracellulare a M. intracellulare-podobných kmenů, M. scrofulaceum, M. kansasii, M. chelonae, M. gordonae, M. ulcerans, M. genavense, M. xenopi, M. simiae, M. fortuitum, M. malmoense, M. celatum, a M. haemophilum.

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout proby nebo sady prob pro detekci Mycobacterium kmenů, přesněji M. pneumoniae a M. genitalium.

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout proby nebo sady prob pro detekci Pseudomonas kmenů, přesněji P. aeruginosa.

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout proby nebo sady prob pro detekci Staphylococcus kmenů, přesněji S. aureus a S. epidermidis.

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout proby nebo sady prob pro detekci Acinetobacter kmenů, přesněji A. baumanii. 7 7 ·· ···· • · • ···· ·: .· ί : · ··· ·

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout proby nebo sady prob pro detekci Listeria kmenů, přesněji L. monocytogenes.

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout proby nebo sady prob pro detekci Brucella kmenů.

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout proby nebo sady prob pro detekci Salmonella kmenů.

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout proby nebo sady prob pro detekci Chlamydia kmenů, přesněji C. trachomatis a C. psittaci.

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout proby nebo sady prob pro detekci Streptococcus kmenů.

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout proby nebo sady prob pro detekci Yersinia enterocolitica kmenů.

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout primery umožňující specifickou amplifikaci 16S-23S rRNA intergenového regionu pro jisté organismy. Přesněji, je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout primery umožňující specifickou amplifikaci intergenového regionu kmenů Mycobacterium, Chlamydia, Listeria, Brucella a Yersinia enterocolitica.

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout nové sekvence 16S-23S rRNA intergenových regionů, ze kterých mohou být odvozeny použitelné intergenové proby nebo primery. 8 ····

• · ·· ···· • · • ·

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout kity pro detekci alespoň jednoho mikroorganismu ve vzorku, ve kterém jsou použity uvedené proby a/nebo primery.

Je zaznamenáno, že pro několik výše uvedených mikroorganismů byly intergenové sekvence již publikovány v literatuře nebo ve veřejnosti přístupných databankách.

Nicméně, mělo by být jasné, že sekvence intergenového regionu popsaná v tomto vynalezu (obr. 1 - 103) jsou nové a v případě, že pocházejí ze stejných druhů jako jsou ty, jejichž intergenové sekvence již byly popsány v oboru dříve, pak se v určitém rozsahu liší od již popsaných sekvencí.

Kromě toho, je základním cílem předkládaného vynálezu vybrat, z kompilace dat sekvencí intergenového regionu, specifické proby a sady prob umožňující detekci a identifikaci určitého panelu organismů, kde se jedná o organismy náležeící společnému taxonu, nebo o organismy, které mohou být přítomny ve stejném typu vzorku.

Postup selekce se obvykle skládá z teoretické a praktické části. Nejprve ze všeho, různé intergenové sekvence musí být seřazeny k "nejbližší sousední" nebo k intergenovým sekvencím jiných mikroorganismů, které mohou být přítomny ve stejném vzorku. Toto samozřejmě vyžaduje určení sekvence intergenového regionu, jak je popsáno v příkladech. Ze seřazení mohou být definovány regiony divergence, ze kterých jsou projektovány proby s požadovanými hybridizačními charakteristikami, podle návodu, který je odborníkům znám a který je podrobněji popsán níže.

Za druhé, projektované proby musí být pokusně testovány a musí být hodnocena jejich použitelnost za specifických hybridizaěních podmínek a/nebo v kombinaci s jinými probami. Pokusné testování může být provedeno podle jakékoliv hybridizaění metody v oboru známé, ale preferovaným testem pro simultání testování různých prob za stejných podmínek je reversní hybridizaění test. Specifickým formátem pro reversní hybridizaci různých prob simultáně použitých v předkládaném vynálezu je LiPA {Line Probe Assay) jak je popsána níže. Při pokusném testování se může ukázat neočekávané chování, hybrídizace, pokud jsou proby hybridizovány na cílovou nukleovou kyselinu a může být vyžadována specifická adaptace prob.

Kromě toho, specificita a sensitivita prob musí být testována na velkém souboru kmenů, jak náležejících taxonu, tak z jiných taxonů. Vzhledem k heterogenitě genomu v intergenovém regionu, nebo existenci mnoha intergenových regionů s různými sekvencemi ve stejném organismu je dosti často nezbytné sekvencovat intergenové regiony dalších kmenů, nebo sekvencovat další intergenové regiony" ve stejném kmenu, a znovu naprojektovat proby podle dat nové sekvence tak, aby se získala lepší sensitivita a/nebo specificita (viz např. příklad 3). V některých případech může být nezbytné nebo je preferováno použití několika prob pro stejný organismus (viz např. příklad 2 a 7) . Také, ři sekvencování intergenového regionu, některé organismy mohou vykazovat neočekávanou (ne)příbuznost, která může věst k revisi klasifikace kmenů oproti klasickým taxonomickým kriteriím (viz např. příklady 2 a 7) . 10 • · • · ···♦ ♦ ·· · ♦ • Μ Závěrem, pokusná část postupu selekce prob je nepostradatelná a je komplementární k teoretické části. Projektování prob, zejména za daných podmínek reversní hybridizace (stejné podmínky pro každou probu) není jednoduché a proby musí být hodnoceny pečlivě před jejich použitím ve formátu reversní hybridizace. Proto, proby nemohou být jednoduše odvozeny na teoretickém základě ze známé genové sekvence.

Pro projektování prob s požadovanými charaktreristikami může být použit následující návod.

Protože rozsah a specificita hybridizačních reakcí jak jsou zde popsány je ovlivněn mnoha faktory, bude ovlivnění jednoho nebo více z těchto faktorů určovat přesnou sensitivitu a specificitu jednotlivé proby, to, zda je perfektně komplementární ke svému cíly či nikoliv. Význam a účinek různých testovacích podmínek, které jsou zde dále vysvětleny, je odborníkům známý.

Za prvé, stabilita hybridu nukleových kyselin (proba : cíl) by měla být vybrána tak, aby byla kompatibilní s testovacími podmínkami. Toto může být provedeno tak, že se vyhýbáme dlouhým na A a T bohatým sekvencím, ukončení hybridů G:C páry baží a projektováním prob s vhodným Tm. Počátek a konec proby by měly být vybrány tak, aby délka a %GC vedly k Tm o asi 2 - 10 °C vyšší než je teplota, při které bude konečný test proveden. Složení baží proby je signifikantní, protože G-C páry baží vykazují vyšší termální stabilitu ve srovnání s A-T páry baží díky adičním vodíkovým můstkům. Tak hybridizace obsahující komplementární nukleové kyseliny s vyšším obsahem G-C bude 11 *··· • ψ 9 «· ·· *«· • ♦ • · ♦ *·· stabilnější při vyšších teplotách.

Podmínky, jako je iontová síla a inkubační teplota, za které bude proba použita, musí být také vzaty v úvahu při konstrukci proby. Je známo, že hybridizace se bude zvyšovat se zvyšující se iontovou sílou reakční směsy a že termální stabilita hybridů se bude zvyšovat se zvyšující se iontovou sílou. Na druhou stranu, chemická reagens, jako je formamid, urea, DMSO a alkoholy, které narušují vodíkové můstky, budou zvyšovat přísnost hybridizace. Destabilizace vodíkových můstků takovými reagens se může projevit značnou redukcí Tm. Obecně, optimální hybridizace pro syntetické oligonukleotidové proby okolo 10 -50 baží se vyskytuje asi 5 °C pod teplotou tání pro daný duplex. Inkubace při teplotách pod optimem může umožnit chybné párování baží hybridizujících sekvencí a může proto vést k redukované specificitě.

Je žádoucí mít proby, které hybridizují pouze za podmínek vysoké přísnosti. Za podmínek vysoké přísnosti budou tvořeny pouze hybridy vysoce komplementárních nukleových kyselin; hybridy bez dostatečného stupně komplementarity nebudou tvořeny. V souladu s tím, podmínky přísnosti testu určují stupeň komplementarity dvou řetězců nukleových kyselin potřebný pro tvorbu hybridu. Přísnost je vybrána tak, aby maximalizovala rozdíl ve stabilitě mezi hybridy tvořenými cílovou a necílovou nukleovou kyselinou. V některých příkladech předkládaného vynálezu, např. pokud je potřeba odlišit vysoce příbuzné organismy, může být nutné detekovat změny jednoho páru baží. V těchto případech j sou nutné podmínky vysoké přísnosti.

Za druhé, proby musí být umístěny tak, aby minimalizovali 12 12 • · · · · · • ···· · · • · · · · 1« · I · • · « · · · · • · · « ······ • · · · · · • · « · ······ ·· * stabilitu hybridu nukleových kyselin (proba:non-cíl). Toto může být provedeno minimalizováním délky perfektní komplementarity k non-cílovému organismu, vyvarováním se na GC bohatých regionů homologie k non-cílovým sekvencím a umístěním proby tak, aby byla v rozsahu co nejvíce destabilizujících chybných párování. To, zda je sekvence proby použitelná pouze pro detekci specifického typu organismu závisí hodně na rozdílu termální stability mezi (proba:cíl) hybridy a (proba:non-cíl) hybridy. V projektování prob by měl být rozdíl v těchto Tm hodnotách co možná největší (např. alespoň 2 °C a lépe 5 °C). Délka cílové sekvence nukleové kyseliny a v souladu s tím délka sekvence proby mohou být také významné. V některých případech zde může existovat několik sekvencí z určitého regionu, lišících se v umístění a délce, ze kterých mohou vznikat proby požadovaných hybridizačních charakteristik, v jiných případech může být jedna proba signifikantně lepší než jiná, která se odlišuje pouze v jedné bázi. Ačkoliv je pro nukleové kyseliny možné, aby hybridizovály, když nejsou zcela kompementární, bude nejdelší úsek zcela komplementární sekvence baží primárně určovat stabilitu hybridu. Ačkoliv mohou být použity oligonukleotidové proby různé délky a složení baží, oligonukleotidové proby preferované v tomto vynálezu jsou mezi 10 a 50 bázemi délky a jsou dostatečně homologní k cílové nukleové kyselině.

Za třetí, regiony v cílových DNA nebo RNA, o kterých je známo, že tvoří silné vnitřní struktury inhibiční pro hybridizaci jsou méně preferovány. Obdobně, proby s silnou samo-komplementaritou by měly být vyloučeny. Jak je vysvětleno výše, hybridizace je asociace dvou jednoduchých řetězců 13 ·· ··· nukleové kyseliny za tvorby dvoujitého řetězce vázaného vodíkovými můstky. Je předpokládáno, že pokud je jeden ze dvou řetězců cele nebo částečně obsažen v hybridu, pak bude méně schopný tvorby nového hybridu. Mohou existovat intramolekulární nebo intermolekulární hybridy tvořené v molekulách jednoho typu prob, pokud zde je dostatečná vlastní komplementarita. Takové struktury by měly být vyloučeny pečlivým projektováním prob. Projektováním prob tak, že významná část požadované sekvence je jednořetězcová může být rozsah a stupeň hybridizace značně zvýšen. Jsou dostupné počítačové programy pro vyhledávání takových interakcí. Nicméně, v jistých případech, nemusí být možné vyhnout se takovým typům interakcí.

Proby podle předkládaného vynálezu jsou projektovány pro dosažení optimálního provedení za stejných hybridizačních podmínek, takže mohou být použity v sadách pro simultání hybridizaci; toto značně zvyšuje použitelnost těchto prob a ede to k významnému zisku času a k omezení pracnosti. Je zřejmé, že pokud by měly být preferovány jiné podmínky hybridizace, pak by všechny proby měly být adaptovány podle toho adicí nebo delecí počtu nukleotidů na jejich koncích. Mělo by být jasné, že tyto konkomitantní adaptace by měly dávat v podstatě stejné výsledky, konkrétně ty, že příslušné proby stále specificky hybridizují na definované cíle. Takové adaptace mohou být také nutné, pokud by amplifikovaným materiálem měla být přirozená RNA a ne DNA, jako je tomu v případu NASBA systému.

Podmínky hybridizace mohou být monitorovány podle několika parametrů, jako je charkter a koncentrace složek media a teploty, za kterých jsou hybridy tvořeny a promývány. I 14 • · ··· · « · · ·§ · · • · · • · · · · • · ··· ·# 4

Hybridizační a promývací teplota je limitována v horní hranici v závislosti na sekvenci proby (složení její nukleové kyseliny, druhu a délce). Maximální hybridizační a promývací teploty prob popsaných v tomto vynálezu jsou v rozsahu od 40 °C do 60 °C, lépe od 45 °C do 55 °C ve specifické hybridizaci a promývací media jsou popsána v sekci příkladů. Při vyšších teplotách soutěží duplexování (= tvorba hybridů) s disociací (nebo denaturací) hybridů tvořených mezi probou a cílem.

Preferované hybridizační medium podle vynálezu obsahuje 3 x SSC a 20% formamid a hybridizační teploty mohou být v rozsahu od 45 °C do 55 °C, s preferovanou hybridizační teplotou 50 °C. Preferované promývací medium obsahuje 3 x SSC a preferované promývací teploty jsou stejné jako preferované hybridizační teploty, t.j. preferovaně mezi 45 °C a 55 °C, a nejlépe 50 °C.

Nicméně, pokud jsou vloženy modifikace, jak v probách, tak v mediu, pak by měly být teploty, při kterých mohou být proby použity pro získání požadované specificity, změněny podle známých vztahů, jako jsou ty, které jsou popsány v následujícím odkazu: Hames B and Higgins S (eds.) Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, U.K., 1985.

Vybrané proby nukleových kyselin odvozené od 16S-23S rRNA intergenového regionu a popsané v předkládaném vynálezu jsou uvedeny v tabulce la (SEQ ID NO: 1 až 64, 175 až 191, 193 až 201, a 210 až 212) . Jak je popsáno v sekcí příkladů, některé z těchto prob vykazují lepší sensitivitu a/nebo specificitu než jiné, a lepší proby jsou proto preferovaně použity v metodách pro detekci požadovaných mikroorganismů v biologickém vzorku. 15 • · · · • · · · · · 15 • · · · • · · · · · • ·

Μ I I • · · • · Μ·

Nicméně, je možné, že pro jisté aplikace (např. epidemiologické, typování subkmenů...) mohou být velmi informativní sady prob obsahující méně specifické a/nebo méně sensitivní proby (viz příklad 7) . Následující definice slouží jako ilustrace termínů a vyjádření použitých v různých provedeních předkládaného vynálezu jak jsou dány dále.

Termín "intergen" je zkrácením termínu označujícího 16S-23S rRNA vnitřní transkribovaný intergenový region.

Termín "proba" označuje jednořetězcové pro sekvenci specifické nukleotidy, které mají sekvenci, která je dostatečně komplementární pro hybridizaci na cílovou sekvenci, která má být detekována. Přesnější termín "intergenová proba" označuje probu jak je definována výše mající sekvenci, která je dostatečně komplementární pro hybridizaci na cílovou sekvenci, která je umístěna v intergenovém regionu (regionech) organismu (nebo skupiny organismů), které mají být detekovány.

Preferovaně jsou uvedené proby ze 70%, 80%, 90% nebo více než 95% homologní k přesnému komplementu cílové sekvence, která má být detekována. Tyto cílové sekvence jsou buď genomová DNA nebo prekursorová RNA, nebo jejich amplifikované verse.

Preferovaně jsou tyto proby délky okolo 5 až 50 nukleotidů, lépe okolo 10 až 25 nukeotidů. Nukleotidy jak jsou použity v předkládaném vynálezu mohou být ribonukleotidy, deoxyribonukleotidy a modifikované nukleotidy jako je inosin nebo nukleotidy obsahující modifikované skupiny, které nemění zásadně jejich hybridizační charakteristiky. Kromě toho, odborníků v oboru je jasné, že jakákoliv z níže popsaných prob může být použita jako taková, nebo ve své komplementární formě, nebo ve své RNA formě (kde T je nahrazeno U).

Proby podle vynálezu mohou být tvořeny klonováním rekombinantních plasmidů obsahujících inserty včetně korespondujících nukleotidových sekvencí, pokud je to potřeba štěpením z klonovacích plasmidů za použití adekvátních nukleas a jejich získáním, např. frakcionací podle molekulové hmotnosti. Proby podle předkládaného vynálezu mohou také být syntetizovány chemicky, například konvenční fosfodiesterovou metodou.

Termín "komplementární" nukleová kyselina jak je zde použit znamená sekvence nukleových kyselin, které mohou tvořit přesně odpovídající dvoušroubovíci s přesně spárovanými bázemi jedna s druhou.

Termín "homologní" jak je použit v této přihlášce je synonymem pro identický: to znamená, že nukleová kyselina, o které je řečeno, že je např. z 80% homologní vykazuje z 80% identické páry baží ve stejné pozici při seřazení sekvencí.

Termín "polynukleová kyselina" odpovídá jak dvojřetězcové, tak jednořetězcové cDNA nebo genomové DNA nebo RNA, obsahující alespoň 10, 20, 30, 40 nebo 50 sousedních nukleotidů. Polynukleová kyselina, která je kratší než 100 nukleotidů je často oznaočována jako oligonukleotid. Jednořetězcové sekvence 17 17 i i ·· · polynukleové kyseliny jsou v předkládaném vynálezu vždy presentovány od 5'konce do 3' konce.

Termín "nejblíže příbuzný" znamená taxon, o kterém je známo nebo o kterém je očekáváno, že je nej těsněji příbuzný ve smyslu DNA homologie a který má být odlišen od požadovaného organismu.

Vyjádření "požadované hybridizační charakteristiky" znamená, že proba hybridizuje pouze s DNA nebo RNA z organismu, pro který byla projektována a nikoliv s DNA nebo RNA z jiných organismů (nejblíže příbuzných nebo organismů, u kterých je pravděpodobný výskyt ve stejném vzorku). Prakticky to znamená, že intensita hybridizačního signálu je alespoň dvakrát, třikrát, čtyřikrát, pětkrát, desetkrát nebo vícekrát s cílovou DNA nebo RNA z organismu, pro který byla proba projektována, ve srovnání s non-cílovými sekvencemi.

Tyto požadované hybridizační charakteristiky odpovídají tomu, co je dále v textu nazýváno "specifická hybridizace".

Vyjádření "taxon-specifická hybridizace" nebo "taxon specifická proba" znamená, že proba hybridizuje pouze s DNA nebo RNA z taxonu, pro který byla projektována a nikoliv s DNA nebo RNA z jiných taxonů.

Termín taxon může označovat kompletní rod nebo podskupinu v rodu, druh nebo i podtyp v druhu (poddruh, serovar, sequevar, biovar...).

Termín "specifická amplifikace" nebo "specifické primery" 18 ·♦ ···· • 9 « 9 9 9 999 9 • · · · 9 9 99 9 999 999 99 9 označuje skutečnost, že uvedené primery amplifikují intergenový region pouze z těch organismů, pro které byly projektovány a nikoliv z jiných organismů.

Termín "sensitivita" označuje počet falešně negativních: t.j. pokud je 1 ze 100 detekovaných kmenů nerozpoznán, pak vykazuje test sensitivitu (100-1/100)% = 99%

Termín "specificita" označuje počet falešně pozitivních: t.j. pokud je detekováno 100 kmenů a 2 patří organismům, pro které není test projektován, pak je specif icita testu (100-2/100)% = 98%.

Proby vybrané jako "preferenční" vykazují sensitivitu a specificitu vyšší než 80%, lépe vyšší než 90% a nejlépe vyšší než 95%.

Termín "primer" označuje sekvenci jednořetězcového DNA oligonukleotidu schopného účinkovat jako bod iniciace pro syntesu produktu extense primeru, který je komplementární k řetězci nukleové kyseliny, který má být kopírován. Délka sekvence primeru musí být taková, aby umožňovala navození syntesy produktů extense. Preferovaný primer má délku okolo 5-50 nukleotidů. Specifická délka a sekvence bude záviset na komplexitě požadovaných DNA a RNA cílů, stejně jako na podmínkách použití primeru jako je teplota a iontová síla. Fakt, že amplifikace primerů nemusí přesně odpovídat korespondující templátové sekvenci pro zajištění vlastní amplifikace je bohatě dokumentován v literatuře (Kwok et al., 1990). 19 ·· ···· • · · • · · ··· · • · ·· ·

Použitou amplifikační metodou může být bud' polymerasová řetězová reakce (PCR; Saiki et al., 1988), ligasová řetězová reakce (LCR; Landgren et al., 1988; Wu and Wallace, 1989; Barany, 1991), amplifikace založená na sekvenci nukleové kyseliny (NASBA; Guatelli et al., 1990; Compton, 1991), na transkripci založený amplifikační systém (TAS; Kwoh et al., 1989), amplifikace nahrazením řetězce (SDA; Duck, 1990; Walker et al., 1992) nebo amplifikace prostředky QS replikásy (Lizardi et al., 1988; Lomeli et al., 1989) nebo jiná vhodná metoda pro amplifikaci molekul nukleové kyseliny v oboru známá.

Oligonukleotidy použité jako primery nebo proby mohou také obsahovat analoga nukleotidů jako jsou fosforothioáty (Matsakura et al., 1987), alkylfosforothioáty (Miller et al., 1979) nebo peptidové nukleové kyseliny (Nielsen et al., 1991; Nielsen et al., 1993) nebo mohou obsahovat interkalační agens (Asseline et al., 1984).

Jako většina variací nebo adaptací zavedených do původní DNA sekvence podle vynálezu budou tyto variace vyžadovat adaptace s ohledem na podmínky, za kterých může být oligonukleotid použit za získání požadované specificity a sensitivity. Nicméně eventuální výsledky hybridizace budou v podstatě stejné jako jsou ty, které jsou získané s nemodifikovanými oligonukleotidy.

Zavedení těchto modifikací může být výhodné pro pozitivní ovlivnění charakteristik jako je kinetika hybridizace, reversibilita tvorby hybridů, biologická stabilita oligonukleotidových molekul, atd.

Termín "pevný nosič" může označovat jakýkoliv substrát, na 20 Μ ♦ · · · 20 Μ ♦ · · · * ··» který může být oligonukleotidová proba připojena, kdy si proba uchovává své hybridizační charakteristiky a hladina pozadí hybridizace zůstává nízká. Obvyklým pevným nosičem bude mikrotitrační plotna, membrána (např. nitrocelulosová nebo nylonová) nebo mikrosféra (korálek). Před aplikací na membránu nebo fixací může být vhodné modifikovat nukleokyselinovou probu tak, aby se usnadnila fixace nebo aby se zlepšila účinnost hybridizace. Takové modifikace mohou zahrnovat připojení homopolymeru, připojení různých reaktivních skupin jako jsou alifatické skupiny, NH2 skupiny, SH skupiny, karboxylové skupiny, nebo připojení na biotin, hapteny nebo proteiny.

Termín "značený" označuje použití značené nukleové kyseliny. Značení může být provedeno použitím značených nukleotidů inkorporovaných během polymerasového kroku amplifikace jak to popisuje Saiki et al., (1988) nebo Bej et al., (1990) nebo použitím značených primerů, nebo jakoukoliv jinou metodou v oboru známou. Charakter značky může být izotopový (32P, 35S, atd.) nebo neizotopový (biotin, digoxigenin, atd.). "Vzorek" může být jakýkoliv biologický materiál, odebraný buď přímo od lidské bytosti (nebo zvířete), nebo po kultivaci (obohacený), nebo nebo vzorek odebraný z potravy nebo krmivá. Biologickým materiálem může být, například, expektorans jakéhokoliv druhu, bronchiální laváž, krev, kožní tkáň, biopsie, lymfocytámí krevní kultivační materiál, kolonie atd. Uvedené vzorky mohou být připraveny a extrahovány jakýmkoliv v oboru známým způsobem. "Cílový" materiál v těchto vzorcích může být buď genomová DNA nebo prekursorová RNA detekovaného organismu (= cílového 21 • ••I «· ♦··· ·· · ·· ·· · Φ i • · · · · · · • · * · · * ·«· · • · · · 9 · *♦· · ··! 999 ·« · organismu), nebo jejich amplifikované verse jak bylo uvedeno výše. Přesněji, sekvence nukleové kyseliny cílového materiálu je lokalizována v intergenovém regionu cílového organismu.

Detekce a identifikace cílového materiálu může být provedena za použití jedné z mnoha elektroforetických metod, hybridizačních metod nebo metod sekvencování jak jsou popsány v literatuře a odborníkům známy. Nicméně, velmi vhodnou a výhodnou technikou pro simultání detekci nukleových kyselin, jejich přítomnost v biologických vzorcích je možná, je Line Probe Assay technika. Line Probe Assay (LiPA) je reversní hybridizační formát (Saiki et al., 1989) za použití membránových proužků, na které může být vhodně aplikováno několik oligonukleotidových prob (včetně oligonukleotidů negativní a pozitivní kontroly) jako paralelní linie.

LiPA technika, jak ji popsal Stuyver et al., (1993) a mezinárodní přihláška WO 94/12670, poskytuje velmi rychlý a pro uživatele snadný hybridizační test. Po amplifikaci, během které je obvykle inkorporována neizotopová značka do amplifikovaného produktu a alkalické denaturaci je amplifikovaný produkt uveden do kontaktu s probami na membráně a je provedena hybridizace po dobu 1 až 1,5 hodiny. Následně jsou detekovány vytvořené hybridy enzymatickou procedurou vedoucí k viditelnému fialově hnědému precipitátu. LiPA formát je zcela kompatibilní s komerčně dostupnými snímacími prostředky, což umožňuje automatickou interpretaci možných výsledků. Všechny tyto výhody činí LiPA formát vhodný pro rutiní použití.

LiPA formát není pouze výhodným prostředkem pro identifikaci a detekci patogenů na úrovni druhů, ale také na vyšších nebo i 22 • · «· ♦ nižších taxonomických úrovních. Například, konfigurace prob na LiPA proužcích může být vybrána tak, že mohou detekovat úplný rod (např. Neisseria, Listeria, atd.) nebo mohou identifikovat podskupiny v rodu (např. podskupiny v komplexu Mycobactereium avium - intracellulare - scrophulaceum) nebo v některých případech mohou detekovat subtypy (poddruhy, serovary, sequevary, biovary atd., podle toho, co je klinicky relevantní) v druhu. Mělo by být podtrženo, že schopnost simultáně generovat hybridizační výsledky s mnoha probami je vynikající výhodou LiPA technologie. V mnoha případech množství informací, které může být získáno za použití určité kombinace prob vysoce převyšuje data získaná za použití testu s jednou probou. Proto je selekce prob na membránovém proužku nanejvýš důležitá, protože optimální sada prob bude generovat maximum možných informací. Toto je zde podrobněji doloženo dále.

Skutečnost, že různé proby mohou být kombinovány na proužku také nabízí možnost vhodně se vypořádat s nedostatkem sensitivity způsobeným heterogenitou sekvencí v cílovém regionu detekované skupiny organismů. Díky této heterogenitě mohou být dvě nebo více prob nezbytných pro pozitivní identifikaci všech organismů v určité skupině. Tyto proby mohou být aplikovány na proužky membrány v různých umístěních a výsledek je potom interpretován jako pozitivní, pokud je alespoň jedna z prob pozitivní. Alternativně mohou být tyto proby aplikovány jako směs ve stejném umístění, což redukuje počet linií na proužku. Tato redukce může být vhodná pro to, aby byl proužek stručnější, nebo proto, aby bylo možné rozšířit celkový počet prob na proužku. Jiným alternativním přístupem, ve světle 23 23 • · ·

• #· «··· ·· · ♦ · • · · · • * ··· · • · · ··· »· ·

• ·« · těchto praktických výhod, je syntesa oligonukleotidů, které nesou sekvence dvou (nebo více) různých prob (= degenerovaných prob) , které pak mohou být dále zpracovány a aplikovány na proužek jako oligonukleotidová molekula. Tento přístup bude značně zjednodušovat proces zpracování LiPA proužků. Například, proby s nukleotidovou sekvencí A a B jsou oba nutné pro detekci všech kmenů taxonu X. V předešlé alternativě může být syntetizována proba mající sekvenci nukleotidů AB. Tato proba bude mít charakteristiky prob A a B.

Vzhledem k výše uvedeným vlastnostem může být LiPA systém považován za preferovaný formát pro hybridizační metodu, ve které je potřeba detekovat simultáně několik organismů ve vzorku. Kromě toho, jak je popsáno v sekci příkladů, LiPA systém je preferovaný formát pro selkční metodu pro experimentální hodnocení a selekci teoreticky naplánovaných prob.

Nicméně, mělo by být jasné, že jakýkoliv jiný hybridizační test, kde jsou použity různé proby za stejných hybridizačních a promývacích podmínek, může být použit pro výše uvedené metody detekce a selekce. Například, je možné imobilizovat cílovou nukleovou kyselinu na pevný nosič a použít směs různých prob, kde každá je značena jiným způsobem, což vede k různému detekčnímu signálu pro každou probu hybridizovanou na cíl.

Jako příklad je dále uveden postup, který je potřeba sledovat pro detekci jednoho nebo více organismů ve vzorku za použití LiPA formátu: - Za prvé, nukleové kyseliny organismu ve vzorku, který má být detekován, jsou zpřístupněny pro amplifikaci a/nebo hybridizaci. - Za druhé, nukleové kyseliny, pokud jsou přítomny, jsou ampifikovány s jedním nebo s druhým cílovým amplifikačním systémem, ak je upřesněno dále. Obvykle je amplifiace nutná pro posílení hybridizačniho signálu. Nicméně pro některé vzorky nebo pro některé organismy nemusí být amplifikace nezbytná. Tak tomu také mže být v tom případě, že je použit pro detekci tvořených hybridů vysoce sensitivní signál-amplifikační systém. - Za třetí, eventuálně po kroku denaturace, nukleové kyseliny přítomné ve vzorku nebo ve vzniklém produktu amplifikace jsou uvedeny do kontaktu s LiPA proužky na kterých je jedna nebo více DNA prob, umožňujících detekci požadovaného organismu a jsou imobilizovány a je umožněna hybridizace. - Nakonec, eventuálně po provedení kroku promytí, jsou hybridy detekovány za použití vhodného a kompatibilního detekčního systému. Z pozorovaných hybridizačních signálů nebo vzorků může být odvozena přítomnost nebo za absence jednoho nebo několika organismů v tomto určitém biologickém vzorku.

Použitý amplifikační systenm může být více nebo méně universální, v závislosti na specifické potřebné aplikaci.

Za použití universálních primerů umístěných v konservovaných sousedních regionech (16S a 23S genu) rRNA intergenu bude amplifikován intergenový region většiny, pokud ne všech, organismů eubakteriálního původu. Stejné výsledky mohou být získány za použití kombinace různých sad primerů, které 25 25 ·· ·· ····

• · I • · ♦ * ·#· · • · ·♦ · redukují universalitu (mnohotnou amplifikaci, t.j. amplifikační proceduru, při které jsou použity dvě nebo více sad primerů simultáně v jedné a stejné reakční směsy).

Pro některé aplikace může být vhodné amplifikovat ne všechny organismy přítomné ve vzorku, ale specifičtěji, podle definované taxa. Toto může být dosaženo za použití specifických primerů umístěných buď v méně konzervovaných částech sousedících genů intergenů (např. MYCP1-5 pro amplifikaci intergenového regionu mycobacterií), nebo umístěných v samotných intergenech (např. LIS-P1-P7, BRU-P1-4, CHTR-P1-2, a YEC-P1-2 pro specifickou amplifikaci intergenových regionů druhu Listeria, Brucella, Chlamydia trachomatis a Yersinia enterocolitica, v příslušném pořadí). Předkládaný vynález tak poskytuje metodu pro detekci a identifikaci alespoň jednoho mikroorganismu, nebo pro simultání detekci několika mikroorganismů ve vzorku, kde tato metoda obsahuje kroky: (i) pokud je to nutné, uvolnění, isolace a/nebo koncentrace polynukleových kyselin z mikroorganismu(ů), které mají být detekovány ve vzorku; (ii) pokud je to nutné, amplifikaci 16S-23S rRNA intergenového regionu, nebo jeho části, z mikroorganismu(ů), který má být detekován, s alespoň jedním vhodným párem primerů; (iii) hybridizaci polynukleové kyseliny podle kroku (i) nebo (ii) se sadou prob obsahujíc alespoň dvě proby, za stejných hybridizačních a promývacích podmínek, kde uvedené proby jsou 26 26 ·· ···· • · · • ♦ · ··· · • · ·· · * ·♦·♦ · « ·· t Μ ·· • · · ♦ • · % · * • · · · ·♦· ♦ ·· · ··· vybrány ze sekvencí tabulky la nebo jejich ekvivalentů a/nebo z taxon-specifických prob odvozených od jakýchkoliv intergenových sekvencí representovaných na obr. 1 - 103, kde uvedená taxon-specifická proba je vybrána tak, aby byla schopná hybridizace za stejných hybridizačních a promývacích podmínek jako alespoň jedna z prob podle tabulky la; (iv) detekci hybridů tvořených v kroku (iii); (v) identifikaci mikroorganismu(ů) přítomných ve vzorku z různých hybridizačních signálů získaných v kroku (iv) .

Proby jak jsou uvedeny v tabulce la jsou všechny vybrány tak, aby vykazovaly požadované hybridizační charakteristiky při hybridizační a promývací teplotě 50 °C v preferovaném hybridizačním a promývacím mediu 3X SSC a 20% formamid.

Termín "ekvivalenty" proby, také nazývané "varianty" nebo "homology" nebo "jasné deriváty" označuje proby lišící se v sekvenci od jakýchkoliv jiných prob specifikovaných v tabulce 1 bud' adicí nebo odstraněním jakýchkoliv jejich příslušných konců o jednom nebo několika nukleotidech, nebo změnou jednoho nebo více nukleotidů v uvedených sekvencích, nebo kombinací obojího, kde uvedené ekvivalenty stále hybridizují se stejnými RNA nebo DNA cíly jako korespondující nemodifikovaná sekvence proby. Uvedené ekvivalenty mají alespoň 75% homologii, lépe více než 80% a nejlépe více ež 85% homologii s korespondující nemodifikovanou sekvencí proby. Mělo by být uvedeno že, za použití ekvivalentů proby, může být nezbytné modifikovat hybridizační podmínky pro získání stejné specificity jako má korespondující nemodifikovaná proba. V důsledku toho, jelikož 27 • · * ·· ·♦♦»

« je cílem vynálezu použití sady prob, které pracují za stejných hybridizačních a promývacích podmínek, bude také nezbytné modifikovat v souladu s tím sekvence jiných prob, které patří ke stejné sadě prob jako původní nemodifikovaná proba. Tyto modifikace mohou být provedeny podle principů v oborů známých, např. jak je popsáno v Hames B and Higgins S (Eds) : Nucleic acid hybridization: Practical Approach. IRL Press, Oxford, UK, 1985.

Vynález tako poskytuje metodu pro selekci taxon-specifických prob ze sekvence(í) intergenového regionu uvedeného taxonu, kde uvedené proby jsou vybrány tak, aby vykazovaly požadované hybridizační charakteristiky za jednotných hybridizačních a promývacích podmínek.

Termín "jednotné" znamená, že tyto podmínky jsou stejné pro různé proby umožňující detekci různých taxonů.

Preferovaně, předkládaný vynález poskytuje metodu jak je popsána výše, kde jsou alespoň dva mikroorganismy detekovány simultáně. V preferovaném provedení obsahuje sada prob jak je popsána v kroku (iii) alespoň dvě proby, které jsou vybrány ze sekvencí tabulky la, nebo jejich ekvivalentů. V jiném provedení obsahuje sada prob jak je popsána v kroku (iii) alespoň jednu probu vybranou ze sekvencí podle tabulky la, nebo jejich ekvivalentů, a alespoň jednu taxon-specifickou probu odvozenou od jakýchkoliv intergenových sekvencí jak jsou representovány na obr. 1 - 103. 28 • · ·· · ·« ·Μ· 28 • · ·· · ·« ·Μ·

·* · · • · • · <* • ·

·· · · I V ještě jiném provedení obsahuje sada prob jak je popsána v kroku (iii) alespoň dvě taxon-specifické proby odvozené od jakýchkoliv intergenových sekvencí jak jsou representovány na obr. 1 - 103. Předkládaný vynález také poskytuje metodu jak je popsána výše, kde proby jak jsou specifikovány v kroku (iii) jsou kombinovány s alespoň jednou jinou probou, preferovaně také z 16S-23S intergenového regionu, což umožňuje simultání detekci různých patogeních bakterií, o kterých je pravděpodobné, že jsou přítomné ve stejném vzorku.

Klinicky relevantní organismy přítomné v biologických vzorcích se mohou velmi lišit v závislosti na původu vzorku. Nejběžnější patogení bakterie, které mohou být přítomny ve vzorcích sputa, nebo ve vzorcích pocházejících z respiračního traktu, jsou:

Moraxella catarrhalis Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Pseudomonas aeruginosa Mycoplasma pneumoniae Acinetobacter species Mycobacterium species Staphylococcus aureus Leginella pneumophila

LiPA prožky nesoucí intergenové proby umožňující detekci většiny, pokud ne všech, těchto organismů, budou mimořádně výhodné z důvodů, které jsou vysvětleny výše. 29 29 «· • · • * • · I·· Μ« ·· • »··· Μ · • · • · 9 • · *·· « ·· ····

• · I • · ·

• ··· I • · • 4 4

Je jasné, že toto platí také pro jiné vzorky, jako je: mozkomíšní mok, urogenitální vzorky, gastrointestinální vzorky, krev, moč, potravinové produkty, půda, atd. Například, preferovaný panel pro mozkomíšní mok bude obsahovat kombinace prob umožňující detekci a diferenciaci následujících organismů:

Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Streptococcus agalactiae Listeria monocytogenes Mycobacterium tuberculosis

Pro výše uvedené organismy byly intergeňové proby již naprojektovány ve dřívější patentové přihlášce (WO 91/16454) . Pro možnost detekce většiny patogenů pravděpodobně přítomných ve vzorku v jednom testu mohou být průby podle předkládaného vynálezu kombinovány s alespoň jednou probou podle W091/16454, nebo jejich jasnými deriváty jak je specifikováno ve W091/16454. Pro ujasnění jsou zde tyto proby uvedeny:

Neisseria ponorrheoae:

Neisseria meningitidis:

Haemophilus ducrevi

NGI1: CGATGCGTCGTTATTCTACTTCGC NGI2: TTCGTTTACCTACCCGTTGACTAAGTAAGCAAAC NMI1: GGTCAAGTGTGACGTCGCCCTG NMI2: GTTCTTGGTCAAGTGTGACGTC NMI3: GCGTTCGTTATAGCTATCTACTGTGC NMI4: TGCGTTCGATATTGCTATCTACTGTGCA NMI5: TTTTGTTCTTGGTCAAGTGTGACGTCGCCCTGAA TGGATTCTGTTCCATT NMI6: TTTGCCTAACATTCCGTTGACTAGAACATCAGAC HDI1: TTATTATGCGCGAGGCATATTG

Branhamella catharralis BCI1: TTAAACATCTTACCAAAG

BCI2: TTGATGTTTAAACTTGCTTGGTGGA 30 ···· Μ ···· • · · • Μ » • · Μ ·

Bordetella pertussis ΒΡΙ1: CCACACCCATCCTCTGGACAGGCTT Haemophilus influenzae HII1: ACGCATCAAATTGACCGCACTT

HII2: ACTTTGAAGTGAAAACTTAAAG Streptococcus agalactiae SAI1: AATCGAAAGGTTCAAATTGTT

SAK: GGAAACCTGCCATTTGCGTCTT SAD: TCCACGATCTAGAAATAGATTGTAGAA SAM: TCTAGTTTTAAAGAAACTAGGTT Streptococcus pneumoniae SPI1: GTGAGAGATCACCAAGTAATGCA

SPI2: AGGAACTGCGCATTGGTCTT SPD: GAGTTTATGACTGAAAGGTCAGAA

Vynález tak poskytuje metodu jak je popsána výše, kde uvedený vzorek pochází z respiračního traktu a kde uvedená sada prob jak je definována v kroku {iii) obsahuje alespoň jednu probu vybranou z následujících intergenových prob: (SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4) (SEQ ID NO 5) (SEQ ID NO 6)

MYC-ICG-1 : ACTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTA MYC-ICG-22 : CTTCTGAATAGTGGTTGCGAGCATCT MTB-ICG-1 : GGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCA MTB-ICG-2: GACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCAC MTB-ICG-3 : CGGCTAGCGGTGGCGTGTTCT

MAI-ICG-1 : CAACAGCAAATGATTGCCAGACACAC 31 ·· ···· • · Φ ·· MIL-ICG-11 : MIL-ICG-22 : MAC-ICG-1 : MAV-ICG-1 : MAV-ICG-22 : MIN-ICG-1 : MIN-ICG-2 : MIN-ICG-22 : MIN-ICG-222 : MIN-ICG-2222 MAL-ICG-1 : -MHEF-ICG-1 : MAH-ICG-1 : MCO-ICG-11 : MTH-ICG-11 : MTH-ICG-2 : MEF-ICG-11 : MSC-ICG-1 : MKA-ICG-1 : MKA-ICG-2 : MKA-ICG-3 : MKA-ICG-4 : MKA-ICG-5 : MKA-ICG-6 : MKA-1CG-7 : MKA-ICG-8 : MKA-ICG-9 : MKA-ICG-10 : MCH-ICG-1 : MCH-ICG-2 : MCH-ICG-3 :

GAGGGGTTCCCGTCTGTAGTG

TGAGGGGTTCTCGTCTGTAGTG

CACTCGGTCGATCCGTGTGGA

TCGGTCCGTCCGTGTGGAGTC

GTGGCCGGCGTTCATCGAAA

GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT

GCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTA

CTGATGCGTTCGTCGAAATGTGT

TGATGCGTTCGTCGAAATGTGT

: GGCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTAA

ACTAGATGAACGCGTAGTCCTTGT

TGGACGAAAACCGGGTGCACAA

TGGCCGGCGTGTTCATCGAAA

GCACTTCAATTGGTGAAGTGCGAGCC

GCGTGGTCTTCATGGCCGG

ACGCGTGGTCCTTCGTGG

TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGTC

GATGCGTTTGCTACGGGTAGCGT

GATGCGTTGCCTACGGGTAGCGT

ATGCGTTGCCCTACGGGTAGCGT

CGGGCTCTGTTCGAGAGTTGTC

CCCTCAGGGATTTTCTGGGTGTTG

GGACTCGTCCAAGAGTGTTGTCC

TCGGGCTTGGCCAGAGCTGTT

GGGTGCGCAACAGCAAGCGA

GATGCGTTGCCCCTACGGG

CCCTACGGGTAGCGTGTTCTTTTG

GGTGTGGACTTTGACTTCTGAATAG

CGGCAAAACGTCGGACTGTCA

GGTGTGGTCCTTGACTTATGGATAG (SEQ ID NO 7) (SEQ ID NO 8) (SEQ ID NO 9) (SEQ ID NO 10) (SEQ ID NO 11) (SEQ ID NO 12) (SEQ ID NO 13) (SEQ ID NO 14) (SEQ ID NO 15) (SEQ ID NO 16) (SEQ ID NO 17) (SEQ ID NO 18) (SEQ ID NO 19) (SEQ ID NO 20) (SEQ ID NO 21) (SEQ ID NO 22) (SEQ ID NO 23) (SEQ ID NO 24) (SEQ ID NO 25) (SEQ ID NO 26) (SEQ ID NO 27) (SEQ ID NO 28) (SEQ ID NO 182) (SEQ ID NO 183) (SEQ ID NO 184) (SEQ ID NO 185) (SEQ ID NO 186) (SEQ ID NO 187) (SEQ ID NO 29) (SEQ ID NO 30) (SEQ ID NO 210) MGO-ICG-1 : AACACCCTCGGGTGCTGTCC (SEQ ID NO 31) MGO-ICG-2 : GTATGCGTTGTCGTTCGCGGC (SEQ ID NO 32) MGO-ICG-5 : CGTGAGGGGTCATCGTCTGTAG (SEQ ID NO 33) MUL-ICG-1 : GGTTTCGGGATGTTGTCCCACC (SEQ ID NO 175) MGV-ICG-1 : CGACTGAGGTCGACGTGGTGT (SEQ ID NO 176) MGV-ICG-2 : GGTGTTTGAGCATTGAATAGTGGTTGC (SEQ ID NO 177) MGV-ICG-3 : TCGGGCCGCGTGTTCGTCAAA (SEQ ID NO 211) MXE-ICG-1 : GTTGGGCAGCAGGCAGTAACC (SEQ ID NO 178) MSI-ICG-1 : CCGGCAACGGTTACGTGTTC (SEQ ID NO 179) MFO-ICG-1 : TCGTTGGATGGCCTCGCACCT (SEQ ID NO 180) MFO-ICG-2 : ACTTGGCGTGGGATGCGGGAA (SEQ ID NO 181) MML-ICG-1 : CGGATCGATTGAGTGCTTGTCCC (SEQ ID NO 188) MML-ICG-2 : TCTAAATGAACGCACTGCCGATGG (SEQ ID NO 189) MCE-ICG-1 : TGAGGGAGCCCGTGCCTGTA (SEQ ID NO 190) MHP-ICG-1 : CATGTTGGGCTTGATCGGGTGC (SEQ ID NO 191) PA-ICG l : TGGTGTGCTGCGTGATCCGAT (SEQ ID NO 34) PA-ICG 2 : TGAATGTTCGTGGATGAACATTGATT (SEQ ID NO 35) PA-ICG 3 : CACTGGTGATCATTCAAGTCAAG (SEQ ID NO 36) (SEQ ID NO 37) (SEQ ID NO 38) (SEQ ID NO 49) (SEQ ID NO 50) (SEQ ID NO 51) PA-ICG 5 : MPN-ICG 1 MPN-ICG 2 MGE-ICG 1

CTCTTTCACTGGTGATCATTCAAGTCAAG

ATCGGTGGTAAATTAAACCCAAATCCCTGT

CAGTTCTGAAAGAACATTTCCGCTTCTTTC

CACCCATTAATTTTTTCGGTGTTAAAACCC

Mycoplasma-ICG : CAAAACTGAAAACGACAATCTTTCTAGTTCC (SEQ ID NO 52) STAU-ICG 1 STAU-ICG 2 STAU-ICG 3 STAU-ICG 4 ACI-ICG 1 : ACI-ICG 2 : (SEQ ID NO 53) (SEQ ID NO 54) (SEQ ID NO 55) (SEQ ID NO 56) (SEQ ID NO 57) (SEQ ID NO 58)

TACCAAGCAAAACCGAGTGAATAAAGAGTT

CAGAAGATGCGGAATAACGTGAC

AACGAAGCCGTATGTGAGCATTTGAC

GAACGTAACTTCATGTTAACGTTTGACTTAT

GCTTAAGTGCACAGTGCTCTAAACTGA

CACGGTAATTAGTGTGATCTGACGAAG a lépe z následujících intergenových prob: 33

MYC-ICG-1 : MYC-ICG-22 : MTB-ICG-1 : MTB-ICG-2 : MTB-ICG-3 : MAI-ICG-1 : MIL-ICG-11 : MIL-ICG-22 : MAC-ICG-1 : MAV-ICG-1 : MAV-ICG-22 : MIN-ICG-1 : MAL-ICG-1 : MCO-ICG-11 : MTH-ICG-11 : MTH-ICG-2 : MEF-ICG-11 : MSC-ICG-1 : MKA-ICG-3 : MKA-ICG-4 : MKA-ICG-5 : MKA-ICG-6 : MKA-ICG-7 : MKA-ICG-8 : MKA-ICG-9 : MKA-ICG-10 : MCH-ICG-1 : MCH-ICG-2 : MCH-ICG-3 : MGO-ICG-5 : MUL-ICG-1 : MGV-ICG-1 :

ACTGG AT AGTGGTTGCGAGCATCTA

CTTCTGAATAGTGGTTGCGAGCATCT

GGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCA

GACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCAC

CGGCTAGCGGTGGCGTGTTCT

CAACAGCAAATGATTGCCAGACACAC

GAGGGGTTCCCGTCTGTAGTG

TGAGGGGTTCTCGTCTGTAGTG

CACTCGGTCGATCCGTGTGGA

TCGGTCCGTCCGTGTGGAGTC

GTGGCCGGCGTTCATGGAAA

GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT

ACTAGATGAACGCGTAGTCCTTGT

TGGCCGGCGTGTTCATCGAAA

GCACTTCAATTGGTGAAGTGCGAGCC

GCGTGGTCTTCATGGCCGG

ACGCGTGGTCCTTCGTGG

TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGTC

ATGCGTTGCCCTACGGGTAGCGT

CGGGCTCTGTTCGAGAGTTGTC

CCCTCAGGGATTTTCTGGGTGTTG

GGACTCGTCCAAGAGTGTTGTCC

TCGGGCTTGGCCAGAGCTGTT

GGGTGCGCAACAGCAAGCGA

GATGCGTTGCCCCTACGGG

CCCTACGGGTAGCGTGTTCTTTTG

GGTGTGGACTTTGACTTCTGAATAG

CGGCAAAACGTCGGACTGTCA

GGTGTGGTCCTTGACTT ATGGATAG

CGTGAGGGGTCATCGTCTGTAG

GGTTTCGGGATGTTGTCCCACC

CGACTGAGGTCGACGTGGTGT (SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4) (SEQ ID NO 5) (SEQ ID NO 6) (SEQ ID NO 7) (SEQ ID NO 8) (SEQ ID NO 9) (SEQ ID NO 10) (SEQ ID NO 11) (SEQ ID NO 12) (SEQ ID NO 17) (SEQ ID NO 20) (SEQ ID NO 21) (SEQ ID NO 22) (SEQ ID NO 23) (SEQ ID NO 24) (SEQ ID NO 27) (SEQ ID NO 28) (SEQ ID NO 182) (SEQ ID NO 183) (SEQ ID NO 184) (SEQ ID NO 185) (SEQ ID NO 186) (SEQ ID NO 187) (SEQ ID NO 29) (SEQ ID NO 30) (SEQ ID NO 210) (SEQ ID NO 33) (SEQ ID NO 175) (SEQ ID NO 176) 34 ···· ·· ·♦·· 34 ···· ·· ·♦·· MGV-ICG-2 : MGV-ICG-3 : MXE-ICG-1 : MSI-ICG-1 : MFO-ICG-1 : MFO-ICG-2 : MML-ICG-1 : MML-ICG-2 : MCE-ICG-1 : MHP-ICG-1 : (SEQ ID NO 177) (SEQ ID NO 211) (SEQ ID NO 178) (SEQ ID NO 179) (SEQ ID NO 180) (SEQ ID NO 181) (SEQ ID NO 188) (SEQ ID NO 189) (SEQ ID NO 190) (SEQ ID NO 191)

GGTGTTTGAGCATTGAATAGTGGTTGC

TCGGGCCGCGTGTTCGTCAAA

GTTGGGCAGCAGGCAGTAACC

CCGGCAACGGTTACGTGTTC

TCGTTGGATG GCCTCGCACCT

ACTTGGCGTGGGATGCGGGAA

CGGATCGATTGAGTGCTTGTCCC

TCTAAATGAACGCACTGCCGATGG

TGAGGGAGCCCGTGCCTGTA

CATGTTGGGCTTGATCGGGTGC

TGGTGTGCTGCGTGATCCGAT (SEQ ID NO 34) TGAATGTTCGT(G/A)(G/A)ATGAACATTGATTTCTGGTC (SEQ ID NO 37) CTCTTTCACTGGTGATCATTCAAGTCAAG ATCGGTGGTAAATTAAACCCAAATCCCTGT CAGTTCTGAAAGAACATTTCCGCTTCTTTC CACCCATTAATTnTTCGGTGTTAAAACCC PA-ICG 1 : PA-ICG 4 : PA-ICG 5 : MPN-ICG 1 MPN-ICG 2 MGE-ICG 1 (SEQ ID NO 38) (SEQ ID NO 49) (SEQ ID NO 50) (SEQ ID NO 51)

Mycoplasma-ICG : CAAAACTGAAAACGACAATCTTTCTAGTTCC (SEQ ID NO 52)

TACCAAGCAAAACCGAGTGAATAAAGAGTT CAGAAGATGCGGAATAACGTGAC AACGAAGCCGTATGTGAGCATTTGAC GAACGTAACTTCATGTTAACGTTTGACTTAT GCTTAAGTGCACAGTGCTCTAAACTGA CACGGTAATTAGTGTGATCTGACGAAG STAU-ICG 1 STAU-ICG 2 STAU-ICG 3 STAU-ICG 4 ACI-ICG 1 : ACI-ICG 2 : (SEQ ID NO 53) (SEQ ID NO 54) (SEQ ID NO 55) (SEQ ID NO 56) (SEQ ID NO 57) (SEQ ID NO 58) nebo ekvivalenty uvedených prob, a/nebo kde sada prob obsahuje alespoň jednu taxon specifickou probu odvozenou od sekvence intergenového regionu korespondující jednomu mikroorganismu, který má být detekován v uvedeném vzorku, kde uvedená sekvence intergenového regionu je vybrána z jakékoliv ze sekvencí jak jsou representovány SEQ ID NO: 76 až 106, 157 až 174, 124, 125, 111 až 35 Μ » · · · ··· • · 115, 139 až 144 nebo 126 až 130, a s tím, že uvedené proby nebo ekvivalenty prob jsou pokud možno použity v kombinaci s jakoukoliv probou detekující alespoň jeden z následujících organismů: Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis nebo Bordetella pertussis. Výše uvedené proby podle vynálezu jsou projektovány pro detekci druhů Mycobacterium {SEQ ID NO: 1 až 33 a 175 až 191), Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 34 až 38), druhů Mycoplasma (SEQ ID NO: 49 až 52), Staphylococcus aureus (SEQ ID NO: 53 až 56) a Acinetobacter baumanii (SEQ ID NO: 57 a 58).

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři, čtyři, pět, šest, sedm, osm nebo více prob použity současně.

Vynález se také týká metody jak je popsána výše, kde uvedený vzorek je odebrán z mozkomíšního moku a kde uvedená sada prob jak je definována v kroku (iii) obsahuje alespoň jednu probu vybranou z následujících intergenových prob: (SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4) (SEQ ID NO 5) (SEQ ID NO 39) MYC-ICG-1 : MYC-ICG-22 MTB-ICG-1 MTB-ICG-2 MTB-ICG-3 LIS-ICG 1 : LMO-ICG 1 : LMO-ICG 2 : LMO-ICG 3 : LISP-ICG 1: ACTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTA CTTCTGAATAGTGGTTGCGAGCATCT GGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCA GACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCAC CGGCTAGCGGTGGCGTGTTCT CAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATC AAACAACCTTTACTTCGTAGAAGTAAATTGGTTAAG · (SEQ ID NO 40) TGAGAGGTTAGTACTTCTCAGTATGTTTGTTC (SEQ ID NO 41) AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC (SEQ ID NO 42) CGTTTTCATAAGCGATCGCACGTT (SEQ ID NO 212) 36 • ·· * ·· ···· • f · ·· ·

• · ·· · ·*· a preferovaně z následuj ících intergenových prob: MYC-ICG-1 : ACTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTA (SEQ ID NO 1) MYC-ICG-22 : CTTCTGAATAGTGGTTGCGAGCATCT (SEQ ID NO 2) MTB-ICG-1 : GGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCA (SEQ ID NO 3) MTB-ICG-2 : GACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCAC (SEQ ID NO 4) MTB-ICG-3 : CGGCTAGCGGTGGCGTGTTCT (SEQ ID NO 5) LIS-ICG 1 : CAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATC (SEQ ID NO 39) LMO-ICG 3 : AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC (SEQ ID NO 42) LISP-ICG 1: CGTTTTCATAAGCGATCGCACGTT (SEQ ID NO 212) nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo kde sada prob obsahuje alespoň jednu taxon specifickou probu odvo2enou od sekvence intergenového regionu korespondující jednomu mikroorganismu, který má být detekován v uvedeném vzorku, kde uvedená sekvence intergenového regionu je vybrána z jakékoliv ze sekvencí jak jsou representovány SEQ ID NO: 116, 118 - 121 nebo 213 - 215, a s tím, že uvedené proby nebo ekvivalenty prob jsou pokud možno použity v kombinaci s jakoukoliv probou detekující alespoň jeden z následujících organismů: Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae nebo Streptococcus pneumoniae. Výše uvedené proby podle vynálezu jsou projektovány pro detekci Mycobacterium species, a přesněji Mycobacterium tuberculosis (SEQ ID NO: 1 až 5), a Listeria species, přesněji Listeria monocytogenes (SEQ ID NO: 39 až 42).

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři, čtyři, pět, šest, sedm, osm 37 ···· »· ·»tf *· ·

Μ Μ • · • · • · 11« • · 1 « » ♦ *· · • · Μ · nebo více prob použity současně.

Vynález se také týká metody jak je popsána výše, kde uvedený vzorek je odebrán z urogenitálního traktu a kde uvedená sada prob jak je definována v kroku (iii) obsahuje alespoň jednu probu vybranou z následujících intergenových prob: CHTR-ICG 1 : GGAAGAAGCCTGAGAAGGTTTCTGAC (SEQ ID NO 45) CHTR-ICG 2 : GCATTTATATGTAAGAGCAAGCATTCTATTTCA (SEQ ID NO 46) CHTR-ICG 3 : GAGTAGCGTGGTGAGGACGAGA (SEQ ID NO 47) CHTR-ICG 4 : GAGTAGCGCGGTGAGGACGAGA (SEQ ID NO 201) CHPS-ICG 1 : GGATAACTGTCTTAGGACGGTTTGAC (SEQ ID NO 48) MGE-ICG 1 : CACCCATTAATTTTTTCGGTGTTAAAACCC (SEQ ID NO 51)

Mycoplasma-ICG ; CAAAACTGAAAACGACAATC Γ l TCTAGT i CC (SEQ ID NO 52) nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo kde sada prob obsahuje alespoň jednu taxon specifickou probu odvozenou od sekvence intergenového regionu korespondující jednomu mikroorganismu, který má být detekován v uvedeném vzorku, kde uvedená sekvence intergenového regionu je vybrána z jakékoliv ze sekvencí jak jsou representovány SEQ ID NO: 122, 123, 197, 124 nebo 125, a s tím, že uvedené proby nebo ekvivalenty prob jsou pokud možno použity v kombinaci s jakoukoliv probou detekující alespoň jeden z následujících organismů: Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus ducreyi nebo Streptococcus agalactiae. Výše uvedené proby podle vynálezu jsou projektovány pro detekci druhu Chlamydia (SEQ ID NO: 45 až 48 a 201), a druhu Mycoplasma (SEQ ID NO: 51 až 52) . 38

38 • ···* • • n · • • • • • * • • • • ··· • ·· · I · • · · * • · *·· · • · · ··· Μ I ·· ····

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři, čtyři, pět, šest, sedm, osm nebo více prob použity současně.

Vynález se také týká metody jak je popsána výše, kde uvedený vzorek je odebrán z potravy a kde uvedená sada prob jak je definována v kroku (iii) obsahuje alespoň jednu probu vybranou z následujících intergenových prob: LIS-ICG 1 : LMO-ICG 1 : LMO-ICG 2 : LMO-ICG 3 : LIV-ICG 1 :

CAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATC (SEQ ID NO 39) AAACAACCTTTACTTCGTAGAAGTAAATTGGTTAAG (SEQ ID NO 40) TGAGAGGTTAGTACTTCTCAGTATGTTTGTTC (SEQ ID NO 41) AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC (SEQ ID NO 42)

GTTAGC ATA A ATAGGTA ACTATTTATG AC AC A AGTAAC (SEQ ID NO 43) (SEQ ID NO 44) (SEQ ID NO 212) (SEQ ID NO 53) (SEQ ID NO 54) (SEQ ID NO 55) (SEQ ID NO 56) (SEQ ID NO 59) (SEQ ID NO 60) (SEQ ID NO 193) (SEQ ID NO 194) (SEQ ID NO 61) (SEQ ID NO 62) (SEQ ID NO 63) (SEQ ID NO 64) (SEQ ID NO 198) (SEQ ID NO 199) (SEQ ID NO 200)

LSE-ICG 1 :AGTTAGCATAAGTAGTGTAACTATTTATGACACAAG

LISP-ICG 1: CGTTTTCATAAGCGATCGCACGTT

STAU-ICG 1 : TACCAAGCAAAACCGAGTGAATAAAGAGTT

STAU-ICG 2 : CAGAAGATGCGGAATAACGTGAC

STAU-ICG 3 : AACGAAGCCGTATGTGAGCATTTGAC

STAU-ICG 4 : GAACGTAACTTCATGTTAACGTTTGACTTAT

BRU-ICG 1 : CGTGCCGCCTTCGTTTCTCTTT

BRU-ICG 2 : TTCGCTTCGGGGTGGATCTGTG

BRU-ICG 3 : GCGTAGTAGCGTTTGCGTCGG

BRU-ICG 4 : CGCAAGAAGCTTGCTCAAGCC

SALM-ICG 1 : CAAAACTGACTTACGAGTCACGTT rGAG

SALM-ICG 2 : GATGTATGCTTCGTTATTCCACGCC

STY-ICG 1 : GGTCAAACCTCCAGGGACGCC

SED-ICG 1 : GCGGTAATGTGTGAAAGCGTTGCC

YEC-ICG 1 : GGAAAAGGTACTGCACGTGACTG

YEC-ICG 2 : GACAG CTGAAACTTATCCCTCCG

YEC-ICG 3 : GCTACCTGTTGATGTAATGAGTCAC a preferovaně z následujících intergenových prob: 39 • ···· · Μ · ·· · LIS-ICG 1 : LMO-ICG 3 : LISP-ICG 1: STAU-ICG 1 : STAU-ICG 2 : STAU-ICG 3 : STAU-ICG 4 : BRU-ICG 2 : BRU-ICG 3 : BRU-ICG 4 : SALM-ICG 1 : YEC-ICG 1 : YEC-ICG 2 : YEC-ICG 3 : (SEQ ID NO 39) (SEQ ID NO 42) (SEQ ID NO 212) (SEQ ID NO 53) (SEQ ID NO 54) (SEQ ID NO 55) (SEQ ID NO 56) (SEQ ID NO 60) (SEQ ID NO 193) (SEQ ID NO 194) (SEQ ID NO 61) (SEQ ID NO 198) (SEQ ID NO 199) (SEQ ID NO 200)

CAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATC

AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC

CGTTTTCATAAGCGATCGCACGTT

TACCAAGCAAAACCGAGTGAATAAAGAGTT

CAGAAGATGCGGAATAACGTGAC

AACGAAGCCGTATGTGAGCATTTGAC

GAACGTAACTTCATGTTAACGTTTGACTTAT

TTCGCTTCGGGGTGGATCTGTG

GCGTAGTAGCGTTTGCGTCGG

CGCAAGAAGCTTGCTCAAGCC

CAAAACTGACTTACGAGTCACGTTTGAG

GGAAAAGGTACTGCACGTGACTG

GACAGCTGA AACTT ATCCCTCCG GCTACCTGTTGATGTAATGAGTCAC nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo kde sada prob obsahuje alespoň jednu taxon specifickou probu odvozenou od sekvence intergenového regionu korespondující jednomu mikroorganismu, který má být detekován v uvedeném vzorku, kde uvedená sekvence intergenového regionu je vybrána z jakékoliv ze sekvencí jak jsou representovány SEQ ID NO: 116, 118 - 121, 213 - 215, 139 - 144, 131, 132, 154, 133 - 138, 195 nebo 196, a s tím, že uvedené proby nebo ekvivalenty prob jsou pokud možno použity v kombinaci s jakoukoliv probou detekující kmeny druhu Campylobacter.

Výše uvedené proby podle vynálezu jsou projektovány pro detekci druhu Listeria (SEQ ID NO: 39 až 44), druhu Staphycoccus (SEQ ID NO: 53 až 56), druhu Brucella (SEQ 40 ··· · # ······ • Μ Μ t · · • · · · · · • · · ······ • · · · · • *····· ·· · ID NO: 59, 60, 193 a 194), druhu Salmonella (SEQ ID NO: 61 až 64) a Yersinia enterocolitica (SEQ ID NO: 198 až 200) .

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři, čtyři, pět, šest, sedm, osm nebo více prob použity současně.

Vynález se také týká metody jak je popsána výše, kde uvedený vzorek je odebrán z gastrointestinálního traktu pacienta a kde uvedená sada prob jak je definována v kroku (iii) obsahuje alespoň jednu probu vybranou z následujících intergenových prob: SALM-ICG 1 : SALM-ICG 2 : STY-1CG 1 : SED-ICG 1 : YEC-ICG 1 : YEC-ICG 2 : YEC-ICG 3 :

CAAAACTGACTTACGAGTCACGTTTGAG GATGTATGCTTCGTTATTCCACGCC GGTCAAACCTCCAGGGACGCC GCGGTAATGTGTGAAAGCGTTGCC GGAAAAGGTACTGCACGTGACTG GACAGCTGAAACTTATCCCTCCG . GCTACCTGTTGATGTAATGAGTCAC (SEQ ID NO 61) (SEQ ID NO 62) (SEQ ID NO 63) (SEQ ID NO 64) (SEQ ID NO 198) (SEQ ID NO 199) (SEQ ID NO 200) a preferovaně z následujících intergenových prob: (SEQ ID NO 61) (SEQ ID NO 198) (SEQ ID NO 199) (SEQ ID NO 200)

SALM-ICG 1 : CAAAACTGACTTACGAGTCACGTTTGAG YEC-ICG 1 : GGAAAAGGTACTGCACGTGACTG YEC-ICG 2 : GACAGCTGAAACTTATCCCTCCG YEC-ICG 3 : GCTACCTGTTGATGTAATGAGTCAC nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo kde sada prob obsahuje 41

alespoň jednu taxon specifickou probu odvozenou od sekvence intergenového regionu korespondující jednomu mikroorganismu, který má být detekován v uvedeném vzorku, kde uvedená sekvence intergenového regionu je vybrána z jakékoliv ze sekvencí jak jsou representovány SEQ ID NO: 133 - 138 nebo 195 - 196, a s tím, že uvedené proby nebo ekvivalenty prob jsou pokud možno použity v kombinaci s jakoukoliv probou detekující druh Campy1obacter. Výše uvedené proby podle vynálezu jsou projektovány pro detekci druhu Salmonella (SEQ ID NO: 61 až 64) a Yersinia enterocolitica (SEQ ID NO: 198 až 200) .

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři, čtyři, pět, šest, sedm, osm nebo více prob použity současně.

Vynález se také týká použití vybraných prob nebo jejich ekvivalentů pro detekci specifických bakteriálních taxonů, kde uvedený taxon je buď kompletní rod, nebo podskupina v rodu, druh, nebo i podtyp v druhu.

Vynález tak poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycobacterium species a subspecies ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4) (SEQ ID NO 5)

MYC-ICG-1 : ACTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTA MYC-ICG-22 : CTTCTGAATAGTGGTTGCGAGCATCT MTB-ICG-1 : GGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCA MTB-ICG-2 : GACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCAC MTB-ICG-3 : CGGCTAGCGGTGGCGTGTTCT 42 ·· ···· 9 · · 9 · · ··· · • · MAMCG-1 : MIL-ICG-11 : MIL-ICG-22 : MAC-ICG-1 : MAV-ICG-1 : MAV-ICG-22 : MIN-ICG-1 : MIN-ICG-2 : MIN-ICG-22 : MIN-ICG-222 : MIN-ICG-2222 MAL-ICG-1 : MHEF-ICG-1 : MAH-ICG-1 : MCO-ICG-11 : MTH-ICG-11 : MTH-ICG-2 : MEF-ICG-11 : MSC-ICG-1 : MKA-ICG-1 : MKA-ICG-2 : MKA-ICG-3 : MKA-ICG-4 : MKA-ICG-5 : MKA-ICG-6 : MKA-ICG-7 : MKA-ICG-8 : MKA-ICG-9 : MKA-ICG-10 : MCH-ICG-1 : MCH-ICG-2 :

CAACAGCAAATGATTGCCAGACACAC

GAGGGGTTCCCGTCTGTAGTG

TGAGGGGTTCTCGTCTGTAGTG

CACTCGGTCGATCCGTGTGGA

TCGGTCCGTCCGTGTGGAGTC

GTGGCCGGCGTTCATCGAAA

GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT

GCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTA

CTGATGCGTTCGTCGAAATGTGT

TGATGCGTTCGTCGAAATGTGT

: GGCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTAA

ACTAGATGAACGCGTAGTCCTTGT

TGGACGAAAACCGGGTGCACAA

TGGCCGGCGTGTTCATCGAAA

GCACTTCAATTGGTGAAGTGCGAGCC

GCGTGGTCTTCATGGCCGG

ACGCGTGGTCCTTCGTGG

TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGTC

GATGCGTTTGCTACGGGTAGCGT

GATGCGTTGCCTACGGGTAGCGT

ATGCGTTGCCCTACGGGTAGCGT

CGGGCTCTGTTCGAGAGTTGTC

CCCTCAGGGATTTTCTGGGTGTTG

GGACTCGTCCAAGAGTGTTGTCC

TCGGGCTTGGCCAGAGCTGTT

GGGTGCGCAACAGCAAGCGA

GATGCGTTGCCCCTACGGG

CCCTACGGGTAGCGTGTTCTTTTG

GGTGTGGACTTTGACTTCTGAATAG

CGGCAAAACGTCGGACTGTCA (SEQ ID NO 6) (SEQ ID NO 7) (SEQ ID NO 8) (SEQ ID NO 9) (SEQ ID NO 10) (SEQ ID NO 1.1) (SEQ ID NO 12) (SEQ ID NO 13) (SEQ ID NO 14) (SEQ ID NO 15) (SEQ ID NO 16) (SEQ ID NO 17) (SEQ ID NO 18) (SEQ ID NO 19) (SEQ ID NO 20) (SEQ ID NO 21) (SEQ ID NO 22) (SEQ ID NO 23) (SEQ ID NO 24) (SEQ ID NO 25) (SEQ ID NO 26) (SEQ ID NO 27) (SEQ ID NO 28) (SEQ ID NO 182) (SEQ ID NO 183) (SEQ ID NO 184) (SEQ ID NO 185) (SEQ ID NO 186) (SEQ ID NO 187) (SEQ ID NO 29) (SEQ ID NO 30) MGO-ICG-1 : 43 AACACCCTCGGGTGCTGTCC • · t • · · · I · · (SEQ ID NO 3*1) MGO-ICG-2 : GTATGCGTTGTCGTTCGCGGC (SEQ ID NO 32) MGO-ICG-5 : CGTGAGGGGTCATCGTCTGTAG (SEQ ID NO 33) MUL-ICG-1 : GGTTTCGGGATGTTGTCCCACC (SEQ ID NO 175) MGV-ICG-1 : CGACTGAGGTCGACGTGGTGT (SEQ ID NO 176) MGV-ICG-2 : GGTGTTTGAGCATTGAATAGTGGTTGC (SEQ ID NO 177) MXE-ICG-1 : GTTGGGCAGCAGGCAGTAACC (SEQ ID NO 178) MSI-ICG-1 : CCGGCAACGGTTACGTGTTC (SEQ ID NO 179) MFO-ICG-1 : TCGTTGGATGGCCTCGCACCT (SEQ ID NO 180) MFO-ICG-2 : ACTTGGCGTGGGATGCGGGAA (SEQ ID NO 181) MML-ICG-1 CGGATCGATTGAGTGCTTGTCCC (SEQ ID NO 188) MML-TCG-2 TCTAAATGAACGCACTGCCGATGG (SEQ ID NO 189) MCE-ICG-1 : TGAGGGAGCCCGTGCCTGTA (SEQ ID NO 190) MHP-ICG-1 : CATGTTGGGCTTGATCGGGTGC (SEQ ID NO 191) a lépe na alespoň jednu probu z následující omezené skupiny interčjrenových prob: MYC-ICG-1 : MYC-ICG-22 MTB-ICG-1 : MTB-ICG-2 : MTB-ICG-3 : MAI-ICG-1 : MIL-ICG-11 MIL-ICG-22 MAC-ICG-1 MAV-ICG-1 MAV-ICG-22 MIN-ICG-1 : MAL-ICG-1 : MCO-ICG-11 MTH-ICG-11 MTH-ICG-2 : MEF-ICG-11 (SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4) (SEQ ID NO 5) (SEQ ID NO 6) (SEQ ID NO 7) (SEQ ID NO 8) (SEQ ID NO 9) (SEQ ID NO 10) (SEQIDNO 11) (SEQ ID NO 12) (SEQ ID NO 17) (SEQ ID NO 20) (SEQ ID NO 21) (SEQ ID NO 22) (SEQ ID NO 23)

ACTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTA

CTTCTGAATAGTGGTTGCGAGCATCT

GGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCA

GACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCAC

CGGCTAGCGGTGGCGTGTTCT

CAACAGCAAATGATTGCCAGACACAC

GAGGGGTTCCCGTCTGTAGTG

TGAGGGGTTCTCGTCTGTAGTG

CACTCGGTCGATCCGTGTGGA

TCGGTCCGTCCGTGTGGAGTC

GTGGCCGGCGTTCATCGAAA

GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT

ACTAGATGAACGCGTAGTCCTTGT

TGGCCGGCGTGTTCATCGAAA

GCACTTCAATTGGTGAAGTGCGAGCC

GCGTGGTCTTCATGGCCGG

ACGCGTGGTCCTTCGTGG • · · · · · 44 • · · · · · 44 (SEQ ID NO 24) (SEQ ID NO 27) (SEQ ID NO 28) (SEQ ID NO 182) (SEQ ID NO 183) (SEQ ID NO 184) (SEQ ID NO 185) (SEQ ID NO 186) (SEQ ID NO 187) (SEQ ID NO 29) (SEQ ID NO 30) (SEQ ID NO 210) (SEQ ID NO 33) (SEQ ID NO 175) (SEQ ID NO 176) (SEQ ID NO 177) (SEQ ID NO 211) (SEQ ID NO 178) (SEQ ID NO 179) (SEQ ID NO 180) (SEQ ID NO 181) (SEQ ID NO 188) (SEQ ID NO 189) (SEQ ID NO 190) (SEQ ID NO 191) MSC-ICG-1 : MKA-ICG-3 MKA-ICG-4 MKA-ICG-5 MKA-ICG-6 MKA-ICG-7 MKA-ICG-8 MKA-ICG-9 MKA-ICG-10 : MCH-ICG-1 MCH-ICG-2 MCH-ICG-3 MGO-ICG-5 MUL-ICG-1 MGV-ICG-1 MGV-ICG-2 MGV-ICG-3 MXE-ICG-1 MSI-ICG-1 : MFO-ICG-1 : MFO-ICG-2 : MML-ICG-1 : MML-ICG-2 : MCE-ICG-1 : MHP-ICG-1 :

TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGTC

ATGCGTTGCCCTACGGGTAGCGT

CGGGCTCTGTTCGAGAGTTGTC

CCCTCAGGGATTTTCTGGGTGTTG

GGACTCGTCCAAGAGTGTTGTCC

TCGGGCTTGGCCAGAGCTGTT

GGGTGCGCAACAGCAAGCGA

GATGCGTTGCCCCTACGGG

CCCTACGGGTAGCGTGTTCTTTTG

GGTGTGGACTTTGACTTCTGAATAG

CGGCAAAACGTCGGACTGTCA

GGTGTGGTCCTTGACTTATGGATAG

CGTGAGGGGTCATCGTCTGTAG

GGTTTCGGGATGTTGTCCCACC

CGACTGAGGTCGACGTGGTGT

GGTGTTTGAGCATTGAATAGTGGTTGC

TCGGGCCGCGTGTTCGTCAAA

GTTGGGCAGCAGGCAGTAACC

CCGGCAACGGTTACGTGTTC

TCGTTGGATGGCCTCGCACCT

ACTTGGCGTGGGATGCGGGAA

CGGATCGATTGAGTGCTTGTCCC

TCTAAATGAACGCACTGCCGATGG

TGAGGGAGCCCGTGCCTGTA CATGTTGGGCTTGATCGGGTGC nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 76 - 110 nebo 157 - 174, kde uvedené proby hybridizují specificky na Mycobacterium species.

Sekvence representované SEQ ID NO: 76 - 110 a 157 - 174 jsou

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři, čtyři, pět, šest, sedm, osm nebo více prob použito současně.

Jak je popsáno výše, preferovaná omezená sada prob jsou ty proby, které vykazují sensitivitu a specificitu vyšší než 80%, lépe vyšší než 90% a nejlépe vyšší než 95% za specifických hybridizačních podmínek jak jsou popsány v sekci příkladů. V jednom specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů komplexu Mycobacterium tuberculosis ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4) (SEQ ID NO 5)

MTB-ICG-1 : GGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCA MTB-ICG-2 : GACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCAC MTB-ICG-3 : CGGCTAGCGGTGGCGTGTTCT nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 76, kde uvedená proba hybridizuje specificky na komplex M. tuberculosis. Komplex M. tuberculosis obsahuje kmeny M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum a M. microti.

Sekvence representované SEQ ID NO: 76 je nová.

Preferovaně jsou alespoň dvě nebo tři z uvedených prob použity současně. V jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů ·· ···· 46

Mycobacterium z MAIS-komplexu, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 6) (SEQ ID NO 7) (SEQ ID NO 8) (SEQ ID NO 9) (SEQ ID NO 10) (SEQ ID NO 11) (SEQ ID NO 12) (SEQ ID NO 13) (SEQ ID NO 14) (SEQ ID NO 15) (SEQ ID NO 16) (SEQ ID NO 17) (SEQ ID NO 18)

MAI-ICG-1 : CAACAGCAAATGATTGCCAGACACAC MIL-ICG-11 : GAGGGGTTCCCGTCTGTAGTG MIL-ICG-22 : TGAGGGGTTCTCGTCTGTAGTG MAC-ICG-1 : CACTCGGTCGATCCGTGTGGA MAV-ICG-1 : TCGGTCCGTCCGTGTGGAGTC MAV-ICG-22 : GTGGCCGGCGTTCATCGAAA MIN-ICG-1 : GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT MIN-ICG-2 : GCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTA MIN-ICG-22 : CTGATGCGTTCGTCGAAATGTGT MIN-ICG-222 : TGATGCGTTCGTCGAAATGTGT MIN-ICG-2222 : GGCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTAA MAL-ICG-1 : ACTAGATGAACGCGTAGTCCTTGT MHEF-ICG-l : TGGACGAAAACCGGGTGCACAA MAH-ICG-1 (SbQ ID NO 19) (SEQ ID NO 20) (SEQ ID NO 21) (SEQ ID NO 22) (SEQ ID NO 23) (SEQ ID NO 24) na jakoukoliv probu

MCO-ICG-11 : TGGCCGGCGTGTTCATCGAAA

MTH-ICG-11 : GCACTTCAATTGGTGAAGTGCGAGCC

MTH-ICG-2 : GCGTGGTCTTCATGGCCGG

MEF-ICG-11 : ACGCGTGGTCCTTCGTGG

MSC-ICG-1 : TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGTC nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo odvozenou od SEQ ID NO: 77 - 100 nebo 108 - 110, kde uvedená proba hybridizuje specificky na kmeny MAIS-komplexu. MAIS-komplex jek je definován v tomto vynálezu obsahuje všechny kmeny M. avium, M. intracellulare, M. scrophulaceum a všechny kmeny, které jsou blízce příbuzné k výše uvedeným druhům a nenáleží jednoznačně k jiným definovaným druhům Mycobacterií. 47 • · · · ♦· ···· I · ·

• I

• f ♦ ·

• · · · • · ·· ·

Poslední skupina kmenů je v tomto vynálezu definována jako "MIC kmeny" (M. intracelluare kmeny).

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři, čtyři, pět, šest, sedm, osm nebo více prob použity současně. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů M. avium a M. paratuberculosis ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 10) (SEQ ID NO 11)

MAV-ICG-1 : TCGGTCCGTCCGTGTGGAGTC MAV-ICG-22 : GTGGCCGGCGTTCATCGAAA nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 77 a 78, kde uvedená proba hybridizuje specificky na M. avium a M. paratuberculosis.

Sekvence jak jsou representovány v SEQ ID NO: 77 a 78 jsou nové.

Preferovaně využívá toto provedení obě proby v kombinaci. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycobacterium intracellulare a MIC-kmenů ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 6) (SEQ ID NO 7) (SEQ ID NO 8)

MAI-ICG-1 : CAACAGCAAATGATTGCCAGACACAC MIL-ICG-11 : GAGGGGTTCCCGTCTGTAGTG MIL-ICG-22 : TGAGGGGTTCTCGTCTGTAGTG 48 48 ·· « ·· • · * • · · * • · φ *♦· · ··« (SEQ ID NO 9) (SEQ ID NO 12) (SEQ ID NO 13) (SEQ ID NO 14) (SEQ ID NO 15) (SEQ ID NO 16) (SEQ ID NO 17) (SEQ ID NO 18) (SEQ ID NO 19) (SEQ ID NO 20) (SEQ ID NO 21) (SEQ ID NO 22) (SEQ ID NO 23) ·· ···· • · • « ·#· ♦

MAC-ICG-1 : CACTCGGTCGATCCGTGTGGA MIN-ICG-1 : GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT MIN-ICG-2 : GCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTA MIN-ICG-22 : CTGATGCGTTCGTCGAAATGTGT MIN-ICG-222 : TGATGCGTTCGTCGAAATGTGT MIN-ICG-2222 : GGCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTAA MAL-ICG-1 : ACTAGATGAACGCGTAGTCCTTGT MHEF-ICG-1 : TGGACGAAAACCGGGTGCACAA MAH-ICG-1

MCO-ICG-11 : TGGCCGGCGTGTTCATCGAAA MTH-ICG-11 : GCACTTCAATTGGTGAAGTGCGAGCC MTH-ICG-2 : GCGTGGTCTTCATGGCCGG MEF-ICG-11 : ACGCGTGGTCCTTCGTGG nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, nebo 99, kde uvedená proba hybridizuje specificky na M. intracellulare kmeny nebo MIC kmeny.

Sekvence jak jsou representovány v SEQ ID NO: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, nebo 99 jsou nové.

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři, čtyři, pět, šest, sedm, osm nebo vice prob použity současně. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycobacterium intracellulare ve vzorku, kde krok (iii) 49 • ·· · • ·· ··

♦ * · • · ··» ♦·· •t ·#·· • · · • ♦ · • ··· # • · «· · obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 12)

MIN-ICG-1 : GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 89, kde uvedená proba hybridizuje specificky na M. intracellulare kmeny. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycobacterium scrophulaceum ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 24)

MSC ICG-1 : TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGTC nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 100, kde uvedená proba hybridizuje specificky na M. scrophulaceum.

Sekvence jak je representována v SEQ ID NO: 100 je nová. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycobacterium kansasii ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 25) (SEQ ID NO 26) (SEQ ID NO 27) (SEQ ID NO 28) (SEQ ID NO 182) (SEQ ID NO 183) (SEQ ID NO 184) (SEQ ID NO 185) (SEQ ID NO 186) (SEQ ID NO 187)

MKA-ICG-1 : GATGCGTTTGCTACGGGTAGCGT MKA-ICG-2 : GATGCGTTGCCTACGGGTAGCGT MKA-ICG-3 : ATGCGTTGCCCTACGGGTAGCGT MKA-ICG-4 : CGGGCTCTGTTCGAGAGTTGTC MKA-ICG-5 : CCCTCAGGGATTTTCTGGGTGTTG MKA-ICG-6 : GGACTCGTCCAAGAGTGTTGTCC MKA-ICG-7 : TCGGGCTTGGCCAGAGCTGTT

MKA-ICG-8 : GGGTGCGCAACAGCAAGCGA MKA-ICG-9: GATGCGTTGCCCCTACGGG

MKA-ICG-10 : CCCTACGGGTAGCGTGTTCTTTTG 50

·· ··· fl ·· « ♦ «·· ·· ΙΜ· • t · • » · • ··· · • · f* t a lépe na: (SEQ ID NO 27) (SEQ ID NO 28) (SEQ ID NO 182) (SEQ ID NO 183) (SEQ ID NO 184) (SEQ ID NO 185) (SEQ ID NO 186) (SEQ ID NO 187)

MKA-ICG-3 : ATGCGTTGCCCTACGGGTAGCGT MKA-ICG-4: CGGGCTCTGTTCGAGAGTTGTC MKA-ICG-5 : CCCTCAGGGATTTTCTGGGTGTTG MKA-ICG-6: GGACTCGTCCAAGAGTGTTGTCC MKA-ICG-7 : TCGGGCTTGGCCAGAGCTGTT MKA-ICG-8 : GGGTGCGCAACAGCAAGCGA MKA-ICG-9 : GATGCGTTGCCCCTACGGG MKA-ICG-10 : CCCTACGGGTAGCGTGTTCTTTTG nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 101, 167, 168 nebo 169, kde uvedená proba hybridizuje specificky na M. kansasii.

Sekvence representované SEQ ID NO: 101, 167, 168 a 169 jsou nové.

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři nebo čtyři z uvedených prob použity současně. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycobacterium chelonae ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: 51

·· ····

MCH-ICG-1 : GGTGTGGACTTTGACTTCTGAATAG MCH-ICG-2 : CGGCAAAACGTCGGACTGTCA MCH-ICG-3 : GGTGTGGTCCTTGACTTATGGATAG (SEQ ID NO 29) (SEQ ID NO 30) (SEQ ID NO 210) nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 102, 103 nebo 174, kde uvedená proba hybridizuje specificky na M. chelonae. Podle jiného preferovaného provedení jsou tyto proby použity v kombinaci. Sekvence representované SEQ ID NO: 102, 103 a 174 jsou nové. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycobacterium gordonae ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob:

MGO-ICG-1 : AACACCCTCGGGTGCTGTCC MGO-ICG-2 : GTATGCGTTGTCGTTCGCGGC MGO-ICG-5 : CGTGAGGGGTCATCGTCTGTAG (SEQ ID NO 31) (SEQ ID NO 32) (SEQ ID NO 33)

a lépe na: MGO-ICG-5 : CGTGAGGGGTCATCGTCTGTAG (SEQ ID NO 33) nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 104, 105 nebo 106, kde uvedená proba hybridizuje specificky na M. gordonae.

Sekvence representované SEQ ID NO: 104 až 106 jsou nové. 52 • ···· ·· · ·· · • · • ·

Preferovaně jsou alespoň dvě nebo tři z uvedených prob použity současně. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycobacterium ulcerans nebo Mycobacterium marinum ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následující probu: (SEQ ID NO 175)

MUL-ICG-1 : GGTTTCGGGATGTTGTCCCACC nebo na ekvivalenty uvedené proby, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 157, kde uvedená proba hybridizuje specificky na M. ulcerans nebo M. marinum.

Sekvence representovaná SEQ ID NO: 157 je nová. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycobacterium genavense ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následující probu: (SEQ ID NO 176) (SEQ ID NO 177) (SEQ ID NO 211)

MGV-ICG-1 : CGACTGAGGTCGACGTGGTGT MGV-ICG-2 : GGTGTTTGAGCATTGAATAGTGGTTGC MGV-ICG-3 : TCGGGCCGCGTGTTCGTCAAA nebo na ekvivalenty uvedené proby, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 158, 159, 160, 161 nebo 162, kde uvedená proba hybridizuje specificky na M. genavense.

Sekvence representované SEQ ID NO: 158 - 162 jsou nové. 53 ♦ · ·Μ· ·· ·· · ···

* *

Jak je popsáno v příkladech, M. genavense obsahuje M. genavense kmeny sensu strictu a skupinu blízce příbuzných kmenů nazývaných M. simiae-podobné. První skupina kmenů může být detekována specificky probou MGV-ICG-1, zatímco druhá skupina hybridizuje specificky s probou MGV-ICG-3. Proba MGV-ICG-2 detekuje obě skupiny. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycobacterium xenopi ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následující probu: MXE-ICG-1 : GTTGGGCAGCAGGCAGTAACC (SEQ ID NO 178) nebo na ekvivalenty uvedené proby, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 163, kde uvedená proba hybridizuje specificky na M. xenopi.

Sekvence representovaná SEQ ID NO: 163 je nová. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycobacterium simiae ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následující probu: MSI-ICG-1 : CCGGCAACGGTTACGTGTTC (SEQ ID NO 179) nebo na ekvivalenty uvedené proby, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 164 nebo 165, kde uvedená proba hybridizuje specificky na M. simiae. 54 ♦ ·

·« ♦ · • · · • · ··· • · • ···

Sekvence representované SEQ ID NO: 164 nebo 165 jsou nové. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycobacterium fortuitum ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 180) (SEQ ID NO 181)

MFO-ICG-1 : TCGTTGGATGGCCTCGCACCT MFO-ICG-2 : ACTTGGCGTGGGATGCGGGAA nebo na ekvivalenty uvedených prob, nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 166, kde uvedená proba hybridizuje specificky na M. fortuitum.

Sekvence representovaná SEQ ID NO: 166 je nová. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycobacterium celatum ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následující probu: (SEQ ID NO 190)

MCE-ICG-1 : TGAGGGAGCCCGTGCCTGTA nebo na ekvivalenty uvedené proby, nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 170, kde uvedená proba hybridizuje specificky na M. celatum.

Sekvence representovaná SEQ ID NO: 170 je nová. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více 55 ···» I» +···

• Μ · • · • β « kmenů Mycobacterium haemophilum ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následující probu: (SEQ ID NO 191)

MHP-ICG-1 : CATGTTGGGCTTGATCGGGTGC nebo na ekvivalenty uvedené proby, nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 171,.172 nebo 173, kde uvedená proba hybridizuje specificky na M. haemophilum.

Sekvence representované SEQ ID NO: 171 až 173 jsou nové. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycobacterium malmoense ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 188) (SEQ ID NO 189)

MML-ICG-1 : CGGATCGATTGAGTGCTTGTCCC MML-ICG-2 : TCTAAATGAACGCACTGCCGATGG nebo na ekvivalenty uvedených prob, nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 107, kde uvedená proba hybridizuje specificky na M. malmoense.

Sekvence representovaná SEQ ID NO: 107 je nová. V ještě jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycobacterium ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2)

MYC-ICG-1 : ACTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTA MYC-ICG-22 : CTTCTGAATAGTGGTTGCGAGCATCT 56 56 • · • · · • · » ««tl «· · • · ·· · · • · ·· Μ • · • β • Μ ··» #· ·»·· • · · β · · ··· · ·· · nebo na ekvivalenty uvedených prob.

Podle preferovaného provedení jsou obě proby použity v kombinaci.

Vynález také poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycoplasma ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: MPN-ICG 1 : ATCGGTGGTAAATTAAACCCAAATCCCTGT (SEQ ID NO 49) MPN-ICG 2 : CAGTTCTGAAAGAACATTTCCGCTTCTTTC (SEQ ID NO 50) MGE-ICG 1 : CACCCATTAATTTTTTCGGTGTTAAAACCC (SEQ ID NO 51)

Mycoplasma-ICG : CAAAACTGAAAACGACAATCT1TCTAGTTCC (SEQ ID NO 52) nebo na ekvivalenty uvedených prob, nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 124 nebo 125, kde uvedená proba hybridizuje specificky na druh Mycoplasma.

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři nebo čtyři z uvedených prob použity současně. Přesněji, vynález poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycoplasma pneumoniae ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: MPN-ICG 1 : ATCGGTGGTAAATTAAACCCAAATCCCTGT (SEQ ID NO 49) MPN-ICG 2 : CAGTTCTGAAAGAACATTTCCGCTTCTTTC (SEQ ID NO 50) nebo na ekvivalenty uvedených prob, nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 125, kde uvedená proba hybridizuje specificky na Mycoplasma pneumoniae. Podle preferovaného provedení jsou obě proby použity v kombinaci.

Sekvence representovaná SEQ ID NO: 125 je nová. V jiném jednotlivém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Mycoplasma genitalium ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následující probu: MGE-ICG 1 : CACCCATTAATmTTCGGTGTTAAAACCC (SEQ ID NO 51) nebo na ekvivalenty uvedené proby, nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 124, kde uvedená proba hybridizuje specificky na Mycoplasma genitalium.

Sekvence representovaná SEQ ID NO: 124 je nová.

Vynález také poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Pseudomonas ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 34) (SEQ ID NO 35) (SEQ ID NO 36)

PA-ICG 1 : TGGTGTGCTGCGTGATCCGAT

PA-ICG 2 : TGAATGTTCGTGGATGAACATTGATT (SE

PA-ICG 3 : CACTGGTGATCATTCAAGTCAAG (SE

PA-ICG 4 : TGAATGTTCGT(G/A)(G/A)ATGAACATTGATTTCTGGTC (SEQ ID NO 37) (SEQ ID NO 38)

PA-ICG 5 : CTCTTTCACTGGTGATCATTCAAGTCA AG 58 • · · · · · «I • · · ·· • · · • t · • · · • · · · · • · ·· · nebo na ekvivalenty uvedených prob, nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 111, 112, 113, 114 nebo 115, kde uvedená proba hybridizuje specificky na kmeny Pseudomonas.

Sekvence representované SEQ ID NO: 111 - 115 jsou nové.

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři nebo čtyři z uvedených prob použity současně. Přesněji, vynález poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Pseudomonas aeruginosa ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: PA-ICG 1 PA-ICG 2 PA-ICG 3 PA-ICG 4 PA-ICG 5 : TGGTGTGCTGCGTGATCCGAT TGAATGTTCGTGGATGAACATTGATT CACTGGTGATCATTCAAGTCAAG TGAATGTTCGT(G/A)(G/A)ATGAACATTGATTTCTGGTC (SEQ ID NO 37) CTCTTTCACTGGTGATCATTCAAGTCAAG (SEQ ID NO 38) (SEQ ID NO 34) (SEQ ID NO 35) (SEQ ID NO 36) a lépe na alespoň jednu z·následujích prob: PA-ICG 1 : TGGTGTGCTGCGTGATCCGAT (SEQ ID NO 34)

PA-ICG 4 : TGAATGTTCGT(G/A)(G/A)ATGAACATTGATTTCTGGTC (SEQ ID NO 37) PA-ICG 5 : CTCTTTCACTGGTGATCATTCAAGTCAAG (SEQ ID NO 38) nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 111, kde uvedená proba hybridizuje specificky na pseudomonas aeruginosa. 59 • ♦♦·· · ·· · ·· ♦ • · · • · « · • · · ♦·· · ··· ·

Sekvence representovaná SEQ ID NO: 111 je nová. ·· ···· * * ♦

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři, čtyři nebo pět z uvedených prob použity současně.

Vynález také poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Staphylococcus ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob:

STAU-ICG 1 : TACCAAGCAAAACCGAGTGAATAAAGAGTT STAU-ICG 2 : CAGAAGATGCGGAATAACGTGAC STAU-ICG 3 : AACGAAGCCGTATGTGAGCATTTGAC STAU-ICG 4 : GAACGTAACTTCATGTTAACGTTTGACTTAT (SEQ ID NO 53) (SEQ ID NO 54) (SEQ ID NO 55) (SEQ ID NO 56) nebo na ekvivalenty uvedených prob, nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142 143 nebo 144, kde uvedená proba hybridizuje specificky na druh Staphylococcus. Sekvence representované SEQ ID NO: 139 - 144 jsou nové. Preferovaně jsou alespoň dvě, tři nebo čtyři z uvedených prob použity současně. Přesněji, vynález poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Staphylococcus aureus ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu, a preferovaně na obě, z následujících prob:

I (SEQ ID NO 55)

STAU-ICG 3 : AACGAAGCCGTATGTGAGCATTTGAC STAU-ICG 4 : GAACGTAACTTCATGTTÁACGTTTGACTTAT (SEQ ID NO 56) nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142 nebo 143, kde uvedená proba hybridizuje specificky na Staphylococcus aureus. Podle preferovaného provedení jsou obě tyto proby použity v kombinaci. V jiném specifickém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Staphylococcus epidermidis ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 144, protože tato proba může specificky hybridizovat na Staphylococcus epidermidis.

Vynález také poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Acinetobacter ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: ACI-ICG 1 : GCTTAAGTGCACAGTGCTCTAAACTGA ' (SEQ ID NO 57) (SEQ ID NO 58)

ACI-ICG 2 : CACGGTAATTAGTGTGATCTGACGAAG nebo na ekvivalenty uvedených prob, nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 126, 127, 128, 129 nebo 130, kde uvedená proba hybridizuje specificky na druh Acinetobacter. Podle preferovaného provedení jsou obě tyto proby použity v kombinaci. # · · · · ···· 61 ·· * « • ♦ · * • · · · · · • · · • Μ ·· ·

Sekvence representované SEQ ID NO: 126 až 130 jsou nové. Přesněji, vynález poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Acinetobacter bamanii ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: ACI-ICG 1 : GCTTAAGTGCACAGTGCTCTAAACTGA (SEQ ID NO 57) ACI-ICG 2 : CACGGTAATTAGTGTGATCTGACGAAG (SEQ ID NO 58) nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 126, kde uvedená proba hybridizuje specificky na Acinetobacter baumanii. Podle preferovaného provedení jsou obě tyto proby použity v kombinaci.

Vynález také poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Listeria ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: LIS-ICG 1 : LMO-ICG 1 : LMO-ICG 2 : LMO-ICG 3 : LIV-ICG 1 : LSE-ICG 1 : LISP-ICG 1:

CAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATC (SEQ ID NO 39) AAACAACCTTTACTTCGTAGAAGTAAATTGGTTAAG (SEQ ID NO 40) TGAGAGGTTAGTACTTCTCAGTATGTTTGTTC (SEQ ID NO 41) AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC (SEQ ID NO 42)

GTTAGCATAAATAGGTAACTATTTATGACACAAGTAAC (SEQ ID NO 43) AGTTAGCATAAGTAGTGTAACTATTTATGACACAAG CGTTTTCATAAGCGATCGCACGTT (SEQ ID NO 212) ·· ···· 62 a lépe na alespoň jednu z následujících prob: LIS-ICG 1 : CAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATC (SEQ ID NO 39) LMO-ICG 3 : AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC (SEQ ID NO 42) LISP-ICG 1: CGTTTTCATAAGCGATCGCACGTT (SEQ ID NO 212) nebo na ekvivalenty uvedených prob, nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 116, 118, 119, 120, 121, 213, 214, nebo 215, kde uvedená proba hybridizuje specificky na druh Listeria.

Jak je popsáno v sekci příkladů, druh Listeria zahrnuje Listeria druh sensu strictu a skupinu blízce příbuzných organismů označovaných jako "Listerii-podobné organismy". Poslední skupina může být specificky rozpoznávána probou LISP-ICG 1.

Sekvence representované SEQ ID NO: 116, 118 až 121 a 213 až 215 jsou nové.

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři, čtyři, pět nebo šest z uvedených prob použity současně. Přesněji, vynález poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Listeria monocytogenes ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: LMO-ICG 1 :AAACAACCTTTACTTCGTAGAAGTAAATTGGTTAAG(SEQ ID NO 40) LMO-ICG 2 : TGAGAGGTTAGTACTTCTCAGTATGTTTGTTC (SEQ ID NO 41) LMO-ICG 3 : AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC (SEQ ID NO 42) a lépe na následující probu: (SEQ ID NO 42)

LMO-ICG 3 : AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 120, kde uvedená proba hybridizuje specificky na Listeria monocytogenes.

Preferovaně jsou alespoň dvě nebo tři z uvedených prob použity současně.

Vynález také poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Brucella ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 59) (SEQ ID NO 60) (SEQ ID NO 193) (SEQ ID NO 194) (SEQ ID NO 60) (SEQ ID NO 193) (SEQ ID NO 194) BRU-ICG 1 : CGTGCCGCCTTCGTTTCTCnT BRU-ICG 2 : TTCGCTTCGGGGTGGATCTGTG BRU-ICG 3 : GCGTAGTAGCGTTTGCGTCGG BRU-ICG 4 : CGCAAGAAGCTTGCTCAAGCC a lépe na alespoň jednu z následujících prob:

BRU-ICG 2 : TTCGCTTCGGGGTGGATCTGTG BRU-ICG 3 : GCGTAGTAGCGTTTGCGTCGG

BRU-ICG 4 : CGCAAGAAGCTTGCTCAAGCC nebo na ekvivalenty uvedených prob, nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 131, 132 nebo 154, kde uvedená proba 64 64 ·· ···· • ···· ·· · ♦· ·♦ · · · • ♦ · ♦ · i # • · · · ······ • Φ Φ Φ ♦ · ··· · ♦·· ··· ·· · hybridizuje specificky na kmeny Brucella.

Sekvence representované SEQ ID NO: 131, 132 a 154 jsou nové.

Vynález také poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Salmonella ve vzorku, kde krok -(iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 61) (SEQ ID NO 62) (SEQ ID NO 63) (SEQ ID NO 64) (SEQ ID NO 61) SALM-ICG 1 : CAAAACTGACTTACGAGTCACGTTTGAG SALM-ICG 2 : GATGTATGCTTCGTTATTCCACGCC STY-ICG 1 : GGTCAAACCTCCAGGGACGCC SED-ICG 1 : GCGGTAATGTGTGAAAGCGTTGCC a lépe na následující probu:

SALM-ICG 1 : CAAAACTGACTTACGAGTCACGTTTGAG nebo na ekvivalenty uvedených prob, nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 133, 134, 135, 136, 137, nebo 138, kde uvedená proba hybridizuje specificky na kmeny Salmonella.

Sekvence representované SEQ ID NO: 133 až 138 jsou nové.

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři, nebo čtyři z uvedených prob použity současně.

Vynález se také týká metody jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Chlamydia ve 65 ·· ···· • · · ♦ · · « ··· ·· · vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: CHTR-ICG 1 : GGAAGAAGCCTGAGAAGGTTTCTGAC (SEQ ID NO 45) CHTR-ICG 2 : GCATTTATATGTAAGAGCAAGCATTCTATTTCA (SEQ ID NO 46) CHTR-ICG 3 : GAGTAGCGTGGTGAGGACGAGA (SEQ ID NO 47) CHTR-ICG 4 : GAGTAGCGCGGTGAGGACGAGA (SEQ ID NO 201) CHPS-ICG 1 : GGATAACTGTCTTAGGACGGTTTGAC (SEQ ID NO 48) nebo na ekvivalenty uvedených prob, nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 122, 123 nebo 197, kde uvedená proba hybridizuje specificky na kmeny Chlamydia.

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři, čtyři nebo pět z uvedených prob použity současně. Přesněji, vynález poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Chlamydia trachomatis ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: CHTR-ICG 1 : GGAAGAAGCCTGAGAAGGTTTCTGAC (SEQ ID NO 45) CHTR-ICG 2 : GCATTTATATGTAAGAGCAAGCATTCTATTTCA (SEQ ID NO 46) CHTR-ICG 3 : GAGTAGCGTGGTGAGGACGAGA (SEQ ID NO 47) CHTR-ICG 4 : GAGTAGCGCGGTGAGGACGAGA (SEQ ID NO 201) nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 123 nebo 197, kde uvedená proba hybridizuje specificky na Chlamydia trachomatis. ♦ ··· · · ·· ··♦· 66

Sekvence representované SEQ ID NO: 123 a 197 jsou nové.

Preferovaně jsou alespoň dvě, tři nebo čtyři z uvedených prob použity současně. V jiném jednotlivém provedení poskytuje vynález metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Chlamydia psittaci ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň následující probu: CHPS-ICGl: GGATAACTGTCTTAGGACGGTTTGAC (SEQ ID NO 48) nebo na ekvivalenty uvedené proby, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 122, kde uvedená proba hybridizuje specificky na Chlamydia psittaci.

Sekvence representovaná SEQ ID NO: 122 je nová.

Vynález také poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci a identifikaci jednoho nebo více kmenů Streptococcus ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 nebo 153, kde uvedená proba hybridizuje specificky na kmeny Streptococcus, nebo ekvivalenty těchto prob.

Sekvence representované SEQ ID NO: 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 nebo 153, jsou nové.

Vynález také poskytuje metodu jak je popsána výše pro detekci jednoho nebo více kmenů Yersinia enterocoitica ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 198) (SEQ ID NO 199) (SEQ ID NO 200)

YEC-ICG 1 : GGAAAAGGTACTGCACGTGACTG YEC-ICG 2 : GACAGCTGAAACTTATCCCTCCG YEC-ICG 3 : GCTACCTGTTGATGTAATGAGTCAC nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 195 nebo 196, kde uvedená proba hybridizuje specificky na Yersinia enterocolitica.

Sekvence representované SEQ ID NO: 195 a 196 jsou nové. V některých případech může být výhodné amplifikovat ne všechny organismy přítomné ve vzorku, ale pouze přesnější taxa, která jsou považována za relevantní. V těchto případech poskytuje vynález primery umožňující specifickou amplifikaci intergenového regionu pro pouze předem zadaná taxa.

Vynález tak poskytuje metodu jak je popsána výše pro specifickou detekci a identifikaci Chlamydia trachomatis ve vzorku, kde krok (ii) obsahuje amplifikaci 16S-23S rRNA intergenového regionu nebo jeho části za použití alespoň jednoho z následujících primerů: (SEQ ID NO 69) (SEQ ID NO 70)

CHTR-P1 : AAGGTTTCTGACTAGGTTGGGC CHTR-P2 : GGTGAAGTGCTTGCATGGATCT nebo ekvivalentů těchto primerů, kde uvedené ekvivalenty se liší v sekvenci od výše uvedených primerů změnou jednoho nebo více 68 68 ·· ···♦ • ···· · ·· · ·· • * · ♦ · · · • · · ♦ ♦♦ · «·# ·· · · ♦ • · · · « ♦ ··· · • · · ··· ♦· · nukleotidů, kdy uvedené ekvivalenty stále specificky amplifikují intergenový region nebo jeho část od Chlamydia trachomatis.

Preferovaně jsou použity oba primery.

Vynález také poskytuje metodu jak je popsána výše pro specifickou detekci a identifikaci druhu Listeria ve vzorku, kde krok (ii) obsahuje amplifikaci 16S-23S rRNA intergenového regionu nebo jeho části za použití alespoň jednoho z následujících primerů: (SEQ ID NO 71) (SEQ ID NO 72) (SEQ ID NO 73) (SEQ ID NO 74) (SEQ ID NO 75) (SEQ ID NO 202) (SEQ ID NO 203)

LIS-P1 : ACCTGTGAGTTTTCGTTCTTCTC LIS-P2 : CTATTTGTTCAGTTTTGAGAGGTT LIS-P3 : ATTTTCCGTATCAGCGATGATAC LIS-P4 : ACGAAGTAAAGGTTGnTTTCT LIS-P5 : GAGAGGTTACTCTCTTTTATGTCAG LIS-P6 : CTTTTATGTCAGATAAAGTATGCAA LIS-P7 : CGTAAAAGGGTATGATTATTTG nebo ekvivalentů těchto primerů, kde uvedené ekvivalenty se liší v sekvenci od výše uvedených primerů změnou jednoho nebo více nukleotidů, kdy uvedené ekvivalenty stále specificky amplifikují intergenový region nebo jeho část od druhu Listeria.

Vynález se také týká metody jak je popsána výše pro specifickou detekci a identifikaci druhu Mycobacterium ve vzorku, kde krok (ii) obsahuje amplifikaci 16S-23S rRNA intergenového regionu nebo jeho části za použití alespoň jednoho z následujících primerů: ·· ···· • Μ·· Μ · ·· ·· ·· · ·· ····· h Q ·······*·· · · · · · * ···« ······ ·· · MYC-P1: TCCCTTGTGGCCTGTGTG (SEQ ID NO 65) MYC-P2: TCCTTCATCGGCTCTCGA (SEQ ID NO 66) MYC-P3: GATGCCAAGGCATCCACC (SEQ ID NO 67) MYC-P4: CCTCCCACGTCCTTCATCG (SEQ ID NO 68) MYC-P5: CCTGGGTTTGACATGCACAG (SEQ ID NO 192) nebo ekvivalentů těchto primerů, kde uvedené ekvivalenty se liší v sekvenci od výše uvedených primerů změnou jednoho nebo více nukleotidů, kdy uvedené ekvivalenty stále specificky amplifikují intergenový region nebo jeho část od druhu Mycobacterium.

Vynález se také týká metody jak je popsána výše pro specifickou detekci a identifikaci druhu Brucella ve vzorku, kde krok (ii) obsahuje amplifikaci 16S-23S rRNA intergenového regionu nebo jeho části za použití alespoň jednoho z následujících primerů: BRU-P1 : TCGAGAATTGGAAAGAGGTC (SEQ ID NO 204) BRU-P2 : AAGAGGTCGGATTTATCCG (SEQ ID NO 205) BRU-P3 : TTCGACTGCAAATGCTCG (SEQ ID NO 206) BRU-P4 : TCTTAAAGCCGCATTATGC (SEQ ID NO 207) nebo ekvivalentů těchto primerů, kde uvedené ekvivalenty se liší v sekvenci od výše uvedených primerů změnou jednoho nebo více nukleotidů, kdy uvedené ekvivalenty stále specificky amplifikují intergenový region nebo jeho část od druhu Brucella. 70 • · ····

·· · • · · • · ·

Vynález se také týká metody jak je popsána výše pro specifickou detekci a identifikaci druhu Yersinia enterocolitica ve vzorku, kde krok (ii) obsahuje amplifikaci 16S-23S rRNA intergenového regionu nebo jeho části za použití alespoň jednoho z následujících primerů: (SEQ ID NO 208) (SEQ ID NO 209)

YEC-P1 : CCTAATGATATTGATTCGCG YEC-P2 : ATGACAGGTTAATCCTTACCCC nebo ekvivalentů těchto primerů, kde uvedené ekvivalenty se liší v sekvenci od výše uvedených primerů změnou jednoho nebo více nukleotidů, kdy uvedené ekvivalenty stále specificky amplifikují intergenový region nebo jeho část od druhu Yersinia enterocolitica.

Vynález také poskytuje kompozice obsahující alespoň jednu probu a/nebo primer jak jsou definovány výše.

Uvedené kompozice mohou obsahovat jakýkoliv nosič, pomocnou látku, značku nebo ředidlo známé v oboru pro proby nebo primery, přesněji jakoukoliv značku nebo nosič detailně uvedený v sekci definice.

Vynález se jednotlivě týká izolovaných prob a primerů, jak · byly definovány výše a přesněji jakékoliv proby jak je specifikována v tabulce la a jakéhokoliv primerů jak je specifikován v tabulce lb.

Podle jiného provedení se předkládaný vynález také týká nových 71 t · »· · ·· · • * • · · • · «·· · ·· * ··· ·

·· • I • « · · sekvencí intergenového regionu jak jsou definovány výše a jak jsou uvedeny na obr, 1 - 103 (SEQ ID NO: 76 až 154, SEQ ID NO: 157 až 174, SEQ ID NO: 195 až 197 a SEQ ID NO: 213 až 215). V jiném provedení vynález poskytuje metodu reversní hybridizace obsahující jakoukoliv probu jak je definována výše, kde uvedené proby jsou imobilizovány ve známém umístění na pevném nosiči, lépe na proužku membrány. V ještě jiném provedení poskytuje vynález kit pro detekci a identifikaci alespoň jednoho mikroorganismu, nebo pro simultání detekci a identifikaci několika mikroorganismů ve vzorku, kde tento kit obsahuje následující složky: (i) pokud je to vhodné, tak alespoň jeden vhodný pár primerů pro umožnění amplifikace intercistronického 16S-23S rRNA intergenového regionu, nebo jeho části; (ii) alespoň ednu probu jak byla definována výše; (iii) pufr, nebo složky nezbytné pro produkci pufru, umožňující hybridizační reakci mezi uvedenými probami a polynukleovými kyselinami přítomnými ve vzorku, nebo jejich ampifikovanými produkty; (iv) roztok, nebo složky nezbytné pro produkci roztoku, umožňující promytí vytvořených hybridů za vhodných promývacích podmínek; (v) pokud je to vhodné, tak prostředky pro detekci hybridů vzniklých z předcházející hybridizace. 72 ···· • · • Φ » « ·* Φ··· »t ·· · ♦ · ♦ · · · · · • · · »·· ♦ • · · · ··· «·· ·· ·

Popis obrázků na přiložených výkresech

Obr. 1: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium tuberculosis kmene H37RV ATCC 27294 (SEQ ID NO: 76).

Obr. 2: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium avium ATCC 2151.769 (ITG 4991) (SEQ ID NO: 77).

Obr. 3: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium paratuberculosis kmene 316F a 2E (SEQ ID NO: 78).

Obr. 4: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 5513 (SEQ ID NO: 79).

Obr. 5: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 8695 (SEQ ID NO: 80).

Obr. 6: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 8708 (SEQ ID NO: 81).

Obr. 7: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 8715 (SEQ ID NO: 82).

Obr. regionu 8: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového z Mycobacterium kmene ITG 8054 (SEQ ID NO: 83).

Obr. 9: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 8737 (SEQ ID NO: 84). 73 • ··

Obr. 10: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 8743 {SEQ ID NO: 85) .

Obr. 11: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 8745 (SEQ ID NO: 86) .

Obr. 12: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 8748 (SEQ ID NO: 87) .

Obr. 13: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 8752 (SEQ ID NO: 88) .

Obr. 14: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium intracellulare serovar 12 ITG 5951 (SEQ ID NO: 89).

Obr. 15: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium lufu ITG 4755 (SEQ ID NO: 90).

Obr. 16: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 5922 (SEQ ID NO: 91) .

Obr. 17: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 1329 (SEQ ID NO: 92) .

Obr. 18: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 1812 (SEQ ID NO: 93) .

Obr. 19: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 5280 (SEQ ID NO: 94) . 74 Φ Φ ΦΦ Φ Μ · · • · · Φ · # Φ Φ Φ Φ

Obr. 20: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 5620 (SEQ ID NO: 95) .

Obr. 21: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 5765 (SEQ ID NO: 96) .

Obr. 22: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 7395 (SEQ ID NO: 97) .

Obr. 23: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 8738 (SEQ ID NO: 98) .

Obr. 24: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kmene ITG 926 (SEQ ID NO: 99) .

Obr.'25: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium scrophulaceum ITG 4988 (SEQ ID NO: 100) .

Obr. 26: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kansasii ATCC 22478 (=ITG 4987 (SEQ ID NO: 101) .

Obr. 27: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium chelonae abscessus ITG 4975 (SEQ ID NO: 102) .

Obr. 28: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium chelonae chelonae ITG 9855 (SEQ ID NO: 103) .

Obr. 29: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového 75 ·· ··♦· • · • · · · regionu z Mycobacterium gordonae ITG 7703 (SEQ ID NO: 104).

Obr. 30: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium gordonae ITG 7836 (SEQ ID NO: 105).

Obr. 31: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium gordonae ITG 8059 (SEQ ID NO: 106) .

Obr. 32: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium malmoense ITG 4842 a ITG 4832 (SEQ ID NO: 107) .

Obr. 33: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium ITG 8757 (SEQ ID NO: 108).

Obr. 34: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium ITG 8723 (SEQ ID NO: 109).

Obr. 35: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium ITG 8724 (SEQ ID NO: 110) .

Obr. 36: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Pseudomonas aeruginosa UZG 5669 (SEQ ID NO: 111).

Obr. 37: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG 1225 (SEQ ID NO: 112)

Obr. 38: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Pseudomonas stutzeri LMG 2333 (SEQ ID NO: 113) .

Obr. 39: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového 76 ΦΦΦΦ • · Μ·Φ • Φ φφ » Φ regionu z Pseudomonas alcaligenes LMG 1224 (SEQ ID NO: 114).

Obr. 40: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Pseudomonas putida LMG 2232 (SEQ ID NO: 115).

Obr. 41: representuje DNA sekvenci malého 16S-23S rRNA intergenového regionu z Listeria ivanovii CIP 7842 (SEQ ID NO: 116) .

Obr. 42: representuje DNA sekvenci malého 16S-23S rRNA intergenového regionu z Listeria monocytogenes (SEQ ID NO: 117).

Obr. 43: representuje DNA sekvenci malého 16S-23S rRNA intergenového regionu z Listeria seeligeri serovar 4A nr. 4268 (SEQ ID NO: 118).

Obr. 44: representuje DNA sekvenci velkého 16S-23S rRNA intergenového regionu z částečné sekvence dlouhého intergenového regionu Listeria ivanovii CIP 7842 (SEQ ID NO: 119).

Obr. 45: representuje DNA sekvenci velkého 16S-23S rRNA intergenového regionu z Listeria monocytogenes IHE serovar 4B (SEQ ID NO: 120).

Obr. 46: representuje DNA sekvenci velkého 16S-23S rRNA intergenového regionu z Listeria seeligeri serovar 4A nr. 4268 (SEQ ID NO: 121).

Obr. 47: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Chlamydia pssitaci 6BC (SEQ ID NO: 122). 77 • · ·

Obr. 48: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Chlamydia trachomatis (SEQ ID NO: 123).

Obr. 49: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycoplasma genitalium (U. Gobel) (SEQ ID NO: 124) .

Obr. 50: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycoplasma pneumoniae ATCC 29432 (SEQ ID NO: 125) .

Obr. 51: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Acinetobacter baumanii LMG 1041 (SEQ ID NO: 126) .

Obr. 52: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Acinetobacter calcoaceticus LMG 1046 (SEQ ID NO: 127) .

Obr. 53: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Acinetobacter haemolyticus LMG 996 (SEQ ID NO: 128) .

Obr. 54: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Acinetobacter johnsonii LMG 999 (SEQ ID NO: 129) .

Obr. 55: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Acinetobacter junii LMG 998 (SEQ ID NO: 130).

Obr. 56: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Brucella melitensis NIDO Biovar l (SEQ ID NO: 131) .

Obr. 57: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Brucella suis NIDO Biovar 1 (SEQ ID NO: 132).

Obr. 58: representuje DNA sekvenci jednoho 16S-23S rRNA 78 «··· • · · 78 «··· • · · • · ·· t intergenového regionu z Salmonella dublin (SEQ ID NO: 133) .

Obr. 59: representuje intergenového regionu z DNA sekvenci jednoho 16S-23S rRNA Salmonella dublin (SEQ ID NO: 134).

Obr. 60: representuje DNA sekvenci jednoho 16S-23S rRNA intergenového regionu z Salmonella enteritidis (SEQ ID NO: 135).

Obr. 61: representuje DNA sekvenci jednoho 16S-23S rRNA intergenového regionu z Salmonella enteritidis (SEQ ID NO: 136).

Obr. 62: representuje DNA sekvenci jednoho 16S-23S rRNA intergenového regionu z Salmonella typhimurium (SEQ ID NO: 137).

Obr. 63: representuje DNA sekvenci jednoho 16S-23S rRNA intergenového regionu z Salmonella typhimurium (SEQ ID NO: 138) .

Obr. 64: representuje DNA sekvenci jednoho 16S-23S rRNA intergenového regionu z Staphylococcus aureus kmen UZG 5728 (SEQ ID NO: 139).

Obr. 65: representuje DNA sekvenci jednoho 16S-23S rRNA intergenového regionu z Staphylococcus aureus kmen UZG 6289 (SEQ ID NO: 140).

Obr. 66: representuje DNA sekvenci jednoho 16S-23S rRNA intergenového regionu z Staphylococcus aureus kmen UZG 6289 (SEQ ID NO: 141).

Obr. 67: representuje DNA sekvenci jednoho 16S-23S rRNA intergenového regionu z Staphylococcus aureus kmen UZG 6289 (SEQ 79 • · · · • · ··· ·· · • · · ID NO: 142).

Obr. 68: representuje DNA sekvenci jednoho 16S-23S rRNA intergenového regionu z Staphylococcus aureus kmen UZG 6289 (SEQ ID NO: 143).

Obr. 69: representuje DNA sekvenci jednoho 16S-23S rRNA intergenového regionu z Staphylococcus epidermidis kmen UZG CNS41 (SEQ ID NO: 144).

Obr. 70: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Streptococcus mitis UZG 2465 (SEQ ID NO: 145).

Obr. 71: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Streptococcus pyogenes UZG 3671 (SEQ ID NO: 146).

Obr. 72: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Streptococcus sanguis UZG 1042 (SEQ ID NO: 147).

Obr. 73: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Streptococcus saprophyticus UZG CNS46 (SEQ ID NO: 148)

Obr. 74: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Streptococcus druhu UZG 536(84) (SEQ ID NO: 149).

Obr. 75: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Streptococcus druhu UZG 4341 (SEQ ID NO: 150).

Obr. 76: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Streptococcus druhu UZG 457 (44B) (SEQ ID NO: 151) . ·· ♦··· • ·#♦♦ ·· ····♦··· AA ·· ··.··· fln · · · · · · ·♦· · · · ·· · · ··· · ··· ··· ·· ·

Obr. 77: representuje regionu z Streptococcus DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového druhu UZG 97A (SEQ ID NO: 152).

Obr. 78: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Streptococcus druhu UZG 483 (76) (SEQ ID NO: 153).

Obr. 79: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Brucella abortus NIDO Tulya biovar 3 (SEQ ID NO: 154) .

Obr. 80: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium ulcerans ITG 1837 a Mycobacterium marinum ITG 7732 (SEQ ID NO: 157) .

Obr. 81: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium genavense ITG 8777 (SEQ ID NO: 158).

Obr. 82: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium genavense ITG 92-742 (SEQ,ID NO: 159).

Obr. 83: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium genavense ITG 9500 (SEQ ID NO: 160).

Obr. 84: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium simiae-like ITG 7379 (SEQ ID NO: 161).

Obr. 85: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium simiae-like ITG 9745 (SEQ ID NO: 162).

Obr. 86: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium xenopi ITG 4986 (SEQ ID NO: 163). 81 81 ·· ··· • ···· ·· · · • · • I · • · ··» · ·

Obr. 87: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium simiae A ITG 4485 (SEQ ID NO: 164).

Obr. 88: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium simiae B ITG 4484 (SEQ ID NO: 165).

Obr. 89: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium fortuitum ITG 4304 (SEQ ID NO: 166).

Obr. 90: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kansasii ITG 6328 (SEQ ID NO: 167).

Obr. 91: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kansasii ITG 8698 (SEQ ID NO: 168).

Obr. 92: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium kansasii ITG 8973 (SEQ ID NO: 169).

Obr. 93: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium celatum ITG 94-123 (SEQ ID NO: 170) .

Obr. 94: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium haemophilum ITG 776 (SEQ ID NO: 171).

Obr. 95: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium haemophilum ITG 778 (SEQ ID NO: 172) .

Obr. 96: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Mycobacterium haemophilum ITG 3071 (SEQ ID NO: 173) .

Obr. 97: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového • ···· • # ♦· f··· ·· • ·· «· • · · • • • • • ♦ · • • · • • • ··· · • • • • t 4 • 4 · 4 ··· 44 4 regionu z Mycobacterium chelonae ITG 94-330 a ITG 94-379 (SEQ ID NO: 174) .

Obr. 98: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Yersinia enterocolitica kmen P95 (SEQ ID NO: 195) .

Obr. 99: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Yersinia enterocolitica kmen P95 (SEQ ID NO: 196) .

Obr. 100: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Chlamydia trachomatis kmen SSDZ 94 M 1961 (SEQ ID NO: 197) .

Obr. 101: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Listeria-like izolátu MB 405 (SEQ ID NO: 213) .

Obr. 102: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA intergenového regionu z Listeria-like izolátu MB 405 (SEQ ID NO: 214) . intergenového 215) .

Obr. 103: representuje DNA sekvenci 16S-23S rRNA regionu z Listeria-like izolátu MB 405 (SEQ ID NO: 83 •I ·· · · • · · · • · · · · · · • · · · ··· ··· «· ·

Legenda Tabulka Tabulka Tabulka Tabulka Tabulka Tabulka Tabulka Tabulka Tabulka Tabulka k tabulkám: la: Seznam všech nových prob pocházejících z 16S-23S intergenového regionu. lb: Seznam možných primerů pro taxon-specifickou amplifikaci intergenového regionu nebo jeho části. 2: Hybridizačni výsledky pro Pseudomonas. 3: Různé vzorky prob získané pro typy mycobacteriálních kmenů. 4: Kmeny Mycobacterium testované LiPA. 5: Hybridizační výsledky pro Listeria (Proby LM01, 2, LSE 1, LIV 1, LIS 1) 6: Hybridizační výsledky pro Listeria (Proby LMO 3, LIS 1). 7: Hybridizační výsledky pro Chlamydia. 8: Nové mycobacteriální proby a hybridizační výsledky. 9: Hybridizační výsledky pro Brucella.

Tabulka 10: Hybridizační výsledky pro Staphylococcus. 84 «· · • · ··· · • · ·

Tabulka Proba MYC-ICG-I MYC-ICG-22 MTB-ICG-1 MTB-ICG-2 MTB-ICG-3 MAI-ICG-1 MIL-ICG-11 MIL-ICG-22 MAC-ICG-1 MAV-ICG-1 MAV-ICG-22 MIN-ICG-1 MIN-ICG-2 MIN-ICG-22 MIN-ICG-222 MIN-ICG-2222 MAL-ICG-1 MHEF-ICG-1 MAH-ICG-1 MCO-ICG-11 MTH-ICG-11 MTH-ICG-2 MEF-ICG-11 MSC-ICG-1 MKA-ICG-1 MKA-ICG-2 MKA-ICG-3 MKA-ICG-4 MCH-ICG-1 MCH-ICG-2

Sekvence ia

SEP ID NO

ACTGG ATAGTGGTTGCG AGCATCT A

CTTCTGAATAGTGGTTGCGAGCATCT

GGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCA

GACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCAC

CGGCTAGCGGTGGCGTGTTCT

CAACAGCAAATGATTGCCAGACACAC

G AGGGGTTCCCGTCTGT AGTG

TG AGGGGTTCTCGTCTGT AGTG

CACTCGGTCGATCCGTGTGGA TCGGTCCGTCCGTGTGGAGTC jq GTGGCCGGCGTTCATCGAAA π GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT o GCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTA 13 CTGATGCGTTCGTCGAAATGTGT 14 TGATGCGTTCGTCGAAATGTGT 15 GGCTGATGCGTTCGTCG AAATGTGT AA 16 ACTAGATGAACGCGTAGTCCTTGT 57 TGGACGAAAACCGGGTGCACAA jg TGGCCGGCGTGTTCATCGAAA 20 GCACTTCAATTGGTGAAGTGCGAGCC 21 GCGTGGTCTTCATGGCCGG 22 ACGCGTGGTCCTTCGTGG 23 TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGTC 24 GATGCGTTTGCTACGGGTAGCGT 25 GATGCGTTGCCTACGGGTAGCGT 26 ATGCGTTGCCCTACGGGTAGCGT 27 CGGGCTCTGTTCGAGAGTTGTC 28 GGTGTGG ACTTTG ACTTCTG A AT AG 29 : CGGCAAAACGTCGGACTGTCA 30 85 85

·· ···· MCH-ICG-3 : GGTGTGGTCCTTGACTTATGGATAG 210 MGO-ICG-l : AACACCCTCGGGTGCTGTCC 31 MGO-ICG-2 : GTATGCGTTGTCGTTCGCGGC 32 MGO-ICG-5 : CGTGAGGGGTCATCGTCTGTAG 33 5 MUL-ICG-1 : GGTTTCGGGATGTTGTCCCACC 175 MGV-ICG-1 : CGACTGAGGTCGACGTGGTGT Π6 MGV-ICG-2 : GGTGTTTGAGCATTGAATAGTGGTTGC Γ7 MGV-ICG-3 : TCGGGCCGCGTGTTCGTCAAA 2:1 MXE-ICG-1 : GTTGGGCAGCAGGCAGTAACC rg 0 10 MSI-ICG-1 : CCGGCAACGGTTACGTGTTC Γ9 MFO-ICG-1 : TCGTTGGATGGCCTCGCACCT 180 MFO-ICG-2 : ACTTGGCGTGGGATGCGGGAA 181 MKA-ICG-5 : CCCTCAGGGATTTTCTGGGTGTTG 182 MKA-ICG-6 : GGACTCGTCCAAGAGTGTTGTCC 183 15 MKA-ICG-7 : TCGGGCTTGGCCAGAGCTGTT 184 MKA-ICG-8 : GGGTGCGCAACAGCAAGCGA 185 MKA-ICG-9 : GATGCGTTGCCCCTACGGG 186 MKA-ICG-10 : CCCTACGGGTAGCGTGTTCTTTTG 187 MML-ICG-1 : CGGATCGATTGAGTGCTTGTCCC 188 20 MML-ICG-2 : TCT A A ATGAAC.GCACTGCCG ATGG 189 MCE-ICG-1 : TGAGGGAGCCCGTGCCTGTA 190 MHP-ICG-1 : CATGTTGGGCTTGATCGGGTGC 191 PA-ICG 1 : TGGTGTGCTGCGTGATCCGAT . 34 PA-ICG 2 : TGAATGTTCGTGGATGAACATTGATT 35 25 PA-ICG 3 : CACTGGTGATCATTCAAGTCAAG 36 PA-ICG 4 : TGAATGTTCGT(G/A)(G/A)ATGAACATTGATTTCTGGTC 37 PA-ICG 5 : CTCTTTCACTGGTGATCATTCAAGTCAAG 38 LIS-ICG 1 : CAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATC 39 LMO-ICG 1 : AAACAACCTTTACTTCGTAGAAGTAAATTGGTTAAG 40 30 LMO-ICG 2 : TGAGAGGTTAGTACTTCTCAGTATGTTTGTTC 41 LMO-ICG 3 : AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC 42 LIV-ICG 1 : GTT AGCAT A A AT AGGT A ACT ATTT ATG AC AC A AGT A AC 43 ···· 86 ···· 86 LSE-ICG 1 LISP-ICG I CHTR-ICG 1 CHTR-ICG 2 CHTR-ICG 3 CHPS-ICG 1 MPN-ICG 1 MPN-ICG 2 MGE-ICG 1 Mycoplasma-ICG STAU-ICG 1 STAU-ICG 2 STAU-ICG 3 STAU-ICG 4 ACI-ICG 1 ACI-ICG 2 BRU-ICG 1 BRU-ICG 2 BRU-ICG 3 BRU-ICG 4 SALM-ICG 1 SALM-ICG 2 STY-ICG 1 SED-ICG 1 YEC-ICG 1 YEC-ICG 2 YEC-ICG 3 CHTR-ICG 4 AGTT AGCAT AAGT AGTGT A ACT ATTT ATG AC AC A AG 44 CGTTTTCATAAGCGATCGCACGTT 212 GGAAGAAGCCTGAGAAGGTTTCTGAC 45 GC ATTTATATGTAAGAGCA AGCATTCT ATTTCA 46 GAGTAGCGTGGTGAGGACGAGA 47 GG ATA ACTGTCTT AGG ACGGTTTG AC 48 ATCGGTGGTAAATTAAACCCAAATC.CCTGT 49 CAGTTCTGAAAGAACATTTCCGCTTCTTTC 50 •CACCCATTAATTTTTTCGGTGTTAAAACCC 51

: CAAAACTGAAAACGACAATCTTTCTAGTTCC TACCAAGCAAAACCGAGTGAATAAAGAGTT CAGAAGATGCGGAATAACGTGAC AACGAAGCCGTATGTGAGCATTTGAC 55 G A ACGTAACTTC ATGTTA ACGTTTG ACTT AT 56 GCTTAAGTGCACAGTGCTCTAAACTGA 57 CACGGTAATTAGTGTGATCTGACGAAG 58 CGTGCCGCCTTCGTTTCTCTTT 59 TTCGCTTCGGGGTGGATCTGTG 60 GCGT AGTAGCGTTTGCGTCGG 193 CGCAAGAAGCTTGCTCAAGCC 194 CAAAACTGACTTACGAGTCACGTTTGAG 61 GATGTATGCTTCGTTATTCCACGCC 62 GGTCAAACCTCCAGGGACGCC 63 GCGGTAATGTGTGAAAGCGTTGCC 64 GGAAAAGGTACTGCACGTGACTG 198 G AC AGCTG AA ACTTATCCCTCCG 199 GCTACCTGTTGATGTAATGAGTCAC 200 GAGTAGCGCGGTGAGGACGAGA 201

Tabulka lb

Primery Sekvence SEQIDNO MYC-P1 : TCCCTTGTGGCCTGTGTG 65 MYC-P2 : TCCTTCATCGGCTCTCGA 66 MYC-P3 : GATGCCAAGGCATCCACC 67 MYC-P4 : CCTCCCACGTCCTTCATCG 68 MYC-P5 : CCTGGGTTTGACATGCACAG 192 CHTR-P1 : AAGGTTTCTGACTAGGTTGGGC 69 CHTR-P2 : GGTGAAGTGCTTGCATGGATCT 70 LIS-P1 : ACCTGTGAGTTTTCGTTCTTCTC 71 . LIS-P2 : CTATTTGTTCAGTTTTGAGAGGTT 72 LIS-P3 : ATTTTCCGTATCAGCGATGATAC 73 LIS-P4 : ACGAAGTAAAGGTTGTTTTTCT 74 LIS-P5 : GAGAGGTTACTCTCTTTTATGTCAG 75 LIS-P6 : CTTTTATGTCAGATAAAGTATGCAA 202 LIS-P7 : CGTAAAAGGGTATGATTATTTG 203 BRU-P1 : TCGAGAATTGGAAAGAGGTC 204 BRU-P2 : AAGAGGTCGGATTTATCCG 205 BRU-P3 : TTCGACTGCAAATGCTCG 206 BRU-P4 : TCTTAAAGCCGCATTATGC 207 YEC-P1 : CCTAATGATATTGATTCGCG 208 YEC-P2 : ATGACAGGTTAATCCTTACCCC 209 88 • · ·· · Μ « · • * : : · Příklad 1

Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa je signifikantní lidský patogen, obvykle v kontextu vážných základních onemocnění. Je také hlavní příčinou nosokomiálních infekcí, které se obvykle vyznačují resistencí na antimikrobiální agens. Tato gram negativní, nefermentativní tyčka může být odpovědná za různé klinické manifestace, jako je infekce v ráně, bakteriemie, infekce respiračního a urogenitálního traktu a také je hlavní příčinou morbidity a mortality u pacientů s cystickou fibrosou.

Pseudomonas druhy jsou nyní odlišovány na základě jejich růstových charakteristik a na základě několika biochemických vlastností, což vyžaduje protokol trvající 24 až 72 hodin pro správnou identifikaci patogenu. Už vývoj monoklonálních nebo polyklonálních protilátek signifikantně zlepšil identifikaci Pseudomonas druhu. Nově nicméně bylo ukázáno, že je možné detekovat organismus přímo v klinickém vzorku velmi sensitivním a specifickým způsobem za použití DNA prob s nebo bez předchozí amplifikace cílové DNA. DNA proby pro studium Pseudomonas aeruginosa byly již popsány a jsou zejména používány pro epidemiologické typování (Ogle et al., 1987; Samadpour et al., 1988; Mclnthos et al., 1992). Nicméně, žádná z těchto prob nebyla odvozena od 16S-23S intergenu. 16S-23S rRNA gen intergenový region a část 23S rRNA genu byla 89 • · · t · ·· · • * • * • » »· · · ··· ·· ···· * · · • # · ·* amplifikována konservovanými primery (horní primer: TGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA, SEQ ID NO: 155; dolní primer: CCTTTCCCTCACGGTACTGGT, SEQ ID NO: 156) za použití polymerasové řetězové reakce pro následující druhy: - Pseudomonas aeruginosa 5669

- Pseudomonas alcaligenes LMG 1224T - Pseudomonas fluorescens LMG 5167 - Pseudomonas putida LMG 2232

- Pseudomonas stutzeri 2333T

- Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG 1225T

Pro usnadnění klonmování získaných amplikonů bylo Notl rozpoznávací místo přidáno do dolního primeru. Po purifikaci a trávení fragmentu Notl byl amplikon klonován do EcoRV/Notl tráveného pBleuscript SK* plasmidového vektoru.

Sekvencování 16S-23S rRNA gen intergenového regionu bylo provedeno podle dideoxy-řetězové terminační chemické reakce buď za použití dvojřetězcoé plasmidové DNA kombinované s primery umístěnými v plasmidovém vektoru nebo přímo s PCR produkty po purifikaci kombinovanými s vnitřními PCR primery.

Obr. 36 až 40 representují sekvenci nukleotidů 16S-23S rRNA genového intergenového regionu pro různé druhy Pseudomonas popsané výše. Pro P. fluorescens byla získána pouze částečná sekvence.

Ze sekvence nukleových kyselin intergenu od P. aeruginosa kmen 5669 bylo vybráno a chemicky syntetizováno pět oligonukleotidových prob. Sekvence oligonukleotidů jsou 90 • · · · · «· · • 9 * · 9 · 99 · · • · · · • · Μ·· 99 9 9 99 9 následuj ící:

PA1 = PA-ICG 1 : TGGTGTGCTGCGTGATCCGATA PA2 = PA-ICG 2 : TGAATGTTCGTGGATGAACATTGATT PA3 = PA-ICG 3 : CACTGGTGATCATTCAAGTCAAG

Testování specificity a sensitivity oligonukleotidových prob bylo provedeno za použití testu reversní hybridizace. Genomová DNA z různých testovaných bakterií byla amplifikována za použití biotynylováných primerů (stejné primery jako pro proceduru klonování, viz výše). Získaný amplikon, překlenující 16S-23S rRNA genový intergenový region, byl denaturován a hybridizován na proužek membrány, na kterém byly různé oligonukleotidové proby imobilizovány v liniích (LiPA). Hybridizace byla provedena ve směsy 3xSSC (lxSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M citrát sodný, pH 7,0) a 20% formamidu (FA) při teplotě 50 °C po jednu hodinu. Promytí bylo provedeno ve stejné směsy při stejné teplotě po dobu 15 minut.

Hybridy byly detekovány za použití streptavidinového konjugátu navázaného na alkalickou fosfatasu a proby byly vizualizovány precipitační reakcí za použití NBT (nitrobluetetrazolium) a BCIP (bromo-chloro-indolfosfát). Výsledky hybridizace získané pro proby PA1, PA2 a PA3 jsou dány v tabulce 4 a ukazují, že proby PAl a PA3 byly 100% specifické pro Pseudomonas aeruginosa a hybridizovaly na všechny testované kmeny. Hybridizační signál pro probu PA3 při 50 °C nebyl optimální, takže oligonukleotidová proba byla vylepšena přidáním nějakých dalších oligonukleotidů ke specifické probě. Tato nově projektovaná proba je PA5. « 9 91 » · · · · • ·

PA5 = PA-ICG 5: CTCTTTCACTGGTGATCATTCAAGTCAAG

Hybridizační pokusy s probou PA5 ukázal, ža tato proba také vykazuje 100% specificitu a 100% sensitivitu pro P. aeruginosa.

Oligonukleotidová proba PA2 hybridizovala pouze na 5 z 17 testovaných kmenů Pseudomonas aeruginosa. Přímé sekvencování 16S-23S rRNA genového intergenového regionu kmenů, které nehybridizovaly s těmito probami ukázalo určitou heterogenitu mezi různými kmeny. Byly pozorovány dvě chyby ve srovnání s prvně vyvinutou PA2 probou. Pro překonání této heterogenity mezi různými kmeny v regionu proby PA2 byla projektována nová proba PA4. Tato proba je degenerována v pozici chybných umístění a byly přidány některé další nukleotidy pro zlepšení hybridizačního signálu při 50 °C.

PA4 = PA-ICG-4: TGAATGTTCGT (G/A) (G/A) ATGAACATTGATTTCTGGTC 100% specificita a 100% sensitivita byla získána s touto degenerovanou probou jak je ukázáno ve výsledcích hybridizace.

Tabulka 2

Hybridizační výsledky pro Pseudomonas

Testovaný taxon PA1 PA2 PA3 PA4 PA5 Pseudomonas aerueinosa 17/17 5/17 17/17 17/17 17/17 Pseudomonas alcaligenes 0/1 0/1 0/1 0/1 0/’ Pseudomonas fluorescens 0/1 0/1 0/1 0/1 n/; Pseudomonas putida 0/1 0/1 0/1 0/1 0/' Pseudomonas pseudoalcalieenes 0/1 0/1 0/1 0/1 0.: Pseudomonas stutzeri 0/1 0/1 0/1 0/1 0/· Pseudomonas ceoacia 0/1 0/1 0/1 ND ND Neisseria eonorrhoeae 0/1 0/1 0/1 ND ND Escherichia coli 0/1 0/1 0/1 ND ND Bordetella pertussis 0/1 0/1 0/1 ND ND Bordetella parapertussis 0/1 0/1 0/1 ND ND Bordetella bronchiseptica 0/1 0/1 0/1 ND ND Mvcobacterium tuberculosis 0/1 0/1 0/1 ND ND Mvcobacterium avium 0/1 0/1 0/1 ND ND Moraxella catarrhalis 0/4 0/4 0/4 ND ND Haemophilus influenzae 0/2 0/2 0/2 ND ND Stremococcus pneumoniae 0/3 0/3 0/3 ND ND Acinetobacter calcoaceticus 0/1 0/1 0/1 ND ND Stanhvlococcus aureus 0/2 0/2 0/2 ND ND (n/m: počet kmenů pozitivních/počet testovaných kmenů) (ND: neprovedeno) 9¾

♦ »* • · «*· ··· 9·

Příklad 2

Mycobacterium

Mnoho druhů mykobakterií může být příčinou závažných lidských infekčních onemocnění. Známými příklady j sou Mycobacterium tuberculosis a Mycobacterium leprae. Nově byly jiné druhy jako je M. avium, M. intracellulare a M. kansasii češtěji zjišťovány jako lidské patogeny zejména u imunokompromitovaných jedinců. V důsledku toho nemůže být laboratorní diagnostika mykobakteriálních infekcí omezena na komplex kmenů M. tuberculosis, ale měla by ideálně zahrnovat většinu jiných klinicky relevantních druhů mykobakterií.

Identifikace a rozlišení patogeních mykobakterií na úrovni druhů běžnými laboratorními technikami je obecně obtížná a časově náročná.

Pro překonání tohoto problému byly využity DNA techniky.

Popsané techniky jsou v rozsahu od přímého DNA probování do automatizované sekvenční analýzy. Několik přístupů bylo nově popsáno (Jonas et al., 1993; Frothingham and Wilson, 1993;

Tomioka et al., 1993; Saito et al., 1989; Vaneechoute et al., 1993; Telenti et al, 1993; Boddinghaus et al., 1990).

Nicméně, všechny tyto metody měly určité nevýhody, a většina z nich stále spočívala na kultivaci. Kromě toho, a hlavně, žádná z těchto technik neumožňovala simultání detekci různých klinicky relevantních druhů mycobavterií v jednom testovacím kole. Kromě toho, rozlišení jednotlivých skupin v komplexu Mycobacterium 94 • ···· • I 9 9 9 99 99 99 9 9 9 9 ♦♦ ♦··· 9 99 999 9 9 9 9 9 999 999 99 9 avium-intracellulare je problematické a často i nemožné.

Pro překonání výše uvedených nevýhod byl vyvinut LiPA test, který umožňuje simultání a spolehlivou detekci a odlišení mnoha druhů a skupin Mycobacterium. Sady prob použité pro dosažení tohoto cíle byly všechny odvozeny od 16S-23S rRNA intergenového regionu. Metody jsou analogické k těm, které byly uvedeny v příkladu 1. 16S-23S rRNA intergenový region, a část 16S a 23S sousedních genů, byla amplifikována PCR s primery konzervovanými pro rod Mycobacterium. Alespoň jeden z následujících primerů umístěných v 16S genu byl použit jako horní primer: (SEQ ID NO 65) (SEQ ID NO 192)

MYC-P1: TCCCTTGTGGCCTGTGTG MYC-P5: CCTGGGTTTGACATGCACAG

Alespoň jeden z následujících primerů umístěných v 23S genu byl použit jako dolní primer pro amplifikaci: (SEQ ID NO 66) (SEQ ID NO 67) (SEQ ID NO 68)

MYC-P2: TCCTTCATCGGCTCTCGA MYC-P3: GATGCCAAGGCATCCACC MYC-P4: CCTCCCACGTCCTTCATCG Všechny výše uvedené primery amplifikovaly intergenový region všech testovaných kemnů Mycobacterium, kromě primerů MYC-P2, který nebyl funkční pro M. chelonae. Aby se zvýšila sensitivita detekce, byla někdy provedena "nested PCR", za použití P5 a P4 jako zevních primerů a PÍ a P3 jako vnitřních primerů.

Aby bylo možné vybrat a naprojektovat proby a kombinace prob, 96

·· ···· • « · • ♦ · • ··· · « · ·· ♦

Mtb2 a Mtb3 hybridizují s DNA pocházející ze všech testovaných kmenů komplexu M. tuberculosis. Žádný z jiných testovaných kemnů nehybridizoval s těmito probami za použitých podmínek. Kromě toho, komplex kmenů M. tuberculosis, stejně jako je tomu v případě jiných testovaných kmenů Mycobacterium, hybridizuje buď s mycí, nebo myc22 probou, nebo s oběma. Poslední dvě proby jsou projektovány jako obecné proby pro Mycobacterium, buď samostatně, nebo v kombinaci jedna s druhou. M. avium/M. paratuberculosis Všechny studované kmeny M. avium a M. paratuberculosis ukazovaly stejné vzorky hybridizace se sadou prob. Pro tyto typy organismů byly získány pozitivní hybridizační signály s probami mycl/myc22, mail, milll, mávl, mahl a mav22. Poslední dvě proby hybridizují výlučně s M. avium a M. paratuberculosis kmeny a mohou proto být použity jako druhově specifické proby. Protože 16S-23S rRNA intergenové sekvence od izolátů M. avium a M. paratuberculosis jsou identické nebo téměř identické, nemohou být tyto dvě taxa odlišeny je dno od druhého.Toto zjištění podporují data sekvencování 16S, která ukazují, že M. avium a M. paratuberculosis by měla být skutečně považována za příslušící jednomu genovému druhu (Rogal et al., 1990), M. avium ssp . avium a M. avium ssp. paratuberculosis. M. intracellulare a komplex M. intracellulare (MIC) MIC kmeny jsou genotypicky vysoce příbuzné organismy, které podle dat sekvence 16S-23S rRNA intergenového regionu patří k jinému seskupení, které je separátní od jiných Mycobacterium druhů. Mycobacterium avium a Mycobacterium scrophulaceum jsou 97 • ···· ·· · • » ♦ · ♦ ♦♦ t ·· ··· • · • · #·♦ ·· jejich nejbližší příbuzní. Téměř všechny testované kmeny, které jsou označovány obecně jako kmeny M. avium komplexu (MAC) (dříve MAIS komplex) mohou být nalezeny v MIC skupině. Tak MIC skupina definovaná v předkládaném vynálezu zahrnuje MAC typ kmenů popsaný Frothingamem a Wilsonem (1993) s výjimkou MAC-G, který se zdá být M. scrophulaceum. Také kmeny M. intracellulare sensu stricto (M. intracellulare s.s.) jsou součástí tohoto seskupení.

Protože tato MIC skupina obsahuje dosti velkou skupinu kmenů s, mimo jiné, podskupinami vykazujícími různé hybridizační charakteristiky se sadou prob, bylo provedeno další subdělení na MIC-typy. MIC 1 obsahuje M. intracellulare s.s. spolu s některými jinými MAC kmeny. Všechny MIC 1 izoláty, bez výjimky, hybridizují na následující proby: mycl/myc22, mail a macl. Následujíc proby mohou být použity pro provedení dalšího subdělení v MIC 1 skupině: milll, mini, min2 až 222, mil22 a mhefl. M. intracellulare sensu stricto kmeny (typ MIC l.la) mohou být odlišeny od jiných podtypů v této skupině pomocí proby mini, která je pozitivní pouze pro tuto skupinu kmenů. Všechny kmeny typu MIC l.la jsou pozitivní, pokud jsou testovány s M. intracellulare probou Gen-Probe Rapid Diagnostic systému pro MAC. Typ MIC 1.1b a MIC 1.2 obsahuje kmeny, které jsou těsně příbuzné M. intracellulare. Ty mohou být odlišeny za použití prob milll a mil22 (viz tabulka 3). Další subdělení v těchto skupinách nebylo provedeno, ačkoliv toho může být dosaženo za použití prob. min2, min22, min222 a min2222. Další subdělení může mít význam z epidemiologických důvodů. 98 ΦΦ ····

Pouze dva z našeho souboru kmenů byly zařazeny do skupiny MIC2 kmenů. Jedním z těchto kmenů je kmen "Mycobacterium lufu" (ITG 4755) . Specifická proba generovaná těmito kmeny je charakterizována pozitivním hybridizačním signálem s následujícími probami: mycl/myc22, mail, mil22, mahl, a mail. Variabilní hybridizační výsledky jsou získány s probami min222, macl a mhefl. Ostatní proby jsou negativní. Je nepravděpodobné, že by se MIC2 ukázaly eventuálně být heterogení skupinou, pokud by bylo identifikováno více kmenů tohoto typu. Variabilní proby mohou pomoci v další diferenciaci, pokud to bude relevantní.

Typ MIC 3 skupiny je dosti velký počet MAC kmenů, které jsou dosti vzdáleně příbuzné s M. intracellulare s.s. a s většinou ostatních MAC kmenů. Toto seskupení může být považováno za odlišné od M. avium a M. intracellulare na genotypové hladině. Všechny MIC 3 subtypy hybridizují na proby mycl/myc22, mail, mil22 a mcol. Pozitivní signál s poslední probou (mcol) je charakteristický pro MIC 3 kmeny. Variabilní výsledky hybridizace jsou získány s následujícími probami: macl, mhefl a mahl. MIC 3 mohou být dále rozděleny na čtyři podtypy za použití třech prob: mthll, mth2 a mefll. Proba mth2 je specifická pro MIC 3.1, který obsahuje skupinu vysoce příbuzných MAC-kmenů izolovaných od imunokompromitováných lidských jedinců. Většina MIC 3 kmenů je umístěna v MIC 3.1 podtypu. Této skupině kmenů může být přiřazen status druhu, stejně jako tomu může být pro jiné skupiny MAC kmenů, dosud nepojmenované. V podtypech MIC 3.4, MIC 3.3 a MIC 3.2 se nachází pouze dva, jeden a jeden kmen v příslušném pořadí, v našem souboru testovaných kmenů.

Typ MIC 4 je soubor "MAIS" kmenů (včetně M. malmoense) , které jsou vzdáleně příbuzné k M. intracellulare. Jedinou probou z výše 99 99 • » · · · * Μ · *· • * · • · · · • · · »·· · *·

t · • * • · ·· ··«· popsané sady, která hybridizuje na MIC 4, kromě obecných mycl/myc22 prob, je mail proba. Tato proba vykazuje širokou specificitu, kdy hybridizuje také na M. avium, M. intracellulare a jiné MIC kmeny a na M. scrophulaceum. M. scrophulaceum Všechny testované kmeny M. scrophulaceum vykazovaly stejné vzorky hybridizace se sadou prob. Pozitivní signál s probou mscl je jedinečný pro kmeny M. scrophulaceum. Jediné další proby s pozitivním signálem pro tento druh jsou zřejmě mycl/myc22 a tajé mail. M. kansasii

Proby mka3 a mka4 jsou specifické pro M. kansasii: t.j. je získán zřetelný pozitivní signál na LiPA proužku, pokud je amplifiovaná DNA z kmenů M. kansasii použita k hybridizaci, zatímco se všemi ostatními testovanými organismy je signál negativní. Ačkoliv sekvence prob mkal a mka2 nejsou zcela komplementární s cílovou sekvencí (3 a 1 chybné párování, v příslušném pořadí), jsou tyto proby také užitečné, protože hybridizují výlučně na DNA M. kansasii a nikoliv na jakoukoliv jinou testovanou mycobacteriální DNA za použitých podmínek (50 °C, 3xSSC, 20% formamid). Toto ilustruje, že proby nemusí mít nezbytně bezchybné párování k cíly, aby byly použitelné, a že modifikace v sekvenci a délce může být v jistém stupni umožněna. M. chelonae

Druhy M. chelonae obsahují kmeny M. chelonae ssp. chelonae 100 100 • • ·· » • * ·· • • • • • · • • • • ·· · • *·« »· MM • · · • » · • ·* · < • Φ a M. chelonae ssp. abscessus. Intergenový region byl sekvencován pro jeden kmen každého poddruhu a byly zaznamenány malé rozdíly (SEQ ID NO: 103 a SEQ ID NO: 102). Proby mchl a mch2 hubridizují na oba tyto kmeny. Všechny ostatní proby jsou negativní pro tyto dva kmeny kromě mycl/myc22. Při testování prob mchl a mch2 dvěma dalšími M. chelonae kmeny, které nejsou uvedeny v tabulce 4, t.j. M. chelonae 94-379 a M. chelonae 94-330, oba získány od Institute of Tropical Medicine, Antwerp, Belgium, se zdálo, že tyto nehybridizují s probou mchl. Toto bylo potvrzeno sekvencováním intergenového regionu těchto dvou kmenů (SEQ ID NO: 184). Analýza seskupení intergenového regionu s jinými mykobakteriemi ukázala, že kmeny M. chelonae mohou být dále děleny na dvě skupiny. Třetí proba mch3 byla projektována pro specifickou detekci této druhé skupiny kmenů, ke které patří 94-379 a 94-330.

Toto ilustruje, že použití DNA prob odvozených od 16S-23S rRNA intergenového regionu může být užitečné v odlišení různých skupin kmenů, které patří ke stejnému druhu podle metod klasické identifikace, a pravděpodobně mohou být použity pro detekci a popis nových druhů mezi mykobakteriemi. V tomto případě mch2 detekuje kmeny M. chelonae, zatímco mchl a mch3 rozlišují mezi různými podskupinami. M. gordonae Z pěti testovaných kmenů M. gordonae hybridizovaly všechny s probou mgo5. Pozitivní hybridizační signály byly také získány s probou mycl/myc22, a některé kmeny M. gordonae také hybridizovaly s probou mgol a mgo2. 101 • ♦ ··· •t · • · • · • ♦ ··· ♦ ·· # # •1 ···· « · • · ··· · • * «· ·

Jiné druhy mykobakterií

Kmeny patřící k jiným druhům mykobakterií, než byly popsány výš, hýbridizovaly pouze s obecnými probami mycl/myc22. Toto ukazuje, že tyto kmeny s největší pravděpodobností patří k rodu Mycobacterium, ale že nepatří k jednomu z druhů nebo skupin, které byly specificky identifikovány za použití jedné nebo více z výše uvedených prob.

Na závěr můžeme tvrdit, že podle určité použité kombinace prob podle vynálezu mohou být poskytnuty DNA probové testy na různých úrovních.

Pokud jsou všechny proby použity v jednom a stejném LiPA testu, pak může být dosaženo rozlišení na úrovni druhů, stejně jako subtypů jistých skupin mykobakterií. Nicméně, sestavení prob na proužku může být omezeno na ty proby, které jsou druhově specifické: v tom případě je identifikace provedena na úrovni druhů. Další redukce počtu prob na proužku může vést ke specifické detekci pouze jednoho nebo právě několika druhů.Samozřejmě, LiPA proužky mohou být projektovány pro odlišení pouze subtypu kmenů, např. těch, které patří ke komplexu M. intracellulare (MIC). V závislosti na jednotlivých potřebách laboratoří provádějících diagnosu a/nebo typizování mykobakterií mohou být všechny tyto aplikace hodnotné. Nicméně, je jasné, že za použití prob v LiPA formátu je množství informací získaných pro identifikaci organismů přítomných v klinickém vzorku značně zvýšeno ve srovnání s testy s DNA probami využívajícími pouze jednu probu. Pro některé skupiny, nebo alespoň pro některá další dělení něaké skupiny, nemůže být jedinečná proba hybridizující na tuto (pod)skupiny projektována. V tom případě jsou pouze sestavy 102 ·· · ·· · 102 ·· · ·· ·

• « · prob schopné posytnout potřebnou informaci. Pro tyto aplikace je LiPA výhodným formátem. 103 « · ··· · • · · • · * · • · ·· ·

Tabulka 3 - Různé charakteristiky prob získaných pro poddruhy § •H u<u 4->o (U8ϋ 2 *—< u 03 E t 1 + + + +1 +| + + + 1 1 ll|| E 1 1 . 1 + + + + + + 1 + 1,1 fS fS ¾ Ě 1 + +| + +1 lili I lili «a Ě 1 1 + +1 +1 1 lili 1 lili E 1 + +1+1 1 lili 1 1 liti Ě 1 1 + +1 , < 1 1 1 1 t 1 iiii 1—< c E 1 ( + 1 . 1 t t 1 1 1 1 <111 <s <s ► > es rt E E 1 + 1 1 1 1 lili 1 1 lili milll 1 + + + 1 r 1 1 1 t ( 1 1 t I 1 *5 E 1 + + + + + + + + + + + iiii rs rs •a ja x> «J E E E + 1 1 1 1 1 lili 1 1 1 1 1 1 ťS 73 *3 ►) >» E E + + + + + + + + + + + + "f· + + -+ Mycobacferium XA *55 o *3 o 'Γ *2 o 3 «o 2 2 ΧΛ *S3 £ "3 o u OJ JD C P .1 e £ s. s 2' M jO Η H ^ u u u 2 2 2 <N u «-Η 2 rf (n ^ ri cn cn n U U U u 2222 Ti· u 2 o ce £ O Ur O V5 2 D< V) 4) i> .1 i a t H — ·§ rt G <L> W- J2 "o eo 8 2 2 2 2 104 • · · · · ·· · • · · • · · · · · • · • · · ··

Mycobacterium mcol mthll mth2 mefll mhefl mahl mail mscl mkal,2,3,4 meh mgol,2 mgo5 1,2,3 105

• ···» ·· I 105 • ···» ·· I I 9 I 9 999 • ·· ··· 999 ·· » • · • · • · • · · 9

Tabulka 4 - Kmeny Mycobacterium testované v LiPA druh/skupina čísla kmenů z Institute of Tropical Médičine, Antwerp,{kromě těch, které jsou v závorkách) M. tuberculosis complex 7602, 8004, 8017, 8647. 8872. 9081. 9129. 9173. 9517. (ATCC 27294i 8324, 8428 M. avium/ M. paratuberculosis 1101, 1983, 2070, 2074. 4176. 4189. 4191, 4193, 4197. 4204. 4386. 4991. 5872, 5874, 5884, 5887. 5893. 5894. 5897, 5903. 5904. 5905. 5927. 5933. 8180, 8750, (ATCC 25291). M. naratub : (316F). (2E) M. intracellulare (MIC 1.1.a) 4199. 4208, 5701, 5880, 5906, 5908. 5909. 5913. 5915. 5917. 5918. 59‘0. 5921, 5924, 5925, 5929. 8713. 8717. 8718. 8720. 8721. 8722. 8732. 87-0. 8741, 8742, 8744, 8747. 8749 MIC 1.1.b 8694, 8745, 8754 8708 5513, 8743 8054. 8190 MIC 1.2 8710, 8711, 8712. 8714, 8715. 8716. 8725. 8729. 8733. 8737. 8746. 87:1. 8752 5919 8695 8748 MIC 2 5922 4755 (M. lufu) MIC 3.4 1815 8707 MIC 3.3 5620 MIC 3.1 925, 926, 1329, 1788. 1794. 1812, 1818. 2069. 2073. 2076. 4541, 4543. 5074, 5280, 5789, 7395. 8739. 8753 8738 MIC 3.2 5765 M. scrofulaceum 4979, 4988, 5907, 8706, 8726, 8727, 8735. (MB022). (MB023). (MB0241 M. kansasii 4987, (ATCC 22478) M. chelonae 4975, 9855 M. gordonae 7703, 7704, 7836, 7838, 8059 MIC 4 8723, 8724 8757 4842 (M. malmoense) jiné mykobak-teriální druhy 7732 (M. marinum), 94-123 (M. celatum), 778 (M. haemophilum). 8777 (M. genavense), 4484 (M. siniae), 4986 (M. xenopi). 4304 (M. fonuitum). 1837 (M. ulcerans) 106 »· ···· • ·· ·

Příklad 3 - Listeria

Druhy Listeria jsou skupinou Gram-pozitivních tyček v pčírodě značně rozšířených. V této skupině se zdá, že pouze L. monocytogenes je patogení pro lidi a pro zvířata. L. monocytogenes je příčinným agens listeriosy, způsobuje meningitidu, potraty, encephalitidu a septikemii.

Imunokompromitování jedinci, novorozenci a těhotné ženy jsou rizikovými skupinami této potravou se přenášející choroby. Většina případů bývá způsobena konzumací potravy zvířecího původu, zejména měkkých sýrů. Proto by měla být přítomnost L. monocytogenes vyloučena v jídle. Pro bezpečné měření je v některých zemích požadována absence všech druhů Listeria v potravinových produktech.

Klasická metoda identifikace L. monocytogenes v potravě vyžaduje obohacenou kultivaci po 48 hodin a následující tvorbu kolonií na selektivním agarovém mediu po 48 hodin, po které následuje celá sada biochemických a morfologických test (Farber and Peterkin, 1991). Tento postup může být značně zjednodušen za použití genových prob. Několik DNA prob pro identifikaci L. monocytogenes již bylo ppsáno. Některé z těchto prob jsou odvozeny od genů odpovědných za patogenitu organismu, například od genu pro listeriolysin O (Datta et al., 1993) nebo od s invasí asociovaného proteinu (iap) {Bubert et al., 1992).

Komerčně dostupný identifikační systém, založený na specifické 16S rRNA probě, je obsažen v GenProbe (Herman and De Ridder, 1993: Ninet et al., 1992). 107 • · · · ·· ···· ·· ·· · · • « · · · • · · ♦·· · • · · · ··· · · · ·· ·

Tyto specifické proby jsou použity jako potvrzovací test pro kolonie získané po obohacení a umístění na selektivní agarové medium.

Nově bylo v několika publikacích popsáno použití poymerasové řetězové reakce pro amplifikaci cílového regionu DNA prob, což může zkrátit čas testu bez interference se specificitou a sensitivitou testu. Jsou popsány různé sady primerů, které mohou specificky amplifikovat DNA L. monocytogenes. Tyto sady primerů byly odvozeny od genu pro listeriolysin O (Golstein Thomas et al., 1991), a od iap genu (Jaton et al., 1992).

My jsme použitli 16S-23S rRNA genový intergenový region jako cíl pro vývoj rodově specifické proby pro Listeria a proby specifické pro Listeria monocytogenes.

Za použití konservovaných primerů odvozených od 3' konce 16S rRNA a 5' konce 23S rRNA (sekvence jsou dané v příkladu 1) byl intergenový region amplifikován za použití polymerasové řetězové reakce a následně byl klonován do vhodného plasmidového vektoru podle stejného postupu jako v příkladu 3.

Byly získány dva amplikony různé délky (800 bp a 1100 bp) Oba PCR fragmenty byly klonovány pro následující druhy Listeria: - Listeria monocytogenes, serovar 4b (Instituut voor Hygiene en Epidemiologie, Belgium) - Listeria ivanovii CIP 78.42 (Collection Nationale de Cultures de Microorganisms de 1'Institut Pasteur, France) t· ♦ 108 - Listeria seeligeri serovar 4a, č. 42.68 (Bacteriologisches Institut, Sudd Versuchs- und Forschungsanstalt fur Milchwirtschaft Weihenstephan, Gerraany)

Sekvence intergenového regionu mezi 16S a 23S rRNA genem byla určena za použití klonovaného materiálu pocházejícího z 800 bp PCR fragmentu a toto bylo provedeno pro tři popsané druhy Listeria. Obr. 41 až 43 ukazují sekvence různých získaných krátkých intergenových regionů. Sekvence tohoto krátkého intergenového regionu L. monocytogenes byla také získána z EMBL databanky (LMRGSPCR).

Podle této informace o sekvenci byly vybrány a chemicky syntetizovány následující oligonukleotidy pro druhově specifickou detekci:

LMO-ICG-1 : AAACAACCTTTACTTCGTAGAAGTAAATTGGTTAAG LMO-ICG-2 : TGAGAGGTTAGTACTTCTCAGTATGTTTGTTC LSE-ICG-1 : AGTTAGCATAAGTAGTGTAACTATTTATGACACAAG LIV-ICG-1 : GTTAGCATA A ATAGGTA ACT ATTT ATG AC AC A AGT A AC

Také byla projektována druhově specifická proba pro Listeria: LIS-ICG-1 : CAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATC

Oligonukleotidové proby byly imobilizovány na prožku membrány a následovala reversní hybridizace s biotynylovanými PCR fragmenty a hybridy byly vizualizovány za použití precipitační reakce. Hybridizační výsledky pro různé druhy Listeria jsou shrnuty v tabulce 5. 109 ·# ···· ·· ··# ··· ··

Tabulka 5

Druh n LISÍ LMOl LM02 LSE1 LI VI L. monocvtoeenes 1 + + + — — L. seelieeri 2 + + ± + ± L. ivanovii 3 + + — ± + L. welshimeri 3 + + + — — L. innocua 2 + + + — —

Tyto hybridizační výsledky ukazují, že proba LISÍ může detekovat všechny popsané druhy Listeria, ale také že druhově specifické proby zkříženě hybridizují jedna s druhou. Proto, z tohoto krátkého intergenového regionu nebyly proby s dostatečnou specificitou nalezeny.

Pro Listeria monocytogenes byl také určen 16S-23S rRNA genový intergen pocházející z 1100 bp fragthentu. Obr. 45 ukazuje sekvenci získanou pro tento druh. Tato informace o sekvenci byla také získána pro L. seeligeri (viz obr. 44).

Na základě srovnání baží L. seeligeri byla následující oligonukleotidová proba vybrána pro specifickou detekci L. monocytogenes.

LMO-ICG-3 : AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC

Počáteční hybridizační výsledky (nejsou ukázány) ukázaly, že u této proby pro L. monocytogenes LM03 nebyla pozorována žádná 110 • t ·· · Μ I • · • ♦ • · ·» • · • ♦ · • · ··♦ ♦·♦ ·· ·· ···· • ♦ · • · ♦ ··· ♦ • · ♦ · · zkřížená hybridizace s jinými druhy Listeria a že všechny použité kmeny Listeria hybridizovaly s obecnou probou LISÍ.

Oligonukleotidové proby, LISÍ pro detekci všech druhů Listeria a LM03 pro specifickou detekci L. monocytogenes, byly imobilizovány na proužku membrány a hybridizovány na značené amplikony, obsahující 16S-23S rRNA intergenový region, odvozený od různých organismů. Výsledky hybridizace jsou ukázány v následující tabulce.

Vynikající specificita a sensitivita byla získána pro proby LM03 a LISÍ v příslušném pořadí na úrovni druhu a rodu.

Tabulka 6

Testované taxony

Listeria monocvtogenes Listeria ivanovii Listeria seeligeri Listeria welshimeri Listeria innocua Listeria murravi Listeria gravi Brochotrix thermosphacta Brochotrix campestris Bacillus cereus Bacillus brevis Bacillus coalgulans Bacillus pumilis Bacillus macerans Bacillus lentus Bacillus firmus Bacillus subtilis Bacillus megantum Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus durans Lactococcus lactis Lactococcus casei Escherichia coli Hafnia halvei

Aprobacterium tumefaciens Mvcoplasma dimorpha Clostridium tvrobutvricum Clostridium perfringens Clostridium sporopenes Clostridium acetobutvricum Bručel la abortus Brucella suis Brucella melitensis Staphvlococcus aureus Salmonella tvphimurium Salmonella enteritidis Yersinia enterocolitica n LISÍ LM03 44 + + 10 + — 11 + — 16 + — 23 + — 3 + — 2 + — 1 — — 1 — — 3 — — 2 — — 1 — — 1 — — 1 — — 1 — — 2 — — 2 — — 1 — — 1 — — 1 — — 1 — — 3 — — 1 — — 1 — — 1 — — ? 1 — — 1 — — 1 — — 1 — — 1 — — 1 — — 1 — — 1 — — 1 — — 1 — — 1 — — 1 — — n: počet testovaných kmenů • • · · · • • ·· ···· • · • M ·· • · · • • • • t · · • • * • • • ··· · • • • • • · ··« • ·· · ··♦ «· ♦

Tyto dvě proby mohou být použity pro detekci druhu Listeria a Listeria monocytogenes přímo ve vzorku potravy nebo po obohacení vzorku v kapalném bujónu. V obou případech se mohou vyskytnout problémy s amplifikací s konzervovanou sadou primerů vzhedem k enormnímu pozadí flory v těchto vzorkách.

Pro překonání tohoto problému bylo projektováno několik sad primerů odvozených od 16S-23S rRNA intergenového regionu druhu Listeria.

Primery LIS-P1 a LIS-P2 jsou horní primery, zatímco LIS-P3 a LIS-P4 jsou dolní primery. Tyto primery amplifikují menší 16S-23S rRNA intergenový region stejně jako větší intergen druhu Listeria (kromě L. grayi a L. murrayi). Pokud je to potřeba, mohou být tyto primery použity v "nested PCR" testu, kde IS-P1/LIS-P4 jsou zevní primery a LIS-P2/LIS-P3 jsou vnitřní primery.

Pro specifickou detekci Listeria monocytogenes byla projektována proba LMO-ICG-3 a byla odvozena od většího 16S-23S rRNA intergenového regionu. Pro specifickou amplifikaci pouze tohoto většího intergenového regionu pro lepší detekci tohoto patogenu přímo ve vzorku byla odvozena sada primerů z částečné informace o sekvenci pro velký 16S-23S rRNA intergenový region, která není přítomná v malém rRNA intergenu. Pro tento účel jsou primery LIS-P5 a LIS-P6 použity jako horní primery a LIS-P7 je použit jako dolní primer.

113 LIS-P1 : ACCTGTGAGTTTTCGTTCTTCTC

LIS-P2 : CTATTTGTTCAGTTTTGAGAGGTT

LIS-P3 : ATTTTCCGTATCAGCGATGATAC

LIS-P4 : ACGAAGTAAAGGTTGTTTTTCT LIS-P5 : GAGAGGTTACTCTCTTTTATGTCAG LIS-P6 : CTTTTATGTCAGATAAAGTATGCAA LIS-P7 : CGTAAAAGGGTATGATTATTTG

·· ···· • t · I · · ·· · · • · ·♦ · 71 72 73 74 75 202 203 Během hodnocení prob pro Listeria spp. byl izolován ze sýru organismus, který náležel k Listeria podle metod klasického určení. Tento izolát (MB 405) ukazoval následující charakteristiky (podobně jako Listeria spp.): Gram pozitivní, rostoucí na Oxford a Tryptickém sojovém agaru, katalasa pozitivní. Jediným rozdílem proti Listeria spp. byla pohyblivost, která byla negativní.

Za použití konzervovaných primerů jak jsou popsány v příkladu 1 pro amplifikaci 16S-23S rRNA intergenového regionu tohoto izolátu MB 405 byly získány stejné vzorky amplikonů pro tento kmen jako pro jiné Listeria spp. Hybridizace amplikonů ukázala, že zde není získaný signál s jakoukoliv z prob pro Listeria spp.

Sekvencování 16S rRNA izolátu MB 405a následné srovnání s Listeria spp. a příbuznými ukázalo, že organismus je těsněji příbuzný s Listeria spp., než s jinými dosud v literatuře popsanými druhy, taxonomické studie ukáží, zda tento organismus patří nebo nepatří rodu Listeria. Tento izolát, a následně izolované organismy stejného typu, jsou označovány v této přihlášce jako Listeria podobné organismy. U izolátu MB 405 se zdálo, že obsahuje alespoň tři různé 16S-23S rRNA intergenové regiony, které byly klonovány a subsekvencovány. Podle srovnání s Listeria spp byla vybrána oligonukleotidová proba pro specifickou detekci Listeria 114 ···· ·· ·

···· podobných kmenů:

LISP-ICG-1 : CGTTTTCATAAGCGATCGCACGTT

Reversní hybridizační reakce teto proby s 16S-23S rRNA intergenovými regiony Listeria spp. ukázala, že zde není zkřížená hybridizace. Příklad 4: Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis je malá obligátně intracelulární gram negativní bakterie, která má 15 serovarů (A-K, Ba, LI, L2 a L3) lišících se hlavním zevním membránovým proteinem (MOMP) a obsahující kryptický plasmid nutný pro intracelulární růst. A-K a Ba serovary vytvářejí trachoma biovar, zatímco LI, L2 a L3 serovary vytvářejí LGV biovar.

Serovary A, B, Ba a C jsou obecně asociovány s trachomem, hlavní příčinou slepoty ve světě, které je možné předcházet. D-K serovary jsou nacházeny hlavně u sexuálně přenosných infekcí a jsou hlavní příčinou cervitidy a pánevních zánětlivých onemocnění u žen a uretritidy a epididimitidy u mužů. Serovary LI, L2 a L3 jsou nacházeny u lymfogranuloma venerum, vzácné sexuálně přenosné choroby.

Buněčná kultura je vyžadována jako základní metoda pro laboratorní dignostiku, ačkoliv životaschopnost vzorku je obtížné udržet během transportu a laboratorní techniky jsou časově náročné a technicky náročné. Proto bylo vyvinuto mnoho kitů pro rychlé testování, jako je enzymově vázaný imunosorbentní test a přímé barvení fluorescentní protilátkou. Nicméně, žádný z těchto 115 • » · * · • « * · t · 115 • » · * · • « * · t · 6 · • · ·«« ·· i · t · * · · • · ··· « · testů nemá vysokou hladinu sensitivity a specificity.

Neizotopové testy s EDNA probami (Gen-Probe PÁCE; Woods et al., 1990), které detekují chlamydiální rRNA, jsou komerčně dostupné. Nově, polymerasová řetězová reakce byla použita pro detekci infekcí Chlamydia. Detekce byla zaměřena na buď kryptický plasmid (Loeffelholz et al., 1992) nebo na ompl gen, který kóduje hlavní zevní membránový protein (Taylor-Robinson et al., 1992). Ve srovnání s jinými technikami má PCR vyšší sensitivitu a specificitu (Ossewaarde et al., 1992).Žádný z těchto testů nevyužívá DNA prob odvozených od 16S-23S rRNA genového intergenového regionu.

Pro kmeny Chlamydia trachomatis L2 a Chlamydia psittaci 6BC byla část ribosomálního RNA cistronu, obsahujícího 16S-23S rRNA intergenový region, byla ampifikována za použití konzervovaných primerů (viz příklad 1) a následně byla subklonována do plasmidového vektoru. 16S-23S rRNA intergenový region byl sekvencován za použití dideoxyřetězové terminační reakce.

Sekvence intergenového. regionu z obou druhů Chlamydia je ukázána na obrázku 47 až 48.

Podle této informace o sekvenci byly chemicky syntetizovány následující oligonukleotidové proby:

CHTR-ICG-1 : GGAAGAAGCCTGAGAAGGTTTCTGAC CHTR-ICG-2 : GCATTTATATGTAAGAGCAAGCATTCTATTTCA CHTR-ICG-3 : GAGTAGCGTGGTGAGGACGAGA CHPS-ICG-1 : GGATAACTGTCTTAGGACGGTTTGAC 116 * «··· · · ·· ««ti Μ ···#·♦·· • · · · · · · • · · · I I *»· · • 9 ♦ ♦ ♦ · *·· « ··· ··· ·· ·

Oligonukleotidové proby byly zmobilizovány v liniích na proužku membrány a následně byly použity v reversním hybridizačním testu s biotynylovanými PCR produkty, obsahujícími 16S-23S rRNA intergenový region, jako cíly.

Hybridizace byla provedena v roztoku 3xSSC a 20% formamidu (FA) při teplotě 50 °C.

Hybridizační výsledky s různými probami sjou ukázány v následující tabulce.

Tabulka 7

Testované kmeny CHTR1 CHTR2 CHTR3 CHPS1 Chlamvdia trachomatis L2 + + + __ Chlamvdia psittaci 6BC — — — + Chlamvdia psittaci CP — — — + Chlamvdia psittaci TT — - — + Haemophilus ducrevi CIP 542 — - — — Haemophilus influenzae NCTC 8143 — - — — Neisseria ponorrhoeae NCTC 8375 — - — — Moraxella catarrhalis LMG 5128 — - — — Escherichia coli B - - — — Streptococcus pneumoníae S92-2102 — — —

Jak je ukázáno v tabulce, při teplotě hybridizace 50 °C jsou proby CHTR1, CHTR2 a CHTR3 specifické pro Chlamydia trachomatis a proba CHPS1 je specifická pro Chlamydia psittaci. Několik klinických izolátů, získaných z SSDZ, Delft, Netherlands, identifikovaných jako Chlamydia trachomatis za použití běžných metod, bylo testováno v testu reversní 117

hybridizace s různými oligonukleotidovými probami. Všechny proby specifické pro Chlamydia trachomatis dávaly pozitivní hybridizační signál, a žádný z těchto izolátů nereagoval s probou pro Chlamydia psittaci. Pro některé klinické izoláty reagovala proba CHTR2 signifikantně slaběji než CHTR1 nebo CHTR3. Intergenový region jednoho z těchto izolátů (94 M 1961) byl sekvencován (SEQ ID NO: 197) a sekvence ukázala jednu chybu v intergenové sekvenci kmenu L2. Další proba (CHTR4) byla odvozena od této nové intergenové sekvence: (SEQ ID NO 201)

CHTR-ICG-4 : GAGTAGCGCGGTGAGGACGAGA

Tato proba dávala silnější hybridizační signál než CHTR2 s některými klinickými izoláty od Chlamydia trachomatis.Může být použita samostatně, nebo v kombinaci s probou CHTR2 (například mohou být obě proby aplikovány na jedné LiPA linii).

Pro vývoj velmi sensitivního testu pro detekci Chlamydia trachomatis přímo v klinických vzorcích byla odvozena specifická sada primerů z 16S-23S rRNA intergenového regionu, CHTR-P1 (horní primer) a CHTR-P2 (dolní primer) , která amplifikuje specificky intergenový region druhu Chlamydia.

CHTR-P1 : AAGGTTTCTGACTAGGTTGGGCCHTR-P2 : GGTGAAGTGCTTGCATGGATCT 69 70 Příklad 6: Mycoplasma pneumoniae a Mycoplasma genitalium

Mykoplasmata jsou šupinou malých prokaryont o kterých je známo, že jsou schopné růstu v bezbuněčném mediu, nemají buněčnou stěnu a mají velmi malý genom s malým obsahem G+C. Bylo izolováno 118 ·» ···· «· t é • · více než 100 různých druhů od lidí, zvířat, rostlin a hmyzu. U lidí byla mykoplasmata nalezena buď jako patogení organismy, nebo jako komensálové. Nejlépe známým patogenem je Mycoplasma pneumoniae, příčinné agens primární atypické pneumonie, zejména u dětí a u mladých dospělých. Diagnosa Mycoplasma pneumoniae je založena na přímé izolaci kultivační metodou nebo na detekci specifických protilátek proti Mycoplasma pneumoniae v séru pacienta.

Jiný patogen, prvně izolovaný ze vzorků z uretry od pacientů s negonokokovou uretritidou, byl ppsán jako Mycoplasma genitalium. Toto mykoplasma má několik vlastostí společných s Mycoplasma pneumoniae. Oba druhy jsou patogení a oba mají schopnost adherovat na erytrocyty, na různé buněčné tkáně, sklo, a plastové povrchy. Dále, M. pneumoniae a M. genitalium nesou antigeny, které dávají vzniknout rozsáhlým zkříženým reakcím v serologických testech. Pozorování, že M. genitalium může být také nalezeno ve vzorcích z respiračního traktu od pacientů s pneumonií a izolováno ze směsi s M. pneumoniae dává vzniknout otázkám o možné patogenítě M. genitalium.

Protože kultivace obou druhů je časově náročná a sérologie postrádá specificitu, byly vyvinuty rychlejší a specifičtější testy pro identifikace těchto mykoplasmat. Použití hybridizačních testů s DNA probami bylo popsáno pro tyto druhy, ale i přes dobrou specificitu tyto testy neumožňují detekci nízkých hladin M. pneumoniae a M. genitalium. Nověji byly vyvinuty techniky DNA hybridizace za použití polymerasové řetězové reakce. Byl popsán M. pneumoniae specifický PCR test za použití genu pro PÍ adhesin (Buck et al., 1992) a 16S rRNA genu (Kuppeveld et al., 1992).

Specifické PCR testy pro M. genitalium byly popsány za použití sekvencí pro gen pro adhesin a 16S rRNA gen.

Intergenové sekvence linikých izolátů M. pneumoniae a M. genitalium (získaných od U. Gobel, Uniersity of Freiburg,

Germany) byly určeny. Jsou ukázány na obr. 49 až 50. Sekvence vykazují určité rozdíly vzhledem k sekvencím z jiných kmenů stejného druhu deponovaných v EMBL databance (MPMAC a MGG37, v příslušném pořadí). na základě této informace byly odvozeny čtyři proby: jedna obecná proba pro mykoplasmata, dvě specifické pro M. pneumoniae a jedna specifická pro M. genitalium:

Mycoplasma-ICG: C A AA ACTG A A A ACG AC A ATC' 1" 1'1 ’CT AGTTCC MPN-ICG-1: ATCGGTGGTAAATTA AACCCAAATCCCTGT MPN-ICG-2: CAGTTCTGAAAGAACATTTCCGCTTCTTTC MGE-ICG-1: CACCCATTA ATTTTTTCGGTGTTAA AACCC

Proby byly aplikovány na LiPA proužky a hybridizovány za standartních podmínek (3xSSC, 20% formamid při 50 °C) pro amplifikování intergenového materiálu od čtyř kmenů M. pneumoniae, jednoho kmenu M. genitalium a dvaceti dvou kmenů jiného druhu než Mycoplasma. Obecná proba hybridizovala pouze na pět testovaných kmenů Mycoplasma, zatímco specifick proby hybridizovály pouze na ty kmeny druhu, pro které byly proj ektovány. Příklad 7: Jiné druhy mykobakterií

Se stálým zlepšováním laboratorní techniky stále vzrůstají informace o systematickém a klinickém významu tak zvaných "potenciálně patogeních mykobakterií". S S objevem nově rozpoznaných onemocnění byly objeveny další syndromy asociované s různými druhy mykobakterií a byly hodnoceny jako velmi významné.

Pro rozšíření LiPA testu pro simultání detekci různých mykobakteriálních druhů jak je popsáno v příkladu 2 byla projektována nová sada DNA prob pro specifickou identifikaci následujících druhů: Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium genavense, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium simiae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium malmoense, Mycobacterium celatum a Mycobacterium haemophilum.

Tyto proby byly odvozeny od sekvence 16S-23S rRNA intergenového regionu. Pro výše uvedené druhy byla tato informace získána přímým sekvencováním PCR produktů nebo po klonování PCR-amplifikovaného intergenového regionu. Získané sekvence jsou representovány na obr. 80 - 97 a na obr. 38 pro M. malmoense.

Sekvence intergenového regionu výše uvedených mykobakteriálních druhů byly srovnávány a sestaveny se sekvencemi již popsanými v příkladu 2 nebo z veřejně dostupných zdrojů. Z regionů divergence byly projektovány druhově specifické DNA proby. Proby byly vybrány a projektovány takovým způsobem, aby bylo získáno požadované hybridizační chování (t.j. druhově specifická hybridizace) za stejných podmínek, jako jsou podmínky specifikované pro jiné mykobakteriální proby uvedené v příkladu 2, t.j. 3xSSC, 20% deionizovaný formamid, 50 °C. Toto umožňuje simultání detekci alespoň dvou, a možná všech, druhů mykobakterií popsaných v tomto vynálezu. Následující oligonukleotidové proby byly projektovány pro sekvenci příslušného intergenového regionu M.ulcerans, M. genavense, M.xenopi, M.simiae, M.fortuitum, M.malmoense, M. celatum a M.haemophilum:

MUL-ICG-1 : GGTTTCGGGATGTTGTCCCACC

MGV-ICG-1 : CGACTGAGGTCGACGTGGTGT MGV-ICG-2 : GGTGTTTGAGCATTGAATAGTGGTTGC MXE-ICG-1 : GTTGGGCAGCAGGCAGTAACC MSI-ICG-1 : GCCGGCAACGGTTACGTGTTC

MFO-ICG-1 : TCGTTGGATGGCCTCGCACCT MFO-ICG-2 : ACTTGGCGTGGGATGCGGGAA MML-ICG-1: CGGATCGATTGAGTGCTTGTCCC MML-ICG-2: TCTAAATGAACGCACTGCCGATGG MCE-ICG-1: TGAGGGAGCCCGTGCCTGTA MHP-ICG-1: CATGTTGGGCTTGATCGGGTGC

Proby byly imobilizovány na LiPA proužcích a hybridizovány s amplifikovaným biotynylovaným materiálem odvozeným od represenatativních mykobakteriálních druhů jak je popsáno v příkladu 2. Amplifikace intergenového regionu byla provedena PCR za použití sady primerů jak je popsáno v příkladu 2. Různé kmeny použité pro testování specificity jsou ukázány v tabulce 8 spolu se získanými výsledky hybridizace. Kmeny byly získány z Institute of Tropical Medicine, Antwerp, Belgium.

Testované proby (MSI-ICG1, MXE-ICG-1, MFO-ICG-1, MFO-ICG-2, MML-ICG-1, MML-ICG-1 a MHP-ICG-1) specificky detekovaly M.simiae, M.xenopi, M.fortuitum, M.malmoense, M. celatum a M.haemophilum v příslušném pořadí a nevykazovaly zkříženou hybridizaci s jinými testovanými druhy mykobakterií. Tak umožňují tyto proby specifickou detekci druhů mykobakterií, které nejsou dále identifikovatelné za použití sady DNA prob popsaných v příkladu 2. M. malmoense bylo klasifikováno v příkladu 2 jako "MIC-4" typ, zatímco jiné druhy uvedené výše hybridizovaly pouze na obecné proby MYC1/MYC22 pro rod Mycobacterium, a v příkladu 2 byly tak klasifikovány jako "jiné mykobakteriální druhy". Všechny testované izoláty M. genavense reagovaly s MGV-ICG1 a MGV-ICG2 a nikoliv s MSI-ICG1 projektovanou pro M. simiae, těsně příbuzné s M. genavense. Skupina "intermediálních" organismů, situovaných mezi M. simiae a M. genavense, byla získána z Institute of Tropical Medicine, Antwerp, kde byla klasifikována jako "M. simiae -podobné kmeny (kmeny 4358, 4824, 4833, 4844, 4849, 4857, 4859, 7375, 7379, 7730, 9745, 94-1228). Tyto kmeny reagují pouze s probou MGV-ICG2 a nikoliv s probou MSI-ICG1, která specificky detekuje kmeny M. simiae sensu stricto. Sekvencování 16S-23S rRNA intergenového regionu dvou z těchto "M. simiae-podobných" izolátů (kmeny 7379 a 9745) (viz SEQ ID NO: 161 a 162) potvrdilo, že jsou více příbuzné M. genavense než M. simiae. Nová proba MGV-ICG3 byla projektována pro specifickou detekci této skupiny organismů, které pravděpodobně patří do nového druhu:

MGV-ICG 3 : TCGGGCCGCGTGTTCGTCAAA

Toto znovu ilustruje, že použití DNA prob odvozených od 16S-23S rRNA intergenového regionu může být užitečné v odlišení různých skupin kmenů, které nejsou určitelné podle klasických taxonomických kriterií. Použití těchto DNA prob může pravděpodobně vést k popisu nových (pod)druhů mykobakterií. V tomto případě, MGV-1 proba bude reagovat pouze s kmeny M. 123

·· ····

genavense sensu stricto,, MGV-3 proba bude reagovat pouze s intermediálními "M. simiae - podobnými" kmeny a MGV-2 proba bude detekovat oba typy kmenů.

Proba MUL-ICG-1 reagovala se všemi testovanými kmeny M. ulcerans, ale vykazovala také zkříženou hybridizaci s kmenem M. marinum ITG 7732. Sekvencování intergenového regionu tohoto kmenu M. marinum ukázalo kromě toho identickou sekvenci k sekvenci M. ulcerans kmene 1837 (viz obr. 80). Další rozlišení mezi M. marinum a M. ulcerans může být provedeno za použití proby z 16S-rRNA genu M. ulcerans, jehož část je ko-amplifikována s intergenovým regionem, pokud jsou primery MYC P1-P5 použity pro amplifikaci. Druhově specifická 16S-rRNA proba pro M. ulcerans, která může pracovat za stejných hybridizačních podmínek jako intergenové proby pro odlišení druhů Mycobacterium, je například: TGGCCGGTGCAAAGGGCTG (SEQ ID NO 216) Výše uvedený odstavec ukazuje, že ačkoiv je preferováno použití prob odvozených od intergenového regionu, je také možné, a někdy to je nezbytné, kombinovat intergenové proby s probami odvozenými od jiných genových sekvencí, např. 16S rRNA genu.

Opět, tyto další proby jsou vybrány tak, aby vykazovaly požadované hybridizační charakteristiky za stejných hybridizačních a promývacích podmínek jako intergenové proby.

Pro M. kansasii, další kemn z těch, které jsou uvedeny v příkladu 2, byly testovány proby MKA-ICG-1, 2, 3 a 4 popsané v příkladu 2. protože žádná z těchto prob nebyla plně uspokojivá, byly projektovány další proby pro detekci M. kansasii. Proto, intergenový region některých dalších kmenů M. kansasii ITG 6328, 8698 a 8973 byl sekvencován (viz obr. 90 až 92). Tyto kmeny byly 124 • ♦ ♦·· »· · • · také získány z Institute of Tropical Medicine, Antwerp, Belgium. Zřetelně, kmeny M. kansasii tvoří dosti heterogenní skupinu, ze značnými rozdíly v intergenové sekvenci mezi různými kmeny, byly projektovány další proby MKA-ICG-5, 6, 7, 8, 9 a 10, kde všechny hybridizovaly za stejných podmínek jako byly popsány výše, t.j. 3xSSc, 20% deionizovaný formamid, 50 °C. Proby byly testovány se souborem testovacích kmenů získaných z Institute of Tropical Medicine, Antwerp, Belgium, a výsledky jsou ukázány v tabulce 8. Žádná z prob M. kansasii nehybridizuje s jinými druhy než s M. kansasii, v té míře, jak bylo testováno. Nicméně, vzhledem k heterogenímu charakteru tohoto druhu, žádná z prob pro M. kansasii nehybridizuje se všemi kmeny M. kansasii. Různé m. kansasii proby rozpoznávají různé kmeny M. kansasii. Tato různá hybridizace může mít klinický význam. Na druhé straně, pokud je žádoucí detekce všech kmenů M. kansasii, pak může být použita kombinace různých prob pro M. kansasii. 125 ·· · · · · ···· ·· • · · ·

Tabulka 8: další mykobakteriální proby

126 « *··· ·· · • · • · • · ·** * • • «« ·· • • ♦ • • • ·« · #·* » · • · * • · · · • · ·· · ·· ····

II +1 ο ο τ* 03 ω β «)

rO 03 w £ Ο - β <13 Ό3 Ο > Μ Ο ο3 +J α> W β ω -μ 'ι-Η φ β β > • rH 1| Η-> ·-< Ο Ν β ο α> Ο. Τ3 <13 II > 3 + ω β CD -Ο <13 Μ Ο 03 Μ 03 (0 β 03 β 'Μ '»η

> G * ι—Η »-Η 4-3 ·γΊ ο3 β3 60 «3

<D -rH β β II β I > SUBSTITUTE SHEET ÍRIIIF m 127 « ·♦·· Μ · • # • · • · ··· · ·· ····

128 • · ··· ·· t • · ·# ···· * · 1 1 1 1 1 ( 1 1 1 1 1 1 1 1 4975 9855 94-330 94-379 94-123 778 3071 Ο r- Ζϊ σ\ ο r* rř S r·* o r- co *n oo On On t"* C\ 4484 4485 4986 4304 M. chelonae Μ. celatum Μ. haemophilum M. genavense and M. simíae-like M. simiae M. xenopi M. fortuitum Příklad 8: Brucella

Brucelosa je velmi rozšířená a ekonomiky významná zoonosa, která také postihuje lidi.

Pro identifikaci Brucella spp. jsou používány hlavně bakteriologické a imunologické techniky. Tyto testy jsou časově náročné a často dávají falešně pozitivní výsledky. Jsou vyvíjeny rychlé a spolehlivé identifikační metody, zejména založené na amplifikaci a hybridizaci DNA.

Specifická detekce Brucella spp. založená na amplifikaci 43 kDa zevního membránového proteinu (Feket A. et al., 1990) nebo části 16S rRNA genu (Herman and De Ridder, 1992) byla již popsána.

Pro vývoj specifických DNA prob a primerů pro detekci Brucella spp. jsme analyzovaly 16S-23S rRNA genový intergenový region. Za použití konservovaných primerů (sekvence jsou dané v příkladu 1) byl intergenový region amplifikován a následně klonován do Bluscript SK+ vektoru podle stejného postupu jako v příkladu 1. Získaný ampikon délky okolo 1400 bp byl klonován pro následující druhy Brucella: - Brucella abortus NIDO Tulya biovar 3 (SEQ ID NO: 154) - Brucella mellitensis NIDO biovar 1 (SEQ ID NO: 131) - Brucella suis NIDO biovar 1 (SEQ ID NO: 132)

HindlII trávení konstruktu, následované subklonováním získaných fragmentů (n=3) usnadnilo sekvencování intergenového regionu pro tři popsané Brucella spp. Obr. 56, 57 a 79 representují sekvence intergenových regionů získaných pro výše uvedené kmeny Brucella mellitensis, Brucella suis a Brucella abortus, v příslušném pořadí. Díky vysoké homologii těchto sekvencí intergenového regionu mezi různými druhy Brucella nebyly žádné druhově specifické DNA proby dedukovány z této informace o sekvenci a byly projektovány pouze rodově specifické proby.

Pro tento účel byly chemicky syntetizovány následující proby:

BRU-ICG 1 : CGTGCCGCCTTCGTTTCTCTIT BRU-ICG 2 : TTCGCTTCGGGGTGGATCTGTG BRU-ICG 3 : GCGTAGTAGCGTTTGCGTCGG BRU-ICG 4 : CGCAAGAAGCTTGCTCAAGCC

Oligonukleotidy byly imobilizovány na proužku membrány a po reversní hybridizaci s biotynylovánými PCR fragmenty byly hybridy vizualizovány za použití precipitační reakce. Hybridizační výsledky imobilizovaných prob s různými Brucella spp. a příbuznými organismy jsou uvedeny v tabulce 9.

Tyto hybridizační výsledky ukazují, Že proby BRU-ICG2, BRU-ICG3 a BRU-ICG4 jsou specifické pro Brucella spp. a že mohou být použity v reversním hybridizačním testu pro detekci těchto patogenů. Proba BRU-ICG1 zkříženě hybridizuje s kmeny Ochrobactrum antropi a Rhizobium loti, což jsou dva vysoce taxonomicky příbuzné organismy, ale u kterých není předpokládána přítomnost v materiálu vzorku použitém pro detekci Brucella.

Jak bylo popsáno v předchozích příkladech (např. 3 a 4) byly 131

také Brucella specifické primery vybrány z 16S-23S rRNA intergenového regionu, aby specificky amplifikovaly intergenový region Brucella kmenů. BRU-Pl a BRU-P2 byly použity jako horní primery, zatímco BRU-P3 a BRU-P4 byly použity jako dolní primery. Pokud je použit "nested PCR test", pak je kombinace BRU-P1/BRU-4 zevní sada primerů, zatímco kombinace BRU-P2/BRU-3 je vnitřní sada primerů.

BRU-Pl : TCGAGAATTGGAAAGAGGTC BRU-P2 : AAGAGGTCGGATTTATCCG BRU-P3 : TTCGACTGCAAATGCTCG BRU-P4 : TCTTAAAGCCGCATTATGC 204 205 206 207 132 • · * ·· · » » »··

Tabulka 9 n BRU-ICG 1 BRU-ICG 2 BRU-ICG Brucella abortus 6 + + + Brucella suis 3 + 4* + Brucella melitensis 4 + + + Brucella ovis 2 + + + Brucella canis 2 + + ~u Brucella neotomae 1 + + + Phvllobacteriura rubiacearium 1 - - NT Ochrobactrum anthrooi 8 + - — Amobacterium tumefaciens 2 - - NT Aerobacterium rhizoeenes 1 — - NT MvcoDlana dimoroha 1 - - NT Rhizobium Joti 1 + - - Rhizobium meliloti 1 - - NT Rhizobium leeuminosarum 1 - - NT Bradvrhizobium ianonicum 1 - - NT Brochothrix thermosnhacta 1 - - NT Brochothrix camnestris 1 - - NT Bacillus cereus 3 - - NT Bacillus brevis 2 - - NT Bacillus coaleulans 1 - - NT Bacillus pumilis 1 - - NT Bacillus macerans 1 - - NT Bacillus lentus 1 _ _ NT Bacillus finnus 2 - - NT Bacillus subtílis 2 - - NT Bacillus meeantum 1 - - NT Enterococcus faecalis 1 — — NT Enterococcus faecium 1 - - NT Enterococcus durans 1 - - NT Lactobaciibis lactís 3 . ' - - NT Lactobacillus case'i 1 - - NT Leuconostoc lactís 1 - - NT Escherichia coli 1 - - NT Hafhia halvei 1 - - NT Clostridium tvrobutvricum 1 - - NT Clostridium nerftineens 1 “ — NT Clostridium snoroeenes 1 — — NT Clostridium acetobutvricum 1 - — NT StaDhvlococcus aureus 1 - - NT Salmonella enteritidis 1 — - NT Yersinia enterocolitica 1 - - NT Listeria monocvtoeenes 1 - - NT Listeria ivanovii 1 — — NT Listeria seelieeri 1 - - NT Listeria welshimeri 1 - - NT Listeria innocua 1 - - NT Listeria murravi 1 - - NT Listeria ρβγϊ 1 — NT NT=netestováno n

BRU-ICG 4 + + + + + + NT gggggggggggggggggggggggggggggggggggg.gggi počet testovaných kmenů 133 133 • ···· Μ « • · • · ·«· · ·« ·*·*

Ml ·· Příklad 9: Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus je staphylokokový druh nejčastěji asociovaný s lidskými a zvířecími infekcemi. Kmeny Staphylococcus aureus byly identifikovány jako významná etiologická agens jak kolektivních, tak nosokomiálních infekcí. Nově se infekce methicilin resistentním S. aureus (MRSA) zdá být více prevalentní v mnoha zemích. Kmeny náležející k tomuto druhu jsou také příčinnými agens kaženi potravin a otrav z potravy.

Pro rychlé a specifické odlišení kmenů S. aureus od jiných stafylokoků bylo již v litaratuře popsáno použití molekulárnch technik založených na DNA probách a/nebo PCR. Příklady cílových genů použitých pro vývoj těchto na DNA založených testů jsou 16S rRNA gen (De Buyser et al., 1992; Geha et al., 1994), mecA gen (Ubukata et al., 1992; Shimaoka et al., 1994) a nuc gen (Brakstad et al., 1992; Chesnau et al., 1993).

Jako cíl pro vývoj specifických DNA prob jsme vybrali 16S-23S rRNA genový intergenový region. Amplifikace za použití konzervovaných primerů odvozených od 16S a 23S rRNA genů, sekvence viz příklad 1) ukazují, že získané vzorky nebyly stejné pro všechny testované kmeny S. aureus. Bylo pozorováno mnoho variací buď v počtu získaných fragmentů, nebo ve velikosti těchto fragmentů.

Jeden intergenový region z kmene UZG 5728 a čtyři intergenové regiony (různé délky) z kmenu UZG 6289 byly klonovány do Bluescript SK+ vektoru a následně sekvencovány. Sekvence jsou representovány na obr. 64 až 68 (SEQ ID NO: 139 až SEQ ID NO: 143) . Pro vývoj specifických DNA prob byly tyto iféné intergenové 134 134 ·· ♦··· • ·· ν· ·· · • · • t · • · ·*· · μ ·· ; ; • · * · • · · ··· • · · ··· ··· ·· regiony srovnávány jeden s druhým a s intergenovým regionem odvozeným od Staphylococcus epidermidis kmen UZG CNS141 (SEQ ID NO: 144) .

Byly chemicky syntetizovány následující proby:

STAU-ICG 1 : TACCAAGCAAAACCGAGTGAATAAAGAGTT STAU-ICG 2 : CAGAAGATGCGGAATAACGTGAC STAU-ICG 3 : AACGAAGCCGTATGTGAGCATTTGAC STAU-ICG 4 : GAACGTAACTTCATGTTAACGTTTGACTTAT

Oligonukleotidy byly imobilizovány na proužku membrány a po reversní hybridizaci s biotynylovanými PCR fragmenty byly hybridy vizualizovány za použití kolorimetrické precipitační reakce.

Hybridizační výsledky imobilizovaných prob s různými Staphylococcus spp. a non-stafylokokovými organismy jsou uvedeny v tabulce 10.

Tyto hybridizační výsledky ukazují, že pouze proby STAU-ICG3 a STAU-ICG4 jsou specifické pro kmeny Staphylococcus aureus. Proba STAU-ICG1 reaguje se všemi testovanými Staphylococcus spp. a proba STAU-ICG2 zkříženě hybridizuje s kmenem S. lugdinensis. Ani proba STAU-ICG3, ani proba STAU-ICG4 nedetekuje všechny testované kmeny S. aureus, ale pokud jsou obě proby použity simultáně v LiPA testu, pak všechny testované kmeny S. aureus hybridizují s jednou z těchto prob nebo s oběma. 135 ···· • · · · » · · · · · testované kmeny n STAU-ICG 1 STAU-ICG 2 STAU-ICG 3 STAU-ÍCG 4 lili)

+ + + + ' * 1 l+l I I

I I I I i i i I I + + + + 4—I—1—I—H + +

1 ' I I I I I I I I

CO O CN CO »-< CO 1 .«o 3 3 3 3 8 8 £ a a a a « a .S δ p· i V3 Ν' '*»* N. 3 3 ' 8 o υ £££ §· 8 §* to čo to u o o υ o I 8 o

&3 o o8 JO & o 8 o -2 ^ . to

•a a388 JO •SP 'S..S tf*Q tj &o .5 .a ε a o 3 -a |t 1¾ to o o O tj o o “5* U •a *a & & es *a to ^ Ů3 t: <u O, rs -S Φ *·Ν4 O K* to 8

.to .t, g B g ·£ -2lil cv >a *oiN s SřE ^--o a -2 o '£ S c ti Um*«S ε * -1¾ « fc s s .a « C tj <u o O c«1| íl tu a o δ a —. tu a4 a % a *a **»4 p.3 •Š ^ 8*8 δ S 8 §. ÍP c

<3 § 2 8 ·«8-5 8 ct §> g i? *s O r* tu tu »a 3 * a I tJ Š ta o -S 5r o3 a o δ *§ a-S o ^1¾ ^ S -r 136 136 •· ····

• · · · · ♦ I II · «I Μ · · · • · · · · · · • · · · ······ • · · · · · ···· ······ ·· ·

Odkazy

Asseline U, Delarue M, Lancelot G, Toulme F, Thuong N (1984) Nucleic acid-binding molecules with high affmiíy and base sequence specifícity : intercalating agents covalently linked to oligodeoxynucleotides. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81(11):3297-301.

Barany F (1991). Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase. Proč Nati Acad Sci USA 88: 189-193.

Bej A, Mahbubani M, Miller R, Di Cesare J, Haff L, Atlas R (1990) Mutiplex PCR amplification and immobilized capture probes for detection of bacterial pathogens and indicators in water. Mol Cell Probes 4:353-365. Bóddinghaus B, Rogall T, Flohr T, Blocker H, Bottger E (1990). Detection and Identification of Mycobacteria by amplification of rRNA. Journal of Clinical Microbiology, 28 : 1751-1759.

Brakstad, O.G., K. Aasbakk, and J.A. Maeland. 1992. Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene. J. Clin. Microbiol. 30:1654-1660.

Bubert A, Kóhler S, Goebel W (1992). The homologous and heterologous regions within the iap gene allow genus- and species-specific Identification of Listeria spp. by polymerase chain reaction. Applied and Environmental Microbiology, 58 : 2625-2632.

Buck G, 0’Hara L, Summersgill J (1992). Rapid, sensitive detection of Mycoplasma pneumoniae in simulated clinical specimens by DNA amplification. Journal of Clinical Microbiology, 30 : 3280-3283.

Bukh J, Purcell R, Miller R (1993). At least 12 genotypes ... PNAS 90,8234-8238. Chesneau, O., J. Allignet and N. El Solh. 1993. Thermonuclease gene as a target nucleotide sequence for specific recognition of Staphylococcus aureus. Mol. Cell. Probes. 7:301-310.

Chomczynski P, Sacchi N (1987) Single step methoďof RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162:156-159.

Compton J (1991). Nucleic acid sequence-based amplification. Nátuře, 350: 91-92.

Datta A, Moore M, Wentz B, Lané J (1993). Identification and enumeration of Listeria monocytogenes by nonradioactive DNA probe colony hybridization. Applid and Environmental Microbiology, 59 : 144-149.

De Buyser, M., A. Morvan, S. Aubert, F. Dilasser and N. El Solil. 1992. Evaiuation of a ribosomal RNA gene probe for the Identification of species and subspecies within the genus Staphylococcus. J. Gen. Microbiol. 138:889-899.

Duck P (1990). Probe amplifier systém based on chimeric cycling oligonucleotides. Biotechniques 9, 142-147.

Farber J, Peterkin P (1991). Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen. Microbiological Reviews, 55 : 476-511.

Fekete, A., J.A. Bantle, S.M. Balling and M.R. Sanborn. 1990. Preliminary development of a diagnostic test for Brucella using polymerase chain reaction. J. Appl. Bacteriol. (52:216-227,

Frothingham R, Wilson K (1993). Sequence-based differentiation of strains in the. Mycobacterium avium complex. Journal of Bacteriology, 175.

Frothingham R, Wilson K (1994). Molecular phylogeny of the Mycobacterium avium complex demonstrates clinically meaningful divisions. J Infect Diseases, 169: 305-312.

Geha, D.J., J.R. Uhl, C.A. Gustaferro, and D.H. Persing. 1994. Multiplex PCR for 138 ♦ · • · ·· · ♦ · ♦ • ♦

Identification of methicillin-resistant staphylococci in the clinical laboratory. J. Clin. Microbiol. 32:1768-1772.

Golsteyn Thomas E, King R, Burchak J, Gannon V (1991). Sensitive and specific detection of Listeria monocytogenes in milk and ground beef with the polymerase chain reaction. Applied and Environmental Microbiology, 57 : 2576-2580.

Guatelli J, Whitfield K, Kwoh D, Barringer K, Richman D, Gengeras T (1990) Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proč Nati Acad Sci USA 87: 1874-1878.

Herman L, De Ridder H (1993). Evaluation of a DNA-probe assay for the Identification of Listeria monocytogenes. Milchwissenschaft, 48 : 126-128.

Herman, L. and H. De Ridder. 1992. Identification of Brucella spp. by using the polymerase chain reaction. Appl. Env. Microbiol. 58:2099-2101.

Jacobs K, Rudersdorf R, Neill S, Dougherty J, Brown E, Fritsch E (1988) The thermal stability of oligonucleotide duplexes is sequence independent in tetraalkylammonium salt Solutions: application to identifying recombinant DNA dones. Nucl Acids Res 16:4637-4650.

Jaton K, Sáhli R, Bille J (1992). Development of polymerase chain reaction assays for detection of Listeria monocytogenes in clinical cerebrospinal fluid samples. Journal of Clinical Microbiology, 30 : 1931-1936.

Jonas V, Aidan M, Curry J, Kamisango K, Knott C, Lankford R, Wolfe J, Moore D (1993). Detection and Identification of Mycobacterium tuberculosis directly from sputum sediments by amplification of rRNA. Journal of Clinical Microbiology, 31 : 2410-2416.

Kempsell K et al. (1992). The nucleotide sequence of the promotor, 16S rRNA and spacer region of the ribosomal RNA operon of Mycobacterium tuberculosis and comparison with M. leprae precursor rRNA. Journal of Gen Microbiol, 138: 1717-1727.

Kwoh D, Davis G, Whitfield K, Chappelle H, Dimichele L, Gingeras T (1989). Transcription-based amplification systém and detection of amplified human immunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwich hybridization formát. Proč Nati Acad Sci USA, 86: 1173-1177.

Kwok S, Kellogg D, McKinney N, Spasic D, Goda L, Levenson C, Sinisky J, (1990). Effects of primer-template mismatches on the polymerase Chain reaction: Human immunodeficiency views type 1 model studies. Nucl. Acids Res., 18: 999.

Landgren U, Kaiser R, Sanders J, Hood L (1988). A iigase-mediated gene detection technique. Science 241:1077-1080.

Lizardi P, Guerra C, Lomeli H, Tussie-Luna I, Kramer F (1988) Exponential amplification of recombinant RNA hybridization probes. Bio/Technology 6:1197-1202.

Loeffelholz M, Lewinski C, Silver S, Purohit A, Herman S, Buonagurio D, Dragon E (1992). Detection of Cfúamydia trachomatis in endocervical specimens by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology, 30 : 2847-2851.

Lomeli H, Tyagi S, Printchard C. Lisardi P, Kramer F (1989) Quantitative assays based on the use of replicatable hybridization probes. Clin Chem 35: 1826-1831.

Maniatis T, Fritsch E, Sambrook J (1982) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Matsukura M, Shinozuka K, Zon G, Mitsuya H, Reitz M, Cohen J, Broder S (1987) Phosphorothioate analogs of oligodeoxynucleotides : inhibitors of replication and cytopathic effects of human immunodeficiency virus. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84(21):7706-10.

Mclntosh I, Govan J, BrockD (1992). Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum ffom cystic fibrosis patients by the polymerase chain reaction. Molecular and Cellular Probes, 6 : 299-304. 140 ·♦ · ♦ · · ♦ • · · • ♦ ·♦♦ • · ♦ ·· ··

Miller P, Yano J, Yano E, Carroll C, Jayaram K, Ts’o P (1979) Nonionic nucleic acid analogues. Synthesis and characterization of dideoxyribonucleoside methylphosphonates. Biochemistry 18(23):5134-43.

Nielsen P, Egholm M, Berg R, Buchardt O (1991) Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science 254(5037):1497-500.

Nielsen P, Egholm M, Berg R, Buchardt O (1993) Sequence specific inhibition of DNA restriction enzyme cleavage by PNA. Nucleic-Acids-Res. 21(2):197-200.

Ninet B, Bannerman E, Bille J (1992). Assessment of the accuprobe Listeria monocytogenes culture Identification reagent kit for rapid colony confirmation and its application in various enrichment broths. Applied and Environmental Microbiology, 58 : 4055-4059.

Ogle J, Janda J, Woods D, Vasil M (1987). Characterization and use of a DNA probe as an epidemiological markér for Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Infectious Diseases, 155 : 119.

Ossewaarde J, Rieffe M, Rozenberg-Arska M, Ossenkoppele P, Nawrocki R, Van Loon A (1992). Development and clinical evaluation of a polymerase chain reaction test for detection of Chlamydia trachomatis. Journal of Clinical Microbiology, 30 : 2122-2128.

Rogall T, Wolters J, Flohr T, Bóttger E (1990). Towards a phylogeny and defmition of species at the molecular level within the genus Mvcobactericum. Int. J. Syst. Bacteriol. 40 : 323-330.

Rossau R, Michielsen A, Jannes G, Duhamel M, Kersten K, Van Heuverswyn H. DNA probes for Bordetella species and a colorimetric reverse hybridization assay for the detection of Bordetella pertussis. Mol. Cell. Probes 6 : 281-289, 1992

Saiki R, Gelfand D, Stoffel S, Scharf S, Higuchi R, Hora G, Mullis K, Erlich H (1988). II · »· ♦ 141 • ·· · • · · · · ·

Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239 : 487-491.

Saiki R, Walsh P, Levenson C, Erlich H (1989) Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes (1989) Proč Nati Acad Sci USA 86:6230-6234.

Saito H, Tomioka H, Sáto K, Hiromichi T, Tsukamura M, Kuze F, Asano K (1989). Identification -and partial characterization of Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare by using DNA probes. Journal of Clinical Microbiology, 27 : 994-997.

Samadpour M, Moseley S, Lory S (1988). Biotinylated DNA probes for exotoxin A and pilin genes in the differentiation of Pseudomonas aeruginosa strains. Journal of Clinical Microbiology, 26 : 2319-2323. Sáno T, Smith C, Cantor C (1992) Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Science 258:120-122.

Shimaoka, Μ., M. Yoh, A. Segawa, Y. Takarada, K. Yamamoto and T. Honda. 1994, Development of enzyme-labeled oligonucleotide probe for detection of mech. gene in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 12:1866-1869.

Stuyver L, Rossau R, Wyseur A, Duhamel M, Vanderborght B, Van Heuverswyn H, Maertens G (1993) Typing of hepatitis C virus (HCV) isolates and characterization of new (sub)types using a Line Probe Assay. J Gen Virology, 74: 1093-1102.

Suzuki Y et al. (1988). Complete nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of Mycobacterium bovis BCG. J Bacteriol, 170: 2886-2889.

Taylor-Robinson D, Gilroy C, Thomas B, Keat A (1992). Detection of Chlamydia trachomatis DNA in joints of reactive arthritis patients by polymerase chám reaction. Lancet 340 : 81-82. 142 142 ·· ···· • · ·· ♦ · I · • · · · ♦ • · ♦·· ···

Telenti A, Marchesi F, Balz M, Bally F, Bóttger E, Bodmer T (1993). Rapid Identification of Mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis. Journal of Clinical Microbiology, 31 : 175-178.

Tomioka H, Saito H, Sáto K, Tasaka H, Dawson J (1993). Identification of Mycobacterium avium complex strains belonging to serovars 21-28 by three commercial DNA probe tests. Tubercle and Lung Disease, 74 : 91-95.

Ubukata, K., S. Nakagami, A. Nitta, A. Yamane, S. Kawakami, M. Suguria and M. Konno. 1992. Rapid detection of the mech. gene in methicillin-resistant staphylococci by enzymatic detection of polymerase chain reaction products. J. Clin. Microbiol. 30:1728-1733.

Van der Giessen, J et al (1994). Comparison of the 23S rRNA genes and the spacer region between the 16S and 23S rRNA genes of the dosely related M. avium and M. paratuberculosis and the fast-growing M. phlei. Microbiology, 140: 1103-1108.

Vaneechoutte M, De Beenhouwer H, Claeys G, Verschraegen G, De Rouck A, Paepe N, Elaichouni A, Portaels F (1993). Identification of Mycobacterium species by using amplified ribosomal DNA restriction analysis. Journal of Clinical Microbiology, 31 : 2061-2065.

Van Kuppeveld F, Van Der Logt J, Angulo A, Van Zoest M, Quint W, Niesters H, Galama J, Melchers W (1992). Genus- and species-specific Identification of mycoplasmas by 16S rRNA amplification. Applied and Environmental Microbiology, 58 : 2606-2615.

Walker G, Little M, Nadeau J, Shank D (1992). Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase systém. Proč Nati Acad Sci USA 89:392-396.

Woods G, Young A, Scott J, Blair T, Johnson A (1990). Evaluation of a nonisotopic probe for detection of Chlamydia trachomatis in endocervical specimens. Journal of Clinical Microbiology, 28 : 370-372.

Wu D, Wallace B (1989). The ligation amplification reaction (LAR) - amplification of 143 • « · · •· ··«· • · • ·

specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation. Genomics 4:560-569.

Claims (52)

144 ll/ ····· · · ······ M · ·· ·· · * · • · · · · · ·

n éi. ar o 3c y 1. Způsob pro detekci a identifikaci alespoň jednoho mikroorganismu, nebo pro simultání detekci několika organismů ve vzorku vyznačující se tím, že obsahuje kroky: (i) pokud je to nutné, isolování a/nebo koncentrování polynukleových kyselin z mikroorganismu(ů), které mají být detekovány ve vzorku; (ii) pokud je to nutné, amplifikaci 16S-23S rRNA intergenového regionu, nebo jeho části, z mikroorganismu(ů), který má být detekován, s alespoň jedním vhob dným párem primerů; (iii) hybridizaci polynukleových kyselin podle kroku (i) nebo (ii) se sadou prob obsahující alespoň dvě proby, za stejných hybridizačních a promývacích podmínek, kde uvedené proby jsou vybrány ze sekvencí tabulky la nebo jejich ekvivalentů a/nebo z taxon-specifických prob odvozených od jakýchkoliv intergenových sekvencí representovaných na obr. 1 - 103, kde uvedená taxon-specifická proba je vybrána tak, aby byla schopná hybridizace za stejných hybridizačních a promývacích podmínek jako alespoň jedna z prob podle tabulky la; (iv) detekci hybridů tvořených v kroku (iii); (v) identifikaci mikroorganismu(ů) přítomných ve vzorku z různých hybridizačních signálů získaných v kroku (iv).

2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený vzorek pochází z respiračního traktu a tím, že uvedená 145 ·· ···· ··· ♦ · sada prob jak je definována v kroku (iii) obsahuje alespoň jednu probu vybranou z následujících intergenových prob: MYC-ICG-1 : ACTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTA (SEQ ID NO 1) MYC-ICG-22 : CTTCTGAATAGTGGTTGCGAGCATCT (SEQ ID NO 2) MTB-ICG-1 : GGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCA (SEQ ID NO 3) MTB-ICG-2 : GACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCAC (SEQ ID NO 4) MTB-ICG-3 : CGGCTAGCGGTGGCGTGTTCT (SEQ ID NO 5) MAI-ICG-1 : CAACAGCAAATGATTGCCAGACACAC (SEQ ID NO 6) MIL-ICG-11 : GAGGGGTTCCCGTCTGTAGTG (SEQ ID NO 7) MIL-ICG-22 : TGAGGGGTTCTCGTCTGTAGTG (SEQ ID NO 8) MAC-ICG-1 : CACTCGGTCGATCCGTGTGGA (SEQ ID NO 9) MAV-ICG-1 : TCGGTCCGTCCGTGTGGAGTC (SEQ ID NO 10) • ···♦ ♦ · ·· ♦ ·♦ ·ι ·· 146 J ♦ ·♦ ♦· · ♦ • ♦ ♦ « · * · ♦ ·♦··· • ·· · • ♦ · ♦ * ··· ··· ♦♦ MAV-ICG-22 : GTGGCCGGCGTTCATCGAAA (SEQ ID NO 11) MIN-ICG-1 : GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT (SEQ ID NO 12) MIN-ICG-2 : GCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTA (SEQ ID NO 13) MIN-ICG-22 CTGATGCGTTCGTCGAAATGTGT (SEQ ID NO 14) MIN-ICG-222 : TGATGCGTTCGTCGAAATGTGT (SEQ ID NO 15) MIN-ICG-2222 : GGCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTAA (SEQ ID NO 16) MAL-ICG-1 : ACTAGATGAACGCGTAGTCCTTGT (SEQ ID NO 17) MHEF-ICG-1 : TGGACGAAAACCGGGTGCACAA (SEQ ID NO 18) MAH-ICG-1 : GTGTAATTTCTTTTTTAACTCTTGTGTGTAAGTAAGTG (SEQ ID NO 19) MCO-ICG-11 : TGGCCGGCGTGTTCATCGAAA (SEQ ID NO 20) MTH-ICG-11 : GCACTTCAATTGGTGAAGTGCGAGCC (SEQ ID NO 21) MTH-ICG-2 : GCGTGGTCTTCATGGCCGG (SEQ ID NO 22) MEF-ICG-11 : ACGCGTGGTCCTTCGTGG (SEQ ID NO 23) MSG-ICG-1 : TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGTC (SEQ ID NO 24) MKA-ICG-1 : GATGCGTTTGCTACGGGTAGCGT (SEQ ID NO 25) MKA-ICG-2 : GATGCGTTGCCTACGGGTAGCGT (SEQ ID NO 26) MKA-ICG-3 ATGCGTTGCCCTACGGGTAGCGT (SEQ ID NO 27) MKA-ICG-4 CGGGCTCTGTTCGAGAGTTGTC (SEQ ID NO 28) MKA-íCG-5 CCCTCAGGGATTTTCTGGGTGTTG (SEQ ID NO 182) MKA-ICG-6 GGACTCGTCCAAGAGTGTTGTCC (SEQ ID NO 183) MKA-ICG-7 TCGGGCTTGGCCAGAGCTGTT (SEQ ID NO 184) MKA-ICG-8 GGGTGCGCAACAGCAAGCGA (SEQ ID NO 185) MKA-ICG-9 GATGCGTTGCCCCTACGGG (SEQ ID NO 186) MKA-ICG-10 : CCCTACGGGTAGCGTGTTCTTTTG (SEQ ID NO 187) MCH-ICG-1 GGTGTGGACTTTGACTTCTGAATAG (SEQ ID NO 29) MCH-ICG-2 CGGCAAAACGTCGGACTGTCA (SEQ ID NO 30) MCH-ICG-3 GGTGTGGTCCTTGACTTATGGATAG (SEQ ID NO 210) MGO-ICG-1 AACACCCTCGGGTGCTGTCC (SEQ ID NO 31) MGO-ICG-2 GTATGCGTTGTCGTTCGCGGC (SEQ ID NO 32) MGO-ICG-5 CGTGAGGGGTCATCGTCTGTAG (SEQ ID NO 33) MUL-ICG-1 GGTTTCGGGATGTTGTCCCACC (SEQ ID NO 175) ·♦ ···« 147 ·♦ ···« 147 MGV-ICG-1 MGV-ICG-2 MGV-ICG-3 MXE-ICG-1 : MSI-ICG-1 : MFO-ICG-1 : MFO-ICG-2 : MML-ICG-1 MML-ICG-2 MCE-ICG-1 : MHP-ICG-1 : PA-ICG 1 PA-ICG 2 PA-ICG 3 PA-ICG 4 PA-ICG 5 : MPN-ICG 1 MPN-ICG 2 MGE-ICG 1 (SEQ ID NO 176) (SEQ ID NO 177) (SEQ ID NO 211) (SEQ ID NO 178) (SEQ ID NO 179) (SEQ ID NO 180) (SEQ ID NO 181) (SEQ ID NO 188) (SEQ ID NO 189) (SEQ ID NO 190) (SEQ ID NO 191) (SEQ ID NO 34) (SEQ ID NO 35) (SEQ ID NO 36) CGACTGAGGTCGACGTGGTGT GGTGTTTGAGCATTGAATAGTGGTTGC TCGGGCCGCGTGTTCGTCAAA GTTGGGCAGCAGGCAGTAACC CCGGCAACGGTTACGTGTTC TCGTTGGATGGCCTCGCACCT ACTTGGCGTGGGATGCGGGAA CGGATCGATTGAGTGCTTGTCCC TCTAAATGAACGCACTGCCGATGG TGAGGGAGCCCGTGCCTGTA CATGTTGGGCTTGATCGGGTGC TGGTGTGCTGCGTGATCCGAT TGAATGTTCGTGGATGAACATTGATT CACTGGTGATCATTCAAGTCAAG TGAATGTTCGT(G/A)(G/A)ATGAACATTGAnTCTGGTC (SEQ ID NO 37) (SEQ ID NO 38) (SEQ ID NO 49) (SEQ ID NO 50) (SEQ ID NO 51) CTCTTTCACTGGTGATCATTCAAGTCAAG ATCGGTGGTAAATTAAACCCAAATCCCTGT CAGTTCTGAAAGAACATTTCCGCTTCTTTC CACCCATTAATTTTTTCGGTGTTAAAACCC Mycoplasma-ICG : CAAAACTGAAAACGACAATCTTTCTAGTTCC (SEQ ID NO 52) (SEQ ID NO 53) (SEQ ID NO 54) (SEQ ID NO 55) (SEQ ID NO 56) (SEQ ID NO 57) (SEQ ID NO 58) (SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4) STAU-ICG 1 : TACCAAGCAAAACCGAGTGAATAAAGAGTT STAU-ICG 2 : CAGAAGATGCGGAATAACGTGAC STAU-ICG 3 : AACGAAGCCGTATGTGAGCATTTGAC STAU-ICG 4 : GAACGTAACTTCATGTTAACGTTTGACTTAT ACI-ICG 1 : GCTTAAGTGCACAGTGCTCTAAACTGA ACI-ICG 2 : CACGGTAATTAGTGTGATCTGACGAAG a lépe z následujících intergenových prob MYC-ICG-1 : ACTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTA MYC-ICG-22 : CTTCTGAATAGTGGTTGCGAGCATCT MTB-ICG-1 : GGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCA MTB-ICG-2 : GACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCAC 148 • ·♦·· ·· · • « • «· *«·· ♦ · · « · • · · · • · *«· « • * · M % MTB-ICG-3 : MAI-ICG-1 : MIL-ICG-11 : MIL-ICG-22 : MAG-ICG-1 : MAV-ICG-1 : MAV-ICG-22 : MIN-ICG-1 : MAL-ICG-1 : MCO-ICG-11 : MTH-ICG-11 : MTH-ICG-2 : MEF-ICG-11 : MSC-ICG-1 : MKA-ICG-3 : MKA-ICG-4 : MKA-ICG-5 : MKA-ICG-6 : MKA-ICG-7 : -MKA-ICG-8 : MKA-ICG-9 : MKA-ICG-10 : MCH-ICG-1 : MCH-ICG-2 : MCH-ICG-3 : MGO-ICG-5 : MUL-ICG-1 : MGV-ICG-1 : MGV-ICG-2 : MGV-ICG-3 : MXE-ICG-1 : MSI-ICG-1 : CGGCTAGCGGTGGCGTGTTCT CAACAGCAAATGATTGCCAGACACAC GAGGGGTTCCCGTCTGTAGTG TGAGGGGTTCTCGTCTGTAGTG CACTCGGTCGATCCGTGTGGA TCGGTCCGTCCGTGTGGAGTC GTGGCCGGCGTTCATCGAAA GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT ACTAGATGAACGCGTAGTCCTTGT TGGCCGGCGTGTTCATCGAAA GCACTTCAATTGGTGAAGTGCGAGCC GCGTGGTCTTCATGGCCGG ACGCGTGGTCCTTCGTGG TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGTC ATGCGTTGCCCTACGGGTAGCGT CGGGCTCTGTTCGAGAGTTGTC CCCTCAGGGATTTTCTGGGTGTTG GGACTCGTCCAAGAGTGTTGTCC TCGGGCTTGGCCAGAGCTGTT GGGTGCGCAACAGCAAGCGA GATGCGTTGCCCCTACGGG CCCTACGGGTAGCGŤGTTCTTTTG GGTGTGGACTTTGACTTCTGAATAG CGGCAAAACGTCGGACTGTCA GGTGTGGTCCTTGACTTATGGATAG CGTGAGGGGTCATCGTCTGTAG GGTTTCGGGATGTTGTCCCACC CGACTGAGGTCGACGTGGTGT GGTGTTTGAGCATTGAATAGTGGTTGC TCGGGCCGCGTGTTCGTCAAA GTTGGGCAGCAGGCAGTAACC CCGGCAACGGTTACGTGTTC (SEQ ID NO 5) (SEQ ID NO 6) (SEQ ID NO 7) (SEQ ID NO 8) (SEQ ID NO 9) (SEQ ID NO 10) (SEQ ID NO 11) (SEQ ID NO 12) (SEQ ID NO 17) (SEQ ID NO 20) (SEQ ID NO 21) (SEQ ID NO 22) (SEQ ID NO 23) (SEQ ID NO 24) (SEQ ID NO 27) (SEQ ID NO 28) (SEQ ID NO 182) (SEQ ID NO 183) (SEQ ID NO 184) (SEQ ID NO 185) (SEQ ID NO 186) (SEQ ID NO 187) (SEQ ID NO 29) (SEQ ID NO 30) (SEQ ID NO 210) (SEQ ID NO 33) (SEQ ID NO 175) (SEQ ID NO 176) (SEQ ID NO 177) (SEQ ID NO 211) (SEQ ID NO 178) (SEQ ID NO 179) 149 • ··*· «· · ··« ·· *··· I # · • · · • ♦*· » ·# • · MFO-ICG-1 : MFO-ICG-2 : MML-ICG-1 : MML-ICG-2 : MCE-ICG-1 : MHP-ICG-1 : TCGTTGGATGGCCTCGCACCT ACTTGGCGTGGGATGCGGGAA CGGATCGATTGAGTGCTTGTCCC TCTAAATGAACGCACTGCCGATGG TGAGGGAGCCCGTGCCTGTA CATGTTGGGCTTGATCGGGTGC (SEQ ID NO 180) (SEQ ID NO 181) (SEQ ID NO 188) (SEQ ID NO 189) (SEQ ID NO 190) (SEQ ID NO 191) PA-ICG 1 : PA-ICG 4 : PA-ICG 5 : MPN-ICG 1 MPN-ICG 2 MGE-ICG 1 TGGTGTGCTGCGTGATCCGAT (SEQ ID NO 34) TGAATGTTCGT(G/A)(G/A)ATGAACATTGATTTCTGGTC (SEQ ID NO 37) CTCTTTCACTGGTGATCATTCAAGTCAAG ATCGGTGGTAAATTAAACCCAAATCCCTGT CAGTTCTGAAAGAACATTTCCGCTTCTTTC CACCC ATTAATTTTTTCGGTGTT AAAACCC (SEQ ID NO 38) (SEQ ID NO 49) (SEQ ID NO 50) (SEQ ID NO 51) Mycoplasma-ICG : CAAAACTGAAAACGACAATCTTTCTAGTTCC (SEQ ID NO 52) (SEQ ID NO 53) (SEQ ID NO 54) (SEQ ID NO 55) (SEQ ID NO 56) (SEQ ID NO 57) (SEQ ID NO 58) STAU-ICG 1 : TACCAAGCAAAACCGAGTGAATAAAGAGTT STAU-ICG 2 : CAGAAGATGCGGAATAACGTGAC STAU-ICG 3 : AACGAAGCCGTATGTGAGCATTTGAC STAU-ICG 4 : GAACGTAACTTCATGTTAACGTTTGACTTAT ACI-ICG 1 : GCTTAAGTGCACAGTGCTCTAAACTGA ACI-ICG 2 : CACGGTAATTAGTGTGATCTGACGAAG nebo ekvivalenty uvedených prob, a/nebo kde sada prob obsahuje alespoň jednu taxon specifickou probu odvozenou od sekvence intergenového regionu korespondující jednomu mikroorganismu, který má být detekován v uvedeném vzorku, kde uvedená sekvence intergenového regionu je vybrána z jakékoliv ze sekvencí jak jsou representovány SEQ ID NO: 76 až 106, 157 až 174, 124, 125, 111 až 115, 139 až 144 nebo 126 až 130, a s tím, že uvedené proby nebo ekvivalenty prob jsou pokud možno použity v kombinaci s jakoukoliv probou detekující alespoň jeden z následujících 150 • · · · · • · · · · · 150 • · · · · • · · · · · • · • ··· ·· · · • · • · · • · ··· · · organismů: Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis nebo Bordetella pertussis.

3. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený vzorek pochází z mozkomíšního moku a kde uvedená sada prob jak je definována v kroku (iii) obsahuje alespoň jednu probu (SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4) (SEQ ID NO 5) (SEQ ID NO 39) vybranou z následujících intergenových prob: MYC-ICG-1 : ACTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTA MYC-ICG-22 : CTTCTGAATAGTGGTTGCGAGCATCT MTB-ICG-1 : GGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCA MTB-ICG-2 : GACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCAC MTB-ICG-3 : CGGCTAGCGGTGGCGTGTTCT LIS-ICG 1 : CAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATC LMO-ICG 1 : AAACAACCTTTACTTCGTAGAAGTAAATTGGTTAAG (SEQ ID NO 40) (SEQ ID NO 41) (SEQ ID NO 42) (SEQ ID NO 212) LMO-ICG 2 : TGAGAGGTTAGTACTTCTCAGTATGTTTGTTC LMO-ICG 3 : AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC LISP-ICG 1: CGTTTTCATAAGCGATCGCACGTT a preferovaně z následujících intergenových prob: (SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4) (SEQ ID NO 5) (SEQ ID NO 39) (SEQ ID NO 42) (SEQ ID NO 212) MYC-ICG-1 : ACTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTA MYC-ICG-22 : CTTCTGAATAGTGGTTGCGAGCATCT MTB-ICG-1 : GGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCA MTB-ICG-2: GACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCAC MTB-ICG-3 : CGGCTAGCGGTGGCGTGTTCT LIS-ICG 1 : CAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATC LMO-ICG 3 : AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC LISP-ICG 1: CGTnTCATAAGCGATCGCACGTT I 151 ·· ···· 151 ·· ····

··♦ nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo kde sada prob obsahuje alespoň jednu taxon specifickou probu odvozenou od sekvence intergenového regionu korespondující jednomu mikroorganismu, který má být detekován v uvedeném vzorku, kde uvedená sekvence intergenového regionu je vybrána z jakékoliv ze sekvencí jak jsou representovány SEQ ID NO: 116, 118 - 121 nebo 213 - 215, a s tím, že uvedené proby nebo ekvivalenty prob jsou pokud možno použity v kombinaci s jakoukoliv probou detekující alespoň jeden z následujících organismů: Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae nebo Streptococcus pneumoniae.

4. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený vzorek pochází urogenitálního traktu a kde uvedená sada prob jak je definována v kroku (iii) obsahuje alespoň jednu probu vybranou z následujících intergenových prob: CHTR-ICG 1 : GGAAGAAGCCTGAGAAGGTTTCTGAC (SEQ ID NO 45) CHTR-ICG 2 : GCATTTATATGTAAGAGCAAGCATTCTATTTCA (SEQ ID NO 46) CHTR-ICG 3 : GAGTAGCGTGGTGAGGACGAGA (SEQ ID NO 47) CHTR-ICG 4 : GAGTAGCGCGGTGAGGACGAGA (SEQ ID NO 201) CHPS-ICG 1 : GGATAACTGTCTTAGGACGGTTTGAC (SEQ ID NO 48) MGE-ICG 1 : CACCCATTAATTTTTTCGGTGTTAAAACCC (SEQ ID NO 51) Mycoplasma-ICG : CAAAACTGAAAACGACAATCTTTCTAGTTCC (SEQ ID NO 52) nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo kde sada prob obsahuje alespoň jednu taxon specifickou probu odvozenou od sekvence intergenového regionu korespondující jednomu mikroorganismu, 152 152

• ···· ·· · ···# #··· který má být detekován v uvedeném vzorku, kde uvedená sekvence intergenového regionu je vybrána z jakékoliv ze sekvencí jak jsou representovány SEQ ID NO: 122, 123, 197, 124 nebo 125, a s tím, že uvedené proby nebo ekvivalenty prob jsou pokud možno použity v kombinaci s jakoukoliv probou detekující alespoň jeden z následujících organismů: Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus ducreyi nebo Streptococcus agalactiae.

5. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený vzorek pochází z potravy a kde uvedená sada prob jak je definována v kroku (iii) obsahuje alespoň jednu probu vybranou z následujících intergenových prob: LIS-ICG 1 : CAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATC (SEQ ID NO 39) LMO-ICG 1 : AAACAACCTTTACTTCGTAGAAGTAAATTGGTTAAG (SEQ ID NO 40) LMO-ICG 2 : TGAGAGGTTAGTACTTCTCAGTATGTTTGTTC (SEQ ID NO 41) LMO-ICG 3 : AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC (SEQ ID NO 42) LIV-ICG 1 : GTTAGCATAAATAGGTAACTATTTATGACACAAGTAAC (SEQ ID NO 43) LSE-ICG 1 :AGTTAGCATAAGTAGTGTAACTATTTATGACACAAG (SEQ ID NO 44) LISP-ICG 1: CGTTTTCATAAGCGÁTCGCACGTT (SEQ ID NO 212) (SEQ ID NO 54) (SEQ ID NO 55) (SEQ ID NO 56) (SEQ ID NO 59) (SEQ ID NO 60) (SEQ ID NO 193) (SEQ ID NO 194) (SEQ ID NO 61) (SEQ ID NO 62) STAU-ICG 1 : TACCAAGCAAAACCGAGTGAATAAAGAGTT (SEQ ID NO 53) STAU-ICG 2 : CAGAAGATGCGGAATAACGTGAC STAU-ICG 3 : AACGAAGCCGTATGTGAGCATTTGAC STAU-ICG 4 : GAACGTAACTTCATGTTAACGTTTGACTTAT BRU-ICG 1 : CGTGCCGCCTTCGTTTCTCTTT BRU-ICG 2 : TTCGCTTCGGGGTGGATCTGTG BRU-ICG 3 : GCGTAGTAGCGTTTGCGTCGG BRU-ICG 4 : CGCAAGAAGCTTGCTCAAGCC SALM-ICG 1 : CAAAACTGACTTACGAGTCACGTTTGAG SALM-ICG 2 : GATGTATGCTTCGTTATTCCACGCC • · 153 • t ··· STY-ICG 1 : SED-ICG 1 : YEC-ICG 1 : YEC-ICG 2 : YEC-ICG 3 : LIS-ICG 1 : LMO-ICG 3 : LISP-ICG 1: STAU-ICG 1 : STAU-ICG 2 : STAU-ICG 3 : STAU-ICG 4 : BRU-ICG 2 : BRU-ICG 3 : BRU-ICG 4 : SALM-ICG 1 : YEC-ICG I : YEC-ICG 2 : YEC-ICG 3 : (SEQ ID NO 63) (SEQ ID NO 64) (SEQ ID NO 198) (SEQ ID NO 199) (SEQ ID NO 200) (SEQ ID NO 39) (SEQ ID NO 42) (SEQ ID NO 212) (SEQ ID NO 53) (SEQ ID NO 54) (SEQ ID NO 55) (SEQ ID NO 56) (SEQ ID NO 60) (SEQ ID NO 193) (SEQ ID NO 194) (SEQ ID NO 61) (SEQ ID NO 198) (SEQ ID NO 199) (SEQ ID NO 200) GGTCAAACCTCCAGGGACGCC GCGGTAATGTGTGAAAGCGTTGCC GGAAAAGGTACTGCACGTGACTG GACAGCTGAAACTTATCCCTCCG GCTACCTGTTGATGTAATGAGTCAC a preferovaně z následujících intergenových prob: CAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATC AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC CGTTTTCATAAGCGATCGCACGTT TACCAAGCAAAACCGAGTGAATAAAGAGTT CAGAAGATGCGGAATAACGTGAC AACGAAGCCGTATGTGAGCATTTGAC GAACGTAACTTCATGTTAACGTTTGACTTAT TTCGCTTCGGGGTGGATCTGTG GCGTAGTAGCGTTTGCGTCGG CGCAAGAAGCTTGCTCAAGCC CAAAACTGACTTACGAGTCACGTTTGAG GGAAAAGGTACTGCACGTGACTG GACAGCTGAAACTTATCCCTCCG GCTACCTGTTGATGTAATGAGTCAC nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo kde sada prob obsahuje alespoň jednu taxon specifickou probu odvozenou od sekvence intergenového regionu korespondující jednomu mikroorganismu, který má být detekován v uvedeném vzorku, kde uvedená sekvence intergenového regionu je vybrána z jakékoliv ze sekvencí jak jsou 154 • · · · ·· ···· ·· · • · • · · • · · · · · representovány SEQ ID NO: 116, 118 - 121, 213 - 215, 139 - 144, 131, 132, 154, 133 - 138, 195 nebo 196, a s tím, že uvedené proby nebo ekvivalenty prob jsou pokud možno použity v kombinaci s jakoukoliv probou detekující kmeny druhu Campylobacter.

6. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený vzorek pochází z gastrointestinálního traktu pacienta a kde uvedená sada prob jak je definována v kroku (iii) obsahuje alespoň jednu probu vybranou z následujících intergenových prob: SALM-ICG 1 SALM-ICG 2 STY-ICG 1 : SED-ICG 1 : YEC-ICG 1 : YEC-ICG 2 : YEC-ICG 3 : CAAAACTGACTTACGAGTCACGTTTGAG GATGTATGCTTCGTTATTCCACGCC GGTCAAACCTCCAGGGACGCC GCGGTAATGTGTGAAAGCGTTGCC GGAAAAGGTACTGCACGTGACTG GACAGCTGAAACTTATCCCTCCG GCTACCTGTTGATGTAATGAGTCAC (SEQ ID NO 61) (SEQ ID NO 62) (SEQ ID NO 63) (SEQ ID NO 64) (SEQ ID NO 198) (SEQ ID NO 199) (SEQ ID NO 200) a preferovaně z následuj ících intergenových prob: SALM-ICG 1 YEC-ICG 1 : YEC-ICG 2 : -YEC-ICG 3 : CAAAACTGACTTACGAGTCACGTTTGAG GGAAAAGGTACTGCACGTGACTG GACAGCTGAAACTTATCCCTCCG GCTACCTGTTGATGTAATGAGTCAC (SEQ ID NO 61) (SEQ ID NO 198) (SEQ ID NO 199) (SEQ ID NO 200) nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo kde sada prob obsahuje 155 ·· ·

alespoň jednu taxon specifickou probu odvozenou od sekvence intergenového regionu korespondující jednomu mikroorganismu, který má být detekován v uvedeném vzorku, kde uvedená sekvence intergenového regionu je vybrána z jakékoliv ze sekvencí jak jsou representovány SEQ ID NO: 133 - 138 nebo 195 - 196, a s tím, že uvedené proby nebo ekvivalenty prob jsou pokud možno použity v kombinaci s jakoukoliv probou detekující druh Campylobacter.

7. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů druhu a podruhů Mycobacterium ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4) (SEQ ID NO 5) (SEQ ID NO 6) (SEQ ID NO 7) (SEQ ID NO 8) (SEQ ID NO 9) (SEQ ID NO 10) (SEQ ID NO 11) (SEQ ID NO 12) (SEQ ID NO 13) (SEQ ID NO . 14) (SEQ ID NO 15) (SEQ ID NO 16) (SEQ ID NO 17) (SEQ ID NO 18) MYC-ICG-1 : ACTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTA MYC-ICG-22 : CTTCTGAATAGTGGTTGCGAGCATCT MTB-ICG-1 : GGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCA MTB-ICG-2 : GACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCAC MTB-ICG-3 : CGGCTAGCGGTGGCGTGTTCT MAI-ICG-1 : CAACAGCAAATGATTGCCAGACACAC MIL-ICG-11 : GAGGGGTTCCCGTCTGTAGTG MIL-ICG-22 : TGAGGGGTTCTCGTCTGTAGTG MAC-ICG-1 : CACTCGGTCGATCCGTGTGGA MAV-ICG-1 : TCGGTCCGTCCGTGTGGAGTC MAV-ICG-22 : GTGGCCGGCGTTCATCGAAA MIN-ICG-1 : GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT MIN-ICG-2: GCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTA MIN-ICG-22 : CTGATGCGTTCGTCGAAATGTGT MIN-ICG-222 : TGATGCGTTCGTCGAAATGTGT MIN-ICG-2222 : GGCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTAA MAL-ICG-1 : ACTAGATGAACGCGTAGTCCTTGT MHEF-ICG-1 : TGGACGAAAACCGGGTGCACAA MAH-ICG-1 :

(SEQ ID NO 19) ·· ···· ···· 156 • · · · · • · · · ··· · ··· ·· MCO-ICG-11 : TGGCCGGCGTGTTCATCGAAA (SEQ ID NO 20) MTH-ICG-11 : GCACTTCAATTGGTGAAGTGCGAGCC (SEQ ID NO 21) MTH-ICG-2 : GCGTGGTCTTCATGGCCGG (SEQ ID NO 22) MEF-ICG-11 : ACGCGTGGTCCTTCGTGG (SEQ ID NO 23) MSC-ICG-1 : TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGTC (SEQ ID NO 24) MKA-ICG-1 : GATGCGTTTGCTACGGGTAGCGT (SEQ ID NO 25) MKA-ICG-2 : GATGCGTTGCCTACGGGTAGCGT (SEQ ID NO 26) MKA-ICG-3 : ATGCGTTGCCCTACGGGTAGCGT (SEQ ID NO 27) MKA-ICG-4 : CGGGCTCTGTTCGAGAGTTGTC (SEQ ID NO 28) MKA-ICG-5 : CCCTCAGGGATTTTCTGGGTGTTG (SEQ ID NO 182) MKA-ICG-6 : GGACTCGTCCAAGAGTGTTGTCC (SEQ ID NO 183) MKA-ICG-7 : TCGGGCTTGGCCAGAGCTGTT (SEQ ID NO 184) MKA-ICG-8 : GGGTGCGCAACAGCAAGCGA (SEQ ID NO 185) MKA-ICG-9 : GATGCGTTGCCCCTACGGG (SEQ ID NO 186) MKA-ICG-10 : CCCTACGGGTAGCGTGTTCTTTTG (SEQ ID NO 187) MCH-ICG-1 : GGTGTGGACTTTGACTTCTGAATAG (SEQ ID NO 29) MCH-ICG-2 : CGGCAAAACGTCGGACTGTCA (SEQ ID NO 30) MGO-ICG-1 : AACACCCTCGGGTGCTGTCC (SEQ ID NO 31) MGO-ICG-2 : GTATGCGTTGTCGTTCGCGGC (SEQ ID NO 32) MGO-ICG-5 : CGTGAGGGGTCATCGTCTGTAG (SEQ ID NO 33) MUL-ICG-1 : GGTTTCGGGATGTTGTCCCACC (SEQ ID NO 175) MGV-ICG-1 : CGACTGAGGTCGACGTGGTGT (SEQ ID NO 176) MGV-ICG-2 : GGTGTTTGAGCATTGAATAGTGGTTGC (SEQ ID NO 177) MXE-ICG-1 : GTTGGGCAGCAGGCAGTAACC (SEQ ID NO 178) MSI-ICG-1 : CCGGCAACGGTTACGTGTTC (SEQ ID NO 179) MFO-ICG-1 : TCGTTGGATGGCCTCGCACCT (SEQ ID NO 180) MFO-ICG-2 : ACTTGGCGTGGGATGCGGGAA (SEQ ID NO 181) MML-ICG-1 : CGGATCGATTGAGTGCTTGTCCC (SEQ ID NO 188) MML-ICG-2 : TCTAAATGAACGCACTGCCGATGG (SEQ ID NO 189) MCE-ICG-1 : TGAGGGAGCCCGTGCCTGTA (SEQ ID NO 190) MHP-ICG-1 : CATGTTGGGCTTGATCGGGTGC (SEQ ID NO 191) 157 ·· »9« • ·♦·· ·« · • ♦ • · ·· · · ♦ · • · ··· • · • · ·· a lépe na alespoň jednu probu z následující omezené skupiny intergenových prob: (SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4) (SEQ ID NO 5) (SEQ ID NO 6) (SEQ ID NO 7) (SEQ ID NO S) (SEQ ID NO 9) (SEQ ID NO 10) (SEQ ID NO 11) (SEQ ID NO 12) (SEQ ID NO 17) (SEQ ID NO 20) (SEQ ID NO 21) (SEQ ID NO 22) (SEQ ID NO 23) (SEQ ID NO 24) (SEQ ID NO 27) (SEQ ID NO 28) (SEQ ID NO 182) (SEQ ID NO 183) (SEQ ID NO 184) (SEQ ID NO 185) (SEQ ID NO 186) (SEQ ID NO 187) (SEQ ID NO 29) (SEQ ID NO 30) (SEQ ID NO 210) (SEQ ID NO 33) MYC-ICG-1 : ACTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTA MYC-ICG-22 : CTTCTGAATAGTGGTTGCGAGCATCT MTB-ÍCG-1 : GGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCA MTB-ICG-2: GACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCAC MTB-ICG-3 : CGGCTAGCGGTGGCGTGTTCT MAI-ICG-1 : CAACAGCAAATGATTGCCAGACACAC MIL-ICG-11 : GAGGGGTTCCCGTCTGTAGTG MIL-ICG-22 : TGAGGGGTTCTCGTCTGTAGTG MAC-ICG-1 : CACTCGGTCGATCCGTGTGGA MAV-ICG-1 : TCGGTCCGTCCGTGTGGAGTC MAV-ICG-22 : GTGGCCGGCGTTCATCGAAA MIN-ICG-1 : GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT MAL-ICG-1 : ACTAGATGAACGCGTAGTCCTTGT MCO-ICG-11 : MTH-ICG-11 : MTH-ICG-2 : MEF-ICG-11 : MSC-ICG-1 : MKA-ICG-3 : MKA-ICG-4 : MKA-ICG-5 : MKA-ICG-6 : MKA-ICG-7 : MKA-ICG-8 : MKA-ICG-9 : MKA-ICG-10 : MCH-ICG-1 : MCH-ICG-2 : MCH-ICG-3 : MGO-ICG-5 : TGGCCGGCGTGTTCATCGAAA GCACTTCAATTGGTGAAGTGCGAGCC GCGTGGTCTTCATGGCCGG ACGCGTGGTCCTTCGTGG TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGTC ATGCGTTGCCCTACGGGTAGCGT CGGGCTCTGTTCGAGAGTTGTC CCCTCAGGGATTTTCTGGGTGTTG GGACTGGTCCAAGAGTGTTGTCC TCGGGCTTGGCCAGAGCTGTT GGGTGCGCAACAGCAAGCGA GATGCGTTGCCCCTACGGG CCCTACGGGTAGCGTGTTCTTTTG GGTGTGGACTTTGACTTCTGAATAG CGGCAAAACGTCGGACTGTCA GGTGTGGTCCTTGACTTATGGATAG CGTGAGGGGTCATCGTCTGTAG MUL-ICG-1 : GGTTTCGGGATGTTGTCCCACC (SEQ ID NO 175) MGV-ICG-1 : CGACTGAGGTCGACGTGGTGT (SEQ ID NO 176) MGV-ICG-2 : GGTGTTTGAGCATTGAATAGTGGTTGC (SEQ ID NO 177) MGV-ICG-3 : TCGGGCCGCGTGTTCGTCAAA (SEQ ID NO 211) MXE-ICG-1 : GTTGGGCAGCAGGCAGTAACC (SEQ ID NO 178) MSI-ICG-1 : CCGGCAACGGTTACGTGTTC (SEQ ID NO 179) MFO-ICG-1 : TCGTTGGATGGCCTCGCACCT (SEQ ID NO 180) MFO-ICG-2 : ACTTGGCGTGGGATGCGGGAA (SEQ ID NO 181) MML-ICG-1 : CGGATCGATTGAGTGCTTGTCCC (SEQ ID NO 188) MML-ICG-2 : TCTAAATGAACGCACTGCCGATGG (SEQ ID NO 189) MCE-ICG-1 : TGAGGGAGCCCGTGCCTGTA (SEQ ID NO 190) MHP-ICG-1 : CATGTTGGGCTTGATCGGGTGC i* (SEQ ID NO 191) nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 76 - 110 nebo 157 - 174, kde uvedené proby hybridizují specificky na druh Mycobacterium.

8. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů komplexu Mycobacterium tuberculosis ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4) (SEQ ID NO 5) MTB-ICG-1 : GGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCA MTB-ICG-2 : GACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCAC MTB-ICG-3 : CGGCTAGCGGTGGCGTGTTCT nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 76, kde uvedené proby hybridizují specificky na komplex Mycobacterium tuberculosis. 159 159 ·· ···· • ··♦· • ♦ • # ··· ··

9. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Mycobacterium z MAIS komplexu ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na (SEQ ID NO 6) (SEQ ID NO 7) (SEQ ID NO 8) (SEQ ID NO 9) (SEQ ID NO 10) (SEQ ID NO 11) (SEQ ID NO 12) (SEQ ID NO 13) (SEQ ID NO 14) (SEQ ID NO 15) (SEQ ID NO 16) (SEQ ID NO 17) (SEQ ID NO 18) (SEQ ID NO 19) (SEQ ID NO 20) (SEQ ID NO 21) (SEQ ID NO 22) (SEQ ID NO 23) (SEQ ID NO 24) alespoň jednu z následujících prob: MAI-ICG-1 : CAACAGCAAATGATTGCCAGACACAC MIL-ICG-11 : GAGGGGTTCCCGTCTGTAGTG MIL-ICG-22 : TGAGGGGTTCTCGTCTGTAGTG MAC-ICG-1 : CACTCGGTCGATCCGTGTGGA MAV-ICG-1 : TCGGTCCGTCCGTGTGGAGTC MAV-ICG-22 : GTGGCCGGCGTTCATCGAAA MIN-ICG-1 : GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT MIN-ICG-2: GCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTA MIN-ICG-22 : CTGATGCGTTCGTCGAAATGTGT MIN-ICG-222 : TGATGCGTTCGTCGAAATGTGT MIN-ICG-2222 : GGCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTAA MAL-ICG-1 : ACTAGATGAACGCGTAGTCCTTGT MHEF-ICG-1 : TGGACGAAAACCGGGTGCACAA MAH-ICG-1 : MCO-ICG-11 MTH-ICG-11 MTH-ICG-2 : MEF-ICG-11 : MSC-ICG-1 : TGGCCGGCGTGTTCÁTCGAAA GCACTTCAATTGGTGAAGTGCGAGCC GCGTGGTCTTCATGGCCGG ACGCGTGGTCCTTCGTGG TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGTC nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 77 - 100 nebo 108 - 110, kde uvedené • •Μ • · · · · · 160 • · • Μ • · • · · proby hybridizují specificky na kmeny z MAIS komplexu.

10. Způsob podle nároku 9vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů M. avium a M. paratuberculosis ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 10) (SEQ ID NO 11) MAV-ICG-1 : TCGGTCCGTCCGTGTGGAGTC MAV-ICG-22 : GTGGCCGGCGTTCATCGAAA nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 77 a 78, kde uvedené proby hybridizují specificky na M. avium a M. paratuberculosis.

11. Způsob podle nároku 9vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů M. intracellulare a MIC-kmenů ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 6) (SEQ ID NO 7) (SEQ ID NO 8) (SEQ ID NO 9) (SEQ ID NO 12) (SEQ ID NO 13) (SEQ ID NO 14) (SEQ ID NO 15) (SEQ ID NO 16) (SEQ ID NO 17) (SEQ ID NO 18) MAI-ICG-1 : CAACAGCAAATGATTGCCAGACACAC MIL-ICGrl í : GAGGGGTTCCCGTCTGTAGTG MIL-ICG-22 : TGAGGGGTTCTCGTCTGTAGTG MAC-ICG-1 : CACTCGGTCGATCCGTGTGGA MIN-ICG-1 : GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT MIN-ICG-2: GCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTA MIN-ICG-22 : CTGATGCGTTCGTCGAAATGTGT MIN-ICG-222 : TGATGCGTTCGTCGAAATGTGT MIN-ICG-2222 : GGCTGATGCGTTCGTCGAAATGTGTAA MAL-ICG-1 : ACTAGATGAACGCGTAGTCCTTGT MHEF-ICG-1 : TGGACGAAAACCGGGTGCACAA MAH-ICG-1 :

(SEQ ID NO 19) (SEQ ID NO 20) MCO-ICG-11 : TGGCCGGCGTGTTCATCGAAA (SEQ ID NO 21) (SEQ ID NO 22) (SEQ ID NO 23), MTH-ICG-11 : GCACTTCAATTGGTGAAGTGCGAGCC MTH-ICG-2 : GCGTGGTCTTCATGGCCGG MEF-ICG-11 : ACGCGTGGTCCTTCGTGG nebo ekvivalentů uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou Od SEQ ID NO: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, nebo 99, kde uvedené proby hybridizují specificky na kmeny M. intracellulare a MIC-kmeny.

12. Způsob podle nároku 9vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů M. intracellulare ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následující probu: MIN-ICG-1 : GCATAGTCCTTAGGGCTGATGCGTT (SEQ ID NO 12), nebo ekvivalenty uvedené proby, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 89, kde uvedené proby hybridizují specificky na M. intracellulare.

13. Způsob podle nároku 9vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů M. scrophulaceum ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následuj ící probu: MSC-ICG-1 : TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGTC (SEQ ID NO 24) nebo ekvivalenty uvedené proby, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 100, kde uvedené proby hybridizují specificky na M. scrophulaceum.

14. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů M. scrophulaceum ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na (SEQ ID NO 25) (SEQ ID NO 26) (SEQ ID NO 27) (SEQ ID NO 28) (SEQ ID NO 182) (SEQ ID NO 183) (SEQ ID NO 184) (SEQ ID NO 185) (SEQ ID NO 186) (SEQ ID NO 187) (SEQ ID NO 27) (SEQ ID NO 28), (SEQ ID NO 182) (SEQ ID NO 183) (SEQ ID NO 184) (SEQ ID NO 185) (SEQ ID NO 186) (SEQ ID NO 187) alespoň jednu z následujících prob: MKA-ICG-1 : GATGCGTTTGCTACGGGTAGCGT MKA-ICG-2: GATGCGTTGCCTACGGGTAGCGT MKA-ICG-3 : ATGCGTTGCCCTACGGGTAGCGT MKA-ICG-4 : CGGGCTCTGTTCGAGAGTTGTC MKA-ICG-5 : CCCTCAGGGATTTTCTGGGTGTTG MKA-ICG-6 : MKA-ICG-7 : MKA-ICG-8 : MKA-ICG-9 : MKA-ICG-10 : GGACTCGTCCAAGAGTGTTGTCC TCGGGCTTGGCCAGAGCTGTT GGGTGCGCAACAGCAAGCGA GATGCGTTGCCCCTACGGG CCCTACGGGTAGCGTGTTCTTTTG a lépe na: MKA-ICG-3 : ATGCGTTGCCCTACGGGTAGCGT MKA-ICG-4 : CGGGCTCTGTTCGAGAGTTGTC MKA-ICG-5 : CCCTCAGGGATTTTCTGGGTGTTG MKA-ICG-6 : GGACTCGTCCAAGAGTGTTGTCC MKA-ICG-7 : TCGGGCTTGGCCAGAGCTGTT MKA-ICG-8 : GGGTGCGCAACAGCAAGCGA MKA-ICG-9 : GATGCGTTGCCCCTACGGG MKA-ICG-10 : CCCTACGGGTAGCGTGTTCTTTTG nebo ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu 163 ψ ···· Μ · · ·· ···· • · • · odvozenou od SEQ ID NO: 101, 167, 168 nebo 169, kde uvedené proby hybridizují specificky na M. kansasii.

15. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů M. chelonae ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: MCH-ICG-1 : GGTGTGGACTTTGACTTCTGAATAG (SEQ ID NO 29) MCH-ICG-2 : CGGCAAAACGTCGGACTGTCA (SEQ ID NO 30) MCH-ICG-3: GGTGTGGTCCTTGACTTATGGATAG (SEQ ID NO 210) nebo ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 102, 103 nebo 174, kde uvedené proby hybridizují specificky na M. chelonae.

16. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů M. gordonae ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 31) (SEQ ID NO 32) (SEQ ID NO 33) (SEQ ID NO 33) MGO-ICG-1 : AACACCCTCGGGTGCTGTCC MGO-ICG-2 : GTATGCGTTGTCGTTCGCGGC MGO-ICG-5 : CGTGAGGGGTCATCGTCTGTAG a lépe na: MGO-ICG-5 : CGTGAGGGGTCATCGTCTGTAG nebo ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 104, 105 nebo 106, kde uvedené proby hybridizují specificky na M. gordonae. 164

17. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů M. ulcerans nebo kmenů M. marinum ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následující probu: (SEQ ID NO 175) MUL-ICG-1 : GGTTTCGGGATGTTGTCCCACC nebo ekvivalenty uvedené proby, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 157, kde uvedené proby hybridizují specificky na M. ulcerans a M. marinum.

18. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů M. genavense ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následující proby: MGV-ICG-1 : CGACTGAGGTCGACGTGGTGT (SEQ ID NO 176) MGV-ICG-2 : GGTGTTTGAGCATTGAATAGTGGTTGC (SEQ ID NO 177) MGV-ICG-3 : TCGGGCCGCGTGTTCGTCAAA (SEQ ID NO 211) nebo ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 158, 159, 160, 161 nebo 162, kde uvedené proby hybridizují specificky na M. genavense.

19. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů M. xenopi ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následující probu: (SEQ ID NO 178) MXE-ICG-1 : GTTGGGCAGCAGGCAGTAACC nebo ekvivalenty uvedené proby, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 163, kde uvedené proby hybridizují specificky na M. xenopi.

20. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů M. simiae ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následující probu MSI-ICG-1 : CCGGCAACGGTTACGTGTTC (SEQ ID N0 179^ nebo ekvivalenty uvedené proby, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 164 nebo 165, kde uvedené proby hybridizují specificky na M. simiae.

21. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů M. fortuitum ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následující proby MFO-ICG-1 : TCGTTGGATGGCCTCGCACCT (SEQ ID NO 180) MFO-ICG-2 : ACTTGGCGTGGGATGCGGGAA (SEQ ID NO 181) nebo ekvivalenty uvedené proby, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 166, kde uvedené proby hybridizují specificky na M. fortuitum.

22. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů M. celatum ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následující probu MCE-ICG-1: TGAGGGAGCCCGTGCCTGTA (SEQ ID NO 190) nebo ekvivalenty uvedené proby, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 170, kde uvedené proby hybridizují specificky na M. celatum. 166

23. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů M. haemophilum ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na následující probu: (SEQ ID NO 191) MHP-ICG-1 : CATGTTGGGCTTGATCGGGTGG nebo ekvivalenty uvedené proby, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 171, 172 nebo 173, kde uvedené proby hybridizují specificky na M. haemophilum.

24. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Mycobacterium ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: MYC-ICG-1 : ACTGGATAGTGGTTGCGAGCATCTA (SEQ ID NO 1) MYC-ICG-22 : CTTCTGAATAGTGGTTGCGAGCATCT (SEQ ID NO 2) nebo ekvivalenty uvedených prob.

25. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Mycoplasma ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: MPN-ICG 1 : ATCGGTGGTAAATTAAACCCAAATCCCTGT (SEQ ID NO 49) MPN-ICG 2 : CAGTTCTGAAAGAACATTTCCGCTTCTTTC (SEQ ID NO 50) MGE-ICG 1 : CÁCCCATTAATTnTTCGGTGTTAAAACCC (SEQ ID NO 51) Mycoplasma-ICG : CAAAACTGAAAACGACAATCTTTCTAGTTCC (SEQ ID NO 52) ···» 167 *· I ti Μ · • · I · · • · · · · · · • · · · ··· * ·· · ··· · nebo ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 124 nebo 125, kde uvedené proby hybridizují specificky na druh Mycoplasma.

26. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Mycoplasma pneumoniae ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: MPN-ICG 1 : ATCGGTGGTAAATTAAACCCAAATCCCTGT (SEQ ID NO 49) MPN-ICG 2 : CAGTTCTGAAAGAACATTTCCGCTTCTTTC (SEQ ID NO 50) nebo ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 125, kde uvedené proby hybridizují specificky na Mycoplasma pneumoniae.

27. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Mycoplasma genitalium ve vzorku, kde krok {iii) obsahuje hybridizaci na následující probu: MGE-ICG 1 : CACCCATTAATTnTTCGGTGTTAAAACCC (SEQ ID NO 51) nebo ekvivalenty uvedené proby, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 124, kde uvedené proby hybridizují specificky na Mycoplasma genitalium.

28. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Pseudomonas ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: 168 « ···· · · ·· ···· Μ ········ • · · · « · · • · · · · · ··· · • · · · · · »·· · »·· ··· ♦· * PA-ICG 1 PA-ICG 2 PA-ICG 3 PA-ICG 4 PA-ICG 5 : TGGTGTGCTGCGTGATCCGAT TGAATGTTCGTGGATGAACATTGATT CACTGGTGATCATTCAAGTCAAG TGAATGTTCGT(G/A)(G/A)ATGAACATTGATTTCTGGTC (SEQ ID NO 37) CTCTTTCACTGGTGATCATTCAAGTCAAG (SEQ ID NO 38), (SEQ ID NO 34) (SEQ ID NO 35) (SEQ ID NO 36) nebo ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 111, 112, 113, 114 nebo 115, kde uvedené proby hybridizují specificky na kmeny Pseudomonas.

29. Způsob podle nároku 28 vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Pseudomonas aeruginosa ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: PA-ICG 1 : TGGTGTGCTGCGTGATCCGAT (SEQ ID NO 34) PA-ICG 2 : TGAATGTTCGTGGATGAACATTGATT (SEQ ID NO 35) PA-ICG 3 : CACTGGTGATCATTCAAGTCAAG (SEQ ID NO 36) PA-ICG 4 : TGAATGTTCGT(G/A)(G/A)ATGAACATTGATTTCTGGTC (SEQ ID NO 37) PA-ICG 5 : CTCTTTCACTGGTGATCATTCAAGTCAAG (SEQ ID NO 38), a lépe na alespoň jednu z následujících prob: PA-ICG 1 : TGGTGTGCTGCGTGATCCGAT (SEQ ID NO 34) PA-ICG 4 : TGAATGTTCGT(G/A)(G/A)ATGAACATTGATTTCTGGTC (SEQ ID NO 37) PA-ICG 5 : CTCTTTCACTGGTGATCATTCAAGTCAAG (SEQ ID NO 38) nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 111, kde uvedené proby hybridizují specificky na Pseudomonas aeruginosa. 169 • 9999 · 9 999999 ·· 9 99 99 9 9 9 • · · 9 · · # • · 9 · 9 9 999 9 • · 9 9 ·9 999 9 999 999 99 9

30. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více druhů Staphylococcus ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: STAU-ICG 1 : TACCAAGCAAAACCGAGTGAATAAAGAGTT STAU-ICG 2 : CAGAAGATGCGGAATAACGTGAC STAU-ICG 3 : AACGAAGCCGTATGTGAGCATTTGAC STAU-ICG 4 : GAACGTAACTTCATGTTAACGTTTGACTTAT (SEQ ID NO 53) (SEQ ID NO 54) (SEQ ID NO 55) (SEQ ID NO 56) nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142, 143 nebo 144, kde uvedené proby hybridizují specificky na druhy Staphylococcus.

31. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Staphylococcus aureus ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu, a lépe na obě, z následujících prob: STAU-ICG 3 : AACGAAGCCGTATGTGAGCATTTGAC (SEQ ID NO 55) STAU-ICG 4 : GAACGTAACTTCATGTTAACGTTTGACTTAT (SEQ ID NO 56), nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142, nebo 143, kde uvedené proby hybridizují specificky na Staphylococcus aureus.

32. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Staphylococcus ·· · 170 epidermidis ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 144, kde uvedené proby hybridizují specificky na Staphylococcus epidermidis.

33. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Acinetobacter ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: ACI-ICG 1 : GCTTAAGTGCACAGTGCTCTAAACTGA (SEQ ID NO 57) ACI-ICG 2 : CACGGTAATTAGTGTGATCTGACGAAG (SEQ ID NO 58), nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 126, 127, 128, 129 nebo 130, kde uvedené proby hybridizují specificky na druhy Acinetobacter.

34. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Acinetobacter baumanii ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: ACI-ICG 1 : GCTTAAGTGCACAGTGCTCTAAACTGA (SEQ ID NO 57) ACI-ICG 2 : CACGGTAATTAGTGTGATCTGACGAAG (SEQ ID NO 58) nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 126, kde uvedené proby hybridizují specificky na Acinetobacter baumanii.

35. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, • · · · · 171 • t · · · ·· « » • · · · · · • · I · ·····* • · · · 9 · • 99 9 999 999 99 9 že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Listeria ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: LIS-ICG 1 : LMO-ICG 1 : LMO-ICG 2 : LMO-ICG 3 : LIY-ICG 1 : LSE-ICG 1 : LISP-ICG 1: CAAGTAACCGAGÁATCATCTGAAAGTGAATC (SEQ ID NO 39) AAACAACCTTTACTTCGTAGAAGTAAATTGGTTAAG (SEQ ID NO 40) TGAGAGGTTAGTACTTCTCAGTATGTTTGTTC (SEQ ID NO 41) AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC (SEQ ID NO 42) GTTAGCATAAATAGGTAACTATTTATGACACAAGTAAC (SEQ ID NO 43) AGTTAGCATAAGTAGTGTAACTATTTATGACACAAG CGTTTTCATAAGCGATCGCACGTT (SEQ ID NO 212) a nejlépe na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 39) (SEQ ID NO 42) (SEQ ID NO 212) LIS-ICG 1 : CAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATC LMO-ICG 3 : AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC LISP-ICG 1: CGTTTTCATAAGCGATCGCACGTT nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 116, 118, 119, 120, 121, 213, 214 nebo 215, kde uvedené proby hybridizují specificky na druhy Listeria.

36. Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Listeria monocytogenes ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: 172 172 • ·« · 9 ·· ···· 9 9 t • · t • ·· · · • · • ·· · LMO-ICG 1 : AAACAACCTTTACTTCGTAGAAGTAAATTGGTTAAG (SEQ ID NO 40) LMO-ICG 2 : TGAGAGGTTAGTACTTCTCAGTATGTTTGTTC (SEQ ID NO 41) LMO-ICG 3 : AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC (SEQ ID NO 42) a lépe na následující probu: LMO-ICG 3 : AGGCACTATGCTTGAAGCATCGC (SEQ ID NO 42) nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 118 nebo 120, kde uvedené proby hybridizují specificky na Listeria monocytogenes.

37. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Brucella ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 59) (SEQ ID NO 60) (SEQ ID NO 193) (SEQ ID NO 194) (SEQ ID NO 60) (SEQ ID NO 193) (SEQ ID NO 194) BRU-ICG 1 : CGTGCCGCCTTCGTTTCTCTTT BRU-ICG 2 : TTCGCTTCGGGGTGGATCTGTG BRU-ICG 3 : GCGTAGTAGCGTTTGCGTCGG BRU-ICG 4 : CGCAAGAAGCTTGCTCAAGCC a nejlépe na následující probu: BRU-ICG 2 : TTCGCTTCGGGGTGGATCTGTG BRU-ICG 3 : GCGTAGTAGCGTTTGCGTCGG BRU-ICG 4 : CGCAAGAAGCTTGCTCAAGCC 173 ··

*· Μ·· « I • · « #·· ·· ě nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 131, 132 nebo 154, kde uvedené proby hybridizují specificky na kmeny Brucella.

38. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Salmonella ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: (SEQ ID NO 61) (SEQ ID NO 62) (SEQ ID NO 63) (SEQ ID NO 64) (SEQ ID NO 61) SALM-ICG 1 : CAAAACTGACTTACGAGTCACGTTTGAG SALM-ICG 2 : GATGTATGCTTCGTTATTCCACGCC STY-ICG 1 : GGTCAAACCTCCAGGGACGCC SED-ICG1 : GCGGTAATGTGTGAAAGCGTTGCC a nejlépe na následující probu: SALM-ICG 1 : CAAAACTGACTTACGAGTCACGTTTGAG nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 133, 134, 135, 136, 137 nebo 138, kde uvedené proby hybridizují specificky na kmeny Salmonella.

39. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Chlamydia ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: 174 CHTR-ICG 1 : GGAAGAAGCCTGAGAAGGTTTCTGAC CHTR-ICG 2 : GCATTTATATGTAAGAGCAAGCATTCTATTTCA CHTR-ICG 3 : GAGTAGCGTGGTGAGGACGAGA CHTR-ICG 4 : GAGTAGCGCGGTGAGGACGAGA CHPS-ICG 1 : GGATAACTGTCTTAGGACGGTTTGAC nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 122, 123 nebo 197, kde uvedené proby hybridizují specificky na kmeny Chlamydia.

40. Způsob podle nároku 39 vyznačující se tím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Chlamydia trachomatis ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň jednu z následujících prob: CHTR-ICG 1 : GGAAGAAGCCTGAGAAGGT1TCTGAC (SEQ ID NO 45) CHTR-ICG 2 : GCATTTATATGTAAGAGCAAGCATTCTATTTCA (SEQ ID NO 46) CHTR-ICG 3: GAGTAGCGTGGTGAGGACGAGA (SEQ ID NO 47) CHTR-ICG 4 : GAGTAGCGCGGTGAGGACGAGA (SEQ ID NO 201) ! (SEQ ID NO 45) (SEQ ID NO 46) (SEQ ID NO 47) (SEQ ID NO 201) (SEQ ID NO 48) • ···· » · ·« ···· ·· I f *· · · · • · · · · · · • « · · · 1 *·· · • · · · ♦ ♦ *·· η «·» ··· ·· t

nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 123 nebo 197, kde uvedené proby hybridizují specificky na Chlamydia trachomatis.

41. Způsob podle nároku 39 vyznačující se tím, 175 ·ι·« • · · · · · • · · · · · • · · • · · • Μ · • · • · · že detekuje a identifikuje jeden nebo vice kmenů Chlamydia psittaci ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na alespoň následující probu: CHPS-ICGl: GGATAACTGTCTTAGGACGGTTTGAC (SEQ ID NO 48) nebo na ekvivalenty uvedené proby, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 122, kde uvedené proby hybridizují specificky na Chlamydia psittaci.

42. Způsob podle nároku Ivyznačujícísetím, že detekuje a identifikuje jeden nebo více kmenů Streptococcus ve vzorku, kde krok (iii) obsahuje hybridizaci na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 nebo 153, kde uvedené proby hybridizují specificky na kmeny Streptococcus.

43. Způsob podle nároku l pro specifickou detekci a identifikaci Chlamydia trachomatis ve vzorku vyznačuj ícísetím, že krok (ii) obsahuje amplifikaci 16S-23S rRNA intergenového regionu nebo jeho části, za použití alespoň jednoho z následujících primerů: CHTR-P1: AAGGTTTCTGACTAGGTTGGGC (SEQ ID NO 69) CHTR-P2: GGTGAAGTGCTTGCATGGATCT (SEQ ID NO 70) nebo ekvivalentů uvedených primerů, kde se uvedené ekvivalenty liší od sekvence výše uvedených primerů změnou jednoho nebo více nukleotidů, kdy tyto uvedené ekvivalenty stále ještě specificky amplifikují intergenový region nebo jeho část od Chlamydia trachomatis. 176 ···· ·· ···· 176 ···· ·· ···· ··

• · · · · ·

44. Způsob podle nároku 1 pro specifickou detekci a identifikaci druhu Listeria ve vzorku vyznačující se tím, že krok (ii) obsahuje amplifikaci 16S-23S rRNA intergenového regionu nebo jeho části, za použití alespoň jednoho z následujících primerů: (SEQ ID NO 71) (SEQ ID NO 72) (SEQ ID NO 73) (SEQ ID NO 74) (SEQ ID NO 75) (SEQ ID NO 202) (SEQ ID NO 203) LIS-P1 : ACCTGTGAGTTTTCGTTCTTCTC LIS-P2 : CTATTTGTTCAGTTTTGAGAGGTT LIS-P3 : ATTTTCCGTATCAGCGATGATAC LIS-P4 : ACGAAGTAAAGGTTGTTTTTCT LIS-P5 : GAGAGGTTACTCTCTTTTATGTCAG LIS-P6 : CTTTTATGTCAGATAAAGTATGCAA LIS-P7 : CGTAAAAGGGTATGATTATTTG nebo ekvivalentů uvedených primerů, kde se uvedené ekvivalenty liší od sekvence výše uvedených primerů změnou jednoho nebo více nukleotidů, kdy tyto uvedené ekvivalenty stále ještě specificky amplifikují intergenový region nebo jeho část od druhu Listeria.

45. Způsob podle nároku 1 pro specifickou detekci a identifikaci druhu Mycobacterium ve vzorku vyznačující se tím, že krok (ii) obsahuje amplifikaci 16S-23S rRNA intergenového regionu nebo jeho části, za použití alespoň jednoho z následujících primerů: 177 177 (SEQ ID NO 65) (SEQ ID NO 66) (SEQ ID NO 67) (SEQ ID NO 68) (SEQ ID NO 192) MYC-P1: TCCCTTGTGGCCTGTGTG MYC-P2: TCCTTCATCGGCTCTCGA MYC-P3: GATGCCAAGGCATCCACC MYC-P4: CCTCCCACGTCCTTCATCG MYC-P5: CCTGGGTTTGACATGCACAG nebo ekvivalentů uvedených primerů, kde se uvedené ekvivalenty liší od sekvence výše uvedených primerů změnou jednoho nebo více nukleotidů, kdy tyto uvedené ekvivalenty stále ještě specificky amplifikují intergenový region nebo jeho část od druhu Mycobacterium.

46. Kompozice obsahující alespoň jednu z prob nebo primerů definovaných v nárocích 1 až 45 a 51 až 53.

47. Proba jak je definována v jakémkoliv z nároků 1 až 42 a 51.

48. Primer jak je definován v jakémkoliv z nároků 43 až 45 a 52 až 53.

49. Způsob reversní hybridizace vyznačující se tím, že obsahuje jakoukoliv z prob jak jsou definovány v nárocích 1 až 42 a 51, kde uvedené proby jsou imobilizovány ve známém umístění na pevném nosiči, a lépe na proužku membrány.

50. Kit pro detekci a identifikaci alespoň jednoho mikroorganismu, nebo pro simultání detekci a identifikaci několika mikroorganismů ve vzorku, kde tento kit obsahuje • · « · · I · 179 ·»Μ • · · · · ♦ • · · · · • I · · · · « • · · · • · ··· Μ« · * · nebo na ekvivalenty uvedených prob, a/nebo na jakoukoliv probu odvozenou od SEQ ID NO: 195 nebo 196, kde uvedené proby hybridizují specificky na kmeny Yersinia enterocoliotica.

52. Způsob podle nároku 1 pro specifickou detekci a identifikaci druhu Brucella ve vzorku vyznačující se tím, že krok (ii) obsahuje amplifikaci 16S-23S rRNA intergenového regionu nebo jeho části, za použití alespoň jednoho z následujících primerů: (SEQ ID NO 204) (SEQ ID NO 205) (SEQ ID NO 206) (SEQ ID NO 207) BRU-P1 : TCGAGAATTGGAAAGAGGTC BRU-P2 : AAGAGGTCGGATTTATCCG BRU-P3 : TTCGACTGCAAATGCTCG BRU-P4 : TCTTAAAGCCGCATTATGC nebo ekvivalentů uvedených primerů, kde se uvedené ekvivalenty liší od sekvence výše uvedených primerů změnou jednoho nebo více nukleotidů, kdy tyto uvedené ekvivalenty stále ještě specificky amplifikují intergenový region nebo jeho část od druhu Brucella.

53. Způsob podle nároku 1 pro specifickou detekci a identifikaci druhu Yersinia enterocolitica ve vzorku vyznačující se tím, že krok (ii) obsahuje amplifikaci 16S-23S rRNA intergenového regionu nebo jeho části, ·· ···· 180

• « • · · za použití alespoň jednoho z následujících primerů: YEC-P1 : CCTAATGATATTGATTCGCG (SEQ ID NO 208) YEC-P2 : ATGACAGGTTAATCCTTACCCC (SEQ ID NO 209) nebo ekvivalentů uvedených primerů, kde se uvedené ekvivalenty liší od sekvence výše uvedených primerů změnou jednoho nebo více nukleotidů, kdy tyto uvedené ekvivalenty stále ještě specificky amplifikují intergenový region nebo jeho část od druhu Yersinia enterocolitica.

Λ