CZ378296A3 - Transgenní rostliny produkující trehalozu - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Transgenní rostliny produkující trehalosu a způsoby zvýšení obsahu trehalosy v rostlinách. Rostliny jsou transformovány kódující sekvencí genu pro trehalosa-6-fosfát-synthasu zfázovanou s nekonstitutivním rostlinným promotorem, který umožňuje dočasnou, topologickou nebo stresem indukovanou kontrolu exprese genu. Vynález lze použít pro ochranu běžných kulturních rostlin proti suchu, vysokému obsahu solí a teplotním extrémům a pro zlepšení skladovacích vlastností sklizených rostlin zahrnujících zelené potraviny, trhané ovoce a okrasné rostliny.

fy

Transgenní rostliny produkOblast techniky ·- — ____ _

Vynález se týká genetického inženýrství rostlin s cílem zavést schopnost syntetizovat trehalosu. Konkrétně se vynález týká rostlin, které mají zvýšený obsah trehalosy a způsobu, jak je připravit. Vynález se rovněž týká způsobů jak navodit zvýšení tolerance rostlin ke stresům, jako například chladu a suchu, i způsobů jak navodit produkci trehalosy.

Dosavadní stav techniky

Trehalosa (</-glukopyranosyl-^-D-glukopyranosa) je dimer glukosových molekul spojených přes jejich redukující skupiny. Vzhledem k neobvyklé kombinaci svých chemických vlastností ve srovnání s jinými cukry, včetně nedostatku redukujících skupin, pomalé hydrolysy a schopnosti vytvářet nerozpustné sklo, se jedná o jednu z nejúčinnějších látek používaných pro ochranu bílkovin, buněčných membrán a jiných biologických látek in vítro. Podobně pro žijící organismy, které obsahují velká množství trehalosy je charakteristické, že jsou často vystaveny osmotickému, dehydratačnímu a tepelnému stresu. Jedná se o hmyz, některé litorální živočichy a řadu mikroorganismů, včetně kvasinek a bakterií. Existuje podrobný důkaz, který shrnul Wiemken v roce 1990 v časopise Antomie van Leeuwenhoek 58, 209-217, že primární rolí trehalosy v pekařských kvasinkách je navozovat odolnost k těmto stresům. Předpokládá se však rovněž (Nwaka et al. (1994) FEBS Letters 344, 225-228; Van Dijk et al. (1995) Appl. Environ. Microbiol.

61, 109-115), že akumulace trehalosy v pekařských kvasinkách sama o sobě není dostatečná k navození tolerance ke stresu.

Vysoké hladiny trehalosy se vyskytují v takzvaných resurrection plants, jako například u kapradiny Selagineila lepidophylla, které jsou schopné přežít dlouhodobé vysušení a vystavení vysokým teplotám (viz shrnující článek Avigadův (1982) v Encyclopedia of Plant Research (New Series) 13 A, str. 217-347). Velká většina cévnatých rostlin však není schopna syntetizovat trehalosu. Tyto rostliny často akumulují jiné kompatibilní rozpuštěné látky, jako je glycin betain, prolin a různé polyoly, v odpovědi na stres způsobený například suchem, které snižuje dostupnost intracelulární vody (viz shrnující článek McCue a Hansona (1990) Trends in Biotechnology 8, 358-362).

Existuje velmi málo údajů o přítomnosti trehalosy u krytosemenných rostlin, a většinou se jedná o malá množství, která pravděpodobně odrážejí mikrobiální kontaminaci (např. Kandler a Senser (1965) Z. Pflanzenphysiol. 53, 157-161; Oesch a Meier (1967) Phytochemistry 6, 1147-1148). Opravdu byl vysloven názor, že trehalosa je toxická pro mnoho rostlinných tkání (Veluthambi et al. (1981) Plant Physiol. 68, 1369-1374), zejména pro ty, které mají nízkou nebo nulovou aktivitu trehalasy (trehalasa je enzym, který převádí trehalosu na glukosu). Avšak alespoň jedna krytosemenná rostlina, Myrothamnus flabellifolia (další z takzvaných resurrection plants), akumuluje značná množství trehalosy (Bianchi et al. (1993) Physiologia Plantarum 87, 223-226), což ukazuje na to, že neexistuje absolutní kompatibilitní bariéra mezi trehalosou a krytosemennými rostlinami.

Nepřítomnost trehalosy u většiny krytosemenných rostlin a zmíněná toxicita zjištěná u některých z nich ukazuje, že po zavedení syntetické dráhy pro trehalosu do těchto rostlin lze v některých případech očekávat negativní účinky. Na druhé straně, úspěšná produkce trehalosy v rostlinách by představovala podstatnou výhodu. Trehalosu akumulovanou například v zásobních orgánech cukrovky, bramboru, cibule a podobně, by bylo možné extrahovat na komerční bázi a tak získat trehalosu při nákladech, které by byly kompetitivní ve srovnání se sacharosou v určitých aplikacích. Takové aplikace zahrnují výrobu sušených potravin (práškové mléko a vejce, polévky, ovocné pyré, atd.), protože trehalosa chrání vůni a strukturu mnoha potravinových produktů v průběhu ekeonomicky výhodných sušicích postupů, a v tomto ohledu vysoce překonává obdobný efekt sacharosy (viz např. Roser (1991) Trends in Food Science and Technology, July, str. 166-169; Roser a Colaco (1993) New Scientist, May, str. 25-28). V porovnání se sacharosou je další výhodou trehalosy v mnoha případech (polévky, prášková vejce) skutečnost, že není sladká, a dále i to, že z ní nevzniká fruktosa, která je považována za riskantní pro lidské zdraví. Vysoká cena trehalosy však činí její využití v průmyslové výrobě sušených potravin příliš nákladným. Za druhé, produkce trehalosy v jedlých částech určitých rostlin by vedla k prodloužení skladovatelnosti produktů jako jsou například rajčata. Za třetí, hromadění trehalosy v citlivých tkáních zvyšuje toleranci rostlin k mrazu, suchu, vysokému obsahu soli a podobným stresům.

Podstata vynálezu

Na základě toho, co je uvedeno výše, je předmětem vynálezu poskytnutí nové schopnosti rostlinám syntetizovat trehalosu. Konkrétně je předmětem vynálezu poskytnutí schopnosti řízené akumulovat trehalosu v rostlinných tkáních, jako komerčním zdroji trehalosy, nebo pro navození tolerance ke stresu, nebo za obojím účelem, a přitom minimalizovat potenciálně nepříznivé vlivy trehalosy na růst rostlin.

Vynález je založen na způsobu transformace rostlin strukturálními geny pro synthesu trehalosy, které jsou pod kontrolou vhodných rostlinných promotorů, s cílem produkce transgenních rostlin se zvýšeným obsahem trehalosy. Konkrétně se jedná o to, že kódující sekvence jednoho nebo několika genů kódujících polypeptidy enzymů produkujících trehalosa-6-fosfát nebo samotnou trehalosu, jsou podle vynálezu exprimovány v rostlinách pod kontrolou specifických rostlinných promotorů.

Tedy daná rostlina je transformována alespoň kódující sekvencí genu pro trehalosa-6-fosfátsynthasu (Tre6Psynthasa) vhodně fúzovanou s rostlinným promotorem takovým způsobem, že k plné expresi genu dochází pouze když rostlina dozrává, nebo když se setká se specifickými podmínkami prostředí. Promotory jsou proto s výhodou nekonstitutivní a vybrané tak, aby dovolily dočasnou (např. diurnální), topologickou (např. tkáňově specifickou), nebo stresem aktivovanou (nebo stresem indukovanou) kontrolu exprese genů. Rostlinu lze rovněž transformovat jedním nebo několika geny kódujícími trehalosa-6-fosfatasu (TreóPasu) nebo regulačním polypeptidem, který interaguje s Tre6Psynthasou nebo TreóPasou nebo oběma.

Transformaci rostliny lze provést kterýmkoli ze způsobů dostupných v oboru, včetně infekce transformovaným Agrobacter tumefaciens a přímou introdukcí cizorodé DNA mikroinjekcí, elektroporací, bombardováním částicemi a přímým transportem DNA. Strukturální geny jsou výhodně zvoleny ze skupiny zahrnující kvasinkové geny TPS1, TPS2 a TSL1, které kódují Tre6Psynthasu o molekulové hmotnosti 56 kDa, Tre6Pasu o hmotnosti 102 kDa a regulační subjednotky kvasinkové trehalosasynthasy o molekulové hmotnosti 123 kDa.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout způsob produkce transgenních rostlin se zvýšeným obsahem trehalosy. Tento způsob zahrnuje kroky transformace dané rostliny strukturálními geny pro synthesu trehalosy, zejména genem pro Tre6Psynthasu, jak je uvedeno výše, a exprese těchto genů pod kontrolou vhodného promotoru, který umožní dočasnou, topologickou nebo stresem indukovanou kontrolu exprese uvedených genů.

Třetím předmětem vynálezu je produkce trehalosy, která zahrnuje kroky:

- transformaci rostliny alespoň jedním strukturálním genem pro TreGPsynthasu s cílem vzniku transgenní rostliny,

- kultivaci transgenní rostliny za podmínek, které budou indukovat expresi synthesy trehalosy v rostlině, a

- extrakci trehalosy z rostlinných tkání.

Čtvrtým předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu ochrany rostlin proti nepříznivým podmínkám jako jsou sucho, vysoký obsah soli, teplotní extrémy a jiné stresy. Tento způsob zahrnuje transformaci rostliny alespoň kódovací sekvencí genu pro trehalosa-6-fosfátsynthasu, která je vhodně fúzovaná s rostlinným promotorem, takže plná exprese genu se neuskuteční, dokud se rostlina nesetká s nepříznivými podmínkami. Rostlinu lze výhodně současně transformovat jedním nebo několika geny kódujícími trehalosa-6-fosfatasu a regulační proteiny, které interagují s trehalosa-6-fosfátsynthasou nebo trehalosa-6-fosfatasou nebo oběma. Například, vynález poskytuje způsob ochrany rostlin majících bobule nebo jiné plody proti poškození květů mrazem, což je umožněno transformací rostliny genem pro trehalosa-6-fosfatasu, který je vhodně fúzovaný s rostlinným promotorem, takže k plné expresi genu nedojde, pokud se rostlina nedostane do nízké teploty.

Pátým předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu produkce transformovaných okrasných rostlin, které nevyžadují tak intenzivní a odbornou péči jako netransformované rostliny. Tento způsob zahrnuje transformaci rostliny genem pro trehalosa-6-fosfátsynthasu, který je vhodně fúzován s rostlinným promotorem, takže rostlina obsahuje trehalosu v některých svých tkáních.

Krátký popis obrázků

Obr. 1 ukazuje schematicky strukturu chimérického genového konstruktu obsahujícího malý subjednotkový promotor Rubisco A. thaliana (patslA) zfúzovaný s kvasinkovým genem TPS1, který kóduje subjednotku Tre6Psynthasy a stop signál transkripce z genu pro nopalinsynthasu Agrobacterium tumefaciens (nos). Je ukázána pouze část plasmidu pK0H51 s genovou chimérou. Jsou ukázána unikátní místa pro štěpení restrikčními enzymy významná pro konstrukci genové chiméry.

Obr. 2 uvádí výsledky Western blot analysy transgenních rostlin tabáku, které ukazují TPS1 produkt o molekulové hmotnosti 56 kDa. Produkt je označen šipkou. Proteiny byly extrahovány z transformovaných rostlin tabáku obsahujících (dráhy 1, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 16 a 19) konstrukt popsaný v obr. 1 nebo (GUS) další genovou chiméru obsahující promotor mozaikového viru květáku o molekulové hmotnosti 35S zfúzovaný s genem pro β-giukuronidasu (UlDA) ve stejném vektoru nebo (SRÍ) z netransformovaných rostlin tabáku. Stejná množství proteinu byla nanesena do každé z drah. Použité antisérum (anti-57) bylo připraveno proti subjednotce kvasinkové Tre6Psynthasy o molekulové hmotnosti 56 kDa.

Obr. 3 ukazuje chromatografickou identifikaci trehaiosy. Vzorky (20 1) vodných extraktů tabákových listů byly analysovány pomocí HPLC tak jak je popsáno v Obecném Materiálu a Metodách. Extrakty A a B obsahovaly 192 mg čerstvé hmotnosti Transformantu rostoucího ve skleníku v 19 mi (A) před a (B) po působení trehaiasy. Extrakty C a D obsahovaly 149 mg listové hmoty na mi z (C) Transřormanta 4 nebo (D) kontrolní rostliny transformované plasmidem pDElOOl, který neobsahoval gen TPS1. Obě rostliny byly kultivovány za sterilních podmínek. Maxima trehaiosy jsou označeny T. Dvě velká maxima s retenčním časem okolo 25 minut (maxima 7 a 8 v A) jsou glukosa a sacharosa.

Obr. 4. Záznam proteinové imunobiotovaci techniky ukazující tkáňovou lokalizaci TPSl-subjednotky analyzované u atsl-TPSl transformované linie 4. Listy divokého tabáku (SRÍ) byly použity jako negativní kontrola a 0,1 g Tre6Pssynthasové subjednotky purifikované z kvasinky (TPS1) jako positivní kontrola. Trehalosový obsah stejných tkání je uveden v mg/g suché hmotnosti nad imunoblotovým záznamem. Zkratka nt znamená netestováno. Dále jsou použity následující zkratky: F'B, květní pupeny; UL, horní listy; ML, střední listy; LL, spodní listy; US, horní stonek; R, kořeny; EC, enzymová kontrola.

Obr. 5. Zvýšená tolerance k suchu v rostlinách produkujících trehalosu. Oddělené listy ze stejného vývojového stadia rostlin starých 6 až 8 týdnů, které byly kultivovány in vitro, byly sušeny na vzduchu (25 % RH). (A) V časech, které jsou uvedeny, byly listy váženy a výsledky uvedeny jako relativní čerstvá hmotnost listů v každém čase. Suchá hmotnost každého listu byla získána po sušení listů při + 60 °C po dobu 48 hodin. Kontrola s divokým typem tabáku je označena SRÍ a trehalosu produkující transgenní linie 1, 4 a 8 jsou označeny jejich odpovídajícími čísly. (B) Vzhled oddělených listů transgenní linie 4 a kontrolních rostlin ve vybraných časech během působení stresu.

Obr.6. Přežívání kontrolních a trehalosu produkujících tabákových rostlin za podmínek sucha. (A) 6 až 8 týdnů staré intaktní rostliny pěstované in vitro byly vystaveny sušení vzduchem (D) po doby, vyznačené v grafu. Po 17 hodinách působení stresu byly netransformované kontrolní rostliny (SRÍ) a trehalosu produkující transgenní rostliny linií 4 a 8 rehydratovány (R) tím, že rostliny byly umístěny do vody. (B) 3 týdny staré rostlinky transgenní linie 8 a jak netransformované (SE1) tak vektorem transformované (C) kontrolní rostliny byly vystaveny sušení vzduchem (D) po indikovaný čas. Rostlinky byly následně rehydratovány (R) po 7 hodinách působení stresu tím, že byly umístěny do vody.

Obr. 7. SDS-PAGE (elektroforesa v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti sodium dodecylsulfátu) analysa frakcí obsahujících Tre6Psynthasu M. smegmatis eluovanou z prvního Heparin-Sepharosového sloupce. Dráhy 1 až 4 obsahují popořadě vzorky H33 (7,0 mU) , H35 (20 mU), H36 (21 mU) a H37 (12 mU) (Tab. 3). Po provedení SDS-PAGE v 8 % akrylamidu byly gely obarveny pomocí Coomassie Brilliant Blue. Velikost standardů molekulové hmotnosti v dráze 5 jsou uvedeny v kDa. Poloha polypeptidů Tre6Psynthasy o molekulové hmotnosti 55 kDa je označena šipkou.

Obr. 8. SDS-PAGE analysa frakce z oblasti maxima T're6Psynthasy M. smegmatis eluované z druhého Heparin-Sepharosového sloupce. Frakce T21 (Tab. 3) byla koncentrována ve zkumavce Centricon 10 a následně smísena s polovinou objemu třikrát koncentrovaného pufru používaného pro vzorky při SDS-PAGE. Celková koncentrace byla šestinásobná. Vzorky obsahující (dráha l) 2,9 mU a (dráha 3) 8,7 mU TreóPsynthasy byly analysovány SDS-PAGE v 8 % akrylamidu a obarveny pomocí Coomassie Brilliant Blue. Standardy molekulárních hmotností v dráze 2 seřazené podle velikosti byly 109, 84, 47, 33, 24 a 16 kDa.

Obr. 9. Western analysa Tre6Psynthasy purifikované z M. smegmatis. Na 8 % akrylamidový gel byly naneseny předem obarvené markéry molekulové hmotnosti (dráha 1: 200, 117, 80 a 47 kDa; dráha 10: jediný viditelný markér má 84 kDa), čistá Tre6Psynthasa z frakce T21 (Tab. 3) (dráhy 7a 8: 2,9 mU; dráhy 3, 4 a 9: 8,7 mU) a spojené aktivní frakce ze Sephadexu G100 (Tab. 3) (dráha 6: 7,8 g celkového proteinu; dráhy 2 a 5: 23 g celkového proteinu). Po provedení elektroforesy a přenosu na nitrocelulosu byla nitrocelulosová membrána rozstřižena mezi dráhami 3 a 4 a mezi dráhami 7 a 8. Dráhy 1 až 3 byly obarveny pomocí Coomassie Brilliant Blue, detekce na dráhách 4 až 7 byla provedena anti-57 sérem, které bylo získáno imunizací proti purifikované subjednotce kvasinkové Tre6Psynthasy mající molekulovou hmotnost 56 kDa, a detekce na dráhách 8 až 10 byla provedena pomocí preimunního séra. Imunoreaktivní pásy byly zviditelněny použitím kozího, antikráličího IgG-alkalická fosfatasa konjugátu (Promega) podle instrukcí výrobce. V obou případech byly časy vybarvení 2,8 minut. Diagonální čáry napříč dráhám 4 až 7 byly způsobeny náhodným zvarhaněním membrány během přenosu na nitrocelulosu.

Obr. 10. Western analysa 8 transgenních linií Arabidopsis thaliana. Rostliny vypěstované ze semen primárních transformantů byly extrahovány a analyzovány pomocí antiséra připraveného proti subjednotce kvasinkové Tre6Psynthasy mající molekulovou hmotnost 56 kDa, tak jak je popsáno v obr. 2. Subjednotka TreóPsynthasy purifikovaná z kvasinky (0,1 g) byla použita jako positivní kontrola. Netransformovaná A. thaliana nedává žádný signál.

Podrobný popis vynálezu

V následujícím popisu výraz konstitutivní rostlinný promotor označuje rostlinné promotory, které vyvolávají kontinuální a obecnou expresi s nimi asociovaných kódujících sekvencí, takže produkty těchto sekvencí jsou nalézány ve všech buňkách rostliny a ve všech fázích růstu.

Nekonstitutivní promotory naproti tomu jsou aktivovány specifickými vnitřními nebo vnějšími událostmi, jako například diferenciací buněk, které vyúsťují v tvorbu zvláštních tkání v průběhu vývoje a zrání rostliny, nebo změnami v prostředí rostliny.Je známo mnoho typů změn prostředí, které aktivují zvláštní promotory. Příklady zahrnují světlem indukovanou aktivaci promotorů pro malou subjednotku ribulosa1,5-bisfosfátkarboxylasy (Krebbers et al. (1988) Plant. Mol. Biol. 11, 745-759), jako například promotor astlA použitý v Příkladech 1 až 3, a aktivaci promotorů různými stresy, jako například LTI78 (Nordin et al. (1993) Plant. Mol. Biol. 21, 641-653) a RAB18 (Lang a Palva (1992) Plant. Mol. Biol. 20, 951-962). Avšak náš vynález není omezen těmito příklady nekonstitutivních promotorů. Důležitou a novou částí vynálezu je koncept, že konstitutivní synthesa trehalosy rostlinou bude vždy neekonomická a někdy působící negativně, takže výhody produkce trehalosy popisované v této patentové přihlášce lze nejlépe uskutečnit pomocí nekonstitutivních promotorů. Díky těmto nekonstitutivním promotorům je biosynthesa trehalosy v transgenních rostlinách podřízena dočasné kontrole (t.j. probíhá pouze v určitou dobu), topologické kontrole (t.j. je omezena pouze na určité části rostliny), nebo oběma typům kontrol zároveň.

Názvy rostlinných orgánů použité v tomto popisu jsou obecně používány v zelinářských a ovocnářských kruzích jak pěstiteli tak i zákazníky. Takto například slovo plod představuje ty části jabloně nebo jahodníku, které jsou prodávány za účelem jídla, ačkoli tyto skladované tkáně obsahující semena samy o sobě nejsou plody v přísném botanickém smyslu slova. Zmínili jsme již, že téměř všechny druhy cévnatých rostlin nejsou schopny syntetizovat trehalosu, takže termín trehalosu produkující rostliny nevyžaduje kvantitativní definici. Avšak možnost, že některé běžné rostliny (jiné než takzvané resurrection plants) produkují trehalosu během stresu, dosud nebyla prozkoumána. Tento vynález se týká genetického inženýrství rostlin s cílem vnést heterologní schopnost synthesy trehalosy (v tomto kontextu ji lze rovněž nazývat nová schopnost synthesy trehalosy). Požadovaný vzrůst obsahu trehalosy, ve srovnání s netransformovanou rostlinou, která roste za identických podmínek, buď představuje užitečné zlepšení tolerance ke stresu nebo jej lze využít pro extrakci trehalosy z rostliny za komerčním účelem.

Mnoho mikrobních organismů obsahuje enzymové systémy, které produkují trehalosa-6-fosfát (Tre6P) a hydrolyzují tuto látku na trehalosu. Například Saccharomyces cerevisiae obsahuje trehalososynthasový komplex zahrnující subjednotky o molekulové hmotnosti 56, 102 a 123 kDa (Londesborough a Vucrio (1993) Eur. J. Biochem. 216, 841-848), který kondensuje uridindifosfoglukosu (UDPG) a glukosa-6-fosfát (Glc6P) nejprve na Tre6P (Tre6Psynthasová reakce) a potom na volnou trehalosu (Tre6Pasová reakce). Za Tre6Psynthasovou a Tre6Pasovou aktivitu jsou zodpovědné subjednotky o 56 a 102 kDa a subjednotka mající molekulovou hmotnost 123 kDa má regulační vlastnosti a stabilizuje celý komplex. Jiné mikrobní systémy zahrnují systém Candida utiiis (Soier et al. (1989) FEMS Microbiol. Letters 61, 273-278), Escherichia coli (Glaever et al. (1988) J. Bacteriol. 170, 2841-2849),

Dictyosteiium discoídeum (Kiiiick (1979) Arch. Biochem. Biophys. 196, 121-123) a Mycobacterium smegmatis (Lapp et al. (1971) J. Biol. Chem. 246, 4567-4579), z nichž poslední dva systémy jsou schopny využívat adenindifosfoglukosu (ADPG) jako alternativu k UDPG. Málo je známo o subjednotkové struktuře těchto dalších mikrobních systémů. Mnohobuněčné organismy, které syntetizují trehaiosu, jako jsou Nematoda, hmyz a t.zv. resurrection plants”, pravděpodobně též obsahují enzymy mající Tre6Psynthasovou a Tre6Pasovou aktivitu.

V principu přenos kterékoli z těchto Tre6Psynthas do rostlin udělí rostlinám novou schopnost syntetizovat Tre6P. Bylo zjištěno, že některé rostliny, jako například tabák, mají vrozenou schopnost převádět Tre6P na trehaiosu, takže, překvapivě například, transformace tabáku samotným genem pro Tre6Psynthasu, vede k účinné produkci trehaiosy. Avšak, jestliže je endogenní konverse Tre6P na trehaiosu pomalá nebo vůbec neprobíhá, lze rovněž přenést Tre6Pasu z některého z vhodných zdrojů. Se systémy jako je kvasinkový enzym, kde Tre6Psynthasa a Tre6Pasa jsou subjednotky trehalosasynthasy, je výhodné kotransformovat rostliny geny pro TreěPsyntnasu a Tre6Pasu ze stejného zdroje, takže se vytvoří přirozený komplex enzymů. Ať je zdroj enzymů jakýkoli, lze trehaiosu vytvářenou v transgenních rostlinách extrahovat anebo tento cukr nám navodí zvýšenou toleranci k určitým typům stresu. Produkce trehaiosy v rostlinách transformovaných tímto způsobem určitými kvasinkovými geny již byla popsána (PCT/FI93/00049).

Avšak ačkoli akumulace trehaiosy v určitém čase (např. během vystavení stresu nebo ve zralé rostlině) a v určitých tkáních (např. zásobních orgánech nebo, ve vhodném čase, ve tkáních citlivých k mrazu) bude mít pravděpodobně positivní účinek, nebo alespoň nebude pro rostlinu škodlivá, existuje reálná možnost, že v jiném čase a v jiných tkáních bude akumulace trehalosy pro rostlinu škodlivá (Veluthambi et al. (1971) loc. cit.). Je proto výhodné používat rostlinný promotor (promotor je část genu, která stimuluje transkripci kódující sekvence), který nedovoluje plnou expresi genu nebo genů, a vyvolá syntnesu trehalosy až když rostlina je zralá, nebo se dostane do podmínek prostředí (jako je sucho nebo nízká teplota), kdy výhody přítomnosti trehalosy převýší její možné nevýhody pro rostlinu. V oboru je známo několik příkladů takových nekonstitutivnícn rostlinných promotorů, včetně promotoru malé subjednotky ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasy (Rubisco), který umožňuje světlem indukovanou expresi malé subjednotky RUBISCA (Krebbers et ai. (1988) Plant Mol. Biol. 11, 745-759).

Tabák a rostliny Arabidopsis transformované kódující sekvencí (otevřený čtecí rámec, ORF) kvasinkového genu TPS1 správně fúzovanou s promotorem atslA genu pro malou subjednotku Rubisco jsou známy. TPSl kóduje subjednotku kvasinkové trehalosasynthasy mající molekulovou hmotnost 56 kDa. Transformované rostliny jsou zdravé a fertilní, a obsahují ve svých listech trehalosu. Netransformovaný tabák nebo tabák transformovaný podobným vektorem bez genu TPSl neobsahují trehalosu. Tyto zveřejněné transgenní rostliny byly získány s použitím A. tumefaciens, který zprostředkoval transformaci, ale lze použít kterýkoli způsob dostupný v oboru, včetně přímé introdukce DNA mikroinjekcí, elektroporaci nebo bombardování částicemi (Gasser a Fraley (1989) Science 244, 1293).

Jedna z těchto transformovaných tabákových rostlin (Transformant 4) obsahuje aktivitu T're6Psynthasy. Volná, 56 kDa těžká subjednotka je nestabilní, jestliže ji izolujeme z intaktního kvasinkového komplexu trehalosasynthasy (Londesborough a Vuorio (1993) loc. cit.). Jsou popsány způsoby jimiž odborník dokáže kotransformovat rostliny TPS1 genem a jedním nebo oběma ostatními geny kvasinkové trehalosasynthasy (TPS2 a TSL1), a umístit je pod kontrolu rostlinných promotorů, např. promotoru atslA nebo některého vhodného promotoru, který je konstitutivní. Taková kotransformace často zvýší obsah trehalosy v rostlině ve srovnání s obsahem trehalosy u rostlin obsahujících pouze TPS1, protože subjednotky kódované TPS2 a TSL1 stabilizují subjednotku mající molekulovou hmotnost 56 kDa.

V rostlinách kotransformovaných genem pro Tre6Psynthasu (kontrolovaným indukovatelným promotorem) spolu s jedním nebo několika geny pro Tre6Pasu nebo regulační proteiny (jako například produkt TSL1) regulovanými konstitutivními promotory, bude produkce trehalosy kontrolována indukovatelným promotorem, protože Tre6Psynthasa katalyzuje první jedinečný krok biosynthesy trehalosy.

Bylo prokázáno, že transformované rostliny tabáku produkující trehalosu vykazují zvýšenou toleranci k suchu. Bylo to dokázáno v experimentech prováděných jak s oddělenými listy tak i s celými rostlinami. Zlepšená tolerance k suchu je vykazována zralými rostlinami i mladými rostlinkami potomstva transformantů získaného samosprášením. V tomto potomstvu tolerance k suchu kosegregovala se znakem TPS1, jak ukázala přítomnost subjednotky Tre6Psynthasy, mající molekulovou hmotnost 52 kDa, v zelených tkáních potomstva.

Tolerance k vodou vyvolanému stresu u uvedených transgenních rostlin je překvapující, protože množství trehalosy zjištěné v jejich tkáních se zdá být příliš malé, aby zajistilo osmotické pufrování vnitrobuněčného obsahu. Je možné, že trehalosa funguje tak, že chrání specifická místa, jako jsou membrány, nebo trehalosa či její prekursor (Tre6P) mění rostlinný metabolismus tak, že vyvolávají sekundární změny, které chrání buňky proti stresu.

Bylo zjištěno, že malé morfologické změny pozorované u primárních transformantů obsahujících genovou chiméru TPS1 genu, jako jsou například listy ve tvaru skalpelu, snížená apikální dominance nebo menší výška, většinou zmizely u potomstva, které ještě produkovalo trehalosu. Tyto alterace se zdají být většinou artefakty vyvolané kultivací ve formě tkáňových kultur. Avšak bylo zjištěno, že trehalosu produkující tabákové rostliny, včetně potomstva získaného samosprášením, rostou poněkud pomaleji, neboť se opožďují za kontrolními rostlinami o 1 až 2 týdny po 8-týdenním růstu za optimálních podmínek. Tato skutečnost ukazuje na to, že synthesa trehalosy v rostlinách, i když je pod kontrolou atslA promotoru, někdy zpomaluje růst. Tedy stresem indukované promotory, jako je LT178 (Nordin et al. (1993) Plant. Mol. Biol. 21, 641-653), lze použít v positivním smyslu k udržení normálních růstových rychlostí a výtěžků za podmínek nepřítomnosti stresu, a tyto promotory současně poskytují trehalosou indukovanou ochranu v přítomnosti stresu, tak jak je vysvětleno v Příkladu 5.

Tyto transgenní rostliny syntetizovaly trehalosu ačkoli byly transformovány pouze kvasinkovým genem TPS1 kódujícím Tre6Psynthasu a nikoli genem TPS2, který kóduje Tre6Pasu. Tedy některé rostliny mají endogenní aktivitu převádějící Tre6P na trehalosu. V některých případech je výhodné kotransformovat rovněž rostlinu genem kódujícím TreSPasu, jako je například TPS2, aby se zvýšila rychlost konverse T're6P na trehalosu. Dále je zřejmé, že podobné výsledky lze dosáhnout s geny pro Tre6Psynthasu (a TreSPasu), získanými z jiných organismů než z kvasinek. Řada těchto genů je homologních s TPS1 (a TPS2), a lze je snadno klonovat s použitím imunologických nebo oligonukleotidovýcn prób odvozených od enzymů a genů kvasinkového systému. Například TreéPsynthasa Mycobacterium smegmatis obsahuje 56 kDa těžký polypeptid, který křížově reaguje s antisérem připraveným proti purifikované subjednotce kvasinkové Tre6Psynthasy o molekulové hmotnosti 56 kDa. Aminokyselinové sekvence tryptických peptidů z enzymu M. smegmatis jsou známy a mají blízkou sekvenční nomologii s kvasinkovým enzymem. Odborník dokáže snadno klonovat geny pro Tre6Psynthasu a Tre6Pasu z mnoha organismů, jestliže použije uvedené přístupy. Náš vynález se týká transformace rostlin geny pro Tre6Psynthasu a Tre6Pasu, získanými z jakéhokoli vhodného organismu a fúzovanými s vhodnými rostlinnými promotory.

Rostliny obsahující trehalosu jako výsledek transformace jedním nebo několika geny pro trehalosasynthasu, lze použít několika způsoby. Například trehalosu lze extrahovat z rostlin na komerční bázi. Tato trehalosa je dostatečně levná pro použití ve velkém množství pro zachování chuti, vůně a struktury látek v potravinách během sušení. Pro tento způsob použití je lépe, jestliže je trehalosa akumulována v zásobním orgánu, jako je například hlíza bramboru, kořen cukrové a jiné řepy, nebo cibule cibulovitých rostlin. Byly popsány způsoby pro transformaci těchto uvedených a mnoha jiných plodin (Lindsey (1992) J. Biotechnol. 26, 1-28), avšak náš vynález není omezen těmito rostlinami, které jsou často používány jako modely molekulárními biology. Způsoby -vyvinuté pro modelové rostliny lze upravit pro použití s jinými rostlinami. V důsledku toho lze tuto patentovou přihlášku použít například pro stonek a listy transformované cukrové řepy, nebo plod banánu. V oboru jsou známy rostlinné promotory (např. patatinový promotor), které vyvolávají specificky expresi v zásobním orgánu. V jednom provedení tohoto vynálezu je kódující sekvence genu pro Tre6Psynthasu (např. TPS1) zfúzována s takovým promotorem stejným způsobem, jako byla kódující sekvence TPS1 zfúzována s promotorem atsl, a vhodné rostliny jsou transformovány těmito konstrukty DNA. Trehalosu, která se akumuluje v zásobních orgánech lze potom extrahovat.

V dalším provedení tohoto vynálezu, kdy se trehalosa akumuluje v tkáních rostliny, dochází ke zlepšení skladovacích vlastností po sklizni. V důsledku toho ztrácejí oddělené listy transformovaného tabáku vodu pomaleji než listy tabáku netransformovaného, a i po ztrátě vody neztrácejí barvu (obr. 5). Tento aspekt lze využít i u jedlých a okrasných rostlin. U rostlin používaných jako potrava například zkroucení a odbarvení různých druhů komerčně prodávaných salátů které nastává po sklizení rostlin, představuje závažný ekonomický problém, zejména v prodejnách maloobchodu. Konečné náklady však vždy platí zákazník.

Trehalosu produkující hlávkový salát (locika) zajistí zákazníkům levnější a lepší saláty. Podobně lze uvažovat i o jiných druzích rostlin, které se používají v kuchyni, zejména se to týká zeleniny, kde se v kuchyni používají listy, jako například zelí, brokolice, špenát, kopr nebo petržel, anebo ostatní zelená zelenina jako hrášek a fazol šarlatový. Řada okrasných květin, například růže, tulipány a narcisy, jsou po uříznutí dopravovány dále. I v podmínkách nákladné dopravy v chladících vozech nebo letadly, dochází k velkým ztrátám na zboží. Opět náklady za tyto škody zaplatí zákazník, který v případě využití okrasných květin produkujících trehalosu získá levnější a krásnější produkty, které lépe zadržují svůj obsah vody a méně podléhají odbarvování. V tomto případě týkajícím se našeho vynálezu, je gen pro Tre6Psynthasu zfúzován s rostlinným promotorem, který je zvolen tak, že se trehalosa akumuluje v rostlinných částech, které se mají sklízet. Například promotor atslA vyvolává expresi Tre6Psynthasy v listech, horním stonku a květních pupenech tabáku a trehalosa se akumuluje v těchto částech. Avšak vynálezci uvádějí ve známost, že rostliny jako tabák přenášejí trehalosu z místa její synthesy do tkání, které tento cukr nesyntetizují. Takto byla malá množství trehalosy rovněž nalezena v kořenech těchto transgenních rostlin tabáku, ačkoli nekonstitutivní promotor astlA nevyvolal expresi TreóPsynthasy v kořenech.

V aspektu vynálezu, který má vztah k tomu co je uvedeno výše, jsou jedlé části transformovaných rostlin obsahujících trehalosu, jako například rajčata, bobule a jiné plody, zpracovávány na pyré, pasty, želé a zavařeniny, které mají čerstvější a bohatší vůni a chuť, díky tomu, že obsahují trehalosu. Bylo zjištěno (W089/00012), že přidání trehaiosy do takových potravinových produktů zlepšuje zachování jejich chuti a vůně, zejména, jestliže zpracování zahrnuje sušení. Tento vynález obchází potřebu přidávat trehalosu tím, že dává k dispozici rostlinu, která již sama trehalosu obsahuje. Výhodou z hlediska tohoto aspektu našeho vynálezu je použití promotorů takových jako je například patatinový promotor, které směrují synthesu trehaiosy primárně do zásobního orgánu cílové rostliny.

Bylo ukázáno, že transformovaný tabák, který produkuje trehalosu, má zvýšenou odolnost proti suchu. Obecně jsou transformované rostliny obsahující trehalosu odolnější vůči suchu, mrazu, vysokému obsahu soli a jiným stresům, v porovnání s netransformovanými rostlinami. Sucho, mráz a osmotický stres negativně ovlivňují rostliny zejména tím, že odnímají vodu z buněk a tím poškozují membrány a proteiny. Tento efekt je v podmínkách in vitro zmírněn trehaiosou (Crowe et al. (1992) Annu. Rev. Physiol. 54, 579). V tomto aspektu vynálezu je použitý rostlinný promotor takový, který je indukován stresem. V oboru jsou takové promotory známy, například LTI78 (Nordin et al. (1993) Plant. Mol. Biol. 21, 641-653) a RAB18 (Lang a Palva (1992) Plant. Mol. Biol. 20, 951-962). Takový promotor zabrání synthese trehaiosy pokud tato není potřeba. Pro rostliny, které rostou dobře jestliže obsahují trehalosu, tohoto aspektu vynálezu lze dosáhnout, aniž bychom se uchýlili k použití stresem indukovaného promotoru. Avšak použití stresem indukovaných promotorů k zabránění produkce trehalosy, pokud ji není třeba, má další výhody v tom, že se vyhneme sníženému výtěžku rostliny, vyplývajícímu z částečného využití kapacity fotosynthesy na synthesu trehalosy, a tím i možnému zpomalení růstu, tak jak bylo ukázáno pro tabák obsahující chiméru patslA-TPSl. Tento aspekt má použití nejen v oblasti rostlin používaných jako potrava, nýbrž i v případě okrasných rostlin používaných v zahradě nebo v místnostech. Transformované, ke stresu tolerantní okrasné rostliny vyžadují méně intenzivní a méně odbornou péči ve srovnání s odpovídájícícmi netransformovanými rostlinami. Pomalejší růst některých okrasných rostlin produkujících trehalosu a malé morfologické změny pozorované alespoň u primárních transformantů, nejsou vždy nevýhodou: pomalejší růst a nový vzhled někdy představují atraktivní charakteristiky, zejména v případě okrasných rostlin používaných v místnostech.

V ještě dalším aspektu vynálezu, je gen pro Tre6Psynthasu vhodně zfúzován s rostlinným promotorem (např. LTI78 nebo RAB18), který je aktivován specifickou událostí nebo souborem podmínek (např. chladno nebo sucho), takže lze spustit akumulaci komerčně extrahovatelných množství trehalosy ve zralé rostlině krátce před sklizní, a tím se vyhnout jakýmkoli negativním vlivům trehalosy na časný vývoj některých rostlin.

Podle výšeuvedeného zveřejnění jsou transgenní rostliny podle tohoto vynálezu jednoděložné rostliny, jako například kukuřice, oves, proso, pšenice, rýže, ječmen, čirok, laskavec, cibule, chřest nebo cukrová třtina, nebo dvojděložné rostliny, například vojtěška, sója, petúnie, bavlna, cukrová řepa, slunečnice, mrkev, celer, zelí, okurka, paprika, rajče, brambor, čočka, len, brokolice, tabák, fazole, locika, řepka, květák, špenát, růžičková kapusta, artyčok, hrách, okra, dýně (Cucurbita), kapusta kadeřavá, Brassica oleracea, čajovník nebo kávovník.

Je ukázáno, že kvasinkový gen TPS1 a jeho produkt jsou kompatibilní s biochemickým uspořádáním tabáku: gen byl exprimován s vysokou účinností a subjednotka o molekulové hmotnosti 56 kDa vyvolala synthesu trehalosy. Avšak v oboru je známo, že rostlinné geny někdy mají nižší poměry A+T než například mikrobní geny, a že hladinu exprese heterologních genů v rostlinách lze zvýšit změnou použití kodonu, zejména blízko startu kódující sekvence, na hodnotu nalézanou v rostlinách (Periak et al. (1991) 88, 3324-3328). Domníváme se, že tyto a podobné modifikace genů jsou výhodné v tomto vynálezu.

Je rovněž dobře známo, že se v genech vyskytují přirozené mutace. Tyto a arteficielní změny v DNA sekvenci někdy mění aminokyselinové sekvence kódovaných polypeptidú. Označení TPS1 (nebo TPS2 nebo TSL1), tak jak je použit zde, zahrnuje všechny DNA sekvence homologní s TPS1 (nebo TPS2 nebo TSL1), které kódují polypeptidy s požadovanými funkčními nebo strukturálními vlastnostmi subjednotky kvasinkové trehalosasynthasy, mající molekulovou hmotnost 56 kDa (nebo 102 kDa nebo 123 kDa). Podobně označení geny pro Tre6Psynthasu (nebo Tre6Pasu nebo regulační polypeptidy zahrnuje nejen takové geny, které lze snadno izolovat z přírodních organismů (např. použitím nukleotidových prob vytvořených ze známých sekvencí TPS1 nebo TPS2 nebo TSL1), ale rovněž přírodní a umělé varianty, které kódují polypeptidy s požadovanými funkčními a strukturálními vlastnostmi polypeptidů kódovaných původně izolovanými geny.

Příklady provedení vynálezu

Obecný materiál a metody

Materiál. Byly použity rostliny Nícotiana tabacum cv. SRÍ a Arabidopsis thaliana L. Heynh. ekotyp C-24.

Kvasinkové geny TPS1 (dříve nazývaný TSS1) kódující Tre6Psynthasovou subjednotku trehalosasynthasy, mající molekulovou hmotnost 56 kDa, a TSL1 kódující regulační subjednotku trehalosasynthasy o molekulové hmotnosti 123 kDa byly získány z plasmidů pALK752 a pALK754 popsaných Vuoriem et al. (1993) Eur. J. Biochem. 216, 849-861. Kvasinkový gen TPS2 byl získán z plasmidů poskytnutého Dr. Claudio De Virgiliem a Dr. Andresem Wiemkenem z Botanisches Institut der Universitat Basel ve Švýcarsku a klonován do místa Sací plasmidů YCplaclll. Tento gen (popsaný v práci De Virgilia et al. (1993) Eur. J. Biochem. 212, 315-323) kóduje aminokyselinové sekvence odvozené ze subjednotky o molekulové hmotnosti 102 kDa, tak jak je ukázáno v tabulce 1 v práci Vuorio et al. (1993, ioc. cit.). Antiséra připravená proti kvasinkové trehalosasynthase (anti-TPS/P) a 56 kilodaltonové subjednotce (anti-57K) i obecně používané chemikálie byly získány ze zdrojů uvedených v práci Vuorio et al. (1993, ioc. cit.). Vakuolární trehalasa byla částečně purifikována tak jak je popsáno Londesboroughem a Varimem ((1984) Biochem. J. 219

511-518) ze suc“ gal~ mel“ mal“ kvasinkového kmene (ALKO2967) a nehydrolysovala sacharosu, maltosu ani melibiosu.

DNA manipulace. Všechny manipulace s DNA byly prováděny za použití zavedených laboratorních technik (Sambrook et ai. (1989) v Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York). Kmeny E. coli DH5 a MC1061 byly použity pro plasmidové preparáty. Promotor použitý k regulaci exprese TPS1 pocházel z genu atslA A. thaliana, který kóduje malou subjednotku Rubisco (Krebbers et ai. (1988) ioc. cit.).

Pro konstrukci chimérického genu atslA-TPSl, promotorový fragment atslA, kterému chyběla sekvence pro transitní peptid, byl amplifikován pomocí PCR z plasmidů pGSFR401. Synthetické oligonukleotidové primery byly použity k vytvoření místa pro EcoRI na 5'konci a místa Xbal na 3'konci amplifikovaného fragmentu. Amplifikovaný produkt získaný pomocí PCR byl štěpen příslušnými restrikčními enzymy a po purifikaci na agarosovém gelu byl vložen do plasmidů pUC19 rozštěpeného pomocí enzymů EcoRI a Mlul. Kvasinkový gen TPSl byl amplifikován z plasmidů pALK752 popsaného výše. Výsledný fragment obsahoval 5’ Mlul a 3'Xbal místa. Po digesci a purifikaci byl fragment ligován za patslA v pUC19. Fragment obsahující konstrukt promotor-TPSl byl připraven pomocí restriktas EcoRI a Xbal a potom vložen do pBluescriptlI SK⁺ (Stratagene)-odvozeného plasmidů nesoucího 3'konec T-DNA genu G7 zahrnujícího jeho polyadenylační signál a pravou hraniční sekvenci T-DNA. Nakonec byla celá genové chiméra vložena jako EcoRI-SacI fragment do rostlinného transformačního vektoru pDElOOl (Denecke et ai. (1992) EMBO J. 11, 2345-2355) obsahujícího chimérní gen pro resistenci ke kanamycinu pNOS-NEO-3'OCS jako selektivní markér. Výsledkem byl plasmid pKOHSl nesoucí genovou chiméru patslA-TPSl-3’G7. Konstrukty byly klonovány v kmeni E. coli DH5 pomocí transformace a poté převedeny pomocí elektroporace (Dower, Miller a Ragsdale (1988) Nucl. Acids Res. 16, 6127-6145) do Agrobacterium tumefaciens (C58C1 rif®¹) obsahujícího neonkogenní Ti plasmid pGV2260 (Deblare et al. (1995) Nucl. Acids Res. 13, 2777-2788).

Ostatní konstrukty byly připraveny obdobným způsobem.

Růst rostlinného materiálu. Pro zajištění růstu ve sterilních podmínkách byly sterilizované explantáty Nicotiana tabacum (SRÍ) umístěny do skleněných nádob obsahujících pevné MS medium (Murashige a Skoog (1962) Physiol. Plant. 15, 473-497) do něhož byla přidána sacharosa v koncentraci 2 hmotn. % (MS-2). Tyto nádoby byly potom umístěny do kultivační komory kde bylo možno kontrolovat podmínky růstu, kde rostliny rostly při 22 °C s fotoperiodou 16 hodin. Explantáty byly pravidelně převáděny do nových nádob obsahujících MS-2 medium, aby byl zajištěn kontinuální růst za sterilních podmínek. Skleníkové rostliny rostly v půdě v květináčích a byly denně zalévány. Transformované rostliny A. thaliana byly nejprve kultivovány za sterilních podmínek v dětských lahvích v kontrolovaném prostředí tak jak je popsáno výše pro tabák, a později byly převedeny do půdy v květináčích umístěných ve skleníku, aby bylo dosaženo produkce semen. Semena z primárních transformantů byla buď přímo vsazena do půdy, aby bylo dosaženo nového cyklu produkce semen, nebo byl jejich povrch sterilizován a semena byla kultivována ve sterilních podmínkách na kultivačních destičkách o 24 jamkách pro budoucí molekulární analysu.

Transformace rostlin. Tabák a A. thaliana byly transformovány následujícím způsobem. Počátečním materiálem byly vyříznuté listy tabáku a kořeny A. thaliana. Transformace a tkáňové kultury byly prováděny tak jak popsal Valvekens et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5536-5540) s následujícími modifikacemi. Izolované kořeny nebo listy byly preinkubovány na pevném, kalusy-indukujícím mediu (CIM) po dobu 4 dnů, kořeny byly nařezány na malé segmenty (1-2 mm) a listy byly nařezány na větší kousky (10-20 mm) a přeneseny do 20 ml tekutého CIM. 3',5’-Dimethoxy-4'hydroxyacetofenon byl přidán (0,2 mg/1) před infekcí Agrobacteriem (C58C1 rif^R). Bakterie použité pro infekci byly kultivovány přes noc v YEB mediu (Vervliet et al. (1975) J. Gen. Virol. 26, 33-48), které obsahovalo vhodná antibiotika, při 28 °C, a byly odděleny centrifugací. Bakteriální pelet byl pak resuspendován v 10 mM MgSO^, bakterie byly přidány k rostlinné tkáni a systém byl jemně míchán po dobu 15 minut. Nadbytečná tekutina byla slita a kořeny přeneseny na sterilní filtrační papír. Po dvoudenní kokultivaci na pevném CIM byla rostlinná tkáň opláchnuta 3 až 4 krát tekutým CIM, aby se tkáň zbavila bakterií, a přenesena na selektivní indukční medium (SIM). Po 7 dnech růstu byly explantáty s diferenciovanými morfogenetickými sektory přeneseny na čerstvé SIM.

Extrakce proteinů pro Western analysu. Rostlinné vzorky o hmotnosti 100 až 200 mg čerstvé váhy byly homogenizovány skleněnou tyčinkou v 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavkách se 100 1 pufru na extrakci proteinů (50 mM Tris/HCl pH 7,2, 250 mM sacharosa, 5 mM EDTA, 10 mM MgCl₂, 1 mM CaCl^, 10 mM β-merkaptoethanol, 1 mM fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 30

M pepstatin, 50 Μ leupeptin a 15 Μ aprotinin). Nerozpustný materiál byl odstraněn dvěma centrifugacemi (13 000 g, 10 minut). Koncentrace proteinů v supernatantech byla měřena podle Bradfordové (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254) s použitím hovězího albuminu jako standardu. Stejná množství rozpustných proteinů byla nanesena na SDS-PAGE pro imunologické studie.

SDS-PAGE a imunologické techniky. Proteiny byly odděleny pomocí SDS-PAGE elektroforesy (Laemmli (1970) Nátuře 227, 680-685). Proteiny byly detekovány technikou imunobiottingu s antisérem anti-57 (ředění 1/1000) a králičí protilátkou proti antiséru 57 na níž byla navázána alkalická fosfatasa jako markér. Pro Western biotovací techniku byly bílkoviny elektrořoreticky přeneseny na nitrocelulosové filtry a obarveny pomocí 0,5 % Ponceau Red v 5 % kyselině octové, aby byla potvrzena rovnoměrnost nanášení a úspěšnost přenosu. Filtry byly potom blokovány přes noc 5 % suchým mlékem v prášku, které neobsahovalo tuk, a detekce a barvení byly provedeny standardním způsobem.

Stanovení TreóPsynthasy. Přibližně 500 mg zmrazeného rostlinného materiálu bylo zváženo a rozetřeno na jemný prášek v třecí misce s pevným CC/. Prášek byl převeden do 0,7 mi 50 mM roztoku HEPES/KOH pH 7,0 obsahujícího 1 mM benzamidin, 2 mM MgCi^, 1 mM EDTA a 1 mM dithiotreitol (HBMED), dále obsahujícího 1 mM PMSF a 10 M koncentrace pepstatinu A a leupeptinu, a směs byla ponechána aby roztála. Výsledný homogenát byl zcentrifugován 10 minut při 17 OOOg a v supernatantu byla stanovena aktivita Tre6Psynthasy způsobem podle Lappa et al. (1971) J. Biol. Chem. 246,

4567-4579). Vzorek (10 1) byl přidán k 90 1 reakční směsi obsahující 40 mM HEPES/KOH pří 7,0, 10 mM MgCl^, 10 mM glukosa 6-fosfát, 5 mM fruktosa 6-fosfát, 5 mM uridindifosfoglukosu (UDPG) a 1 mg/ml hovězího albuminu, a směs byla inkubována při 30 °C po požadovanou dobu. Reakce byla zastavena zahříváním na 100 °C po dobu 2 minut. Deriváty cukrů (včetně veškeré vytvořené sacharosy) kromě trehalosy a trehalosa 6-fosfátu byly hydrolyzovány přidáním 50 1 0,6 M HC1 a zahříváním při 100 °C po dobu 5 minut a potom bylo přidáno 50 1 8 % NaOH a směs byla opět zahřívána 15 minut při 100 °C. Zbývající cukry (t.j. trehalosa a trehalosa 6-fosřát) byly stanoveny pomocí anthronového stanovení (Trevelyan a Harrison (1956) Biochem J. 63, 23-33).

Stanoveni trehalosy. Přibližně 500 mg zmrazeného rostlinného materiálu bylo rychle odváženo do skleněné zkumavky. Byla přidána horká destilovaná voda (1 ml) a směs byla povařena po dobu 20 minut a listová hmota byla občas rozrušována tupou skleněnou tyčinkou. Kapalná fáze byla odebrána Pasteurovou pipetou a pevná fáze znovu extrahována 0,5 ml vody. Spojené kapalné fáze byly přečištěny centrifugací. Spojené pevné zbytky byly vysušeny do konstantní váhy při 107 °C (suché hmotnosti listů v průměru činily 5,1 % čerstvých hmotností). Supernatant byl analyzován s použitím kapalinového chromatografu s Dionexem DX-300, který byl vybaven Dionexovým pulsním elektrochemickým detektorem (PED-2). vzorky (20 1; ve třech paralelách) byly injikovány pomocí předkolony Carbopac PA-1 (4 x 50 mm) na kolonu Carbopac PA-1 (4 x 250 mm) a eluovány vodou rychlostí 1 ml/min. Eluát byl smísen s reagens (0,6 ml/min 0,3 M NaOH). Trehalosa se objevila ve 3.

minutě, daleko před glukosou a sacharosou, jejichž maxima se objevovala až okolo 20. minuty.

Příklad 1

Produkce trehalosy tabákovými rostlinami transformovanými kvasinkovým TPS1 genem regulovaným atslA promotorem. Transformované a kontrolní rostliny tabáku byly kultivovány jak ve sterilních podmínkách in vitro tak i ve skleníku. Zralí transformanti neměli odlišný fenotyp od netransformovaných kontrol nebo od kontrol transformovaných vektorem pDElOOl (který neobsahoval TPS1). Listy byly sklizeny v 09.00 hodin, zmrazený a uskladněny při teplotě -70 °C nebo nižší dokud nebyly analyzovány.

Z 26 testovaných transformantů resistentních k účinku kanamycinu jich 20 produkovalo detekovatelná množství imunoreaktivních polypeptidú o očekávané velikostí, jestliže byly testovány s antisérem připraveným proti purifikované subjednotce Tre6Psynthasy kvasinkové trehalosasynthasy, která má molekulovou hmotnost 56 kDa. Příklady jsou uvedeny na obr. 2. Tabulka 1 shrnuje obsah trehalosy v listech.

Výsledky ukazují, že kvasinkový gen TPS1 je v tabáku účinně exprimován, jestlže je jeho promotor nahrazen promotorem atslA. Specifický signál pozorovaný na Western blot stanoveních má správnou molekulovou hmotnost. Nejsilnější signály (např. signál z Transformanta 4 kultivovaného in vitro) byly jen o málo slabší v přepočtu na jednotku vneseného proteinu než signály získané z kvasinkového materiálu sklizeného ve stacionární fázi růstu. Exprese TPS1 byla

30· doprovázena objevením se trehalosy v tkáni listů, což bylo identifikováno jak chováním na HPLC tak i skutečností, že cukr byl degradován vysoce specifickou trehalasou (viz rovněž obr. 3). Různí transformanti exprimovali produkt TPS1 v různých

Tabulka 1. Obsah trehalosy v TPS1 transformantech tabáku.

Tabáková rostlina Zvláštní působení Trehalosa (mg/g čerstvých listů)

Rostliny in vitro

Netransformovaná	SRÍ	-	0,002
pDElOOl kontrola		-	0,002
Transformant 1		-	0,02
Transformant 3		-	0,009
Transformant 4		-	0,067
Transformant 8		-	0,075
Transformant 8	extrakce vody	ethanolem místo	0,055

Skleníkové rostliny

pDElOOl kontrola	-	0,002
Transformant 1	-	0,16
Transformant 4	-	0,16
Transformant 4	alkalická fosfatasa“	0,13
Transformant 5	-	0,052
Transformant 6	-	0,044
Transformant 8	-	0,039
Transformant 8	specifická trehalasa	0,021
Transformant 19	-	0,053
Transformant 19	alkalická fosfatasa“	0,060
Transformant 19	specifická trehalasa	0.016
Transformant 25	-	0,036
Transformant 26	-	0,11

“Extrakt byl podroben působení alkalické fosfatasy za podmínek, kdy nosič [¹⁴C]trehalosa 6-fosfát byl defosforylován.

hladinách z důvodů, které dosud nejsou známy. Se zjevnou výjimkou, kterou byl Transformant 8, množství trehalosy nalezené v listech zhruba korelovalo se silou signálu 56 kDa ve Western blot stanoveních (srovnej obr. 2 a tabulku 1). Ačkoliv tito transformanti nenesou gen kódující rekombinantní

Tre6Pasu, nebyl podán důkaz, že rostliny akumulovaly více Tre6P než trehalosy. Zřejmě tabák má fosfatasy, které jsou schopny přeměnit Tre6P na trehalosu což ukazuje, že alespoň v případě této rostliny je klíčovým enzymem nutným k vnesení trehalosové synthetické dráhy Tre6Psynthasa, a že vnesení tohoto samotného enzymu je vhodné, i když ne nutně optimální.

Určení distribuce v tkáních subjednotky Tre6Psynthasy mající molekulovou hmotnost 56 kDa v transgenní linii 4 ukázalo, že značná množství tohoto polypeptidu lze nalézt ve všech zelených částech rostliny vyjma nižšího stonku, ale nikoli v kořenech (obr. 4). Distribuce je ve shodě s tkáňovou specificitou exprese atslA genu (De Almeida et ai. (1989) Mol. Gen. Genet. 218, 78). Obr. 4 rovněž ukazuje, že tkáně v nichž byla Tre6Psynthasa exprimována, rovněž obsahovaly trehalosu. Navíc byla malá množství trehalosy nalezena v kořenech což ukazuje, že transgenní tabák transportuje trehalosu z místa synthesy do jiných tkání.

Výsledky rovněž ukázaly, že tabákové rostliny exprimující TPSl regulovaný promotorem atslA a akumulující trehalosu v zelených tkáních během osvitu denním světlem jsou zdravé a mají normální vzhled. Ačkoli primární transformanti obsahující genovou chiméru TPSl měli některé malé morfologické alterace, jako například listy ve tvaru skalpelu, sníženou apikální dominanci a nižší výšku (viz obr. 5 a 6), většina změn se neprojevila v samosprášeném, TPS pozitivním potomstvu, které stále produkovalo trehalosu (viz obr. 6). Proto se zdají být morfologické změny v primárních transformantech artefakty tkáňové kultury, spíše než výsledky produkce trehalosy. Vysoká hladina produkce Tre6Psynthasové subjednotky a přítomnost trehaiosy však vedly k 20 až 50 % snížení růstové rychlosti u transgenních rostlin za normálních podmínek ve srovnání s netransformovanými kontrolami. Zjevně normální fenotyp těchto transgenních rostlin je v kontrastu k publikované toxicitě exogenně přidané trehaiosy k některým rostlinám (Veiuthambi et al. (1981) loc. cit.'). Tyto výsledky ukazují, že produkce trehaiosy in planta pod kontrolou promotoru atslA není pro tabák toxická, ačkoli může přispívat k určitému snížení růstové rychlosti. Indukovatelné promotory spouštěné specifickými událostmi, jako je sucho a zima, lze použít k minimalizaci efektu na snížení růstové rychlosti, tím že tyto promotory vyvolávají produkci trehaiosy pouze když je tato zapotřebí.

Na základě proteinové analysy představují obsahy trehaiosy v nejiepších transformantech uvedené v tabulce 1 (např. 16 mg/g proteinu u Transformanta 4) již alespoň 20 % hladiny při níž nastává jasné zlepšení thermotoierance u kvasinek (De Virgiiio et al. (1990) FEBS Letters 273, 107-110).

Někteří TPS1 transformanti a kontroly byly analyzovány z hlediska přítomné T're6Psynthasové aktivity. Výsledky ukázané v tabulce 2 jsou průměry jejich limity ze stanovení v čase 0, 15 a 30 minut provedeném ve dvou paralelních vzorcích. U kontrol byla Tre6Psynthasová aktivita nulová. U Transformanta 4 se cukr stabilní v kyselém i alkalickém prostředí akumuloval akumulace vyžadovala (Fru6P;

tento v přítomnosti UDPG a Gic6P. Tato

GlcP ale nikoli fruktosa 6-fosfát hexosafosfát aktivuje nativní trehalosasynthasový komplex kvasinek) a neprobíhala, jestliže byl UDPG nahrazen ADPG (enzym purifikovaný z kvasinky rovněž nepoužívá ADPG). Akumulovaný cukr je pravděpodobně trehalosa nebo Tre6P, protože jiné produkty jsou zničeny hydrolysou. Analysa HPLC ukázala, že nešlo o trehalosu. Tedy za podmínek in vítro stanovení je Tre6P syntetizován extrakty Transformanta 4 rychleji než je konvertován na trehalosu. To ukazuje, že celkovou rychlost synthesy trehaiosy v listech lze zvýšit kotransformací s TPS2, který kóduje subjednotku TreóPasy.

Tre6Psynthasová aktivita kvasinkových extraktů zjištěná způsobem použitým v tabulce 2 souhlasila s aktivitou zjištěnou měřením objevujícího se UDP tak jak popsali Londesborough a Vuorio ((1991) J. Gen. Microbiol. 137, 323-330). Dále, kvasinkové extrakty měřené v přítomnosti extraktů tabákových rostlin nebyly inhibovány. Tedy nepřítomnost aktivity v kontrolních rostlinách v tabulce 2 není dána interferencí s některým faktorem přítomným v tabákových extraktech.

Tabulka 2. Tre6Psynthasová aktivita TPS1 transformovaných a kontrolních tabákových listů (všechny výsledky byly získány s rostlinami za sterilních podmínek in vitro).

Transformant Směs stanovení Aktivita Tre6Psynthasy (mU/g čerstvých listů)

		15	min	30	min
Netransformovaná
kontrola	úplná	3	47	3	21
PDE1001 kontrola	úplná	22	35	7	8
Transformant 4
pokus 1	úplná	259	147	60	6
Transformant 4
pokus 2	úplná	128	39	155	22
	bez GicP	12	19	-1	12
	bez Fru6P	153	10	144	3
	ADPG místo UDPG	0	52	4	21

TreóPsynthasová aktivita zjištěná u Transformanta 4 byla nestabilní. U některých extraktů aktivita zmizela během několika hodin, kdy byly skladovány na ledu. Avšak specifický pás pozorovaný u analys typu Western byl stále přítomen prakticky v nezměněné intenzitě v extraktech, které byly uskladněny 24 hodin při teplotě místnosti. Je tedy pravděpodobné, že konformace TreóPsynthasové subjednotky se mění v průběhu skladování tabákových extraktů. Tyto výsledky ukazují, že zvýšená aktivita Tre6Psynthasy bude dosažena transformací tabáku současně TPS1 a jednou nebo několika jinými subjednotkami kvasinkové trehalosasynthasy, čímž se zvýší konformační stabilita subjednotky TreóPsynthasy.

Příklad 2

Transgenní Arabidopsis thaliana.

Rostliny A. thaliana obsahující TPS1 regulovaný promotorem atslA byly konstruovány stejným způsobem, jaký je popsán výše pro tabákové transformanty. Vzhled těchto transformovaných rostlin Arabidopsis je rovněž normální a rostliny jsou zdravé a produkují fertilní semena. Analysa Western typu rostlin kultivovaných ze semen primárních transformantů ukázala, že rostliny obsahovaly subjednotku kvasinkové trehalosasynthasy mající molekulovou hmotnost 56 kDa (obr. 10). Je zřejmé očekávat, že tyto rostliny akumulují trehalosu v zelených tkáních.

Příklad 3

Odolnost trehalosu produkujících rostlin tabáku k sušení.

Aby bylo možné stanovit zda množství trehalosy produkovaná transgenním tabákem jsou dostatečná, aby zvýšila odolnost k sušení, byly oddělené listy z kontrol a transgenních linií pěstovaných in vitro sušeny vzduchem (25 % relativní vlhkost, RH) (obr. 5). Zatímco oddělené listy kontrolních rostlin rychle ztrácely vodu a ukazovaly známky hnědnutí po 3 hodinách stresu, listy trehalosu produkujících rostlin zůstaly zelené až do 24 hodin při jasně snížené ztrátě vody. Protektivní účinek trehalosy je tedy dvojí: za prvé, oddělené listy transgenních rostlin syntetizujících trehalosu nejprve projevovaly lepší retenci vody. Teprve po dlouhém sušení tento rozdíl mezi trehalosu produkujícími a kontrolními rostlinami zmizel. Za druhé, kontrolní listy vykazovaly jasné známky stárnutí a hnědnutí. Naopak listy z trehalosu produkujících rostlin zůstaly zelené alespoň 24 hodin a teprve prodloužené sušení (několik dní) vyvolalo určité zhnědnutí. Existoval jasný rozdíl mezi trehalosu produkujícími a kontrolními rostlinami, i při stejném obsahu vody. Trehalosa tedy chrání rostlinnou .tkáň před účinky dehydratace a snižuje rychlost jakou se voda ztrácí. Hnědnutí by alespoň částečně mohlo být způsobeno Maillardovou reakcí, kdy redukující cukry reagují s volnými aminoskupinami polypeptidú a aminokyselin, a vzniká hnědá barva. Jako neredukující cukr se trehalosa neúčastní této reakce, a dokonce inhibuje reakci mezi jinými cukry a proteiny (Roser a Colaco (1993) New Scientist 1873, 24).

Ochrana oddělených listů trehalosou před poškozením účinkem sušení ukázala, že trehalosa by měla mít podobný účinek i na úrovni celých rostlin. Abychom prokázali, že trehalosa zvyšuje toleranci intaktních rostlin k vysychání,

Transgenní zpomalenou byly rostliny kultivované in vitro vystaveny sušení vzduchem (30 % RH, obr. 6A). Kontrolní rostliny ztratily turgor a zvadly během 3 až 4 hodin. Naopak trehaiosu produkující transgenní rostliny naznačovaly ztrátu turgoru po prodlouženém sušení. Po 17 hodinách sušení byly rostliny rehydratovány a zkoumáno přežívání rostlin (obr. 6A). Netransformované kontrolní rostliny tento pokus nepřežily a ani po prodloužené rehydrataci nedošlo k jejich zotavení. Naopak, trehaiosu produkující transgenní linie, ačkoli byly zřetelně zvadlé a ztratily většinu jejich tkáňové vody (pokles až na hodnotu 30 % reziduáiní čerstvé hmotnosti), přežily 17 hodin sušení.

Zvýšené přežívání podmínek sucha se ukázalo i u mladých rostlinek (obr. 6B). Když byly 3 týdny staré rostlinky transgenní linie 8 spolu s netransformovanými a vektorem transformovanými kontrolními rostlinkami vystaveny sušení vzduchem (50 % RH), byl zjištěn jasný rozdíl v toleranci k suchu mezi trehaiosu produkujícími a kontrolními rostlinami.

trehalosa pozitivní linie 8 vykazovala jak ztrátu turgoru tak zvýšené přežívání dehydratujícího stresu ve srovnání s kontrolními rostlinami (obr. 6B).

Příklad 4

Produkce trehaiosy rostlinami kotransformovanými genem kódujícím Tre6Psynthasu a jedním nebo několika geny kódujícími Treópasu nebo regulační poiypeptid.

Odborník dokáže připravit vektory obsahující kódující sekvence kvasinkových genů TPS2 a TSL1 pod kontrolou atslA promotoru a použít je k transformaci tabáku, Arabidopsis, a jiné rostliny způsoby, které jsou popsány v Obecném Materiálu a Metodách a v Příkladu 1. Rostliny najednou trasformované pomocí TPS1 a jedním nebo oběma dalšími geny TPS2 a TSL1 lze získat křížením jednotlivých transformantů, další transformací již transformované rostliny druhým genem nebo transformací vektory obsahujícími dva nebo tři geny vázané s vhodnými promotory: například TPS1 vázaný s nekonstitutivním promotorem atslA, aby synthesa trehalosy a případně jiný gen nebo geny regulované konstitutivními promotory byly pod jeho kontrolou.

Předpokládá se, že řízená exprese genů pro dvě nebo více subjednotek kvasinkového trehalosasynthasového komplexu, z nichž alespoň jedna má molekulovou hmotnost 56 kDa, vyústí ve zvýšenou akumulaci trehalosy v zelených tkáních rostliny, protože 56 kilodaltonová subjednotka bude stabilizována přítomností druhé subjednotky nebo subjednotek. Rovněž zavedení Tre6Pasové subjednotky o molekulové hmotnosti 102 kDa bude výhodné nebot tím bude snížen očekávaný potenciál akumulace Tre6P, jestliže bude stabilita T‘re6Psynthasové jednotky zvýšena. Je zřejmé, že pro tento typ konstrukce TPS1 kódující sekvenci lze nahradit kódující sekvencí nějakého dalšího strukturálního genu pro Tre6Psynthasu, TPS2 sekvenci sekvencí některého jiného Tre6Pasového genu a TSL1 sekvenci sekvencí některého jiného genu kódujícího polypeptid, který udílí regulační vlastnosti nebo stabilitu Tre6Psynthase a Tre6Pase stejným způsobem jako TSL1 produkt udílí takové vlastnosti jiným subjednotkám přirozené kvasinkové trehalosasynthasy.

Příklad 5

Transformace rostlin geny pro TreóPsynthasu pod kontrolou stresem indukovaných promotorů.

Rostlinné promotory jako jsou LTI78 (Nordin et al. (1993) Plant Mol. Biol. 21, 641-653) a RAB18 (Lang a Palva (1992) Plant Mol. Biol. 20, 951-962) jsou známy tím, že jsou indukovány suchem a chladovým stresem. Transformací tabáku, Arabidopsis a jiných rostlin kódující sekvencí genu pro Tre6Psynthasu, jako je TPS1 pod kontrolou takového stresem indukovaného promotoru, samotného nebo dohromady s kódujícími sekvencemi genů pro Tre6Pasu nebo regulační polypeptid nebo obou, jako jsou TPS2 a TSL1 pod kontrolou jakéhokoli vhodného rostlinného promotoru, lze vyvolat akumulaci trehalosy v rostlinných tkáních pouze v odpovědi na tyto typy stresu. Výhodou je, že hladiny trehalosy, které mají negativní účinek na některé tkáně určitých rostlin, a které rovněž představují odchylku fotosyntetické funkce, která snižuje její výtěžek a někdy zpožďuje růst rostliny, se akumulují pouze (1) jestliže je rostlina náhodně vystavena stresu (výhody ochrany poskytované trehalosou převáží jakékoli negativní účinky) nebo (2) jestliže je rostlina záměrně vystavena stresu aby došlo k akumulaci trehalosy, která pak bude extrahována ze sklizené rostliny.

Příklad 6

Purifikace, analysa a klonování jiných TreóPsynthas.

Ačkoli existují i jiné metabolické dráhy synthesy trehalosy, je zřejmé, že hlavní synthetická dráha jde přes T're6P, jak to popsali Cabib a leloir (1958, Ioc. cit.). Klíčový enzym v této dráze je Tre6Psynthasa, jelikož, jak je ukázáno výše, jestliže je Tre6P vytvořen, mnoho buněk bude schopno tuto látku deřosřorylovat za vzniku volné trehalosy. Tedy hlavní myšlenkou tohoto vynálezu je vnést Tre6Psyntnasovou aktivitu do cílové rostliny. Není primárně důležité odkud tato aktivita pochází. Používáme kvasinkový enzym, který náhodou je subjednotkou kvasinkového komplexu trehalosasynthasy, který obsahuje ještě nejméně dvě další subjednotky. V obdobných případech je možné, že optimální aktivita Tre6Psynthasové subjednotky bude vyžadovat přítomnost jedné nebo několika ostatních subjednotek, ačkoli zjevně subjednotka kvasinkové T're6Psynthasy o molekulové hmotnosti 56 kDa účinně funguje v tabáku bez subjednotek o 102 a 123 kDa.

Je dobře známo, že enzymy katalýzující stejnou reakci v odlišných organismech jsou často homologní, takže jestliže byl jednou člen této skupiny klonován, úkol klonovat ostatní členy této skupiny je snadnější. Jelikož kvasinková Tre6Psynthasa byla klonována (Londesborough a Vuorio (1992) USPA 07/836021), je jasné, že existuje skupina homolognícn proteinů, včetně Tre6Psynthasy z E. coli a proteinu z Methanobacterium thermoautotrophicum (McDougall et al., (1993) F'EMS Microbiology Letters 107, 25-30). Rozhodli jsme se otestovat, zda jiné organismy rovněž obsahují homologní Tre6Psynthasy.

Mycobacterium smegmatis obsahuje heparinem aktivovanou TreóPsyntnasu, která byla částečně purifikována a studována purifikovaný U/mg proteinu je schopen derivátů) v

Elbeinovou skupinou (Liu et ai., (1969) J. Biol. Chem. 244, 3728-3791; Lapp et al., (1971) J. Biol. Chem. 246, 4567-4579; Elbein a Mitchell (1975) Arch. Biochem. Biophys. 168, 369-377; Pan et al. (1978) Arch. Biochem. Biophys. 186, 392-400). Enzym těmito pracovníky měl specifickou aktivitu 0,8 při 37 °C s GlcP a UDPG jako substráty (enzym používat řadu nukleosid-difosfoglukosových přítomnosti optimální koncentrace heparinu.

Preparát obsahoval dva polypeptidy s molekulovými hmotnostmi stanovenými pomocí SDS-PAGE', 45 a 90 kDa. My jsme modifikovali jejich purifikační postup tím, že jsme do něj zahrnuli inhibitory proteas a jiná agens chránící proteiny v použitých pufrech a přidali konečný cnromatografický krok v přítomnosti neiontového detergentu Tritonu X-100. Náš konečný postup byl následující:

1) Buňky M. smegmatis (28 g čerstvé hmotnosti rostoucí 3 dny v

Luriově mediu a skladované v zmrazeném stavu) byly rozmraženy ve 40 ml 50 mM HEPES/KOH pH 7,5 obsahujícího 1 mM benzamidin, 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM dithiotreitol, 1 mM fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) a 10 g pepstatinu A/mi a potom rozbity ve French pressu. Homogenát byl centrifugován 20 minut při 28 000 g. (NH^j^SO^ (30 g na 100 mi) byl přidán k supernatantu. Vysrážený protein byl shromážděn, rozpuštěn V 20 mM HEPES/KOH pH 7,5 obsahujícím 0,1 mM EDTA a 0,2 mM dithiotreitol (HED pufr), dále obsahujícím 1 mM PMSF a 10 g pepstatinu A/ml, a dialyzován přes noc proti HED pufru.

2) Dialyzovaný roztok byl nanesen na sloupec DEAE celulosy o rozměrech 3,4 x 25 cm a enzym byl eluován při průtoku 20 ml/hodinu lineárním gradientem maximálně obsahujícím 0,9

M Naci v 1,2 1 HED pufru. Maxima enzymových frakcí (při 0,2 M Naci) byla spojena (33 ml) a upravena na konečnou koncentraci 0,5 mM PMSF a 5 g pepstatinu A/ml. Protein byl vysrážen přidáním 9,9 g (NH^j^SO^ a rozpuštěn v 50 mM Tris/HCl pH 7,5 obsahujícím 50 mM NaCi, 0,1 mM EDTA a 0,2 mM dithiotreitol (TNED pufr).

3) Rozpuštěné proteiny (3,7 ml) byly chromátografovány na koloně Sephadexu G100 (2,8 x 34 cm), která byla ekvilibrována TNED pufrem při průtoku 36 mi/hodinu. Enzymové frakce v maximech byly ihned naneseny na sloupec Heparin Sepharosy (1,5 x 8,5 cm) v TNED pufru. Sloupec byl vyvíjen gradientem maximálně obsahujícím 1,0 M NaCl v objemu 100 ml při rychlosti průtoku 5 ml/hodinu. Enzym byl eluován přibližně při koncentraci 0,5 M NaCl.

4) Vzorek eluátu z Heparin Sepharosy (frakce H37 v tabulce 3) byl převeden do TNED/0,1 % (V/V) Triton X-100 v zařízení Amicon (membrána PM10) a potom nanesen na sloupec Heparin Sepharosy (0,7 x 8 cm) ekvilibrované TNED obsahujícím 0,1 % (V/V) Triton X-100 a eluován gradientem maximálně obsahujícím 1,0 M NaCl v 50 ml stejného pufru.

Ačkoli specifické aktivity po prvním kroku využívajícím Heparin Sepharosu byly mnohem větší než bylo oznámeno Panem et al. (1978), SDS-PAGE (obr. 7) ukázala, že tyto frakce nebyly čisté. Překvapivě bylo maximum při hodnotě 55 kDa jediným hlavním pásem (band), pro nějž intenzita dobře korelovala s enzymovou aktivitou. Band o hodnotě 55 kDa byl oddělen a rozpuštěn v gelu s trypsinem a tryptické peptidy byly odděleny pomocí HPLC a sekvenovány tak jak je popsáno (Londesborough a Vuorio, 1993 loc. cit.). Sekvence jsou ukázány v tabulce 4 a v Seznamu sekvencí. Pro peptidová maxima

Tabulka 3 Purifikace Tre6Psyntnasy z M. smegmatis

Tre6Psynthasa byla stanovena jak popisují Londesborough a Vuorio (1993, ioc. cit.}, avšak při teplotě 35 °C a v přítomnosti 0,25 g heparinu/ml.

Frakce	Objem (mi)	Specifická aktivita (mU/mg)	Celková aktivita (U)
Supernatant (28 000 g)	154	9	25,0
Dialyzovaný precipitát vysrážený pomocí
fNH ) SO	52	21	35,2
v 4 ’ 2 4
DES2 eluát	33	139	23,4
G100 eluát	21	385	14,6
První eluát z Heparin Sepharosy
frakce H33	2,7	1880	0,9
frakce H34	2,7	4380	2,1
frakce H35	2,7	6190	2,7
frakce H36	2,7	7890	2,8
frakce H37	2,7	6340	1,6
Druhý eluát z Heparin Sepharosy (naneseno pouze H37)
frakce T21	1,4	ND	0,08
frakce T22	1,4	ND	0,14
frakce T23	1,4	ND	0,06

a 31, která poskytovala dvojité sekvence, byly aminokyseliny libovolně přiřazeny podle SEQ ID NOs 3 a 4 (z maxima 29) a SEQ ID NOs 6a 7 (z maxima 31) stejným způsobem, jak je ukázáno v tabulce 4. Prvních 9 zbytků Peptidu 13 je z 89 % identických se zbytky 250-258 (VGAFPIGID; viz Vuorio et al. 1993 ioc. cit.; EMBL katalog přírůstků č. X67499) kvasinkové TreóPsynthasy o molekulové hmotnosti 56

3

Tabulka 4. Aminokyselinové sekvence vnitřních tryptických peptidú získaných z Treópsynthasy purifikované z M. smegmatis.

Peak peptidu Sekvence Seznam sekvencí

13		VGAFPISIDSAEL	SEQ	ID	NO: 1
21		AT/GFLDALAATGETGDSGVT	SEQ	ID	NO: 2
29	(dvojitý)	RVVVNNTSR	SEQ	ID	NO: 3
		YLEGAR	SEQ	ID	NO: 4
25		QVLAHDVDR	SEQ	ID	NO: 5
31	(dvojitý)	IGGAQPAD	SEQ	ID	NO: 6
		VGALQVLL	SEQ	ID	NO: 7
43		GEVQVGFR	ŠEQ	FD	NO: 8

Abychom potvrdili, že tento band o molekulové hmotnosti přibližně 56 kDa představuje Tre6Psynthasu, pokusili jsme se o další purifikaci. Enzym se vázal pevně k DDP-giukuronát agarosovému sloupci, ale nemohl být uvolněn zpět. Proto byla frakce H37 převedena do pufru obsahujícího υ,i % Triton X-iuo (dvě třetiny aktivity byly během tohoto přenosu ztraceny) a znovu cnromatografována na Heparin Sepharose v přítomnosti Tritonu X-lUO. Obr. 8 ukazuje, že band mající molekulovou hmotnost přibližně 55 kDa byl jediný materiál reagující s Coomassie Biue, který byl přítomen v aktivních frakcích, kromě dvou siabých pásů menších než cytochrom c. Zřejmě poiypeptid mající molekulovou hmotnost 90 kDa popsaný Panem et al. (1978; loc. cit.) neni podstatnou složkou této TrebPsynthasy z M. smegmatis a velikost důležitého poiypeptidu, přibližně 55 kDa, je znatelně větší než velikost malého poiypeptidu (45 kDa), což je složka, o níž referují uvedení autoři. Obr. 9 ukazuje, že tento poiypeptid je rozeznáván antisérem, které je vytvořeno proti subjednotce

Povaha ostatních relativně surových

TrebPsynthasy kvasinkové trehaiosasynthasy, která ma molekulovou hmotnost 56 kDa, ale nikoli preimunním sérem, což ukazuje, že Tre6P synthasa M. smegmatis sdílí antigenní determinanty s kvasinkovým enzymem.

imunoreaktivních pásu přítomných v preparátech enzymu (viz dráhy 5 a 6 na obr. 9) nebyla zkoumána: ne všechny z nich jsou artefakty vzniklé díky velké dávce naneseného proteinu, nýbrž představují příbuzné proteiny. Nicméně antisérum vytvořené proti kvasinkovému enzymu lze použít k detekci a izolaci positivních klonu z hostitelských buněk transformovaných genovou bankou M. smegmatis. Podobně data týkající se aminokyselinové sekvence v tabulce 4 lze použít ke zkoumání sekvence izolovaného genu. Podobnosti týkající se imunologických reakcí a aminokyselinových sekvenci mezi enzymy kvasinky a M. smegmatis ukazují, že nukieotidové proby odvozené z genu TPSl lze rovněž úspěšně použít k výběru genu M. smegmatis.

Závěrem lze říci, že imunologické a sekvenační studie enzymu M. smegmatis potvrzují, že TrefoPsynthasy různých organismu jsou členy jedné rodiny. Geny těchto enzymu i ze použít stejným způsobem jako TPSÍ k. přípravě transgenních rostlin, které syntetizují trehalosu a mají zlepšenou toleranci ke stresu.

Seznam sekvencí (1) obecné informace (i) předkladatelé: Alko Group Ltd.

and

Eondesborough, John

Tunneia, duti

Hoimstrom, Kjell-Ove Mantyla, Einar Welin, tíjorn Manda!, Abul Palva, E. Tapio (ií) Název vynálezu: Transgenní rostliny produkující trehalosu (ííi) Počet sekvenci: 8 (2) informace pro SEQ ID No:l (i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 13 aminokyselin (tí) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (íí) Molekulární typ: peptid (2) informace pro SEQ ID No: 2 (i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 19 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (iij Molekulární typ: peptid (2) informace pro SEQ ID No:3 (i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 9 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid (2) Informace pro SEQ ID No:4 (i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 6 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid (2) Informace pro SEQ ID No:5 (i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 9 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid (2) Informace pro SEQ ID No:6 (i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 8 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid (2) Informace pro SEQ ID No:7 (i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 8 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid (2) Informace pro SEQ ID No:8 (i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 8 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid

Průmyslová využitelnost vynález se týká transgenních rostlin produkujících trehalosu a způsobu zvýšení obsahu trehalosy v rostlinách. Podle vynálezu jsou rostliny jichž se vynález týká transformovány kódující sekvencí genu pro trehalosa-ó-fosfátsynthasu zfázovanou s nekonstitutivním rostlinným promotorem, který umožňuje dočasnou, topologickou nebo stresem indukovanou kontrolu exprese genu. Vynález lze použít pro ochranu běžných kulturních rostlin proti suchu, vysokému obsahu solí a teplotním extrémům, a pro zlepšení skladovacích vlastností sklizených rostlin zahrnujících zelené potraviny, trhané ovoce a okrasné rostliny.

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROK Υ

   1. Rostlina transformovaná kódující sekvencí genu pro trehalosa-6-fosfátsynthasu fúzovanou s nekonstitutivním rostlinným promotorem, vyznačující se tím, že transformovaná rostlina má novou schopnost syntetizovat trehalosu.
2. 2. Rostlina podle nároku 1,vyznačující se tím, že rostlinný promotor je tkáňově specifický.
3. 3. Rostlina podle nároku 1,vyznačující se tím, že rostlinný promotor je aktivován světlem.
4. 4. Rostlina podle nároku 1,vyznačující se t í m, že rostlinný promotor je aktivovatelný stresem jako je například vystavení suchu, vysoké salinitě nebo extrémním teplotám.
5. 5. Rostlina podle kteréhokoli z nároku 1 až 4 vyznačující se tím, že gen pro trehalosa-6-fosfátsynthasu je mikrobiálního původu.
6. 6. Rostlina podle nároku 5,vyznačující se tím, že gen pro trehalosa-6-fosfátsynthasu je kvasinkový gen TPS1 kódující subjednotku kvasinkové trehalosasynthasy mající molekulovou hmotnost 56 kDa.
7. 7. Rostlina podle kteréhokoli z nároků 1 až 6 vyznačující se tím, že je kotransformována alespoň jedním genem kódujícím trehaiosa-6-fosfatasu nebo regulační polypeptid, který interaguje s vnesenou trehalosa-6-fosfátsynthasou nebo trehalosa-6-fosfatasou.
8. 8. Rostlina podle nároku 7,vyznačující se tím, že gen kódující trehalosa-6-fosfatasu je kvasinkový gen 'TPS2 a gen kódující regulační protein je kvasinkový gen TSL1.
9. 9. Rostlina podle nároku 6,vyznačující se tím, že rostlinný promotor je patslA.
10. 10. Rostlina podle kteréhokoli z nároků laž8, vyznačující se tím, že použitý rostlinný promotor je aktivován stresem, jako například LTI78 nebo RAB18.
11. 11. Rostlina podle kteréhokoli z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že je tolerantnější k účinku stresu než netransformovaná rostlina.
12. 12. Rostlina podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že je jednoděiožná, jako například kukuřice, oves, proso, pšenice, rýže, ječmen, čirok, laskavec, cibule, chřest nebo cukrová třtina.
13. 13. Rostlina podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, v y z n a čující se tím, že je dvouděložná, jako například vojtěška, sója, petúnie, bavlník, cukrová řepa, slunečnice, mrkev, celer, zelí, okurka, paprika, rajče, brambor, čočka, len, brokolice, tabák, fazole, iocika (hlávkový salát), řepka, květák, špenát, růžičková kapusta, artyčok, hrách, okra (ibišek jedlý), dýně (Cucurbita), kapusta kadeřavá, Brassica oleracea, čajovník nebo kávovník.
14. 14. Produkce trehaiosy s použitím rostliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 13.
15. 15. Semeno, vyznačující se tím, že je produkováno rostlinou podle kteréhokoli z nároků 1 až 13.
16. 16. Způsob zvýšení obsahu trehaiosy v rostlinách, vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:

    - transformaci uvedené rostliny alespoň strukturálním genem pro trehaiosa-6-fosfátsynthasu, a

    - expresi uvedeného genu pod kontrolou vhodného promotoru, který dovolí dočasnou, topologickou nebo stresem indukovanou kontrolu nad expresí genu.
17. 17. Způsob podle nároku 16,vyznačující se t í m, že gen je kvasinkový gen TPS1 kódující subjednotku kvasinkové trehalosasynthasy mající molekulovou hmotnost 56 kDa.
18. 18. Způsob podle nároků 16 nebo 17, vyznačující se tím, že rostlina je kotransformována genem pro trehalosa-6-fosřátsynthasu pod kontrolou nekonstitutivního promotoru, jako je patslA, a alespoň jedním genem pro *1 trehalosa-6-řosfatasu nebo regulační subjednotku trehalosasynthasy, pod kontrolou jakéhokoli vhodného promotoru, takže synthesa trehalosy je regulována promotorem kontrolujícím gen trehalosa-6-fosfátsynthasy.
19. 19. Způsob podle nároku 18,vyznačující se tím, že gen pro trehalosa-6-fosřatasu je kvasinkový gen TPS2 a gen pro regulační subjednotku je kvasinkový gen TSL1.
20. 20. Způsob podle kteréhokoli z nároků 16 až 19, v y z n a čující se tím, že kódující sekvence genů trehalosasynthasy jsou zfúzovány s rostlinnými promotory, které vyvolávají expresi specificky v zásobních orgánech.
21. 21. Způsob produkce trehalosy, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

    - transformaci rostliny strukturálním genem pro trehalosa-6-fosfátsynthasu s cílem vytvořit transgenní rostlinu,

    - kultivaci transgenní rostliny za podmínek, které indukují expresi trehalosa-6-fosfátsynthasy v rostlině tím, že uvedený strukturální gen je exprimován pod kontrolou promotoru, který umožňuje dočasnou, topologickou nebo stresem indukovanou kontrolu exprese genu, a

    - extrakci trehalosy z rostlinných tkání.
22. 22. Způsob podle nároku 21,vyznačující se tím, že transgenní rostlina akumuluje trehalosu v zásobním orgánu,
23. 23. Způsob podle nároku 22, vyznačující tím, že rostlina je plodina u níž se sklízí kořen, jako například rajče, cukrová řepa nebo vodnice.
24. 24. Způsob ochrany běžných kulturních rostlin proti suchu, vysokým koncentracím soli a teplotním extrémům, vyznačující se tím, že zahrnuje transformaci rostliny alespoň kódující sekvencí genu pro trehalosa-6-fosfátsynthasu zfúzovaného s rostlinným promotorem, takže nedochází k plné expresi genu dokud se rostlina není vystavena suchu, vysokému obsahu solí nebo teplotním extrémům.
25. 25. Způsob ochrany rostlin produkujících jedlé plody proti poškozeni květů mrazem, vyznačující se tím, že zahrnuje transformaci rostliny alespoň kódující sekvencí genu pro trehalosa-6-fosfátsynthasu, zfúzovaného s rostlinným promotorem, takže k plné expresi genu nedochází, dokud se rostlina není vystavena nízkým teplotám.
26. 26. Způsob zlepšení skladovacích vlastností sklizených rostlin včetně ''zelených potravin, trhaného ovoce a okrasných rostlin, vyznačující se tím, že zahrnuje transformaci rostlin alespoň genem pro trehalosa-6-fosfátsynthasu, zfúzovaným s rostlinným promotorem, tak aby byly získány rostliny, jejichž sklízené části mají zlepšené vlastnosti z hlediska zadržování vody, zlepšenou toleranci k dehydrataci, nebo obojí.
27. 27. Způsob usnadnění kultivace a udržování okrasných rostlin, vyznačující se tím, že zahrnuje transformaci rostliny alespoň genem pro trehalosa-6-fosfátsynthasu, zfázovaným s rostlinným promotorem, takže jsou získány rostliny, které mají zlepšenou toleranci ke stresu ve srovnání s netransformovanou rostlinou.
28. 28. Způsob zlepšení chuti, vůně a struktury pyré, past, želé a zavařenin připravených z jedlých částí rostliny, která se vyznačuje tím, že byla transformována alespoň kódující sekvencí genu pro trehalosa-6-fosfátsynthasu zfázovanou s rostlinným promotorem, takže dochází k akumulaci trehalosy v jedlé části rostliny.