CZ347798A3

CZ347798A3 - Použití interleukinu-10 k produkci populace supresorových buněk

Info

Publication number: CZ347798A3
Application number: CZ983477A
Authority: CZ
Inventors: Maria-Grazia Roncarolo; Waal Malefyt Rene De; Rosa Bacchetta; Herve M. Groux; Vries Jan E. De
Original assignee: Schering Corporation
Priority date: 1996-05-06
Filing date: 1997-05-02
Publication date: 1999-03-17
Also published as: KR20000010799A; NO985160D0; ZA973815B; CA2253803A1; AU2927597A; NO985160L; SK151898A3; AR006942A1; US6277635B1; EP0906428A1; PL329732A1; NZ332413A; WO1997042324A1; BR9709307A; JP2000509604A; IL126658A0

Description

Oblast techniky

Vynález se týká použití interleukinu-10 (IL-10) k produkci populace supresorových buněk, které potlačují různé imunologické funkce, např.: způsoby léčení a inhibice odmítnutí tkáně nebo dalších imunitních funkcí podáváním efektivního množství interleukinu-10 postiženým osobám.

']

i.

Dosavadní stav techniky *

Interleukin-10 je cytokin, který byl původně charakterizován pomocí jeho aktivity při potlačování produkce Thl cytokinů. Viz. např.: de Vries and de Waal Malefyt (eds. 1995) Interleukin-10 Landes Co., Austin, TX, a pod.

; . _{? L} Potlačení imunologických funkcí nachází uplatnění v mnoha důležitých souvislostech. Viz. např.: Paul (ed. 1995) Fundamental Immunology 3^rd ed., Raven Press, NY. Obzvláště allogeneická imunita je důležitá v souvislosti s transplantacemi, a to převážně díky její neobyčejné síle. Protože transplantace orgánů nebo tkání se stává v medicíně stále častější, schopnost minimalizovat problémy spojené s odmítnutím tkání přináší velké ekonomické výhody. Kromě toho, prostředky pro minimalizaci autoimunitních podmínek, k blokování určité odezvy na dané antigeny, např. bakteriální a parazitické, a k minimalizaci reakcí na určité rozpustné antigeny, a to jak proteiny tak i alergeny, budou významnou výhodou pro terapeutické použití.

Nedostatek plně efektivních terapeutik k minimalizaci nebo eliminaci odmítnutí tkání, odhoj ování štěpů nebo dalších imunologických odpovědí přináší spoustu problémů. Tento vynález přináší řešení mnoha těchto problémů.

Podstata vynálezu

Vynález se týká použití cytokinů interleukinu-10 (IL-10) k potlačení odhojování transplantovaných tkání. Vynález se také zahrnuje farmaceutické přípravky obsahující interleukin-10. Přednostně je interleukin-10 podle tohoto vynálezu vybrán ze skupiny obsahující i

zralé polypeptidy otevřených čtecích rámců definovaných aminokyselinovou sekvencí popsanou v SEQ ID No: 1 a SEQ ID No:2. Tyto dvě formy IL-10 se někdy označují jako lidský IL-10 (nebo inhibiční faktor syntézy lidského cytokinu („CSIF“)) a virální IL-10 (nebo BCRF1), např.: Moore et al. (1990) Science 248: 1230-1234; Vieira et al. (1991) Proč. Naťl Acad. Sci. USA 88:1172-1176; Fiorentino et al. (1989) J. Exp. Med. 170: 2081-2095 a Hsu et al. (1990) Science 250: 830-832. Byl také popsán homolog z koňského herpesviru typ 2 (Roe et al. (1993) Virus Genes 7:111-116) stejně jako mnoho dalších z různých druhů. Víhodněji, zralý LI-10 použitý ve způsobech podle tohoto vynálezu je IL-10 definovaný v SEQ ID NO: 3 nebo v SEQ ID NO: 4.

V určitém provedení tedy tento vynález zajišťuje způsob redukce nebo inhibice odhojování tkání při přenosech kostní dřeně u savců, zahrnující podávání efektivního množství interleukinu-10 těmto savcům. Vynález také zajišťuje způsob inhibice, pomocí imunitního systému, antigenově-specifické odpovědi na následné uvedení zmíněných antigenů, zahrnující podávání efektivního množství exogenního interleukinu-10 a antigenů zmíněnému imunitnímu systému. V preferovaném provedení vynálezu je imunitní odpověď mediována s makrofágem, APC, langerhansovou buňkou nebo dendritickou buňkou; metoda dále . inhibuj e proliferativní odpověď CD4+ reaktivních T buněčných klonů nebo inhibice trvá nejméně 21 dní. V dalších preferovaných provedeních je efektivní množství dostatečné ke snížení aktivace T buněk; nebo může zahrnovat sníženou stimulační kapacitu periferálních krevních mononukleárních buněk, dendritických buněk, monocytů a/nebo normálních B buněk.

V dalším provedení vynález poskytuje prakticky čisté antigenově-specifické anergické T buňky charakterizované produkcí (po restimulaci) nízkých koncentrací IL-2, IL-4, IL-5 a GMCSF, středních koncentrací IFN-γ, a vysoké úrovně IL-10, s populací vzniklou podáváním kombinace exogenního IL-10 a antigenů prekurzorům zmíněných T buněk. V preferovaném provedení jsou prekurzory CD4⁺ T buňky, buňky dále produkují vysokou úroveň TNF-α; buňky indukují anergickou odezvu na antigen; podávaným IL-10 je lidský IL-10; IL-10 je podáván po dobu nejméně 7 dnů; a/nebo anergické podmínky trvají nejméně 21 dní. Antigenová specifita může být vůči antigenů vybranému z proteinového antigenů, korpuskulámího antigenů, alloantigenu nebo autoantigenu.

V dalším provedení vynálezu je prakticky čistá antigenově-specifická anergická T buňka charakterizována produkcí (po restimulaci) nízké koncentrace IL-2, IL-5 a GM-CSF, středních koncentrací IFN-γ a vysoké úrovně IL-10. V typickém případě je úroveň produkce cytokinů pro IL-2 nižší než asi 500 pg/ml; pro IL-5 mezi 300 až 3000 pg/ml; pro IFN-γ je nejméně kolem • ·

1000 pg/ml; pro GM-GSF mezi 300 až 3000 pg/ml a pro IL-10 nejméně 3000 pg/ml. Přednostně je úroveň IL-10 po restimulaci s anti-CD3 nejméně 5x vyšší než Thi buněk.

Vynález také zahrnuje prakticky čisté T buňky, vykazující antigen-specifickou anergii na antigen, zahrnující např. případy, kdy antigenem je alloantigen nebo selfantigen; produkci IL-10 po restimulaci s anti-CD3 při alespoň 3000 pg/ml; nebo vykazující antigen-specifickou anergii po dobu nejméně 21 dní.

V dalším provedení poskytuje vynález způsob potlačování odezvy T buňky na antigen podáváním kombinace exogenního IL-10 a antigenu nebo anti-CD3 protilátek imunitnímu systému, obsahujícímu tuto buňku. Přednostně je antigenem alloantigen nebo selfantigen, je ale obvykle omezen MHC molekulami. V dalším provedení je metoda prováděna in vivo; nebo dále potlačuje odezvu na následnou stimulaci, např.: odpověď, která provází transplantaci tkání, orgánů nebo transplantátů kostní dřeně. Typicky je T buňka z příjemce zmíněné transplantované tkáně a antigen je z dárce MHC. Provází-li odezva tkáňovou transplantaci, podává se prostředek často před transplantací tkáně; T buňka je zavedena do příjemce; nebo je před transplantací podáván IL-10 do tkáně, která má být transplantována, např.: dárci a/nebo během transportu. V dalších provedeních způsobuje antigen autoimunitní onemocnění.

V dalších provedeních vynález také zajišťuje metodu potlačení následné odezvy v T buňce na antigen tím, že se imunitnímu systému podává kombinace exogenního IL-10 a antigenu nebo anti-CD3 protilátek. Přednostně je IL-10 podáván nejméně 7 dní.

Tento vynález dále zajišťuje způsob indukování anergie v T buňkách na MHC antigen tím, že se T buňkám podává prekurzor buď exogenní IL-10 a antigen nebo exogenní IL-10 s antiCD3 protilátkami. Přednostně je IL-10 podáván po dobu nejméně 7 dní.

Další provedení tohoto vynálezu zahrnuje prostředky, obsahující EL-10 a antigen. Přípravkem může být farmaceutický přípravek zahrnující IL-10 a farmaceúticky akceptovatelný nosič; IL-10 může být lidský IL-10; nebo antigenem může být alloantigen, selfantigen, proteinový antigen nebo korpuskulámí antigen.

Krátký popis obrázků

Obrázek 1 ukazuje diagram vektoru pcD(SRa) použitého pro expresi IL-10 v savčích buňkách.

Obrázek 2 znázorňuje diagram vektoru TRP-C11 použitého pro expresi IL-10 u baktérie.

Obrázky 3A-3C ukazují histogramy účinku endogenního a exogenního EL-10 na proliferativni odezvu ve směsné odezvě lymfocytů (MLR): PBMC donor x ozařovaný PBMC donor B. Obrázek 3B ukazuje účinek endogenního a exogenního IL-10 na proliferativni odezvy v MLR: PBMC donor B x ozařovaný PBMC donor A. Obrázek 3C ukazuje neutralizaci inhibitomích efektů EL-10 pomocí anti-IL-10 mAb.

Obrázky 4A-4D znázorňují histogramy proliferativních odpovědí čištěných T buněk stimulovaných různými allogeneuckými buňkami, každá v přítomnosti zvyšující se koncentrace IL-10. Obrázek 4A ukazuje stimulaci přečištěných T buněk s allogeneickými ozařovanými propranými monocyty. Obrázek 4B ukazuje stimulaci přečištěných T buněk s pozitivně tříděnými CD14+monocyty. Obrázek 14C ukazuje stimulaci přečištěných T buněk s přečištěnými B buňkami. Obrázek 4D ukazuje stimulaci přečištěných T buněk s Epstein-Barr virem transformovanou lymfoblastoidní buněčnou linií (EBV-LCL).

Obrázek 5 ukazuje histogram kinetiky EL-10 na periferální krevní mononukleární buňky (PBMC) a allogeneické ozařované PBMC.

Obrázek 6 ukazuje histogram působení EL-10 na IL-2 produkty v MLR v přítomnosti nebo bez přítomnosti anti-EL-2 receptoru α řetězce mAb BB10.

Obrázky 7A-7B ukazují působení exogenního EL-2 na redukovanou alloantigenem indukovanou proliferativni odpověď stimulovaných T buněk. Obrázek 7A ukazuje působení exogenního EL-2 na redukovanou alloantigenem indukovanou proliferativni odpověď T buněk stimulovaných s allogeneickým ozařovaným PBMC a indukovanou s IL-10. Obrázek 7B ukazuje působení exogenního EL-2 na redukovanou alloantigenem indukovanou proliferativni odpověď T buněk stimulovaných s allogeneickými B buňkami a indukovanou s EL-10.

Obrázek 8A-8B ukazuje, že IL-10 indukuje alloantigen-specifíckou anergii v CD4⁺ T buňkách v MLR. Obrázek 8A ukazuje [³H]-TdR inkorporaci čištěných CD4⁺ T buněk kultivovaných samotných 3 dny v médiu (bílý sloupec) nebo stimulovaných v primárních MLR s allogeneickými čištěnými monocyty (šedý sloupec) v přítomnosti EL-10 (100 U/ml) (černý sloupec) nebo anti-EL-2 receptoru řetězce mAb BB-10 (šrafovaný sloupec). Obrázek 8B zobrazuje tři různé úseky reprezentující buňky, které byly preaktivovány podle popisu v Obrázku 8 A, kultivovány po dobu 10 dní v přítomnosti IL-10, promyty a restimulovány buď se samotným mediem (černý sloupec), allogeneickými ozařovanými PBMC izolovanými z jiného dárce, než byly monocyty použité v preaktivačním kroku (PBMC-2, křížem šrafovaný sloupec), allogeneickými ozařovanými PBMC izolovanými ze stejného dárce, použitého v preaktivačním

i.

<1 kroku (PBMC-1, šedý sloupec) nebo PBMC-1 plus anti-CD28 mAbs (10 pg/ml) (šrafovaný sloupec).

Obrázky 9A-9B ukazují EL-10 indukovanou polyklonální anergii v CD4⁺T buňkách aktivovaných s CD3 mAb. Obrázek 9A: [³H]-TdR inkorporaci čištěných CD4⁺ T buněk kultivovaných 3 dny v samotném médiu (bílý sloupec) nebo stimulovaných se zesíťováným antiCD3 mAbs (500 ng/ml) (černý sloupec) v přítomnosti EL-10 (100 U/ml) (křížem šrafovaný sloupec) nebo anti-IL-2 reecptoru a řetězce mAb BB-10 (šrafovaný sloupec). Obrázek 9B znázorňuje tři různé úseky reprezentující buňky, které byly preaktivovány podle popisu u Obrázku 9A, kultivovány 10 dní v přítomnosti EL-10, promyty a restimulovány se samotným mediem (černý sloupec), zesíťovaným anti-CD3 mAbs (šedý sloupec), anti-CD3-mAbs plus EL-2 (20 U/ml) (křížem šrafovaný sloupec), anti-CD3 mAbs plus anti-CD28 mAbs (10 pg/ml) (černě šrafovaný sloupec) nebo PMA (1 ng/ml) plus Ca²⁺ ionoforem (A23187, 500 ng/ml) (bílý sloupec).

Obrázek 10 ukazuje vliv velikosti dávky IL-10 na vyvolání anergie v CD4⁺ T buňkách. CD4⁺ T buňky byly aktivovány 10 dní se zesíťovaným anti-CD3 mAbs v přítomnosti samotného média, IL-10 (5 U/ml), EL-10 (20 U/ml) nebo IL-10 (100 U/ml) jak je uvedeno na čtyřech různých úsecích. Po 10 dnech byly buňky sebrány, promyty a restimulovány se samotným médiem (bílý sloupec), zesíťovaným anti-CD3 mAbs (černý sloupec), zesíťovaným anti-CD3 mAbs plus EL-2 (20 U/ml) (šrafovaný sloupec) nebo PMA plus Ca²⁺ ionoforu (černě šrafovaný sloupec).

Obrázek 11 ukazuje kinetiku indukce anergie pomocí IL-10 v CD4⁺ T buňkách. CD4⁺ T buňky byly aktivovány se zesíťovaným anti-CD3 mAbs bez přítomnosti (bílý sloupec) nebo v přítomnosti (černý sloupec) EL-10 (100 U/ml). Po různě dlouhých inkubačních časech v rozmezí 3 až 10 dní byly buňky sebrány, promyty a restimulovány jak je naznačeno na jednotlivých úsecích buď se samotným médiem, zesíťovaným anti-CD3 mAbs, zesíťovaným anti-CD3 mAbs plus EL-2 (20 U/ml), zesíťovaným anti-CD3 mAbs plus anti-CD28 mAbs (10 pg/ml) nebo s PMA plus Ca²⁺ ionoforem.

Obrázek 12 ukazuje, že anergie indukovaná pomocí EL-10 v CD4⁺ T buňkách je dlouhotrvající. CD4⁺ T buňky byly aktivovány se zesíťovaným anti-CD3 mAbs bez přítomnosti (bílý sloupec) nebo v přítomnosti (černý sloupec) EL-10 (100 U/ml) po dobu 10 dní. Po 10 dnech byly buňky sebrány, promyty a kultivovány v přítomnosti EL-2 (2 U/ml). Po 24 dnech byly buňky sebrány a reaktivovány se zesíťovaným anti-CD3 mAbs, zesíťovaným anti-CD3 mAbs plus IL-2 • ·

(20 U/ml), zesilovaným anti-CD3 mAbs plus anti-CD28 mAbs (10 pg/ml) nebo s PMA plus Ca²⁺ ionoforem.

Obrázek 13 ukazuje cytofluorimetrickou analýzu anergických T buněk. CD4⁺ T buňky byly aktivovány se zesilovaným anti-CD3 mAbs v přítomnosti nebo bez přítomnosti IL-10 (100 U/ml) po dobu 10 dní a exprese CD3, CD28 a HLA-DR byla analyzována před a poreaktivaci se zesilovaným anti-CD3 mAbs po dobu 24 h. Černá čára znázorňuje kontrolní T buňky kultivované bez přítomnosti IL-10 a tečkované histogramy ukazují anergické T buňky, které byly kultivovány v přítomnosti IL-10.

Obrázky 14A-14B ukazují expresi IL-2R a řetězce v anergických T buňkách. CD4⁺ T buňky byly aktivovány bez řítomnosti nebo za přítomnosti IL-10 (100 U/ml) po dobu 3 dnů (Obrázek 14A) nebo po dobu 10 dnů (Obrázek 14B) a restimulovány buď se zesilovaným antiCD3 mAbs samotným nebo se zesilovaným anti-CD3 mAbs plus EL-2 (100 U/ml). Exprese molekuly CD25 byla analyzována cytofluorimetrií 24 h po aktivaci. Černá čára ukazuje kontrolní isotyp a tečkovaný histogram reprezentuje značení s anti-CD25 mAbs.

Obrázky 15A-15B ukazují analýzu mobilizace vápníku v anergických buňkách. CD4⁺ T buňky byly aktivovány santi-CD3 mAbs bez přítomnosti (Obrázek 15 A) nebo v přítomnosti (Obrázek 15B) IL-10 (100 U/ml) po dobu 10 dnů a byl přidán indo-l/AM. Jak je naznačeno, anti-CD3 mAbs (10 pg/ml), kozí anti-myší IgG (1 pg/ml) nebo Ca² ionofor (500 ng/ml) bylo přidáno do kyvety a růst intracelulámího Ca²⁺ byl analyzován spektrofluorimetrií a byl měřen jako poměr emise při 405/485 nm.

Obrázek 16 ukazuje, že proliferativní odezvy čištěných CD4⁺ T buněk, u kterých byla provedena anergie následována stimulací se zesíťovaným anti-CD3 mAbs (100 ng/ml) v přítomnosti IL-10 (100 U/ml) po dobu 10 dnů, mohou být částečně obnoveny po restimulaci s velmi vysokými koncentracemi zesítěným anti-CD3 mAbs. Po 10 denní indukční fázi byly CD4⁺ buňky sebrány a centrifugo vány přes Ficoll/hypaque aby byly odstraněny neživotaschopné buňky. Dále byly buňky sebrány a promyty třikrát s PBS. CD4⁺ buňky (4 x 10⁴/ prohlubeň) byly následně restimulovány zvýšenými koncentracemi (10 ng až 1 mg/ml) zesíťovaného anti-CD3 mAbs po dobu 3 dnů.

Obrázek 17 ukazuje proliferativní odezvy Tri klonů ve srovnání s odezvami Thi a Th2 klonů. T buněčné klony byly stimulovány v dvoutýdenních intervalech s ozařovanými krmnými buňkami a PHA. Klidové T buněčné klony byly sebrány 12 dní po stimulacikrmnými buňkami a

PHA, promyty a restimulovány se zesíťovanými anti-CD3 mAbs (100 ng/ml) v přítomnosti nebo • · bez přítomnosti anti-IL-10 mAb (10 pg/ml) nebo anti-IL-1 mAb (10 pg/ml). Je zřejmé, že proliferativní odezvy Tri klonů jsou velmi nízké ve srovnání s odezvami Thl a Th2 klonů. Kromě toho, proliferativní odezvy Tri klonů, narozdíl od odezvy kontrolních Thl a Th2 klonů, jsou značně zesílené s anti-IL-10 mAbs, ovšem ani v přítomnosti anti-IL-10 mAbs odezvy nikdy nedosahují úrovně odezvy kontrolních Thl a Th2 klonů. Proliferativní odezvy všech typů T buněčných klonů, včetně Tri klonů, jsou zcela inhibovány s anti-Il-2 mAbs.

Obrázek 18A-18B ukazuje, že produkce IL-10 v Tri klonech nastává rychle po aktivaci buněk. Značné úrovně EL-10 jsou již produkovány 16 h po aktivaci T buněčných klonů kombinací buď anti-CD3 nebo anti-CD28 mAbs (Obrázek 18A) nebo anti-CD3 mAbs + forbolester PMA (Obrázek 18B). Oproti tomu pouze nízké úrovně produkce IL-10 sThl nebo Th2 klony mohou být měřeny nejdříve 24 h po aktivaci buněk.

Obrázek 19 ukazuje vývoj myších Tri buněk v přítomnosti IL-10. Naivní (MEL14 čiré) CD4⁺ T buňky z myší transgenovaných do DO 11.10 αβ TCR na BALB/c genetickém základu (Murphy et al. (1990) Science 250: 1920-1722) byly stimulovány s OVA peptidem (0,6 μΜ) a ozařované slezinové APC. Kromě toho, kultury dostaly cytokiny: IL-4 (200 U/ml) nebo IL-10 (100 U/ml) nebo oba. Stimulace za stejných podmínek jaké byly popsány výše byla opakována týdně po tři následující týdny (Murphy et al (1996) J. Exp. Med. 183:901-13). Buňky byly poté sebrány, promyty a restimulovány se zesíťovaným anti-CD3 a anti-CD28 mAbs 4 h při 37°C, s Brefeldinem A (10 pg/ml) přidaným poslední 2 hodiny podle uvedeného popisu. Openshaw et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1-11. Buňky byly poté fixovány a obarveny pro detekci syntézy intracelulámího cytokinu s přímo konjugovanými FITC nebo PE protilátkami specifickými pro EFN-γ, IL-2, IL-4 a IL-10 nebo kontrolní isotyp mAb (CT isotyp) jak je naznačeno. Buňky byly také barveny s anti-TCR klonotyp-specifickým mAb KJ1-26 (KJ), aby se prokázalo, že po 3 týdnech kultivace byly všechny buňky pozitivní na transgen.

Obrázky 20A a 20B ukazují proliferativní odezvy Tri buněk. Obrázek 20A: Lidské ThO (JDV 305) a Tri (JDV24) alloantigen-specifické CD4⁺ T buněčné klony nebo antigennespecifické Trl-buněčné klony (JDV15 a JDV308) byly stimulovány buď s allogeneickými ozařovanými monocyty po dobu 5 dnů nebo se zesíťovaným anti-CD3 a anti-CD28 mAbs po dobu 3 dnů. Obrázek 20B: Naivní (MEL 14 čiré) CD4⁺ T buňky z myší transgenických na DO 11.10 αβ TCR na BALB/c genetickém základu byly diferenciovány in vitro podle popisu k Obrázku 19 a restimulovány s OVA peptidem (1 μΜ) a ozařovanými slezinovými APC po dobu 3 dnů. Jeden OVA specifický ThO klon (A-7) a dva OVA specifické Tri typy klonů (A-107 • · a A-10-11) byly stimulovány za stejných podmínek. Proliferativní odezvy byly měřeny [³H]TdR inkorporací během posledních 12 h kultivace. Kultury lidských a myších buněk byly prováděny v přítomnosti kontrolního isotypu mAb (20 pg/ml - černý sloupec), blokujícího antiIL-10 mAb (12G8-5 pg/ml pro lidské buňky nebo JES6-2A5-10 pg/ml pro myší buňky - bílý křížově šrafovaný sloupec), blokujícího anti-TGF-β (Genzyme, MA, 10 pg/ml - černý křížem šrafovaný sloupec) nebo kombinace dvou protilátek (bílý sloupec).

Obrázky 21A a 21B ukazují, že Tri buňky inhibují Ag-specifické proliferativní odezvy naivních CD4⁺ T buněk. Obrázek 21 A: Klidové čištěné lidské CD4⁺ T buňky z dárce JDV byly stimulovány allogeneickými přečištěnými ozařovanými monocyty po dobu 5 dnů ve spodní přihrádce komory na jamkové desky. Klidové T buňky byly kultivovány společně s různými autologními klony v koši na jamkové desky, s alloantigen-specifickým Tri klonem (JDV24), alloantigen-specifickým ThO klonem (JDV305) nebo s antigen-nespecifickým Tri klonem (JDV308). Po 5 dnech byl koš vyjmut a proliferativní odezva klidových CD4⁺ T buněk byla analyzována [H]-TdR inkorporací během posledních 12 h kultivace. Obrázek 21B: Naivní (MEL 14 čiré) CD4⁺ T buňky z myší transgenovaných do DO 11.10 αβ TCR na BALB/c genetickém základu byly stimulovány ve spodní přihrádce komory na jamkové desky s OVA peptidem (1 pM) a ozařovanými slezinovými APC po dobu 3 dnů. Tyto naivní buňky byly kultivovány společně s indikovanými populacemi, obsaženými v koši na jamkové misky; OVAspecifická populace CD4⁺ T buněk, diferenciovaná in vitro třemi následnými restimulacemi v přítomnosti IL-4 (IL-4 Diff.), IL-10 (IL-10 Diff.) nebo IL-4 a IL-10 (IL4/10 Diff) nebo OVA specifické CD4⁺ T buněčné klony A-10-9, A-10-11 (Tri typ klonu) nebo A-7 (Thl typ klonu), po 3 dnech byl koš odstraněn a proliferativní odezva naivních CD4⁺ T buněk byla analyzována ³[H]TdR inkorporací během posledních 12 h kultivace. Kultivace lidských a myších buněk byly prováděny v přítomnosti kontrolního isotypu (20 pg/ml - černý sloupec), blokujícího anti-IL-10 mAb (12G8-5 pg/ml pro lidské buňky nebo JES6-2A5-10 pg/ml pro myší buňky - bílý křížově šrafovaný sloupec), blokujícího anti-TGF-β (Genzyme, MA, 10 pg/ml - černý křížem šrafovaný sloupec) nebo kombinace dvou protilátek (bílý sloupec).

Podstata vynálezu

Vynález je směřován, v některých jeho provedeních, k metodě použití IL-10 kpotlačení odhojování tkání při transplantacích. Vynález také zahrnuje farmaceutické prostředky obsahující

IL-10 pro provádění popsaných metod. Různé IL-10 pro použití podle vynálezu jsou vybrány ze

::

. ..... · · · ··* ..

·· · ·.

I skupiny obsahující dospělé polypeptidy kódované otevřenými čtecími rámci definovanými cDNA inserty vpH5C, pH15C a pBCRFl (SRa), které jsou uloženy v American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, 20. prosince 1989 pod přístupovými čísly 68191, 68192 a 68193. Konstrukce mohou být také založeny na jiných exprimujících systémech. Viz. např.: Pouwels et al. (1985 a Suplements) Cloning Vectors: A Laboratory Manual Elsevier, N. Z.; Rodriquez et al. (1988, eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA. PCR metody mohou být použity k izolaci dalších genů kódujících IL-10, např.: polymorfní nebo druhové varianty.

IL-10 je cytokin se silnými imunosupresivními vlastnostmi. Viz např.: Mosmann et al., U.

S. Patent No. 5,231,012, který je zde zahrnut jako reference. IL-10 inhibuje proliferaci antigenspecifických T buněk na různých úrovních. IL-10 inhibuje rozpoznávací funkce vůči antigenům u buněk, které se touto činností „profesionálně“ zabývají jako např. monocyty, dendritické buňky a Langerhansovy buňky tím, že snižují expresi MHC molekul třídy Π a adhezních a kostimulativních molekul ICAM-1 a B7.1 a B7.2 (viz. review de Vries and de Waal Malefyt (1995, eds.) Interleukin 10, Landes Co, Austin TX). IL-10 také inhibuje u těchto buněk produkci IL-12, který zvyšuje aktivaci T buněk a diferenciaci Thi buněk (D’Andrea et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1041; Hsieh et al. (1993) Science 260: 547. Kromě toho IL-10 přímo inhibuje proliferaci T buněk tím, že inhibuje IL-2 transkripci a IL-2 produkci u těchto buněk (review de Vries and de Waal Malefyt (1995, eds.), Interleukin 10, Landes Co, Austin TX).

Kromě toho má IL-10 silné protizánětlivé účinky. Inhibuje produkci prozánětlivých cytokinů TNF-α, IL-la, IL-Ιβ, IL-6 aⁱehemokinů jako třeba EL-8, ΜΙΡ-Ια a ΜΠΜβ pomocí aktivovaných monocytů/makrofágů, neutrofilů, eosinofilů a žímých buněk (review de Vries and de Waal Malefyt (1995, eds.) Interleukin 10, Landes Co, Austin TX; Takanashi et al. (1994) J. Exp. Med. 180: 711; Arock et al. (1996) Eur. J. Med. 26: 166). Kromě toho podporuje IL-10 mikrobicidní aktivitu makrofágů závislou na oxidu dusnatém a produkci prostaglandinů u těchto buněk“ (Gázzinéíli et al. (1992) J. Immunol. 148: 1792; Cunha et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 182: 1155; Niiro et al. (1994) Int. Immunol. 6: 661. Na druhé straně zvyšuje produkci antagonisty IL-1 receptoru u monocytů a granulocytů (review de Vries and de Waal Malefyt (1995, eds.) Interleukin 10, Landes Co, Austin TX.

Souhrnem, tato data naznačují, že IL-10 může mít potenciální klinické využití při léčení nemocí spojených s nežádoucí aktivací T buněk a jejich expanzí, jako třeba autoimunitní nemoc, odmítnutí transplantovaných orgánů a kostní dřeně, odhojování štěpů, parasitické infekce jako

např.: glanulomáza, zánětlivá onemocnění jako např. Crohnova nemoc, kolitida, pankreatitida, zánětlivé onemocnění plic nebo očí, parazitické nemoci a alergické nemoci, jako třeba astma, atopická dermatitida a rinitida.

I. Zkouška na Interleukin-10

IL-10 vykazuje biologické aktivity, které mohou být základem stanovení a jednotek. Viz. např. Coligan (1989 a periodické dodatky, ed.) Current Protocols in Lmmunology, Greene/Wiley, NY. Obzvláště mají IL-10 tu vlastnost, že inhibují syntézu nejméně jednoho cytokinu ve skupině obsahující IFN-γ, lymfotoxin, IL-2, IL-3 a GM-CSF v populaci pomocných T buněk, indukovaných pro syntézu jednoho nebo více z těchto cytokinů, vystavením antigenu nebo buňkám zjišťujících jeho přítomnost. Při této aktivitě jsou APC zpracovány tak, že nejsou schopné replikace, ovšem jejich schopnost rozeznávat antigen zůstává funkční. Toto je konvenčně prováděno iradiací APCs, např. s 1500-3000 R (gama nebo X-radiace) před smícháním s T buňkami.

Alternativně může být stanovení inhibice cytokinu provedeno v primární nebo přednostně sekundární směsné reakci lymfocytů (MLR), kde se nemusí použít syngeneické APC. MLR jsou dobře známé vdaném oboru, např.: Bradley str. 162-166, Mishell et al. (1980, eds.) Selected Methods in Cellular lmmunology, Freeman, San Francisco; Battisto et al. (1987) Meth. in Enzymol. 150: 83-91 Academie Press. Ve zkratce, dvě populace allogeneických lymfoidních buněk jsou smíchány, přičemž jedna z populací byla před smícháním ošetřena za účelem zabránění proliferace (např. ozářením). S výhodou se buněčné populace připravují- -o koncentracích kolem 2 x 10⁶ buněk/ml v patřičném médiu, např. RPMI 1640 s 10% séra telecího plodu. Při stanovení se pro kontrolní a testované kultury smíchá 0,5 ml každé populace. Pro sekundární MLR jsou buňky zbývající po 7 dnech v primární MLR restimulovány čerstvě připravenými ozařovanými stimulátorovými buňkami. Vzorek, u něhož se očekává přítomnost IL-10 může být přidán do testované kultury při jejím míchání a jak kontrolní tak testované kultury mohou být zkoušeny na produkci cytokinu 1 až 3 dny po smíchání.

Získávání populací T buněk a/nebo APC populací pro stanovení IL-10 zahrnuje techniky dobře známé v daném oboru, které jsou plně popsány např. v DiSabato et al. (1984, eds.) Meth. in Enzymol. vol. 108 Academie Press. APC pro preferované stanovení IL-10 jsou periferální krevní monocyty, které jsou získávány za použití standardních technik, např.: podle popisu v Boyum (1984) Meth. in Enzymol. 108: 88-102; Máge (1984) Meth. in Enzymol. 108: 118-132;

: : : ·: : :: :

: ::.:. . . · . · ··· ···

·..· : ·..· .:. ..

Litvín et al. (1984) Meth.in Enzymol. 108: 298-302; Stevenson (1984) Meth. in Enzymol. 108: 242-249 a Romain et al. (1984) Meth. in Enzymol. 108: 148-153, které jsou zde zahrnuty jako reference. S výhodou jsou při stanovení IL-10 používány pomocné T buňky, které jsou získávány nejdříve separací lymfocytů zperiferální krve a poté selekcí, např. s využitím průtokové cytometrie, pomocné buňky s použitím komerčně dostupné anti-CD4 protilátky, např. OKT4 popsané v Lf. S. Patent No. 4,381,295 a dodávaný firmou Ortho Pharmaceutical Corp. Potřebné metody jsou popsány v Boyum (1968) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (Suppl. 97): 77; Meth. in Enzymol. Vol. 108 (podle citace výše) a Bram et al. (1986) Meth. in Enzymol. 121: 737-748. Obecně jsou PBL získávány z čerstvé krve Ficoll-Hypaque centrifugací s hustotním gradientem.

Množství antigenů může být použito při stanovení, např. hemocyanin z mořského plže (KLH), kuřecí γ-globulin a pod. Výhodněji je při stanovení namísto antigenů používána pro stimulaci pomocných T buněk anti-CD3 monoklonální protilátka, např. OKT3 popsaná v U. S. Patentu No. 4,361,549.

Koncentrace cytokinů v kontrolním a testovaném vzorku jsou měřeny standardními biologickými a/nebo imunochemickými stanoveními. Konstrukce imunochemických stanovení pro specifické cytokiny je dobře známa v daném oboru, kde jsou k dispozici Čištěné cytokiny, např. Campbell (1984) Monoclonal Antibody Technology Elsevier, Amsterdam; Tijssen (1985) Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier, Amsterdam a U. S. Patent No.

I

4,486,530 jsou příklady literatury, která se touto problematikou široce zabývá. Komerčně dostupná je souprava ELISA pro lidský IL-2, lidský IL-3 a lidský GM-CSF od Genzyme Corp. (Boston, MA) a souprava ELISA pro lidský IFN-γ od Endogen, lne. (Boston, MA). Polyklonální protilátky specifické pro lidský lymfotoxin, dostupné od Genzyme Corp, mohou být použity při radioimunologické stanovení lidského lymfotoxinu, např.: Chard (1982) An Introduetion to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier, Amsterdam. Viz. také Coligan ét al. (eds.) Current Protocols in Immunology.

Výše jmenovaná biologická stanovení cytokinů mohu být také použity k určení aktivity IL-10. Biologické stanovení lidského lymfotoxinu je popsáno vAggarwal (1985) Meth. in Enzymol. 116: 441-446 a vMatthews et al., str. 221-225 vClemens et al. (1987, eds.) Lymphokines and Interferones: A Practical Approach, IRL Press, Washington, D, C. Lidský IL-2 a GM-CSF mohu být stanoveny faktorově závislými buněčnými liniemi CTLL-2 a KG-1, dostupných od ATCC pod přírůstkovým číslem TIB 214 a CCL 246. Lidský EL-3 může být stanoven pomocí jeho schopnosti stimulovat vznik širokého spektra hematopoietických ·« buněčných kolonií na měkkých agarových kulturách, např. podle popisu v Metcalf (1984) The

Homopoietic Colony Stimulating Factors, Elsevier, Amsterdam. INF-γ může být kvantifikován anti-virálním stanovením, např. Meager, str. 129-147, v Clemens et al., eds. (viz. citace výše).

Produkce cytokinu mRNA může být měřena a analyzována bodovou hybridizací podle popisu v White et al. (1982) J. Biol. Chem. 257: 8569-8572 a v Gillespie et al. U. S. Patent No. 4,483,920, které jsou zde zahrnuty jako reference. Další přístupy zahrnují „dot blotting“ s využitím čištěné RNA, např. kapitola 6 v Hames et al. (1985, eds.) Nucleic Acid Hybridization A Practical Approach, IRL Press, Washington, D. C.

V některých případech mohou být vzorky určené pro testování na aktivitu IL-10 zbaveny předem stanovených cytokinů, které by mohly interferovat se stanovením. Například, IL-2 zvyšuje produkci IFN-γ v některých buňkách. V závislosti na pomocných T buňkách použitých při stanovení by měl být IL-2 odstraněn z testovaného vzorku. Toto odstranění je konvenčně prováděno protlačením vzorku přes standardní anti-cytokin afinitní kolonu.

Pro jednoduchost jsou jednotky aktivity IL-10 definovány pomocí schopnosti IL-10 rozšířit proliferaci MC/9 buněk indukovanou s IL-4. Tato definice je popsána v U. S. Patent No. 4,559,310 a je dostupná od ATCC po přístupovým číslem CRL 8306. Jedna jednotka je definována jako koncentrace IL-10, která dává 50% maximální stimulace proliferace MC/9 nad úroveň vyvolanou IL-4 v následném stanovení. Ke stanovení se nachystají vícenásobné koncentrace (vždy dvojmo) LI-4 a LI-10 v 50 μΐ média na jednu jamku ve standardní mikrotitrační desce. Médium se například skládá z RPMI 1640, 10% séra telecího plodu, 50 μΜ 2-merkaptoethanolu, 2 mM glutammu, penicilinu (100 U/L) a streptomicynu (100 pg/L). Přidá se IL-4 rozpuštěný v médiu (25 μΙ/jamku s aktivitou 1600 U/ml (400 U/ml při konečném zředění))a vzorky se inkubují přes noc, např. 20 až 24 h. Pak se přidá ³H-thymidin (např. 50 pCi/ml v médiu), tak aby bylo 0,5 až 1,0 pCi na jamku a buňky jsou opět inkubovány přes noc, poté jsou sebrány a podrobeny měření radioaktivity.

Π. Čištění a farmaceutické přípravky

Jsou-li polypeptidy podle tohoto vynálezu exprimovány v rozpustné formě, například jako produkty sekrece transformovaných kvasinkových nebo savčích buněk, mohou být čištěny pomocí standardních známých postupů, včetně takových kroků jako jsou srážení síranem amonným, iontově-výměnná chromatografie, gelová filtrace, elektroforéza, afinitní chromatografie a pod, např. „Enzyme Purification and Related Techniques,“ (1977) Methods in

X.

Enzymology 22: 233-577 a Scopes (1982) Protein Purifícation: Principles and Practice, SpringerVerlag, New York poskytují přehled o těchto čistících operacích. Podobně, jsou-li polypeptidy podle tohoto vynálezu v nerozpustné formě, např. jako agregáty, inkludované sloučeniny a pod., mohou být čištěny standardními metodami známými v daném oboru, včetně separace inkludovaných sloučenin od rozbitých hostitelských buněk pomocí centrifugace, rozpouštění inkludované sloučeniny s chaotropickými a redukčními činidly, ředění rozpuštěné směsi a snížení koncentrace chaotropického a redukčního činidla, přičemž polypeptid může zaujmout biologicky aktivní konformaci. Popsané postupy jsou popsány v následujících odkazech, které jsou zde uvedeny jako reference: Winkler et al. (1986) Biochemistry 25: 4041-4045; Winker et al. (1985) Biotechnology 3: 992-998; Koths et al., U. S. Patent 4,569,790 a European patent applications 86306917.5 a 86306353.3. Rekombinantní metody dovolují produkci proteinů buďs fůzním produktem, který dovoluje čištění nebo s epitopním přívěškem, který také pomáhá při čištění nebo detekci. Mohou být vestavěny specifické prostředky, které dovolují odstranění cizích sekvencí. Má se za to, že aminokonec molekuly IL-10 je důležitý při vázání kjeho receptoru, proto se obvykle upřednostňuje k fůzi karboxylový konec.

V tomto patentu výraz „efektivní množství“ znamená množství dostatečné k zajištění požadovaného výsledku, např. v daném kontextu ke snížení nebo prevenci odhojování tkání. Přednostně budou mít tato množství minimální negativní postranní vlivy. Efektivní množství pro konkrétního pacienta může záviset na faktorech jako je stav, typ a množství transplantované tkáně, celková zdravotní situace pacienta, způsob podávání, vážnost postranních efektů a pod. Obecně je IL-10 podáván jako farmaceutický přípravek, zahrnující efektivní množství EL-ΙΌ a farmaceutický nosič. Farmaceutickým nosičem může být jakákoliv netoxická látka vhodná pro dodání přípravku podle tohoto vynálezu pacientovi. Obecně jsou přípravky užitečné pro parenterální podávání těchto léčiv dobře známé, např. Remington’s Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, PA nebo Gilman et al. (eds.) Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Bašéš of Therapeutičs, Pergamon Press. Alternativně mohou být přípravky podle tohoto vynálezu zavedeny do pacientova těla implantovatelným nebo injektovatelným systémem pro přenos léčiva, např. Urquhart et al (1984) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199236; Lewis (1981, ed.) Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals, Plenům Press, New York; U. S. Patent No. 3,773,919; U. S. Patent No. 3,270,960 a pod.

Při parenterálním podávání je EL-10 přednostně formulován v jednotkových dávkách v injektovatelné formě (roztok, suspenze, emulze) dohromady s farmaceutickým nosičem. Viz.

• · • · · · • · ···· • · · ·· · např. Avis et al. (1993, eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, NY; Lieberman et al. (1990, eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, NY a Lieberman et al. (1990, eds) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, NY. Příklady těchto nosičů zahrnují normální fyziologický roztok, Ringerův roztok, roztok dextrózy a hankův roztok. Mohou být použity také nevodné nosiče jako fixované oleje a ethyloleát. Preferovaným nosičem je 5% roztok dextrózy ve fyziologickém roztoku. Nosič může obsahovat malá množství aditiv jako třeba látek, které zvyšují isotonicitu a chemickou stabilitu, např. pufry a preservativa. IL-10 je přednostně formulován v čištěné formě, která je prakticky zbavená agregátů a dalších proteinů při koncentracích v rozmezí od 5 do 20 pg/ml. IL-10 je přednostně podáván kontinuální infuzí tak, aby množství dodané během 1 dne bylo v rozmezí od 50 do 800 pg (to je asi 1 až 16 pg/kg/den). Stupeň denní infuze se může lišit na základě monitorování postranních účinků a počtu krevních buněk.

ΠΙ. Tri buňky

Tento vynález také zajišťuje antigen-specifické anergické T buňky, které nemají antigenspecifickou odezvu na přítomnost antigenu. Viz. např.: Paul (1993, ed.) Fundamental Immunology, Raven Press. Tato antigen-specifická anergie může být odlišena od druhové tolerance v mnoha jejích formách, rezultujících z blokády signálu T buněčných receptorů na buněčném povrchu a je tedy nezávislá na antigenu. Nezdá se, jak je dále ukázáno, že by zde popsaná antigen-specifická anergie ovlivňovala signální cestu závislou na Ca²⁺, např. cestu Ras/Raf/MAPK signální transdukce, protože odezva T buněčného receptorů a Ca²⁺odezva ňa setkání s antigenem zůstává, kromě toho, anergie nevyžaduje soustavné podávání činidla k blokování ranných stádií signální transdukce, např. nezbytného pro aktivní blokování funkce T buněčného receptorů. Zdá se, že anergie se zachovává po určité období, např. po dobu nejméně 14 dnů, 18 dnů, 21 dnů, 24 dnů atd. Může se zachovávat po týdny, měsíce a přednostně roky.

Antigen-specifická anergie popsaná v tomto patentu může být vyvolána poskytnutím kombinace IL-10 s antigenem. Komponenty jsou poskytnuty imunitnímu systému nebo buňkám po adekvátní dobu, často zcela souběžně, i když není nezbytně nutné podávání obou komponent po celé období. Tato doba bude typicky nejméně 5 dní, typičtěji nejméně 7 dní, přednostně nejméně 9-11 dní a ještě výhodněji nejméně 13-15 dní nebo více. Dávkování IL-10 a/nebo antigenu může záviset na různých faktorech jako jsou antigen, délka podávání, jsou-li podávány obě komponenty, je-li podáván IL-10 před antigenem a pod. Přednostně se podávají obě komponenty po dobu nejméně 7 dnů.

IL-10 byl již popsán výše. Další prostředky pro ovlivnění vyššího stupně IL-10 zahrnují stimulaci endogenního EL-10, včetně LPS, TNF-α, IL-12, BCG1 (Bacillus Calmett Guerin), Corynebacterium parvus, poly-I-C (alloadjuvant pro aktivaci monocytů a makrofágů) a pod. Protilátky agonistické k IL-10 receptoru mohou také fungovat jako agonisté.

Existují různé typy antigenů, pro které může být antigen-specifická anergie T buněk důležitá. Jak alloantigeny tak i selfantigeny se vyskytují v souvislosti s MHC. Viz. např.: Paul (ed.) Fundamental Immunology. Další antigeny, pro které mže být anergie T buněk důležitá, zahrnují rozpustné antigeny jako třeba rozpustné proteiny nebo fragmenty nerozpustných komplexů, korpuskulámí antigeny jako třeba baktérie nebo parazity a alergeny; Různé formy antigenů budou dodávány společně s IL-10 za účelem indukce antigen-specifického antigenu jak je zde popsáno.

Antigen-specifická anergie zahrnuje mechanismus, který je rozlišitelný od některých dalších forem necitlivosti. Zdá se, že tyto Tri buňky (které byly v dřívějším podání označeny jako Th3 buňky, ovšem v tomto patentu jsou přeoznačeny jako Tri buňky, aby je bylo možné odlišit od jiné populace buněk popsaných v Weiner et. al. (1996) Faseb Meeting, New Orleans, Louisiana A 2558) jsou paměťové T buňky, např. CD45+ na rozdíl od naivních T buněk, např. CD45RA+ nebo CD45RO-. Obzvláště pak tato antigen-specifická anergie odráží neschopnost těchto antigen-specifických buněk odpovědět na následnou restimulaci se specifickým antigenem, typicky s IL-2. Jsou-li antigen-specifické anergické buňky restimulovány s EL-2 a antigenem při normálních úrovních, buňky nejsou ani významně proliferovány ani neprodukují cytokiny. Je-li však stimulována následným dodáním anti-CD3 protilátek (při 100 ng/ml), anergická populace obsahující Tri buňky bude stimulovat pouze růst ThO, Thi a Th2 T buněk. Analýza produkce cytokinů tímto podsouborem T pomocných buněk je dobře známa jde-li o stimulaci při vyšších úrovních anti-CD3 (kolem 1 až 10 pg/ml). Zdá se ovšem, že při této úrovni stimulace nejsou Tri buňky stimulovány k proliferaci nebo produkci cytokinů. Zdá se, že Tri buňky jsou stimulovány jak k proliferaci tak i k produkci cytokinů s anti-CD3 protilátkami při úrovních kolem 100 až 700 pg/ml. Jsou-li tedy buňky ve směsné populaci rozředěny do jednotlivých buněk mikrotitrační desky, všechny buňky zmíněného podsouboru T pomocných buněk budou stimulovány s anti-CD3 protilátkami při 100 až 700 pg/ml, což dovoluje určení • · · ·· profilů produkce cytokinů v různých podsouborech ThO, Thl, Th2 a Tri podle zde uvedeného popisu.

Odezva na následnou obecnou stimulaci s anti-CD3 protilátkami, např. prostřednictvím komplexu T buněčného receptoru s Cd3, může být kvantifikována různými způsoby. Podle výše uvedeného popisu mohou být měřeny různé cytokiny prostřednictvím jejich biologické aktivity. Přednostně může být množství akumulovaného proteinu určeno různými imuno- popř. i jinými stanoveními, jak bude dále popsáno. Alternativně může být měřena produkce mRNA za účelem stanovení úrovně stimulace transkripce.

Typicky jsou cytokiny měřeny po akumulaci vylučovaných proteinů během určité časové periody po např. sekundární nebo následné stimulaci, s použitím anti-CD3 protilátky (100 až 700 v

pg/ml). Cas pro akumulaci je přednostně nejméně 24 h v objemu 1 ml, může ovšem být delší a může zahrnovat další vrstvy živných buněk a pod.

Proliferace buněk po následné stimulaci může být měřena standardními metodami. Tó často zahrnuje měření inkorporace nukleotidů, může ovšem také zahrnovat měření počtu buněk, objemu buněk a pod.

Zatímco některé odezvy tolerance, charakterizované jako anergie, rezultují z blokády signalizace na T buněčném receptoru (viz. Weiss a Littman (1994) Cell 76: 263-274; Chán et al. (1994) Ann. Rev. Immunol. 12: 555-592 a Fraser et al. Immunol. Today 14: 357-362), anergie popsaná v tomto vynálezu existuje při funkčních T buněčném receptoru. Především, stimulace s anti-CD3 stále vede k toku Ca²⁺. Ovšem antigen-specifické T buňky neodpovídají za normálních okolností na stimulaci antigenem, např. produkcí cytikinu a/nebo proliferaci buněk.

Anergie, která je popsána v tomto vynálezu, zahrnuje buď mnohem menší proliferativní odpověď na IL-2 a/nebo antigen, např. menší než 50% odezvu, obvykle menší než 40%, častěji méně než 30%, s výhodou méně než 20% a výhodněji méně než 10% nebo méně ve srovnání s neanergickými buňkami. Alternativně, stimulace požadovaná k indukování odezvy vyžaduje mnohem větší množství ÍL-2 a antigenů, např. 5 až 50 x více, aby byla vyvolána ekvivalentní proliferativní odpověď. Anergie je také reflektována jiným profilem produkce cytokinů po restimulaci klonů s anti-CD3 protilátkami. Viz níže.

Měření produkce cytokinů se provádí po restimulaci klonů se specifickým antigenem, ačkoliv častěji po druhové restimulaci s anti-CD3 (in vitro při 10 pg/ml nebo více), přičemž se podle všeho aktivuje prostřednictvím T buněčného receptoru. Tato stimulace vede k mnohem slabší buněčné proliferativní odezvě a odlišnému profilu cytokinové produkce. Mezi zjevné frfr · Μ· · ·· ·· • frfr · · ·· frfrfr· • fr · fr · · · frfrfrfr • · frfrfrfr · · * frfr frfrfr ··· • · 9 · · · · · ·· · fr · frfrfr 99 99 rozdíly v produkci cytokinu po restimulaci a klonování patří nedetekovatelné množství IL-4 a vyšší produkce IL-10. Viz níže, např. Tabulka 7. Množství použitých anti-CD3 protilátek může také ovlivňovat odezvu, jak je dále naznačeno.

Srovnáním množství produkovaných cytokinů lze vypozorovat, že klony Tri buněk produkují odlišný profil cytokinů než klony ThO, Thl nebo Th2 po stimulaci anti-CD3 (10 pg/ml). Pokud jde o IL-2, tyto klony energických Tri buněk produkují menší množství než asi 30%, přednostně méně než 10% a typicky méně než asi 2% ve srovnání s odpovídajícími ThO nebo Thl klony. Pokud jde o IL-4, tyto anergické Tri buňky produkují méně než 30%,

A e přednostně méně než 10% a typicky méně než 1% ve srovnání s odpovídajícími ThO nebo Thl & buněčnými kmeny. V případě IL-5 produkují tyto anergické Tri buněčné klony asi 10 až 20% ve ^v srovnání s odpovídajícími ThO buněčnými klony, asi 5 až 10% ve srovnání s odpovídajícími Th2 buněčnými klony a asi 5 až 30 x tolik než odpovídající Thl buněčné klony. U IL-10 produkují tyto anergické Tri buňky asi 10 až 50 x tolik jako odpovídající ThO nebo Thl buněčné klony a asi 5 až 25 x tolik co odpovídající Th2 buňky. Pokud jde o IFN-γ, tyto anergické Tri buňky produkují asi 3 až 20 x tolik jako odpovídající Th2 buněčné klony a srovnatelné množství, v rámci faktoru 2 nebo 3, ve srovnání s produkcí klonů ThO nebo Thl. Pokud jde o IFN-α, tyto anergické Tri buňky produkují asi 2 až 5 x tolik jako odpovídající ThO nebo Th2 buněčné klony a srovnatelné množství, v rámci faktoru 2 nebo 3, ve srovnání s produkcí klonů Thl. Anergické

Tri buněčné klony také produkují pouze nízké úrovně GM-CSF.

Povšimněte si také, že trvání IL-10 antigenu může ovlivnit rozsah reversibility. Zatímco léčba 7 dní vede prakticky k ireverzibilitě s normálním množstvím IL-2 nebo anti-CD3 protilátkou (10 pg/ml), velmi velké množství IL-2, antigenu nebo anti-CD3 protilátky (např. 700 pg/ml) povedou k větší schopnosti snížit nebo obrátit anergii.

IL-10 inhiboval v závislosti na dávce alloantigenem indukované proliferativní odezvy - v odezvách primárních smíšených lymfocytů. Supresivní efekt byl optimální v případě, kdy IL-10 byl přidán na začátku kultivace, což naznačuje, že IL-10 má vliv na ranná stadia aktivace T buněk. Proliferativní odezvy byly zesíleny v přítomnosti anti-IL-10 mAb, což naznačuje, že endogenně produkovaný IL-10 potlačuje proliferaci v primárních MLR. Inhibiční efekt EL-10 byl pozorován nezávisle na tom, zda byly jako stimulátorové buňky použity ozařované allogeneické mononukleámí buňky z periferální krve (PBMC), čištěné monocyty nebo B buňky. Snížené proliferativní odezvy nebyly obnoveny při vyšších koncentracích exogenního IL-2, což naznačuje, že efekt IL-10 nemá souvislost s inhibici syntézy IL-2. Kromě toho byla s IL-10 ·· ·· • · · · • · · · ··· ··· • · ·· ·· flfl ···· • fl • · snížena produkce IL-2, IFN-γ, IL-6, GM-CSF a TNF-a v primárních MLR pomocí EL-10 a byla zvýšena v přítomnosti anti-EL-10 mAb. Nejsilnější efekt byl pozorován na produkci TFN-γ. Ačkoliv IL-10 redukuje proliferační odezvu, poměr mezi CD3⁺CD4⁺ a CD3⁺CD8⁺ zůstává stejný u buněk s dodaným EL-10 a buněk kontrolních. Avšak procentuální zastoupení aktivovaných CD3⁺ T buněk, jak můžeme soudit z CD25⁺ a HLA-DR⁺ exprese, byl shodně snížen v přítomnosti IL-10.

Lidský IL-10 inhibuje syntézu IFN-γ a stimulačního faktoru kooonie granulocitních makrofágů (GM-CSF) indukovaných v lidském PBMC pomocí PHA, anti-CD3 mAb a IL-2 (Bacchetta et al. (1989) J. Immunol. 144: 902 a Bevan (1984) Immunol. Today 5: 128. Tato inhibice nastává na transkripění úrovni (Altmann et al. (1989) Nátuře 338: 512, Bacchetta et al., supra). Myší IL-10 (m-IL-10) má pleiotropickou aktivitu na různé typy buněk, včetně efektů urychlujících růst u thymocytů (Chen et al. (1991) J. Immunol. 147: 528), cytotoxických T buněk (De Koster et al. (1989) J. Exp. Med. 169: 1191) a krmných (mast) buněk (de Waal Malefyt et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 1209). m-IL-10 indukuje třídu Π MHC antigen exprese u B buněk a podporuje životaschopnost těchto buněk (de Waal Malefyt et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 915). Kromě toho EL-10 inhibuje produkci cytokinů makrofágy (Bejarano et al. (1985) Int. J. Cancer 35: 327; Fiorentino et al. (1989) J. Exp. Med. 170: 2081). h- a m-IL-10 mají značnou homologii s BCRF-1, otevřený čtecí rámec genomu Epstain Barr viru (EBV) (Azuma et al, (1992) J. Exp. Med. 175: 353; Bacchetta et al. (1989) J. Immunol. 144: 902). Proteinový produkt BCRF-1, označovaný jako virální IL-10 (v-IL-10), sdílí mnohé společné vlastnosti s h- a m-EL-10, včetně CSIF aktivity na lidské a myší T buňky (Bacchetta et al., supra; Bevan, M. J., supra).

Lidský IL-10 a v-EL-10 inhibují antigen-specifickou proliferativní odezvu tak, že snižují schopnost lidských monocytů zjišťovat přítomnost antigenů tím, že snižuje regulaci třídy Π MHC molekul (Figdor et al. (1984) J. Immunol. Methods 68: 68), Kromě toho EL-10 inhibuje syntézu cytokinů s LPS nebo s monocyty aktivovanými s IFN-γ, včetně CM-CSF, G-CSF a prozánětlivých cytokinů IL-la, IL-Ιβ, IL-6, EL-8 a TNF-α (Bejarano et al. (1985) Int. J. Cancer 35: 327; Fiorentino et al, supra). Je zajímavé, že monocyty aktivované s LPS produkují vysoké úrovně IL-10 a že byla pozorována zvýšená produkce cytokinů v přítomnosti anti-IL-10 mAb, což naznačuje autoregulační efekt IL-10 na produkci monokinů (Bejarano et al., supra).

Alloreaktivita alespoň částečně odráží rozpoznání cizích MHC molekul plus antigenových peptidů různého původu (Fiorentino et al. (1991) J. Immunol. 146: 3444;

Fiorentino et al. (1991) J. Immunol. 147: 3815; Freedman et al. (1987) J. Immunol. 139: 3260;

fl • «

Go et al. (1990) J. Exp. Med. 172: 1625). Kromě toho alloreaktivita T buněk může rozpoznat konformační rozdíly mezi MHC molekulami, do značné míry nezávislými na vázaném peptidu nebo dokonce na prázdným MHC molekulách (Harding et al. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 5553; Hsu et ál. (1990) Science 250: 830; Julius et al. (1973) Eur. J. Immunol. 3: 645). IL-10 inhibuje allospecifickou proliferativni odpověď a produkci cytokinů. Kromě toho, snížená proliferativni odezva nemůže být obnovena exogenním IL-2.

Tento vynález tedy zajišťuje prostředky ke generování množství alloantigen-specifických Tri buněk stimulováním hostitelských CD4⁺ T buněk s donorovými ozařovanými PBMC v přítomnosti IL-10, např. po dobu minimálně 3 dnů, přednostně po dobu 5 dnů, výhodněji po dobu nejméně 7 dnů a v určitém provedeních vynálezu po dobu 9,11,13, 15 nebo více dnů. Tyto buňky mohou být podávány před nebo během transplantace (orgánů nebo kostní dřeně). Transplantace a/nebo terapie může probíhat s nebo bez podávání IL-10.

Výše popsaná buněčná terapie může být rozšířena na léčení dalších chronických nemocí způsobených antigeny, jako třeba gliadin (např. gluten), pro léčení celiakie, alergenů pro léčení chronických alergických nemocí (asthma, atopická dermatitida, rinitida) nebo GAD (dekarboxyláza glutamové kyseliny) nebo insulinu pro léčení cukrovky.

Tento vynález kromě toho může zajišťovat léčení nenormální sensitivity na mnoho dalších potenciálních autoantigenů. Buňky nebo léčení mohou přinést prostředky pro indukci dlouhodobé tolerance a rozvoj Tri buněk in vivo. Dlouhodobé (např. 5 až 15 denní) léčení s IL10 může zvýšit in vivo produkci anergie, se současným výskytem příslušných MHC antigenů, např. s třídou I nebo II popřípadě dalšími rozpustnými antigeny.

Vynález také zajišťuje prostředky pro podávání IL-10 za účelem indukce antigenspecifíckých Tri buněk a dlouhodobé antigen-specifícké tolerance in vivo pro léčení nemocí s nežádoucí aktivací T buněk, např. při odhojování transplantátů, odhoojvání štěpů, parazitických nemocech, chronických zápalech jako je třeba Crohnova nemoc, kolitidě, chronických očních zápalech, chronických zápalech plic a chronických zápalech jater. Viz např. Frank et al. (eds.) Samteťs Immunologic Little, Brown, Boston, MA.

V dalších souvislostech může být užitečné podávání IL-10 za účelem indukování autoantigen-specifických Tri buněk a autoantigen-specifické tolerance in vivo při léčení nemocí autoimunity jako třeba revmatická artritida, diabetes, násobná skleróza.

V mnoha provedeních by měl být IL-10 typicky podáván po dobu minimálně 5 až 15 dnů, s výhodou po dobu kolem 7 dní.

• ·

Všechny zde citované reference jsou zde zahrnuty jako samostatné odkazy stím, že je indikováno zda jde o patentové přihlášky nebo publikace.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady slouží k ilustraci tohoto vynálezu. Výběr vektorů a hostitelů stejně jako koncentrace reagencií, teplota a mnoho dalších variabilních parametrů jsou pouze pro ilustrování přihlášky tohoto vynálezu a nárokované subjekty by neměly být limitovány na zde popsaná určitá provedení vynálezu.

Některé ze standardních metod jsou popsány nebo je na ně uveden odkaz např. v Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (druhé vydání), vol. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel et al. Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY nebo Ausubel et al. (1987 a dodatky) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York; Innis et al (eds., 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academie Press, NY. Metody čištění proteinů zahrnují takové metody jako jsou např. srážení síranem amonným, sloupcová chromatografie, elektroforéza, centrifugace, krystalizace a další. Viz např. Ausubel et al. (1987 a pravidelné dodatky); Deutscher (1990) „Guide to Protein Purification“ v Methods in Enzymology vol. 182 a další díly v této sérii a literatura výrobců týkající se použití produktů na bázi čištěných proteinů, např. Pharmacia, Piscataway, N. J. nebo Bio-Rad, Richmond, CA. Kombinace s rekombinantními technikami dovoluje fůzi do vhodných segmentů, např. do FLAG sekvence nebo do vhodných segmentů, které mohou být fúzovány prostřednictvím sekvencí odstranitelných proteázami. Viz např. Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70; Hochuli (1990) „Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent“ v Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 37-98, PLenum Press, N.Y. a Crowe et al. (1992) OÍAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QIAGEN, lne., Chatsworth, CA.

Třídění buněk aktivovaných fluorescencí bylo prováděno s použitím standardních metod na Becton-Dickinson FACStar PLUS. Viz např. Shapiro (1988) Practical FIow Cytometry (2. vydání) Alan Liss, New York.

Příklad 1. Exprese lidského CSIF v bakterálním hostiteli • ·

·..· ί ·.·* ·ϊ· ·· ··

Syntetický lidský CSIF gen byl sestaven z mnoha chemicky syntetizovaných dvoušroubovicovitých fragmentů DNA za vzniku expresního vektoru TAC-RBS-hCSIF. Klonování a exprese byla provedena ve standardním bakteriálním systému, např. v E. coli K-12 kmen JM101, JM103 nebo podobném, popsaném ve Vieira a Messing (1982) Gene 19: 259-268. Natrávení restrikční endonukleázou a ligázové reakce byly provedeny s využitím standardních protokolů, např. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Viz také Ausubel (1987 a periodické dodatky, ed.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, NY; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: = A Laboratory Manual 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

Pro přípravu plasmidu v malém měřítku byl použit alkalický způsob (Maniatis et al., citováno výše). Pro přípravu ve větším měřítku byla použita modifikovaná alkalická metoda, kdy byl použit stejný objem isopropanolu k vysrážení nukleových kyselin z čištěného lyzátu. Srážení studeným 2,5 M síranem amonným bylo použito k odstranění RNA před centrifugací s rovnovážnou hustotou (CsCl) a před detekcí pomocí ethidiumbromidu.

Pro filtrovou hybridizaci byly použity kruhové filtry Whatman 540 k sebrání kolonií, které jsou poté lyžovány a fixovány následným zpracováním s 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI, 1 M Tris HCI pH 8,0, 1,5 M NaCI (každý 2 min) a zahříváním při 80°C (30 min). Hybridizace byly provedeny v 6 x SSPE, 20% formamidu, 0,1% natrium dodecylsulfátu (SDS), 100 pg/ml E. coli tRNA při 42°C po dobu 6 h s využitím syntetické DNA značené ³²P. (20 x SSPE se připravuje rozpuštěním 174 g NaCI, 27,6 g NaH2PO4.9H2O a 7,4 g EDTA v 800 ml H2O, pH se adjustuje na

7,4 s pomocí NaOH, objem se doplní na 1 1 a sterilizuje se autoklávováním). Filtry jsou promyty dvakrát (15 min, pokojová teplota) s 1 x SSPE, 0,1% SDS. Po autoradiografii (Fuji RX film), byly positivní kolonie umístěny na filtru tak, že se znovu vypěstované kolonie spojí s modře barvenými koloniemi na filtru. DNA je sekvencována dideoxy metodou, Sanger et al. (1977) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463. Templáty pro dideoxy reakce jsou buď jedno vláknité DNA příslušných úseků reklonované do M13mp veídorů, např. Messing et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9: 309 nebo dvouvláknové DNA připravené minialkalickou metodou a denaturací s 0,2 M NaOH (5 min, pokojová teplota) a vysrážené z 0,2 M NaOH, 1,43 M acetátu amonného přidáním 2 objemů ethanolu. DNA je syntetizována pomocí fosforamiditové chemie s využitím syntetizátoru Biosystems 380A. Byla provedena syntéza, deprotekce, rozštěpení a čištění (7M močovina PAGE, eluce, DEAE-celulóza chromatografie), např. podle popisu v manuálu k syntetizátoru Applied Biosystems 380.

• · • ·

• · · «· 9

Komplementární vlákna syntetické DNA určené ke klonování (400 ng obě) jsou smíchána a fosforylována polynukleotidkinázou v reakčním objemu 50 pl. Tato DNA je spojena s 1 pg vektorem DNA natráveným s příslušným restrikčním enzymem a ligace se provádí v objemu 50 pl při pokojové teplotě po dobu 4 až 12 h. Podmínky pro fosforylaci, štípání restrikčním enzymem, polymerizační reakci a ligaci byly popsány (Maniatis et al., citováno dříve). Kolonie jsou vyhodnoceny na lacZ⁺ (je-li potřeba) umístěním na L agar s přimíchaným ampicilinem, isopropyl-1-thio-beta-D-galaktosidem (IPTG) (0,4 mM) a 5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-Ggalaktopyranosidem (X-gal) 40 mg/ml.

TAC-RBS vektor je konstruován tak, že se DNA polymerázou vyplní jedno BamHI místo plazmidu pDR540 nesoucího tacp (Pharmacia). To je potom připojeno k nefosforylovanému syntetickému oligonukleotidu (Farmacia), který tvoří dvojkláknový fragment kódující shodné vázací místo ribozomu (RBS) GTAAGGAGGTTTAAC (SEQ ID NO: 5). Po ligaci je směs fosforylována a znovu spojena s Sstl spojkou ATGAGCTCAT (SEQ ID NO: 6). Tento komplex byl poté rozštěpen s Sstl a EcoRI a fragmentu 173 bp izolovaného pomocí elektroforézy na polyakrylovém gelu (PAGE) a klonován do EcoRI-Sstl restrikovaným pUC19 (Pharmacia) podle dále uvedeného popisu. Sekvence RBS-ATG-polyspojovacích úseků ve finální konstrukci (nazvaná TAC-RBS) je ukázána na Obrázku 2.

Syntetický IL-10 gen je zabudován do pUC19 plasmidu v osmi krocích. Při každém kroku mohou být inserty bez vyštípnutého úseku a/nebo inserty detekovány po klonování tak, že se lacZ(a) gen zpUC19 udržuje zarámovaný se startovním kodonem insertovaným v prvním kroku. Klony obsahující vymazaný úsek a/nebo insertované změny mohou být izolovány připojením na modré kolonie na L-ampicilinové desky obsahující X-gal a IPTG. Alternativně, mohou být sekvence insertů v každém kroku snadno určena s použitím universálního sekvenčního primerů pro přípravu plasmidu DNA v mikroměřítku, dostupného např. od Boehringer Mannheim.

V kroku 1 je TAC-RBS vektor štěpen s Sstl, zpracované s T4 DNA polymerázou (jejíž 3’ exonukleázová aktivita štěpí 3’ vyčnívající vlákno v Sstl úseku za vzniku fragmentů s otevřeným koncem) a po deaktivaci s T4 DNA polymerázou, zpracovanou s EcoRI za vzniku fragmentu ze 173 párů baží (bp), obsahující TAC-RBS úsek a mající otevřený konec na ATG startovním kodonu a EcoRI úsek na opačné straně. Nakonec je izolován fragment 173 bp TAC-RBS.

V kroku 2 je izolovaný fragment TAC-RBS z kroku 1 smíchán s EcoRI/KpnI naštípaným plasmidem pUC19 a syntetickým fragmentem 1A/B, který má jak je dále ukázáno volný konec

fl

(na konci proti směru exprese genu) a střídavý konec (konec po směru exprese genu), odpovídající KpnI výseku. Tento KpnI konec je připojen k BstEII místu (po směru exprese genu). Fragmenty jsou spojeny za vzniku pUC 19 v kroku 2.

V kroku 3 se syntetické fragmenty 2A/B a 3A/B (jak je ukázáno dále) smíchají s BstEII/Smal štěpeném pUC19 z kroku 2 (po namnožení a čištění) a jsou spojeny za vzniku pUC19 kroku 3. Je zajíměvé, že konec fragmentu 3A/B po směru exprese genu obsahuje zvláštní báze, které formují Smál otevřený konec. Tyto extra báze jsou štěpeny v kroku 4. Fragmenty 2A/B a 3A/B mají komplementární jednovláknité konce složené z 9 zbytků, které po smíchání hybridizují, čímž dovolují horní výřez BstEII v 2A/B a dolní otevřený konec v 3A/B připojit kpUC19.

V kroku 4 je AflD/Xbal naštěpený pUC19 z kroku 3 (po namnožení a přečištění) znovu čištěn, smíchán se syntetickým fragmentem 4A/B (ukázán níže) a připojen za vzniku pUC19 z kroku 4.

V kroku 5 je Xbal/Sall naštěpený pUC19 z kroku 4 (po namnožení a přečištění) smíchán se syntetickým fragmentem 5A/B (ukázán níže) a připojen za vzniku pUC19 z kroku 4. Je zajímavé, že Sáli střídavý konec fragmentu 5A/B je eliminován při štěpení s Hpal v kroku 6.

V kroku 6 je Hpal/Pstl naštěpený pUC19 z kroku 5 (po namnožení a čištění) smíchán se syntetickým 6A/B (ukázán níže) a připojen za vzniku pUC19 z kroku 6.

V kroku 7 je Clal/Sphl štěpený pUC19 z kroku 6 (po namnožení a čištění) smíchán se syntetickým fragmentem 7A/B (ukázán níže) a připojen za vzniku pUC 19 z kroku 7.

V kroku 8 je MluI/HindUI štěpený pUC19 z kroku 7 (po namnožení a čištění) smíchán se syntetickými fragmenty 8A/B a 9A/B a připojen za vzniku finální konstrukce. Finální konstrukce je insertována standardními technikami do E. coli K-12 kmen KM101, dostupného např. od ATCC pod přístupovým číslem 33876. Po kultivaci je protein extrahován z buněk JMI01 a roztoky extraktů jsou testovány na biologickou aktivitu.

AGCCCAGGCC AGGGCACCCA TCGGGTCCGG TCCCGTGGGT

GTCTGAGAAC AGCTGCACCC CAGACTCTTG TCGACGTGGG

ACTTCCCAGGTGAAGGGTCCtAACCggtac (SEQ ID NO: 7) aTTGGc (SEQ ID NO: 8)

Fragment ÍA/B

GtAACCTGCC TAACATGCTT CGAGATCTCC GAGATGCCTT CAGCAGAGTGGACGG ATTGTACGAA GCTCTAGAGG CTCTACGGAA GTCGTCTCACAAGACTTTCTTT (SEQ ID NO: 9)

TTC (SEQ ID NO: 10)

Fragment 2A/B

CAAATGAAGG ATCAGCTGGA CAACTTGTTc TtAAG (SEQ ID NO: 11)

TGAAAGAAA GTTTACTTCC TAGTCGACCT GTTGAACAA AaTTC (SEQ ID NO: 12)

Fragment 3A/B

GAGTCCTTGC TGGAGGACTT TAAGGGTTAC CTGGGTTGCC AAGCCTTGTC TGAGATGATCCTCAGGAACGACCTCCTGAA ATTCCCAATG GACCCAACGGTTCGGAACAG ACTCTACTAGCAGTTTTAt (SEQ ID NO: 13) GTCAAAATaG (SEQ ID NO: 14)

Fragment 4A/B

CTaGAGGAGG

GAtCTCCTCC

TGATGCCCCA

ACTACGGGGT

AGCTGAGAAC

TCGACTCTTG

CAAGACCCAG

GTTCTGGGTC

ACATCAAGGCTGTAGTTCCGGCATGTtAAC g CGTACAaTTG cagct (SEQ ID NO: 15) (SEQ ID NO: 16)

Fragment 5A/B

AACTCCCTGG - GGGAGAACCT - GAAGACCCTC AGGCTGAGGC TTGAGGGACC CCCTCTTGGA CTTCTGGGAG TCCGACTCCG

TACGGCGCTGATGCCGCGACTCATCGATct gca AGTAGCTAg (SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18)

Fragment 6A/B • ·

CGATTTCTTC

TAAAGAAG gGCgTgcatg gCGcAc

CCTGTCAAAA GGACAGTTTT (SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 20)

CAAGAGCAAG

GTTCTCGTTC

GCCGTGGAGC

CGGCACCTCG

AGGTGAAGAATCCACTTCTTFragment 7A/B

CGCGTTTAAT

AAATTA

AATAAGCTCC

TTATTCGAGG

AAGACAAAGG CATCTACAAA

TTCTGTTTCC GTAGATGTTT

GCCATCGGTAGAGTGAGTTT GAC CTCA (SEQ ID NO: 21) (SEQ ID NO: 22)

Fragment 8A/B

ATCTTCATCA ACTACATAGA AGCCTACATG ACAATGAAGACTCAAACTG TAGAAGTAGT TGATGTATCT TCGGATGTAC TGTTA CTTCTTACGAAACTG A (SEQ ID NO: 23)

ATGCTTTGAC TAcga (SEQ ID NO: 24)

Fragment 9A/B (Malá písmena označují, že se báze v této pozici liší od přirozené sekvence.)

Příklad 2. Exprese vIL-10 v opičích COS 7 buňkách

Gen kódující otevřený čtecí rámec pro vIL-10 byl namnožen polymerázovou řetězovou reakcí s využitím primerů, což dovolilo pozdější inzerci namnoženého fragmentu do vektoru pcD(SRoc) naštěpeného s EcoRI (Obrázek 1). Kódující vlákno insertovaného fragmentu je zobrazeno níže (otevřený čtecí řetězec je uveden velkými písmeny).

aactcATGGA GCGAAGGTTA GTGGTCACTC TGCAGTGCCT GGTGCTGCTT TACCTGGCAC CTGAGTGTGG AGGTACAGAC CAATGTGACA ATTTTCCCCA GAGCTAAGAG ATGCCTTCAG TCGTGTTAAA ACCTTTTTCC AGACAAAGGA CGAGGTAGAT aaccttttgc tcaaggagtc tctgctagag gactttaagg ATGCCAGGCC CTGTCAGAAA TGATCCAATT CTACCTGGAG GAAGTCATGC CACAC-3CTGA AACCAGGACC CTGAAGCCAA AGACCATGTC AATTCTTTGG GTGAAAATCT AAAGACCCTA CGGCTCCGCC TGCGCAGGTG CCACAGGTTC CTGCCGTGTG AGAACAAGAG TAAAGCTGTG GAACAGATAA AAAATGCCTT TAACAAGCTG CAGGAAAAAG GAATTTACAA AGCCATGAGT GAATTTGACA TTTTTATTAA CTACATAGAA GCATACATGA CAATTAAAGC CAGGTGAg

Klony nesoucí insert v odpovídající orientaci byly identifikovány expresí vIL-10 a/nebo elektroforézou po restrikčním štěpení. Jeden tento vektor, nesoucí vIL-10 byl označen pBCRFl (SRa) a byl uložen v ATCC pod přístupovým číslem 68193 20. prosince 1989.

PBCRFl (SRa) byl namnožen vE. coli MCI061, izolován standardními technikami a použit ktrasfekci COS7 opičích buněk podle následujícího: Jeden den před trasfekcí bylo přibližně 1,5 x 10⁶ COS7 opičích buněk nasazeno do každé jamky 100 mm desek obsahujících Dubelcco modifikaci Eagle média (DME) s obsahem 5% séra telecího plodu (FCS) a 2 mM glutaminu. K provedení transfekce byly COS7 buňky odstraněny z misek inkubací s trypsinem, promyty dvakrát s DME bez obsahu séra a suspendovány v DME bez obsahu séra na koncentraci 10⁷ buněk/ml. Alikvoty 0,75 ml byly smíchány s 20 pg DNA a převedeny do sterilní 0,4 cm elektroporačních kyvet. Po 10 minutách byly buňky pulzovány při 200 voltech, 96 pF pomocí BioRad Gene Pulser unit. Po dalších 10 minutách byly buňky vyndány z kyvety a přidány do 20 ml DME s obsahem 5% FCS, 2 mM glutaminu, penicilinu, streptomycinu a gentomycinu. Směs byla rozdělena do 4 tkáňových kultivačních misek. Po 12 až 24 h při 37°C a 5% CO2 bylo médium nahrazeno s podobným médiem obsahujícím pouze 1% FCS a v inkubaci bylo pokračováno dalších 72 h při 37°C a 5% CO2. Médium bylo poté sebráno a určena jeho schopnost inhibovat syntézu IFN-γ.

Alikvoty (10 ml) čerstvě izolovaného PBL (asi 2 x 10⁶ buněk/ml) byly inkubovány při 37°C sPHA (100 ng/ml) v médiu, obsahujícím (i) 90% DME doplněném 5% FCS a 2 mM glutaminu a (ii) 10% kapaliny z COS 7 buněk, které byly předtím transfektovány s pBCRFl (SRa). Po 24 h byly buňky a kapalina sebrány a zkoušeny na přítomnost IFN-γ mRNA popř. IFN-γ proteinu. Kontrolní vzorky byly zpracovány identický s tou výjimkou, že 10% kapalina byla vzata z kultury COS 7 buněk, které byly předtím trasfektovány splasmidem nesoucím nepříbuzný cDNA insert. Vzorky zpracované s vIL-10 vykazovaly asi 50% inhibici IFN-γ syntézy ve srovnání s kontrolním vzorkem.

Příklad 3. Exprese vIL-10 v Escherichia coli

Gen kódující zralý vIL-10 zobrazený v SEQ ID NO: 4 může být exprimován v E. coli.

·· • ·

cDNA insert v pBCRFl (SRa) je reklonován do Ml3 plasmidu, kde se dvakrát pozmění pomocí site-directed mutagenezí: 1) za vzniku Clal místa na 5’ konci kódující oblasti pro zralý vIL-10 polypeptidu, 2) za vzniku BamHI místa na 3’ konci kódující oblasti pro zralý vEL-10 polypeptid. Mutovaná sekvence je poté snadno insertována do TRPC11 expresního vektoru popsaného níže.

TRPCÍ 1 fragment byl konstruován připojením syntetického souhlasného RBS fragmentu k Clal spojce (ATGCAT) a klonováním vzniklých fragmentů na Clal restriktováného pMTl lhc (který byl předtím modifikován aby obsahoval Clal místo). PMTl lhc je malá (2,3 kilobáze) kopie, AMP^R, TET^s derivát pBR322, který nese EcoRI-HindEU polyvázací oblast kVX plasmidu. (nVX je popsán v Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory). Ten byl modifikován tak, aby obsahoval Clal místo pomocí restrikce pMTl lhc s EcoRI a BamHI, doplněním vzniklých „lepivých“ konců a připojením s Clal linkrem (CATCGATG), čímž se obnoví EcoRI a BamHI místa a Smál se nahradí s Clal místem. Jeden trasformant z TRPCÍ 1 konstrukce měl tandemovou RBS sekvenci, lemovanou Clal místy. Jedno zClal míst a část z druhé kopie RBS sekvence byla odstraněna naštípnutím tohoto plasmidu s Pstl, zpracováním s Bal31 nukleázou, restrikcí s EcoRI a zpracováním s T4 DNA polymerázou v přítomnosti trifosfátů všech čtyř deoxynukleotidů. Vzniklé 30 až 40 bp fragmenty byly zpětně získány prostřednictvím PAGE a klonovány do Smál restrikto váného pUC12. EcoRI fragment E. coli (248 bp) nesoucí trpP, odvozený od pKCIOl (popsaný vNichols et al. (1983) Methods in Enzymology 101: 155 Academie Press, NY) byl poté klonován do EcoRI místa aby byla dohotovena TRPCÍ 1 konstrukce, což je ilustrováno na Obrázku 2. TRPCÍ 1 je použit jako vektor pro vIL-10, nejdříve jeho štěpením s Clal a BamHI, čištěním a poté smícháním, ve standardním ligačním roztoku, s Clal-BamHI fragmentem Ml3, obsahujícím nukleotidovou sekvenci kódující zralý BCRF1. TRPCÍ 1 obsahující insert, popisovaný jako TRPCÍl-BCREl, je propagován v kmenu JM101 E. coli K12, dostupného např. od ATCC pod přístupovým číslem 33876.

Příklad 4. Efekt IL-10 na generování alloreaktivity v primárním MLR

Buňky byly kultivovány v Ysselově médiu (Koulova et al. (1991) J. Exp. Med. 173: 759) doplněného 10% zásobním tepelně deaktivovaným lidským AB sérem..

Neutralizační anti-IL-10 mAb 19F1 byl nasazen proti v-IL-10 a účinně neutralizovanému h- a v-IL-10 (Bejarano et al. (1985) Int. J. Cancer 35: 327). BB10 mAb, který rozpoznává EL-2R

p55 řetězec laskavě věnoval Dr. J. Wijdenes (CRTS, Bensancon, Francie). Myší anti-CD3 (antiLeu-4, IgGl), anti-CD4 (Anti-Leu-3a, IgGl), anti-CD8 (anti-Leu-2a, IgG2a), anti-CD14 (antiLeu-M3, IgG2b), anti-CD19 (anti-Leu-12, IgGl), anti-CD25 (anti-IL2R p55, IgGl), anti-CD56 (anti-Leu-19, IgGl), anti-HLA-DR (klon L243, IgG2a) mAb a kontrolní mAb příslušných isotypů byly získány odBecton Dickinson (Mountain View, CA).

Preparáty na bázi sražených leukocytů byly získány z Krevní Banky Stanfordské universitní nemocnice. PBMC byly isolovány centrifugací v hustotním gradientu přes Ficollhypaque (Pharmacia, Uppsala, Švédsko).

Pro čištění T buněk byly PBMC zbavené leukocytů pomocí plastické adherence a fagocytósou železa s využitím metody Lindsey et. al. (1991) J. Exp. Med. 173: 721. Neadherentní buňky byly protlačeny nylonovou vatou podle popisu vMacNeil et. al. (1990) J. Immunol. 145: 4167). Poté byly NK buňky odstraněny pomocí magnetických kuliček. Krátce, po obarvení se saturačními koncentracemi anti-CD56 mAb 30 min při 4°C byly buňky dvakrát promyty Hankovým vyváženým solným roztokem (HBBS) a poté děleny s magnetickými kuličkami, potaženými s ovčí anti-myší IgG (Dynabeads M-450 ovčí anti-myší IgG, Dynal AS, Oslo, Norsko) při poměr kuličky:buňky 40:1. Směs byla inkubována 30 min při 4°C za jemného třepání a poté byly odstraněny roseto váné buňky s koncentrátorem magnetických částic podle doporučení výrobce. Vzniklé buněčné preparáty byly > 99% CD3⁺, <1% CD14⁺, <1% CD19⁺, <1% CD56⁺.

Pro izolaci CD14⁺ monocytů byly PBMC mořeny s PE-konjugováným CD 14 mAb (Becton-Dickinson, Mountain View, CA), dvakrát promyty vHBSS a poté tříděny v CD14⁺ a CD 14' populacích s použitím FACTStar-Plus (Becton-Dickinson, Sunnyvale, CA). Opětná analýza tříděných populací ukázala, že více než 99,5% čištěných buněk bylo CD14⁺. V některých experimentech byly monocyty izolovány zperiferální krve centrifugací na základě hustoty v separátoru krevních komponent, s následnou centrifugační elutriací podle popisu v Moore et al. (1990) Science 248: Ϊ230. Tyto monocytové preparáty byly 95% čistoty jak bylo odhadnuto na základě nespecifického esterázového barvení.

v

Čištěné B lymfocyty byly získány pomocí dělení na magnetických kuličkách.

Neadherentní PBMC byly inkubovány se saturačními koncentracemi anti-CD3, CD4, CD8,

CD14 a CD56 mAb po 30 min při 4°C. Buňky byly dvakrát promyty v HBSS a poté rosetovány s magnetickými kuličkami, pokrytými s ovčí anti-myší IgG (Dynal, AS, Oslo, Norsko) při

poměru kuliček k buňkám 40:1. Následně byly roseto vaně buňky vyčerpány podle výše uvedeného popisu. Vzniklá populace se skládala z více než 98% CD19⁺ buněk.

Pro stanovení proliferace byly PBMC nebo vysoce čištěné T buňky (1 x 10⁵buněk/prohlubeň) stimulovány s různými ozařovanými (4000 rad) allogeneickými stimulátorovými buňkami. PBMC, CD14⁺ monocyty, monocyty separované centrifugální elutriací nebo čištěné B lymfocyty byly použity jako stimulátorové buňky při poměrech R:S 1:1, 5:1, 5:1 popř. 3:1 podle dříve uvedeného pořadí. Kultury byly vytvořeny v trojnásobném provedení v 96 jamkové mikrotitrační desce v přítomnosti nebo bez přítomnosti EL-10 v 200 μΐ média.

Kultury byly pulsovány s [³H]TdR během 10 posledních hodin pětidenní inkubace a sebrány na filtrech ze skelných vláken a radioaktivita byla určena kapalnou scintilací. Výsledky byly vyjádřeny jako cpm inkorporace [³H]TdR a reprezentují průměr několika kultur.

Pro velké kultury byly PBMC nebo vysoce čištěné T buňky kultivovány s ozařovanými allogeneickými buňkami při výše opsaných R:S poměrech v 50 ml baňkách při koncentracích 1 x 10⁶ buněk/ml v přítomnosti nebo bez přítomnosti 100 U/ml IL-10. Pět až šest dní později byla kapalina sebrána a zmrazená při -20°C pro určení obsahu cytokinů, zatímco buňky byly odebrány pro fenotypovou analýzu.

Pro fluorescenční analýzu bylo odebráno 10⁵ buněk z velké kultury a byly kultivovány s 10 μΐ čištěného PE-konjugováného mAb po dobu 30 min při 4°C v mikrotitračních deskách se dnem ve tvaru písmene V (Flow Laboratories, město, země). Ve dvojitých pokusech byly buňky po FITC značení promyty dvakrát s 1% normálním myším sérem a byla přidána PE-konjugo váná mAb. Buňky byly promyty dvakrát sHBSS obsahujícím 1% BSA a 0,2 M NaN₃ a poté analyzovány na FACScan.

Pro určení cytokinů byla z velkývh kultur sebrána kapalina pátý nebo šestý den a byl stanoven obsah GM-CSF EFN-γ, THF-α, IL-2, IL-4, EL-5 a IL-6 pomocí lymfokin-specifické ELISA podle Óhlen et al. (1990) J. Immunol. 145: 52. Pro kvantifikaci produkce IL-2 byly kultury vytvořeny v přítomnosti 10 pg/ml anti-IL-2 receptorové protilátky BB10 za účelem minimalizace spotřeby IL-2. Kapalina byla sbírána po 72 h a úroveň IL-2 byla určena specifickou ELISA. Citlivost různých ELISA byla: 40 pg/ml pro EL-4, 20 pg/ml pro IL-2, IL-5 a IL-6, 50 pg/ml pro GM-CSF a 100 pg/ml pro TNF-α a IFN-γ.

K určení efektu IL-10 na proliferativní odezvy v klasické jednocestné primární MLR byly PBMC stimulovány s ozařovanými allogeneickými PBMC v přítomnosti nebo bez přítomnosti • ·· různých koncentrací IL-10. Na obrázku 3 je ukázáno, že IL-10 inhibuje proliferativní odezvy v závislosti na celkové dávce.

Jak je ukázáno na Obrázku 3, PBMC (1 χ 10⁵ buněk/prohlubeň) a allogeneické PBMC (1 χ 10⁵ buněk/prohlubeň) (PBMC donor A x ozařovaný PBMC donor B (A): PBMC donor Β x ozařovaný PBMC donor A (B)) byly kultivovány 5 dní v přítomnosti vzrůstajících koncentrací IL-10 (otevřené sloupce) a anti-IL-10 (plné sloupce). MLR bylo provedeno v nepřítomnosti (plné sloupce) nebo v přítomnosti (šrafované sloupce) 100 U/ml IL-10 a vzrůstající koncentraci antiIL-10 mAb.

Významný inhibitomí efekt na proliferaci byl již pozorován při koncentracích IL-10 1 U/ml, zatímco maximální inhibiční účinky (v rozmezí od 33 do 95% inhibice v různých experimentech) byly získány při IL-10 koncentracích 100 U/ml. Tyto inhibiční účinky IL-10 na PBMC proliferaci byly zcela neutralizovány s anti-IL-10 mAb, což indikuje specifitu inhibice (Obrázek 3C). Proliferativní odezvy v MLR vyvolané v přítomnosti neutralizující anti-IL-10 mAb byly významně zvýšeny, což naznačuje, že endogenně produkovaný IL-10 je odpovědný za potlačování proliferativní odezvy v primárních MLC\R.

V poslední době bylo ukázáno, že IL-10 silně redukuje schopnost monocytů reagovat na přítomnost (AP) antigenů (Ag) tím, že podregulovává třídu Π MHC antigeny. Narozdíl od toho, exprese třídy Π MHC nebyla ovlivněna s IL-10 (Figdor et al. (1984) J. Immunol Methods 68: 68). Proto tedy bylo zkoumáno, zdaje inhibiční efekt IL-10 v MLR pozorován pouze tehdy, když jsou přítomny monocyty. Pro tyto účely byly negativní selekcí získány vysoce obohacené T buňky, které byly použity jako responderové buňky. Přečištěná populace monocytů obohacená buď centrifugální elutriací nebo přímým tříděným CD14⁺ buněk z PBMC, čištěných B lymfocytů a EBV-LCL, které byly použity jako stimulátorové buňky.

Obrázek 4A-4D ukazuje účinky IL-10 na proliferativní odezvy čištěných T buněk stimulovaných s různými allogeneickými buňkami. Čištěné T buňky (1 x 10⁵/prohlubeň) byly kultivovaný 5 dní š allogeneickými ozařovanými elutrio vánými monocyty (2 χ 10⁴/prohlubeň) (Obrázek 4A), pozitivně tříděnými CD14⁺ monocyty (2 x 10⁴/prohlubeň) (Obrázek 4B), čištěnými B buňkami (3,3 x 10⁴/prohlubeň) (Obrázek 4C), EVC-LCL (1 x 10⁴/prohlubeň) (Obrázek 4D) v přítomnosti zvyšujících se koncentrací IL-10.

Jak lze spatřit na Obrázcích 4A-4D, IL-10 silně inhiboval proliferativní odezvy indukované allogeneickými monocyty nezávisle na tom, zda byly monocyty získány centrifugální elutriací (Obrázek 4A) nebo positivním tříděním s FACS (Obrázek 4B), zatímco proliferativní

odezvy na allogeneické EBV-LCL zůstávají beze změny (Obrázek 4D). Jak bylo pozorováno u určitých proliferativních odpovědí na rozpustné antigeny, tyto výsledky naznačují, že allospecifická proliferace je blokována jsou-li jako stimulátorové buňky použity allogeneické monocyty a nikoliv jsou-li použity allogeneické EBV-LCL. Je zajímavé, že proliferativní odezvy indukované čerstvě izolovanými vysoce čištěnými allogeneickými B buňkami byly inhibovány s IL-10 (Obrázek 4C), což naznačuje, že supresivní efekt IL-10 je také přítomen jsou-li použity B buňky coby stimulátory, bez ohledu na to, že IL-10 nevykazuje žádný měřitelný efekt na třídu I nebo třídu H MHC expresi těchto buněk.

Kinetické experimenty odhalily, že efekt IL-10 na MLR-indukovanou proliferaci se snižuje s časem. Tyto výsledky jsou ukázány na Obrázku 5, kde PBMC (1 x 10⁵/prohlubeň) a allogeneické ozařované PBMC (1 x 10⁵/prohlubeň) byly kultivovány 5 dní, přičemž v indikované době byly přidány zvyšující se koncentrace IL-10. IL-10 byl nejúčinější, když byl přidán na počátku primární kultury: jsou-li přidány 2 nebo 3 den po nasazení kultury, účinky byly pouze marginální a nebyl pozorován žádný jasný efekt v závislosti na dávce. Tyto výsledky naznačují, že IL-10 ovlivňuje ranná stádia aktivace T buněk v MLR.

Příklad 5: Vliv IL-10 na produkci cytokinů v MLC

Bylo prokázáno, že IL-10 redukuje produkci IFN-γ a GM-SCF u PBMC aktivovanými s anti-CD3 nebo PHA (Bacchetta et al. (1989) J. Immunol. 144: 902; Bevan (1984) supra). Kromě toho inhibuje IL-10 produkci cytokinů u monocytů (Bejarano et al. (1985) Int. J. Cancer 35: 327; Fiorentino et al., supra). Aby byl určen vliv IL-10 na produkci cytokinů v jednocestné MLR, byly použity allogeneické_PBMC jako respondery a stimulátorové buňky. Lidské PBMC byly kultivovány 5 dní samotné nebo s allogeneickými ozařovanými PBMC v přítomnosti nebo bez přítomnosti IL-10 nebo anti-IL-10 mAb, 19F1. Kapaliny byly sebrány pátý den a byl určen obsah cytokinů. Produkce cytokinů byla v kapalinách určena pomocí cytokin-specifické ELISA. Tabulka 1 ukazuje vliv exogenního a endogenního IL-10 na produkci cytokinů u alloantigenem stimulovaných lymfocytů. ~ .

Tabulka 1

Podmínky	Cvtokin
	IL-10 (U/ml)	aiL-10 (Uq/ml)	IL-6 (ng/ml)	IL-10 (ng/ml)	GM-CSF (pg/ml)	TNF-a (pg/ml)	IFN-γ (ng/ml)
A	0		22.2	572	109	79	<1
	1		20.5		41	61	<1
	10		13.0		11	38	- <1
	100		12.1		16	47	<1
		.05	22.9		144	144	<1
		.5	25.8		165	111	<1
		5	24.9		172	51	<1
A+B	0		35.4	1473	1744	141	29.5
	1		35.3		928	151	20.8
	10		23.9		784	82	18.1
	100		24.7		612	66	11.4
		.05	3 6.9		2372	137	33.1
		. 5	39.1		2355	137	45.3
		5	39.1		3487	250	43.8

fe • · • · • · · • · · · · · • ·

V Tabulce 1 je ukázáno, že IFN-γ, IL-6, GM-CSF a TNF-α byly produkovány v MLR a že IL-10 inhibovaly produkci těchto cytokinů různou měrou.

Nebyla pozorována žádná významná produkce IL-4 a úroveň IL-5 byla pod 100 pg/ml. Produkce IL-10 se pohybovala od 1000 do 3000 pg/ml v různých experimentech. Nejsilnější inhibiční efekty exogenního IL-10 byly pozorovány u produkce IFN-γ, zatímco nej slabší inhibiční efekt byl pozorován u produkce IL-6.

Zvýšené úrovně IFN-γ, GM-CSF a TNF-α byly pozorovány v kapalinách z MLR, prováděných v přítomnosti anti-IL-10 mAb, jak je ukázáno v Tabulce 1. Tento vliv anti-IL-10 mAb na zvýšení produkce cytokinů byl závislý na velikosti dávky. Vezmeme-li toto vše v úvahu, výsledky naznačují, že jak endogenní tak i exogenní IL-10 snižují produkci testovaných cytokinů. Pro vyhodnocení vlivu IL-10 na produkci IL-2 v MLR a pro minimalizaci spotřeby IL-2 aktivovanými T buňkami, byly kultury provedeny v přítomnosti nebo bez přítomnosti IL-10 a anti-IL-2 receptor mAb BB10. V těchto experimentech IL-10 bránil produkci IL-2 v závislosti na dávce (Obrázek 6). Když byl IL-10 přidán při 100 U/ml nebyl pozorován žádný měřitelný IL-2. Na obrázku 6 byly PBMC (1 x 10⁵ buněk/prohlubeň) a allogeneické ozařované PBMC (1 x 10⁵buněk/prohlubeň) kultivovány se zvyšujícími se koncentracemi IL-10, a to v přítomnosti nebo bez přítomnosti 10 pg/ml protilátky anti-IL-2 R, BB10. Po třech dnech byla kapalina sebrána a bylo provedeno určení obsahu EL-2 pomocí cytokin-specifické ELISA.

Aby se zjistili, zda inhibiční vlivy IL-10 lze pozorovat v přítomnosti exogenního IL-2 byly MLR provedeny s různými koncentracemi IL-2. Na obrázcích 7A-7B je ukázán vliv exogenního IL-2 na redukovanou alloantigenem vyvolanou proliferativní odezvu T buněk indukovanou s IL-10. Čištěné T buňky (10⁵ buněk/prohlubeň) stimulované s allogeneickými ozařovanými PBMC (10⁵ buněk/prohlubeň) (Obrázek 7A) nebo čištěné B buňky (3,3 x 10⁴buněk/prohlubeň) (Obrázek 7B) byly kultivovány se zvyšujícími se množstvími IL-2, a to v přítomnosti (uzavřené značky) nebo bez přítomnosti (otevřené značky) 100 U/ml EL-10. Obrázky ukazují, že přídavek zvýšeného množství IL-2 ďo MLR, kde jsou použity čištěné T buňky jako respondery a PBMC nebo čištěné B buňky jako stimulátory, zvyšuje proliferaci jak v přítomnosti tak i nepřítomnosti IL-10. Inhibiční vlivy IL-10 však byly stále přítomny, i když byl přidán IL-2 při až do koncentrace 100 U/ml [10 U/ml je dostatečná pro saturaci vysoké afinity EL-2 receptoru (IL-2R)]. Podobně, přídavek 400 U/ml EL-4, který vykazuje aktivitu na růstový faktor T buněk (Panina-Bordignon et al. (1991) Science 252: 1548) neobnovil sníženou proliferativní odezvu indukovanou s IL-10. Tyto výsledky prokazují, že nedostatek IL-2 není limitujícím faktorem odpovědným za snížené proliferativni odezvy, pozorované při provádění

MLR v přítomnosti IL-10.

Příklad 6. Vliv IL-10 na propagaci aktivovaných T buněk v MLC

Ke zjištění, zda snížené proliferativni odezvy v MLR v přítomnosti IL-10 odlišně ovlivňují CD4⁺ nebo CD8⁺ podsoubory T buněk, byly kultivovány čištěné T buňky s allogeneickými ozařovanými PBMC, čištěnými B buňkami nebo monocyty, a to v přítomnosti nebo bez přítomnosti IL-10 (100 U/ml). Po šesti dnech byly odebrané T buňky spočteny a byl určen fenotyp s pomocí nepřímé imunofluorescence. Byl určen poměr mezi CD3⁺CD4⁺ a CD3⁺CD8⁺ buňkami. Tabulka 2 ukazuje vliv IL-10 na alloantigenem stimulované T buňky.

Tabulka 2 % poz-íUvnieC buhéU

	x 10^_6/ml	CD3⁺CD4*	CD3*CD8⁺	CD3⁺CD25⁺	CD3	w O v* ►-» o
—	IL- 10	—	IL-lOj	— — —	IL-10\|	— — —	IL-101
experiment 1 T + PBMC	1.3	.76	69	73	21	24	4	2	3	2
T + B	1.2	.72	55	62	28	28	24	18	19	8
experiment 2 T + PBMC	1.4	1.0	ND^b	ND	ND	ND	39	27	36 .	32
T + B T + monocyty ^a	.90	.68	ND	ND	ND	ND	20	8	18	4
1.2	.40	ND	ND	ND	ND	52	24	43	25
experiment 3 T + PBMC	1.02	.37	77	78	18	16	16	13	15	9
T + monocyty ^c	.50	.17	76	79	19	16	7	4	8	5

“Negativně tříděné monocyty ^bND = nebylo provedeno ^cPositivně tříděné monocyty (CD14⁺)

V Tabulce 2 je ukázáno, že celkový počet T buněk byl snížen o 30 až 60%, jsou-li T buňky stimulovány s allogeneickými PBMC, čištěnými monocyty nebo B buňkami v přítomnosti IL-10. Poměr mezi CD3⁺CD4⁺ a CD3⁺CD8⁺ buňkami však zůstával stejný, což naznačuje, že IL10 nemá žádný preferenční vliv na podsoubory T buněk.

Na rozdíl od toho, poměr aktivovaných T buněk exprimujících CD25 a HLA-DR antigeny byl konsistentně snížen v kulturách obsahujících IL-10. Nejsilnější snížení bylo obvykle pozorováno v MLR, kde byly stimulovány čištěné CD3⁺ T buňky a čištěnými B buňkami nebo monocyty.

0 « • 0

0000 • · ·· » 0 0 · » 0 0 ·

000 00·

IL-10 tedy v závislosti na dávce snižuje proliferaci alloresponsivních T buněk v klasické jednocestné primární MLR, kde byly použity allogeneické PBMC dvou různých donorů jako respondery a ozařované stimulátorové buňky. Tyto inhibiční efekty byly zcela neutralizovány santi-IL-10 mAb, což ukazuje specifitu inhibice. Proliferativní odezvy byly značně zvýšeny v přítomnosti anti-IL-10 mAb, což naznačuje, že produkce endogenní IL-10 je odpovědná za potlačení proliferativních odezev MLR.

IL-10 také redukuje proliferativní odezvy v MLR, kde byly použity vysoce čištěné T buňky jako respondery a čištěné monocyty jako stimulátory. Je zajímavé, že IL-10 byl neúčinný, když byly čištěné T buňky stimulovány s ozařovanými allogeneickými EBV-LCL. IL-10 silně blokoval specifické proliferativní odezvy T buněk nebo klonů T buněk na rozpustné antigeny nebo antigenové peptidy, byly-li jako APC použity monocyty ovšem nikoliv při použití EBVLCL. Bylo zjištěno, že tato snížená kapacita na přítomnost antigenů souvisí s efektem IL-10 na podregulování třídy Π MHC exprese u monocytů. Oproti tomu, IL-10 neovlivňoval třídu Π MHC exprese u EBV-LCL (Figdor et al. (1984) J. Immunol. Methods 68: 68). Z těchto dat lze vyvodit, že snížená antigen-specifická proliferativní odezva T buněk odráží spíše zábranu aktivace buněk responderu než přímý potlačovací efekt na proliferaci T buněk. Tyto závěry jsou dále podepřeny snížením Ca²⁺ toků v responderových T buněčných klonech, aktivovaných v přítomnosti IL-10 (Figdor et al. (1984) J. Immunol. Methods 68: 68).

Je zajímavé, že MLR-indukovaná proliferace byla inhibována IL-10 nejen při použití monocytů, ale také při použití čištěných B buněk coby stimulátorů. Několik studií ukázalo, že T buněčné rozpoznání MHC alloantigenů je mechnaisticky podobné rozpoznávání virálních, bakteriálních nebo dalších cizích proteinových antigenů (Fiorentino et al. (1991) J. Immunol. 146: 3444; Fiorentino et al. (1991) J. Immunol. 147: 3815; Freedman et al. (1987) J. Immunol. 139: 3260; Go et al. (1990) J. Exp. Med. 172: 1625). V současné době bylo prokázáno, že významná část HMC třídy Π alloreaktivních T buněčných klonů rozeznává determinanty z proteinů lidského séra společně s allogeneickými molekulami třídy Π (Fiorentino et al. (1991) J. Immunol. 147: 3815). Narozdíl od situace, kde musí vzniknout MHC-peptidové komplexy k aktivaci antigen-specifických T buněčných klonů (Rotzchke et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 1059), zde u monocytů a B buněk není žádný důkaz, který by naznačoval, že pro stimulaci T buněk v MLR musí vzniknout nové allo-MHC-peptidové komplexy. Je nepravděpodobné, že by inhibiční efekt IL-10 na MLR-indukovanou T buněčnou proliferaci mohl být připsán pouze na vrub podregulování exprese MHC třídy Π u monocytů.

• ···· ·· ·· • · · · • · · · ··· ··· • >

• · ··

Bylo prokázáno, kromě zesíťování TCR/CD3 komplexu specifickým alloantigenem, pro produkci cytokinů jsou u allospecifických T buněk vyžadovány LFA-1 - ICAM-1 interakce (Santos-Aguado et al. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8936). Kromě toho bylo prokázáno, že CD28-B7/BB1 interakce jsou nezbytné pro indukci alloantigen-specifické aktivace odpočívajících T buněk, což vede k produkci cytokinů, proliferaci a cytotoxické aktivitě (Spits et al. (1987) J. Immunol. 139: 1143; Thompson-Snipes et al. (1991) J, Exp. Med. 173: 507; Vieira et al. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 1172). B7 je slabě exprimován u odpočívajících B buněk, aleje vyšší po aktivaci těchto buněk. Hokochi et al. (1982) J. Immunol. 128: 823; Yssel et al. (1986) Eur. J. Immunol. 16: 1187). Mohlo by být ovšem vyloučeno, že snížené proliferativní a cytotoxické alloodezvy jsou díky podregulačnímu působení IL-10 na expresi buď TCR/CD3 a nebo těchto doplňkových buněk.

Redukované proliferativní odezvy na alloantigeny také odráží zábranu aktivace responderových T buněk. IL-10 musel být přítomen od počátku kultivace aby vykázal maximální inhibiční efekt. Kromě toho, poměr aktivovaných T buněk, jak bylo odhadnuto z exprese CD25 a HLA-DR antigenů, byl značně nižší v kulturách obsahujících IL-10 než v kontrolní MLR. Ačkoliv celkový počet CD3⁺ T buněk generovaných v MLR prováděných v přítomnosti IL-10 byl snížen, IL-10 neovlivňoval přednostně odezvy CD4⁺ nebo CD8⁺ T buněk, protože poměr těchto T buněčných podskupin byl srovnatelný s kontrolní MLR, prováděnou v nepřítomnosti IL10. To je podpořeno faktem, že IL-10 také snižuje proliferativní odezvy je-li přidán IL-2 při koncentracích, které jsou dostatečné pro saturaci vysoké afinity IL-2 receptorů. Souhrnem, tato data naznačují, že IL-10 snižuje sfimulatomí schopnost PBMC, monocytů a normálních Bburiěk v MLR.

Úrovně cytokinů produkovaných v MLR, kde všechny allogeneické PBMC byly použity jako responder a stimulátor, byly také významně sníženy v přítomnosti exogenního IL-10. Množství IL-2, IFN-γ, TNF-α a GM-CSF byly přibližně dvakrát až třikrát nižší než tomu bylo u kontrolních MLR, prováděných v nepřítomnosti IL-10. Produkce IL-6 byla mnohem méně ovlivněna, což může být díky tomu, že monocyty přítomné v kultuře již velmi záhy po aktivaci vyprodukovaly značné množství tohoto cytokinů, předtím než začala působit aktivita supresoru IL-10 (Bejarano et al. (1985) Int. J. Cancer 35: 327).

Příklad 7. IL-10 a tolerance u SCID pacientů • · · · ··· ···

Byl zkoumán repertoár a mechanismus tolerance T buněk u dvou pacientů s vážnou kombinovanou imunodeficiencí (SCID) jimž byly transplantovány HLA chybné fetální jatemí kmenové buňky. Dvě velmi mladé SCID děti byly transplantovány před 17 popř. 5 lety s fetální mi jatemí mi kmenovými buňkami od plně HLA neslučitelných dárců. Pacient SP obdržel 2 transplantace fetální ch jatemí ch kmenových buněk a v obou případech byl zároveň injektován syngeneický fetální thymus. Ačkoliv standardní HLA typizace ukázala enfragmentaci buněk pouze u druhého dárce, přesnější cytofluorimetrická analýza s využitím monoklonálních protilátek specifických na polymorfní HLA determinanty naznačila, že 10 až 20 % T lymfocytů bylo ve skutečnosti od prvního dárce. Druhý pacient RV obdržel 7 transplantací fetálních jatemí ch kmenových buněk, ovšem vperiferální krvi byla nalezena buněčná populace pouze jednoho dárce (Tabulka 3).

Tabulka 3

HLA TYPY

	A	C	B	DR	DQ
££.
Příjemce	3-33	6	14-47	4-5	3
1 donor	2-11	4	27-62	1-8	1
2 donor	1-2	0	8-18	3-9	3
RV
Příjemce	2-31	4-7	-62	8-10	4-5
donor	2-30	4	8-35	11-13	6-7

U takovýchto pacientů byla po transplantaci pozorována trvalá enfiagmentace dárcovských T buněk, zatímco B buňky a monocyty byly původem hostitele (Tabulka 4).

Tabulka 4 ' chimérismus _apTCR⁺ T buňky y8TCR⁺ T buňky Monocyty

B buňky

NK buňky

Donorového původu

Hostitelského původu

Hostitelského původu-> Pacient SP

Donorového původu-> Pacient RV

·· fr • · · • · · · • · ···· • · · • fr frfr • · fr • · · ·· · ·· · • · • fr frfr

Bez ohledu na tento stav děleného chimérismu uvnitř buněk imunitního systému, bylo dosaženo úplné rekonstituce a byla pozorována normální in vivo a in vitro odezva protilátek na antigeny. Je to díky schopnosti dárcovských T buněk kooperovat s APC hostitele, za allogeneickou bariéru. Obzvláště pak tyto studie demonstrovaly, že tetanus toxoid (TT) specifické T buněčné klony dárcovského původu, izolované zperiferální krve pacienta SP, mohou rozeznat antigen (Ag) zpracovaný a prezentovaný hostitelskou B buňkou, EBV transformovanými B buněčnými liniemi a NK buněčnými klony. Oproti tomu, žádné z testovaných Ag specifických T buněčných klonů nerozeznaly TT prezentované třídou Π HLA antigenem, exprimovaným dárcovskými buňkami, Roncarolo et al. (1989) J. Exp. Med. 167: 1523.

Chimérismus vNK populaci se u dvou pacientů lišil, jak je ukázáno v Tabulce 4. V jednom případě čerstvé NK buňky a NK buněčné klony vykázaly HLA fenotyp hostitele; ve druhém případu byly dárcovského původu. Tyto NK buňky exprimovaly CD 16 a CD56 antigeny a vykazovaly normální cytotoxickou aktivitu vůči paletě NK sensitivních cílů.

Tato zjištění naznačují, že přítomnost hostitelských nebo dárcovských funkčních NK buněk nebrání stabilní enfragmentaci dárcovských T buněk po transplantaci fetálních kmenových buněk. Bez ohledu na koexistenci lymfoidních buněk s většinovými a/nebo menšinovými rozdíly v histokompatibilitě antigenů, bylo dosaženo plné in vivo tolerance u těchto dvou pacientů a nebyly pozorovány žádné známky akutní nebo chronické reakce štěpu proti hostiteli. Kromě toho, in vitro studie dokázaly, že specifická nevnímavost dárcovských T buněk vůči HLA antigenům, exprimovaných hostitelem existovala v primárních smíšených kulturách leukocytů (MLC), zatímco proliferativní odezvy proti allogeneickým buňkám byly normální. Na klonální úrovni však byl nález odlišný. Proliferativní a cytotoxické T buněčné klony dárcovského původu, reaktivní na hostitele, rozeznávající buď antigeny HLA třídy I nebo antigeny HLA třídy Π hostitele, byly odvozeny zperiferální krve obou pacientů. Oproti tomu, co již bylo napsáno o SCID pacientech, jimž byla transplantována kostní dřeň od HLA-haploidentických rodičovských dárců (Keeren et al. Hu. Immunol. 29; 42, (1990), nebyly u těchto dvou pacientů izolovány žádné T buněčné klony reaktivní na dárce. Kromě toho, v RV pacientů nebyly izolovány žádné T buněčné klony specifické pro HLA třídu I lokus A antigeny hostitele, které byly sdíleny dárcem. Frekveční analýza s použitím modifikovaného stanovení mezního zředění potvrdilo nedostatek • · «· · • · · • · · · • · ···· · · ·· * ·· ··

9 9 · • · * * ··* 999

9

99 reaktivity na dárce a ukázalo, že frekvence CD8⁺ T hostitel-reaktivní buněk byla stejného rozsahu jako frekvence T buněk reagujících proti HLA antigenům třetí trany. Hostitel-reaktivní buňky nejsou klonálně vymazány z repertoáru dárcovských T buněk. Tyto hostitel-reaktivní buňky jsou pravděpodobně regulovány, protože u těchto pacientů nebyla evidentní klinická manifestace reakce štěpu proti hostiteli. Jednou z možností je, že hostitel-reaktivní buňky jsou anergické in vivo a že in vitro stimulace v přítomnosti IL-2 může rozbít tuto anergii. Je známo, že hostitel-reaktivní T buňky vykazují zvláštní typ produkce lymfokinu po polyklonální a antigen-specifické stimulaci. Žádný z CD4⁺ stejně jako z CD8⁺ T buněčných klonů není schopen vylučovat IL-4, zatímco syntetizují normální úrovně IL-2, IL-5 a GM-CSF po polyklonální aktivaci. Produkce IFN-γ u těchto klonů je obvykle velmi vysoká. Kromě toho, produkce IL-10 u CD4⁺ hostitel-reaktivní ch T buněčných klonů u RV pacientů je extremně vysoký po antigenspecifické stimulaci a zdá se, že je inverzně korelován k nízké syntéze IL-2. Kromě toho, přídavek exogenního IL-10 může významně potlačit proliferativní odezvy CD4⁺ hostitelreaktivní ch T buněčných klonů in vitro. Proto produkce IL-10 hostitel-reaktivními T buňkami může hrát důležitou roli v podregulování jejich in vivo odezvy.

Pacienti jsou nyní (1992) 17 a 5 let staří, zdraví a vykazují normální imunoodezvu na antigeny. Jejich T buňky jsou dárcovského původu, zatímco monocyty a B buňky zůstávají hostitele. NK buňky mají různé zdroje, protože u jednoho pacienta jsou odvozeny od dárce a u druhého od hostitele. Bez ohledu na HLA nesoulad mezi dárcovskými a hostitelskými buňkami, nebyly pozorovány žádné akutní ani chronické příznaky reakce štěpu proti hostiteli. In vitro experimenty s PBMC ukázaly specifickou necitlivost na HLA antigeny exprimované hostitelskými buňkami. Rozsáhlá klonální analýza ukázala, že CD4⁺ a CD8⁺ hostitel-reaktivní T buněčné klony, rozeznávající třídu Hal HLA molekul hostitele, byly přítomny v periferální krvy obou pacientů. Experimenty s mezním zředěním naznačily, že frekvence CD8⁺ hostitelreaktivní ch buněk byly stejného rozsahu jako bylo pozorováno u alloreaktivních buněk. Oproti tomu, nebyly izolovány žádné donor-reaktivní CD8⁺ T buňky. Hostitel-reaktivní CD4⁺ a CD8⁺ T buněčné klony měly normální schopnost produkce IL-2, EFN-γ, GM-CSF a IL-5, ovšem nesyntetizovaly IL-4. Kromě toho, CD4⁺ T buněčné klony z pacientových RV vylučovaly vysoké úrovně IL-10. Exogenní IL-10 inhiboval proliferativní odezvy CD4⁺ hostitel-reaktivních T buněčných klonů. Hostitel-reaktivní buňky, nejsou vymazány z repertoáru dárcovských T buněk po transplantaci allogeneických jaterních buněk. In vivo tolerance mezi hostitelem a dárcem je • · · tedy udržována periferálním autoregulačním mechanismem, ve kterém mohou hrát cytokiny nějakou roli.

Příklad 8. Indukce dlouhodobé antigen-specifické anergie v lidských CD4⁺ T buňkách

Lidské CD4⁺ T buňky, aktivované allogeneickými monocyty v primární MLR v přítomnosti exogenního IL-10, specificky neproliferovaly po restimulaci se stejnými alloantigeny. Srovnatelný stav T buněčné necitlivosti může být indukován aktivací CD4⁺ T buněk zesíťovanými anti-CD3 mAbs v přítomnosti EL-10. Po restimulaci s alloantigenem nebo anti-CD3 mAb anergické buňky neprodukovaly EL-2, IL-5, EL-10, IFN-γ, TNF-α a GM-CSF. Restimulace anergizovaných T buněk s anti-CD3 mAbs však indukuje normální toky Ca a vede ke zvýšené expresi CD3, CD28 a třídy Π MHC, což naznačuje, že v těchto buňkách se vyskytuje signalizace s pomocí kalcineurinu. Anergický stav vyvolaný EL-10 je dlouhodobý. T buněčná anergie nemohla být zvrácena po restimulaci buněk s anti-CD3 mAb a anti-CD28 mAb, ačkoliv exprese CD3 a CD28 byla normální. Exprese IL-2R a řetězce nebyla přeregulována, což lze přičíst na vrub faktu, že exogenní IL-2 nemůže obrátit anergický stav. Je zajímavé, že anergické T buňky a jejich neanergické protějšky vykázaly srovnatelné úrovně proliferace a produkce cytokinů po aktivaci sPMA a Ca²⁺ inofory, což naznačuje že přímá aktivace reakční cesty závislé na PKC může překonat tolerující efekt IL-10. Souhrnem, tyto údaje ukazují, že EL-10 indukuje T buněčnou anergii a může tedy hrát důležitou roli v indukci a udržení antigenspecifické T-buněčné tolerance.

Bylo ukázáno, že IL-10 inhibuje antigen-specifickou aktivaci a proliferaci T buněk lidské periferní krve a T buněčných klonů, patřících k podskupinám ThO, Thl nebo Th2. Yssel et al. (1992) J. Immunol. 149: 2378-2384; de Waal Malefyt et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 915-924. Tyto inhibiční efekty byly nepřímé a byly zprostředkovány prostřednictvím inhibice funkce buněk reagujících na antigen (APC). Macatonia et al. (1993) J. Immunol. 150: 3755-3765; Caux et al. (1994) Int. Immunol. 6: 1177-1185; Pecanha et al. (1993) J. Immunol. 150: 3215-3223 a Ding a Shevach (1992) J. Immunol. 148: 3133-3139. EL-10 reguluje konstitutivní expresi a třídu Π MHC expresi monocytů, dendritických buněk a Langerhansových buněk, vyvolanou ΠΝ-γ nebo IL-4. de Waal Malefyt et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 915-924 a Peguet-Navarro et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 884-891. Kromě toho inhibuje IL-10 expresi CD54 (ICAM-1, ligand pro LFA-1) a CD80 a CD86 (ligandy pro CD28), které fungují jako důležité kostimulační molekuly pro aktivaci T buněk. Ding et al. (1993) J. Immunol. 15: 1224-234; Willems et al.

• · (1994) Eur. J. Immunol. 24: 1007-1009; Chang et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25: 394-398.

V současné době bylo ukázáno, že IL-10 má přímý vliv na CD4⁺ T tím, že potlačuje vylučování

EL-2. de Waal Malefýt et al. (1993) J. Immunol. 150: 4754-4765 a Taga et al. (1993) Blood 81:

2964-2971.

Podobně jako působí inhibičně na T buněčnou proliferaci coby odpověď na rozpustné antigeny, EL-10 silně snižuje proliferaci lidských alloreaktivních buněk ve smíšené lymfocytní reakci (MLR) a úroveň produkce cytokinů v těchto MLR byla významně snížena v přítomnosti exogenního IL-10. Bejarano et al. (1992) Int. Immunol 4: 1389-1397 a výše. Kromě toho EL-10 potlačuje proliferativní odezvy CD4⁺ allogeneických T buněčných klonů. Jako paralela ke snížené proliferaci byla pozorována snížená úroveň produkce EL-2, IL-5, GM-SCF a IFN-γ v těchto T buněčných klonech. Roncarolo (1995) „Interleukin-10 and transplantation tolerance“ v de Waal Malefýt a de Vries (eds.) Interleukin-10, Landes Company, Austin, Texas, str. 113120.

V současné době bylo popsáno, že u SCID pacientů s úspěšně transplantovanými HLAneodpoví dajícími hematopoietickými buňkami, CD4⁺ T buněčnými klony specificky rozeznávající hostitelské alloantigeny produkují velmi nízké úrovně EL-2 po stimulaci antigenem, ovšem vylučují vysoká množství EL-10, která částečně inhibují jejich proliferaci in vitro. Bacchetta et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 493-502. Kromě toho, PBMC z těchto SCID pacientů exprimuje významně vyšší úrovně IL-10 traskriptu ve srovnání s PBMC normálních kontrolních vzorků, obzvláště u non-T buněčné podskupiny. Bacchetta et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 493502. Tyto výsledky naznačují, že vysoká exprese IL-10 detekovaná v SCID lidských chimérách může hrát důležitou roli při udržování in vivo tolerance tím, že indukuje anrgický stav vT buňkách odvozených od dárce, které jsou specifické na hostitelské alloantigeny.

Optimální aktivace a expanse alloreaktivních T buněk vyžaduje, kromě ligace TCR komplexu, kostimulační signály zajištěné jednou nebo více přídatných molekul exprimováných na buňkách zjišťujících přítomnost alloantigenu. Zapojení TCR pomocí antigenů bez kostimulace vede kT bunecne anergii. De Silva et al. (1991) J. Immunol 147: 3261-3267; Jenkins et al. (1990) J. Immunol. 144: 16-22; Schwartz (1990) Science 248: 1349-1356 a SloanLancaster et al. (1994) J. Exp. Med. 180: 1195-1205. Tento stav nevnímavosti může být také indukován in vitro, v dlouhodobých T buněčných klonech pomocí stimulace s činidly, která mimikují obsazení T buněčných receptorů, za nepřítomnosti CD28 signalizace a/nebo inhibicí vylučování IL-2 u T buněk. De Silva et al. (1991) J. Immunol. 147: 3261-3267; Jenkins et al.

(1990) J. Immunol. 144: 16-22; Schwartz (1990) Science 248: 1349-1356 a Sloan-Lancaster et al. (1994) J. Exp. Med. 180: 1195-1205. Fakt, že vysoké stupně IL-10 jsou spojeny s transplantaění tolerancí a také důkaz, že tento cytokin inhibuje jak antigen zjišťující tak i pomocnou funkci monocytů a produkci IL-2 u T buněk, naznačuje, že IL-10 může být zahrnut v indukci anergie u CD4⁺ T buněk.

V této studii je demonstrováno, že IL-10 je schopen indukovat dlouhodobou antigenspecifickou necitlivost na allogeneické antigeny, která nemůže být obrácena stimulací s IL-2 nebo CD28.

Buňky

Mononukleámí buňky periferální krve byly připraveny centrifugací přes Ficoll-hypaque. CD4⁺ T buňky byly čištěny negativní selekcí. Negativní čištění bylo prováděno s využitím kokteilu protilátek směřovaných proti non-CD4⁺ T.buňkám: CD8, CD 14, CD 16, CD 19, CD20, CD56, HLA-DR. Buňky byly inkubovány se saturačními množstvími protilátek po dobu 20 min při 4°C. Po promytí byl přidán Dynabeads (Dynal, Oslo, Norsko) při poměru 10 kuliček/cílovou buňku a inkubovány 1 h při 4°C4Kuličky a kontaminující buňky byly odstraněny magnetickým polem. Zbývající buňky byly znovu suspendovány se stejným počtem kuliček a byla provedena druhá inkubace po dobu 1 h při 4°C. Po odstranění kontaminujících buněk byly CD4⁺ T buňky analyzovány pomocí FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) a bylo zjištěno, že jsou více než 90-95% pozitivní. Monocyty byly čištěny s použitím stejné procedury s kokteilem obsahujícím protilátky na: CD2, CD3, CD8, CD16, CD19, CD20, CD56. Tyto monocyty byly podle FACScan analýzy více než 95% CD14⁺. V některých experimentech byly CD4⁺ T čištěny positivní selekcí s využitím magnetických kuliček přímo pokrytých s CD4 mAb podle pokynů výrobce (Dynal, Oslo, Norsko). S touto procedurou měly více než 95% čistotu.

Reagencie

Čištěný rekombinantní IL-10 byl zajištěn od Schering-Plough Research Institute (Kenilworth, NI). Anti-IL-2 receptor monoklonální protilátka B-B10 (Herve et al. (1990) Blood 75: 1017-1023), anti-CD3 mAb SPV-T3 (Spits et al. (1983) Hybridoma 4: 423-437) a anti-CD28 (Becton Dickinson, Mountain View, USA) byly již dříve popsány. Nekonjugované PE- nebo FITC-konjugo váné protilátky pro CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56, HLA-DR a kontrolní mAb příslušných isotypů byly koupeny od Becton Dickinson (Mountain View, CA).

·· · ·

Β

1«

Stanovení proliferace

Při těchto stanoveních proliferace byly buňky kultivovány v Ysselově mediu (Yssel et al. (1984) J. Immunol. Methods 72: 219-227) doplněným s 10% FCS a 10% lidským sérem. Pro MLR byly čištěné CD4⁺ T buňky (5 x 10⁴ buněk/prohlubeň) stimulovány s čištěnými allogeneickými monocyty (5 x 10⁴ buněk/prohlubeň) nebo s ozařovanými PBMC (10⁵buněk/prohlubeň) v 200 μΐ jamkových deskách s 96 prohlubněmi s plochým dnem (Falcon, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ). PBMC použité jako stimulátory byly ozařovány při 4000 rad.

Pro aktivaci zesíťovaným anti-CD3 mAb bylo 500 ng/ml anti-CD3 mAb naředěno v 0,1 M Tris pufru pH 9,5 po dobu 1 týdne při 4°C v jamkových deskách s 96 nebo 24 prohlubněmi s plochým dnem. Tyto experimentální podmínky byly nalezeny coby optimální pro pokusy, kde byly testovány různé koncentrace protilátek a různé inkubační doby. Po trojnásobném promytí desek byly přidány CD4⁺ T buňky při koncentraci 5 x 10⁴ buněk/prohlubeň.

Pro aktivaci s forbolesterem (PMA) + Ca ionoforem (A23187 Sigma, USA) byly buňky kultivovány při koncentraci 5 x 10⁴ buněk/prohlubeň a aktivovány 3 dny sPMA (1 ng/ml) a A23187 (500 ng/ml).

Pro měření proliferace T buněk byly buňky kultivovány 72 h nebo 5 dní pro MLR o

experimenty při 37°C v 5% CO2 a následně 12 h pulsovány s [ H]-TdR a poté sebrány podle popisu v Bacchetta et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 493-502.

Indukování anergie

Pro vyvolání anergie byly CD4⁺ T buňky kultivovány při koncentraci 2,5 x 10⁵ buněk/ml v jamkové desce s 24 prohlubněmi (Linbro, ICN Biomedical, Ohio) a aktivovány buď s čištěnými allogeneickými monocyty nebo se zesíťovanými anti-CD3 mAb v přítomnosti IL-10 (100 U/ml). Po různě dlouhých inkubačních dobách (3 až lOdní, viz níže) byly buňky sebrány, navrstveny na Ficoll-hypaque gradient za účelem odstranění mrtvých buněk, promyty dvakrát a restimulovány s ozařovaným allogeneickým PBMC nebo se zesíťovanými anti-CD3 mAb.

Imunofluorescenční analýza

Pro detekci antigenů na buněčném povrchu bylo 10⁵ buněk označeno s PE- nebo FITCkonjugovanými mAb. Buňky byly inkubovány 30 min s příslušnou protilátkou při 4°C v PBS s to·

0,1% BSA a 0,02 mM NaN₃. Po třech promytích byly vzorky označených buněk analyzovány na přístroji FACScan (Becton Dickinson).

Určení produkce lymfokinů

Buňky byly stimulovány zesíťovanými anti-CD3 mAb, PMA a Ca²⁺ ionoforem (A23187) nebo allogeneickými monocyty po dobu 24 h. Vylučování IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-a, IFN-γ a GM-CSF bylo měřeno imunoenzymometrickou analýzou podle popisu v Vacchette et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 493-502 a Bacchetta et al. (1995) Blood 85: 1944-953. Citlivost různých ELISA byla: 20 pg/ml pro IL-2, 40 pg/ml u IL-4 a IL-5, 50 pg/ml u GM-CSF a IL-10 a 100 pg/ml pro IFN-γ a TNF-a.

Studium mobilizace vápníku

Mobilizace intracelulámího vápníku v anergických buňkách zatížených s indo-l/AM byla určována s využitím standardní fluorimetrie. Buňky byly nechány s 2 μΜ indo-l/AM v úplném růstovém médiu při 20°C po dobu 45 min. Buňky byly poté promyty, opět suspendovány v NaHBSS (v mM: 2 CaCI₂, 145 NaCl, 5 KCI, 1 MgCI₂,5 d-glukosa, 20 HEPES, pH 7,3) obsahujícím 1% BSA a udržovány při 20°C 2 h. Přibližně 5 χ 10⁵ buněk bylo poté suspendováno ve 2 ml NaHBSS a drženo při 37°C v konstantně míchané akrylové kyvetě. Byl přidán anti-CD3 mAb (1 pg/ml) a poté kozí antimyší imunoglobulin aby došlo k zesíťování anti-CD3 mAb na buněčném povrchu. Nebyly detekovány žádné toky Ca²⁺ bez přítomnosti zesíťování ani v anergických ani v kontrolních buňkách. Fluorescenční měření k určení [Ca²⁺]j byla provedena s využitím spektrofluorimetru Photon Technologies lne.

IL-10 indukuje alloantigen-specifickou T-buněčnou anergii

Jak již bylo ukázáno (Bejarano et al. (1992) bit. Immunol. 4: 1389-1397), IL-10 částečně inhibuje proliferací CD4⁺ buněk periferální krve v odpovědi na allogeneické monocyty v primární MLR (Obrázek 8). Tato inhibice je srovnatelná s inhibici, indukovanou s anti-IL-2 a řezězcem receptoru mAb (anti-CD25 mAb). Aby se zjistilo, zda prodloužená inkubace alloantigenem stimulovaných CD4⁺ T buněk v IL-10 může také podregulovávat jejich proliferativní odezvy na restimulaci, buňky byly drženy v kultuře v přítomnosti nebo nepřítomnosti IL-10 po dobu 10 dnů (Obrázek 8B). Nebyla pozorována žádná významná úmrtnost buněk v kterékoliv podmínkách kultury a po ukončení zkoušky byla sebrána ···· φ

srovnatelná množství buněk. Po této kultivační periodě, CD4⁺ buňky stimulované s alloantigeny v nepřítomnosti IL-10, dosáhly klidový stav a mohly být plně reaktivovány stejným allogeneickým ozařovaným PBMC v sekundární MLR nebo cizími allogeneickými monocyty v primární MLR (Obrázek 8B). Oproti tomu, CD4⁺ T buňky inkubované v přítomnosti IL-10 nemohly proliferovat v sekundární MLR v odezvě na stejný allogeneický PBMC, zachovaly si ovšem jejich schopnost normálně proliferovat na cizí alloantigeny v primární MLR. Tento necitlivý stav nemohl zvrácen saturačními koncentracemi exogenního EL-2 (20 U/ml) nebo s antiCD28 mAb (10 pg/ml). Kromě toho, tento stav T-buněčné necitlivosti je specifický na IL-10 a není způsoben inhibicí primární MLR, protože CD4⁺ T buňky, inkubované v přítomnosti antiCD25 mAb (10 pg/ml) po dobu 10 dnů, vykazovaly proliferativní odezvy srovnatelné s jejich normálními protějšky.

IL-10 indukuje anergický stav v CD4⁺ T buňkách aktivovaných s anti-CD3 mAb

Dále bylo zkoumáno, zda anergie indukovaná s IL-10 odráží působení IL-10 na CD4⁺ T buňky. Pro tento účel byly vysoce čištěné CD4⁺ T buňky periferální krve aktivovány zesilovanými anti-CD3 mAb v přítomnosti nebo bez přítomnosti exogenního IL-10 po dobu 10 dnů. Přímý vliv IL-10 na proliferaci CD4⁺ T buněk byl pozorován (de Waal Malefyt et al. (1993) J. Immunol. 150: 4754-4765 a Taga et al. (1993) Blood 81: 2964-2971) a tento inhibiční efekt byl srovnatelný s efektem, způsobeným anti-CD25 mAb (Obrázek 9A). Aktivace CD4⁺ T buněk v přítomnosti IL-10 vedla ke stavu hluboké T-buněčné necitlivosti, která nemůže být zvrácena exogenním IL-2 nebo anti-CD28 mAb (Obrázek 9B). Anergické buňky však proliferovaly normálně v odezvě na stimulaci s Ca²⁺ ionoforem a PMA. Tyto výsledky naznačují, že IL-10 indukuje anergický stav u CD4⁺ T buněk, ovšem tyto buňky odpovídaly normálně na signály provázející TCR aktivaci. Tato indukce anergie je IL-10 specifická, podobná T-buněčné necitlivosti na alloantigeny vyvolané s IL-10, a nesouvisí s inhibicí buněčné proliferace, protože CD4⁺ T buňky inkubované v přítomnosti anti-CD25 mAb po dobu 10 dnů proliferovaly normálně v odpovědi na restimulaci se zesíťovánými anti-CD3 mAb. Indukce anergie s IL-10 byla závislá na dávce s maximálním účinkem pozorovaným při 100 U/ml (Obrázek 10). Buňky, které byly aktivovány s anti-CD3 mAb a kultivovány v přítomnosti nebo nepřítomnosti IL-10 po dobu 10 dnů, byly v klidovém stavu .a úmrtí apoptoických buněk nebylo pozorováno ani u kontrolních buněk ani u buněk kultivovaných s EL-10. EL-10 tedy indukuje srovnatelný stav Tbuněčné anergie u alloantigen-specifických i anti-CD3 stimulovaných CD4⁺ T buněk.

ι :

to to

<*

Kinetika indukování anergie s IL-10

Aby byla stanovena kinetika indukování anergie s IL-10, CD4⁺ T buňky byly aktivovány se zesilovanými anti-CD3 mAb v přítomnosti nebo bez přítomnosti IL-10 a restimulovány v různých časových okamžicích po iniciaci kultur (Obrázek 11). CD4⁺ T buňky kultivované v přítomnosti IL-10 pouze po dobu 3 dnů již nebyly schopné proliferovat v odezvě na reaktivaci, se zesilovanými anti-CD3 mAb. Je zajímavé, že anergický stav těchto buněk může být stále ještě obrácen exogenním IL-2 (20 U/ml) nebo s anti-CD28 (10 pg/ml). Oproti tomu, inkubace T buněk s IL-10 po dobu 9 až 10 dnů vedla ke stavu celkové anergie, který nemohl být zvrácen buď přidáním IL-2 nebo anti-CD28 mAb. Tyto výsledky naznačují, že T buňky aktivované prostřednictvím TCR/CD3 komplexů v přítomnosti IL-10 nabývají různé stupně necitlivosti, která závisí na časových periodách, po které byly vystaveny IL-10. To indikuje, že doba expozice IL-10 bude velmi důležitá pro efektivitu suprese.

IL-10 indukuje dlouhodobou T-buněčnou anergii

Pro určení délky trvání anergického stavu CD4⁺ T buněk (vyvolaného s IL-10) po odstranění IL-10, byly buňky aktivovány se zesilovanými antl-CD3 mAb v přítomnosti nebo nepřítomnosti IL-10 po dobu 10 dnů. Po této inkubační periodě byly buňky promyty a rekultivovány 24 h v přítomnosti nízkých koncentrací (2 U/ml) exogenního IL-2 pro optimální udržení T buněk během prodloužené kultivační periody, ovšem v nepřítomnosti IL-10. Tyto T buňky byly sebrány každý druhý den během kultivační periody, promyty a restimulovány s antiCD3 mAb. T buňky, které byly předtím inkubovány s IL-10 nemohly proliferovat dokonce 24 dní po odstranění IL-10. Oproti tomu, kontrolní CD4⁺ T buňky, aktivované s anti-CD3 mAb bez přítomnosti IL-10 po dobu 24 dnů, proliferovaly normálně v odpovědi na stimulaci s anti-CD3 mAb. Kromě toho, necitlivost pozorovaná po kultivaci buněk s IL-10 po dobu 24 dnů nemohla být zvrácena s IL-2 (20 U/ml) nebo s anti-CD28 (10 pg/ml) mAb. Tyto výsledky naznačují, že IL-10 indukuje T-buněčná anergie je hluboká a dlouhodobá.

Anergizované T buňky nemohou vylučovat cytokiny

T-buněčná anergie je obecně definována jako nemožnost T buněk proliferovat a produkovat IL-2 v odpovědi na spouštění TCR (viz. Schwartz (1990) Science 248: 1349-1356). Aby bylo určeno, zda si T-buňky necitlivé po aktivaci buď s allogeneickými monocyty nebo ·· *·

santi-CD3 mAb v přítomnosti IL-10, zachovávají jejich schopnost vylučovat cytokiny, byla analyzována produkce cytokinů po restimulaci se stejnými allogeneickými monocyty popř. s antiCD3 mAb.

CD4⁺ T buňky byly aktivovány buď se zesíťovánými anti-CD3 mAb (10 pg/ml), allogeneickými monocyty v nepřítomnosti (kontrolní buňky) nebo v přítomnosti (anergické buňky) IL-10 (100 U/ml). Buňky byly udržovány v kultuře po dobu 10 dnů, promyty a restimulovány se zesíťovanými anti-CD3 mAb nebo s TPA (1 pg/ml) a Ca²⁺ ionoforem (A23187: 500 ng/ml) nebo s allogeneickým PBMC. Kapaliny z kultury byly sebrány po 24 h a byly analyzovány úrovně cytokinů s pomocí ELISA. K měření buněčné proliferace byly buňky pulsovány s [³H] TdR po dobu 12 h na konci třetího dne u buněk aktivovaných se zesíťovaným anti-CD3-mAb nebo na konci pátého dne u buněk aktivovaných s allogeneickými monocyty.

Tabulka 5 ukazuje cytokinový profil po restimulaci T buněk s anergií vyvolanou s IL-10. T buňky, které byly znecitlivěny po aktivaci buď s alloaritigeny plus IL-10 nebo s anti-CD3 mAb plus IL-10 neprodukovaly detekovatelná množství IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-a, IFN-γ ani GM-CSF 24 h nebo 48 h po restimulaci s odpovídajícími allogeneickými monocyty nebo s. anti-. CD3 mAb. Oproti tomu, kontrolní vzorek produkoval úrovně IL-2, IL-5, IL-10, TNF-a, IFN-γ a GM-CSF, které byly srovnatelné s CD4⁺ T buňkami, odvozenými od různých dárců a stimulovaných podobným způsobem. Tyto buňky však nevylučovaly detekovatelná množství IL4.

Tabulka 5

	cpm	IL-2 pg/ml	IL-4 pg/ml	IL-5 pg/ml	IL-10 pg/ml	TNF-a ng/ml	IFN-γ ng/ml	GM-CSF pg/ml
CD3	kontrolní	42.369	875	<40	80	1.067	10.5	5.5	1,245
	buňky		±59		±23	+226	±0.9	+0.6	± 687
	anergické	2.635	<40	<40	<20	<50	<0.1	<0.1	<50
%	buňky	.... .. ..	— . ,__T..... .	________
TPA + Ca²⁺	kontrolní	147,217	2.121	<40	841	51	21.6	7.6	2.721
ionophor-	buňky		±317		+127	+27	±5.1	±3.1	±635
	anergické	169,321	1.921	<40	1,517	117	18.4	8.4	1,615
	buňky		±427		+415	±4.3	+ 3.6	±2.6	+317
Monocyty	kontrolní	32,236	617	<40	64	897	9.2	2.3	987
	buňky		±42		±15	±125	±0.5	±0.1	±98

anergické . .. . . ...... , ......

buňky 869 <40 <40 <20 <50 <0.1 <0.1 <50 ··· •'0

Obrázek 9 ukazuje, že aktivace s PMA a Ca²⁺ ionoforem zcela zvrátila necitlivost indukovanou s EL-10 u anti-CD3 aktivovavných T buněk. Tabulka 5 ukazuje, že aktivace anergických buněk s PMA a Ca²⁺ ionoforem po dobu 24 h také vede k takovým úrovním produkce EL-2, IL-5, IL-10, IFN-γ a TNF-α, které jsou srovnatelné s jejich neanergizovanými protějšky.

Anergické T buňky nemohou exprimovat CD25 po aktivaci

Fenotypická analýza T buněk, které byly anergizovány po aktivaci s anti-CD3 mAb v * přítomnosti EL-10, nezjistila žádné velké rozdíly v porovnání s jejich protějšky bez podobného zpracování s tou výjimkou, že došlo ke snížení exprese IL-2R a řetězce v anergických T buňkách (viz. Obrázek 13, 14A a 14B). Nebyla pozorována žádná modulace exprese CD3 nebo CD8 u anergických buněk a aktivace zesilovanými anti-CD3 mAb zvýšila expresi CD3, CD28 a třídy Π MHC na stejnou úroveň jako je tomu u kontrolních buněk (Obrázek 13). Tato data vylučují možnost, že T-buněčná necitlivost má vztah k defektní TCR/CD3 nebo CD28 expresi a ukazují, že signalizace prostřednictvím TCR/CD3 komplexu, která je nedostatečná pro T-buněčnou proliferaci, stále probíhá v těchto anergizovaných T buňkách.

Avšak narozdíl od kontrolních buněk, anergické T buňky nemohly přeregulovávat expresi EL-2R a řetězce, což naznačuje, že inhibice exprese EL-2R a řetězce je specifickou vlastností anergizovaných T buněk (Obrázek 14A a 14B). Chyba v přeregulování exprese CD25 byla pozorována také v přítomnosti exogenního IL-2 a koreluje s faktem, že IL-2 nemůže zvrátit Tbuněčnou anergii vyvolanou 8 až 10-ti denní inkubací s EL-10 (Obrázek 11). Oproti tomu, T buňky, které byly znecitlivěny inkubací s EL-10 po dobu 3 dnů stále ještě exprimují značné e úrovně CD25 (Obrázek 14A). Slabé přeregulování CD25 bylo také pozorováno po restimulaci s ·> anti-CD3 mAb, ovšem stupeň exprese byl stále snížený ve srovnání s buňkami bez tohoto zpracování. Přídavek EL-2, který byl schopen zvrátit anergický stav, vyústil ve srovnatelné úrovně exprese CD25 u kontrolních T buněk a T buněk inkubováných v přítomnosti EL-10 po dobu 3 dnů (Obrázek 14A).

Anti-CD3 mAb indukují normální Ca²⁺ toky v anergických T buněk • ·

Představa, že v anergických T buňkách dochází k signalizaci prostřednictvím TCR/CD3 komplexu, byla potvrzena měřením indukce Ca²⁺ toků v těchto buňkách. Po zpracování s Indo-1 byly buňky aktivovány s anti-CD3 mAb zesíťovanými s kozím amti-myším immunoglobulinem, jak je naznačeno na Obrázku 15. Toky Ca²⁺ vyvolané v anergizováných T buňkách po aktivaci se zesíťovanými anti-CD3 mAb byly srovnatelné s toky v nezpracovaných kontrolních T buňkách (Obrázek 15). Zpracování anergických a kontrolních buněk s Indo-1 byla ekvivalentní, jak je vidět ze srovnatelných růstů Ca²⁺ toků, vyvolaných buňkách po přidání Ca²⁺ ionoforu (Obrázek 15). Tyto výsledky indikují, že IL-10 vyvolává anergický efekt v T-buněčné aktivaci.

Tato studie ukazuje, že CD4⁺ T buňky lidské periferální krve, aktivované allogeneickými monocyty v přítomnosti IL-10 po dobu 10 dnů, byly učiněny necitlivými v antigen-specifickém chování. Tyto necitlivé CD4⁺ T buňky nemohly proliferovat a produkovat cytokiny byly-li restimulovány stejnými allogeneickými monocyty. Tyto T-buněčné populace však proliferovaly normálně v odezvě na cizí alloantigeny. Srovnatelný stav T-buněčné anergie byl indukován po aktivaci CD4⁺ T buněk s anti-CD3 mAb v přítomnosti IL-10. Anergie vyvolaná s IL-10 byla závislá na dávce a trvala po dobu delší než 24 dnů po odstranění IL-10, což byla maximální analyzovaná perioda. Kromě toho nemohl být anergický stav zvrácen exogenním IL-2 nebo přidáním anti-CD28 mAb. T-buněčná anergie dále nemohla být vyvolána stimulací s allogeneickými monocyty nebo s anti-CD3 mAb v přítomnosti anti-IL-2 receptoru mAb. Tyto výsledky naznačují, že T-buněčná anergie je specificky indukována s IL-10 a nesouvisí jednoduše s podregulováním produkce IL-2 těmito buňkami.

T-buněčná anergie vyvolaná s EL-10 se jasně odlišuje od T-buněčné necitlivosti indukované inkubací myších nebo lidských buněk s antigenickými peptidy bez přítomnosti profesionální APC. Viz. Sloan-Lancaster et al. (1994) J. Exp. Med. 180: 1195-1205; Lamb et al. (1983) J. Exp. Med. 157: 1434-1447 a Fasler et al. (1995) J. Immunol. 155: 4199-4206. V tomto později zmíněném případu byla exprese TCR/CD3 komplexu podregulována a nebyla pozorována žádná mobilizace [Ca²⁺]j (Lamb et al. (1983) J. Exp. Med. 157: 1434-1447 a Fasler et al. (1995) J. Immunol. 155: 4199-4206 bez ohledu na nalezenou EL-10 indukovanou anergii.

Na druhé straně, CD4⁺ T buňky anergizované s IL-10 sdílejí mnohé charakteristiky s anergickými T buňkami, popsanými u myšího modelu anergie, vyvolané nedostatkem kostimulačních signálů. Viz. De Silva et al. (1991) J. Immunol. 147: 3261-3267; Schwartz (1990) Science 248: 1349-1356; Suzuki et al. (1995) Int. Immunol. 71: 37-43 a Ramsdell a Fowlkes (1992) Science 257: 1130-1134. Obě tyto formy anergických buněk nemohly

proliferovat a produkovat IL-2, měly ovšem normální expresi CD3 nebo CD28 povrchových molekul a normální toky vápníku po mobilizaci TCR/CD3 komplexu. Viz. Schwartz (1990) Science 248: 1349-1356. T-buněčná anergie indukovaná s IL-10 je mnohem hlubší než je anergie popsaná u myšího modelu, protože proliferativní odezva anergických T-buněk nemůže být obnovena přídavkem DL-2 nebo anti-CD28 mAb. Kromě toho byla u těchto anergických buněk následkem stimulace narušena nejen produkce IL-2, ale také IFN-γ, IL-5, IL-10, ΤΝΈ-ct a GMCSF. Indukce T-buněčné anergie s IL-10 tedy není jednoduše díky inhibici produkce IL-2 a díky zabránění produktivních CD28-CD80/CD86 interakcí. T buňky anergizované s IL-10 jsou také odlišné od T buněk, které podléhají apoptose nebo anergizováným T buňkám schopným vylučovat cytokiny bez přítomnosti proliferace. Viz. Jenkins (1992) Immunol. Today 132: 69-73 a Groux et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 1623-1629. Ve skutečnosti nebyla pozorována žádná významná úmrtnost způsobená apoptosou u anergických T buněk kultivovaných v IL-10 a anergické T buňky byly životaschopné, což bylo prokázáno normální proliferací po stimulaci s •Λ I

Ca ionoforem a PMA.

Celkově tato data indikují, že signalizace prostřednictvím TCR/CD3 komplexu je selektivně narušována v T buňkách anergizo váných s IL-10. Tento jev ovšem není díky podregulování TCR nebo CD28 molekul, protože anergické T buňky exprimují úrovně TCR/CD3 a CD28, které jsou srovnatelné s úrovněmi u normálních T buněk. Kromě toho, ačkoliv stimulace anergických T buněk prostřednictvím TCR/CD3 komplexu nevedla k buněčné proliferací a produkci cytokinů, byl po restimulaci buněk s anti-CD3 mAb pozorován jasný nárůst exprese CD3, CD28 a třídy Π MHC, což naznačuje, že u těchto buněk dochází k určitému stupni TCR aktivace.

Tato představa byla dále podpořena pozorováním, že Ca²⁺ toky v anergizo váných T buňkách byly normální po CD3 aktivaci, což demonstruje, že není ovlivněna signalizace zprostředkovaná kalcineurinem. Je důležité, že bylo pozorováno úplné zvrácení anergie po aktivaci s PMA a Ca ionoforem. Tyto stimuly, které doprovází TCR aktivaci, zcela obnovily proliferací a produkci cytokinů u anergizovaných buněk. Tyto skutečnosti naznačují, že EL-10 interferuje s blízkýmy pochody v TCR signalizačním reakěním mechanismu, pravděpodobně na úrovni aktivizace Ras-MAP kinázy, jak bylo navrženo na základě myšího modelu indukce anergie. Viz. např. Kang et al. (1992) Science 257: 1134-1138; Fields et al. (1996) Science 271: 1276-1278 a Li et al. (1996) Science 271: 1272-1275. Alternativně, ačkoliv sestupný směr φ φ φφφ φ φφφφ signalizační kaskády p21ras se zdá být netknut, nelze vyloučit, že EL-10 působí jako negativní regulátor této signalizační reakční cesty.

T buňky, které byly anergizovány aktivací a inkubací s EL-10 po dobu 9 až 10 dnů, narozdíl od jejich normálních protějšků, nemohly přeregulovávat expresi IL-2R a řetězce po restimulaci s anti-CD3 mAb. To tedy vede ke spekulacím, že tato chyba v přeregulování exprese EL-2R a řetězce padá na vrub neschopnosti exogenního EL-2 zvrátit anergii. Tato hypotéza je podepřena pozorováním, že T buňky, anergizované aktivací a inkubací s EL-10 po dobu 3 dnů a které stále ještě exprimují CD25, mohou být zachráněny exogenním EL-2. Srovnatelný, ovšem méně výrazný defekt při použití IL-2 byl popsán u T-buněčné necitlivosti vyvolané superantigenem u TCR-transgenových myší. Viz. Bhadoola et al. (1993) J. Emmunol. 151: 23552367. Celkově tato data naznačují, že indukce anergie může být permanentní, je-li vyvolána odpovídajícím způsobem.

Mezi mechanismy, odpovědnými za vyvolání tolerance na alloantigeny, byl navržen nesmazávací (nondeletional) mechanismus, který vede k funkční deaktivaci příslušných alloreaktivních T buněk. Této funkční deaktivace může být dosaženo blokováním kostimulačních signálů, které jsou zajišťovány doplňkovými molekulami exprimovánými na APC a T buňkách. Viz. Lenschow a Bluestone (1993) Curr. Opin. Immunol. 5: 747-752; Lindsley et al. (1992) Science 257: 792-795; Charlton et al. (1991) Immunol. Cell. Biol. 692: 89-93 a Nako et al. (1994) J. Immunol. 153: 5819-5825. Zabránění interakce mezi CD28 a CD80 nebo CD 86 se zdá být kritickým pro toto vyvolání anergie, ovšem může být zahrnuta také blokáda dalších kostimulačních molekul jako třeba CD2, CD4 nebo CTLA-4. Viz. Boussiotis et al. (1994) J. Exp. Med. 180: 1665-1673. Fakt, že tolerance vzbuzená v těchto experimentálních modelech je dlouhodobá a potenciálně zvrátitelná, ovšem zdůrazňuje mechanismus, který může být složitější, než jen pouhý nedostatek druhého signálu pro T pomocné buňky po rozpoznání alloantigenů. Je možné, že nějaká forma aktivní suprese je mediována cytokiny. Tyto cytokiny mohou přispívat k indukci nebo udržení T-buněčné anergie nejen podregulováním kostimulačních molekul, ovšem také indukcí exprese negativních regulátorů, jako třeba CTLA-4. Viz. Tivol et al. (1995) Immunity 3: 541-547. U lidí jsou SCEĎ pacienti jedním z mála příkladů, kde je in vivo tolerance dosaženo po transplantaci HLA-nesouhlasného materiálu. Tato tolerance je díky nesmazávacímu mechanismu, který je zodpovědný za funkční deaktivaci T buněk, specificky rozpoznávajících hostitelské alloantigeny. Viz. výše a také Roncarolo et al. (1988) J. Exp. Med. 167: 1523-1534 a Bacchetta et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 1067-1078. Tyto hostitel-reaktivní T buňky vylučují : Ί Ί : ι: :

Σ . · « ·»* ··· • · ·· · vysoké úrovně EL-10 in vitro a vysoké úrovně IL-10 byly pozorovány in vivo, což naznačuje, že EL-10 může hrát úlohu při indukci a udržení tolerance. Viz. Bacchetta et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 493-502. Na základě těchto výsledků bychom mohli říci, že vysoké úrovně EL-10 pozorované u těchto pacientů, anergizují in vivo hostitel-reaktivní T buňky. Bylo také ukázáno, že vysoké úrovně vylučování IL-10 před transplantací korelují s úspěšným výsledkem transplantace (Holler et al. (1995) Eur. J. Cancer 31: 39-45), což dále podporuje hypotézu, že IL10 může hrát úlohu při indukci tolerance.

Celkově tato data naznačují, že EL-10 má důležitou roli při transplantační toleranci tím, že indukuje anergii na donor-specifické a/nebo hostitel-specifické alloantigeny. Kromě toho data naznačují, že EL-10 bude mít potenciální klinické využití v prevenci nebo redukci GVHD a odhoj ování alloštěpu.

Obrázek 16 ukazuje, že proliferativní odezvy čištěných CD4⁺ T buněk, které byly anergizovány stimulací se zesíťovanými anti-CD3 mAb (100 ng/ml) v přítomnosti IL-10 (100 U/ml) po dobu 10 dnů, mohou být částečně obnoveny po restimulaci s velmi vysokými koncentracemi zesilovaných anti-CD3 mAb.

Tabulka 6 ukazuje cytokinový profil anergických buněk po restimulaci s anti-CD3 mAb. Buňky (2,5 x 10⁶ buněk/ml) byly stimulovány se zesilovaným anti-CD3 mAb (100 ng/ml) v přítomnosti (anergické buňky) nebo bez přítomnosti (kontrolní buňky) EL-10 (100 U/ml). Po 10 dnech byly buňky sebrány, rozvrstveny na Ficoll-Hypaque gradientu, promyty třikrát a restimulovány při 2,5 x 10⁵ buněk/ml se zesíťovaným CD3 mAb (buď 10 mg/ml nebo 700 mg/ml). Po dvacetičtyř hodinách byla sebrána kapalina z kultur a množství cytokinů bylo stanoveno pomocí ELISA. Výsledky jsou střední hodnoty +/- odchylka vícenásobného měření jednoho reprezentativního experimentu. Zdát shromážděných v Tabulce 6 je zřejmé, že restimulace CD4⁺ T buněk, které byly anergizovány po stimulaci se zesíťovanými anti-CD3 mAb v přítomnosti IL-10 po dobu 10 dnů s extrémně vysokými úrovněmi anti-CD3 mAb (700 mg/ml), vede k nízkým úrovním proliferace a k Tri profilu produkce cytokinů, který je charakterizovaný produkcí vysokých úrovní IL-10, velmi nízkými úrovněmi IL-2 a nedetekovatelnými koncentracemi EL-4. Oproti tomu, anergizované buňky CD4⁺ T buňky nemohou proliferovat a produkovat cytokiny, jsou-li stimulovány se zesíťovanými anti-CD3 mAb při koncentracích 10 pg/ml.

··· • ·

Tabulka 6

• · ·

CD3 pg/ml

CD3

700 pg/ml

	cjxn	IL-2	IL-4	IL-5	IL-10	TNF-a	IFN-γ	GM-CSF
Kontrolní	42,369	pg/ml	pg/ml	pg/ml	pg/ml	ng/ml	ng/ml	pg/ml
buňky	875 ±	<40	80 ±	1067 ±	10.5 ±	5.5 ±	1245 +
	59		23	226	0.9	0.6	687
anergické buňky	2,635	<40	<40	<20	<40	<20	<40	<40
Kontrolní	75,236	1045 ±	<40	107 ±	1145 +	11.2±	4.3 ±	1569 +
buňky		105		39	321	1.3	1.2	537.
anergické	24,569	321 +	<40	445 ±	6421 ±	9.5 +	1.6 +	1125 ±
buňky		65		51	547	0.8	0.4	327

Obrázek 17 ukazuje proliferativní odezvy Tri klonů ve srovnání s odezvami Thi a Th2 klonů.

Tabulka 7 ukazuje profil cytokinové produkce u Tri, ThO, Thi a Th2 klonů, získaných z anergických buněčných populací dvou různých donorů. Různé CD4⁺ T buněčné klony byly sebrány 12 dní po stimulaci se směsí ozařovaných živných buněk + PMA a byly restimulovány se směsí anti-CD3 a anti-CD28 mAb po dobu 24 h. Produkce cytokinů (střední hodnota +/- střední odchylka) je vyjádřena jako pg/10⁶ buněk/ml. Charakteristický profil cytokinové produkce v Tri klonech neukazuje žádnou významnou produkci IL-2 a IL-4, ovšem velmi vysoké úrovně producke IL-10. Kromě toho, tyto buňky produkují IL-5 a IFN-γ a THF-a. Tento profil produkce cytokinů je jasně odlišný od profilu ThO, Thi a Th2 klonů, získaných z anergizovaných popř. neanergizovaných kontrolních T-buněčných populací.

Tabulka 7

Anergické	No. klonů	IL-2	IL-4	IL-5	IL-10	IFN-γ	TNF-a
Trí	15	10	10	1070	12290	3870	5950
ThO	5	530	2270	6120	660	1990	2340
Th2	5	10	3250	13690	1340	350	1140
Thi Kontrolní	5	520	10	80	790	6330	6310
ThO	5	490	2900	11240	850	2656	4210
Th2	5	10	4890	22210	1690	440	520
Thi	5	470	10	10	470	3040	2120

··' ·· ·· » ·· · b · · · • « · · · · ··

Obrázky 18A a 18B ukazují, že k produkci IL-10 u Tri klonů dochází ihned po aktivaci buněk.

Příklad 9: Lidské Tri buněčné klony

Izolace čištěných CD4⁺ T buněk

Mononukleámí buňky periferální krve byly připraveny centrifugací přes Ficoll-hypaque. CD4⁺ T buňky byly čištěny negativní selekcí. Negativní čištění bylo provedeno s využitím kokteilu protilátek směřovaných proti jiným než CD4⁺ T buňkám: CD8, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56, HLA-DR. Buňky byly inkubovány se saturačními množstvími protilátek po dobu 20 min při 4°C. Po promytí byl přidán Dynabeads (Dynal, Norway) v poměru 10 kuliček/cílová buňka a vše bylo inkubováno po dobu 1 h při 4°C. Kuličky a kontaminující buňky byly odstraněny magnetickým polem. Zbývající buňky byly znovu suspendovány se stejným množstvím kuliček a byla provedena druhá inkubační perioda po dobu 1 h při 4°C. Po odstranění kontaminuj ícíchbuněk byly CD4⁺ T buňky analyzovány na FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) a bylo zjištěno, že jsou více než 90 až 95% pozitivní. V některých experimentech byly CD4⁺ T buňky čištěny pozitivní selekcí s využitím magnetických kuliček přímo pokrytých s CD4 mAb podle instrukcí výrobce (Dynal, Norsko). Tímto způsobem byly získány buňky s více než 95% čistotou.

Podmínky kultivace

Při tomto stanovení byly buňky kultivovány v Ysselově médiu doplněném 10% FCS a 1% lidským sérem.

Pro aktivaci se zesíťovanými anti-CD3 mAb bylo 100 pg/ml (u klonovaných anergických buněk) nebo 500 ng/ml (pro indukci anergie) anti-CD3 mAb (SPV-T3) naředěno v 0,1 M Tris pufru, pH 9,5 a bylo inkubováno 4 týdny při 4°C v jamkových deskách s 96 prohlubněmi. Desky byly poté promyty třikrát sRPMI.

Indukce anergie a klonování

Kvyvolíní anergie byly CD4⁺ T buňky kultivovány při 2,5 x 10⁵ buněk/ml v jamkové desce s 24 prohlubněmi (Linbro, ICN Biomedical, Ohio) a byly aktivovány se zesíťovanými antiCD3 mAb v přítomnosti IL-10 (100 U/ml). Po 10 dnech byly buňky sebrány, rozvrstveny na Ficoll-hypaque gradientu aby se odstranily mrtvé buňky, dvakrát promyty a klonovány při 0,3 • · · • · · »· ·· fl fl buňky/prohlubeň. Klonování při mezním zředění bylo prováděno ředěním anergických buněk v živném roztoku (5 x 10⁵ PBMC + 5 x 10⁴ EBV transformovaných B buněk (JY) plus 2 U/ml IL-2) na deskách předem potažených se 100 pg/ml anti-CD3 mAb. Po 10 dnech bylo do každé prohlubně přidáno čerstvé médium obsahující 2 U/ml IL-2. Každé 3 týdny byly všechny jamky reaktivovány s živným roztokem (10⁶ PBMC + 10⁵ EBV-LCL) + PHA (10 pg/ml + IL-2 (2U/ml). Po 5 až 8 týdnech byly narostlé buňky přeneseny na desky se 48 prohlubněmi a poté do desek se 24 jamkami.

Udržování Tri buněk

T buňky byly stimulovány každé 3 týdny s živným roztokem (10⁶ PBMC + 10⁵ EBVLCL) + PHA (10 pg/ml) + IL-2 (2 U/ml). Každé tři dny byly buňky kontrolovány, v případě potřeby rozděleny a bylo přidáno čerstvé médium obsahující 2 U/ml IL-2.

Tento vynález tedy zajišťuje Tri buňky, čištěné do homogenity, např. v klonální formě nebo v populacích, zahrnujících Tri buňky ve vysokých úrovních, obsahujících nejméně kolem 40%, obecně nejméně 50%, v typickém případě nejméně 60%, typičtěji více než 70%, přednostně více než 80%, výhodněji nejméně 90% a ve speciálních provedeních vynálezu nejméně 95% nebo vyšší čistotu Tri buněk.

Příklad 10. In vitro diferenciace nových regulačních CD4⁺ T buněk u lidí a u myší

Indukce a setrvání periferální tolerance jsou důležitým mechanismem k udržení rovnováhy imunitního systému. Kromě toho, T-buněčná tolerance a T-buněčná anergie, aktivní suprese mediovaná T-buňkami nebo T-buněčnými faktory byly navrženy jako mechanismy pro periferální toleranci. Germain and Benacerraf (1981) Scand. J. Immunol. 13:1. Avšak až dosud bránil objasnění mechanismu suprese fakt, že se nepodařilo izolovat klony regulačních T buněk, účastňujících se antigen-specifické inhibice imunitní odezvy. IL-10 byl spojován s indukcí a udržováním tolerance u SCID pacientů po transplantaci allogeneických kmenových buněk. Bacchetta et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 493-502. Kromě toho, stimulace lidských CD4⁺ T buněk v přítomnosti IL-10 vede k antigen-specifické T-buněčné necitlivosti. Groux et al. (1966) J. Exp. Med. 184: 1-11. Zde je ukázáno, že aktivace jak lidských tak i myších CD4⁺ T buněk v přítomnosti IL-10 vede ke vzniku CD4⁺ T-buněčných klonů s nízkou proliferační schopností, produkujících vysoké úrovně IL-10, nízké úrovně IL-2 a žádné IL-4. Tyto antigen-specifické T buněčné klony potlačovaly proliferaci naivních CD4⁺ T buněk v odpovědi na stejný antigen.

·· · • · • · • · 4 • ··«

Tento inhibiční efekt byl mediován jak s IL-10 tak i TGF-β. IL-10 tedy řídí vznik nového podsouboru CD4⁺ T buněk, označovaného jako T regulační buňky (Tri), který potlačuje imunitní odezvy a jehož úkolem je pravděpodobně vyvolání a udržování tolerance.

Jeden z hlavních rysů imunitního systémů je diskriminace mezi vlastním a nevlastním. Rocha a von Boehmer (1991) Science 251: 1225-8; Nossal (1987) Int. Rev. Immunol. 2: 321. Imunologická tolerance zajišťuje imunitnímu systému diskriminaci vlastní/nevlastní a je kritickým faktorem při prevenci patogenní reaktivity proti vlastním antigenům. Imunitní systém je konfrontován s opakovanou stimulací nepatogenními antigeny, získanými inhalací a pozřením cizích látek. Abychom se vyhnuli chronické buněčné aktivaci a zápalu, musí imunitní systém vyvinout necitlivost na takové stimuli. Musí tedy existovat mechanismus, který reguluje nevhodně reaktivní T buňky v periferních částech. Bylo popsáno několik mechanismů periferální imunitní tolerance, včetně T-buněčné anergie (Jenkins et al. (1990) J. Immunol. 144: 16-22, Schwartz (1990) Science 248: 1349-56), T-buněčné vymazání (Rocha a von Boehmer (1991) Science 251: 1225-8) a aktivní imunitní suprese (Germain a Benacerraf (1981) Scand. J. Immunol. 13: 1).

Pochopení těchto mechanismů indukování tolerance je klinicky důležité pro léčení autoimunitních nemocí a pro transplantace, kde musí být štěp určitě rozeznán jako vlastní a musí být tolerován. U lidí jsou SCID pacienti jedním z mála příkladů, kde je dosaženo in vivo tolerance po transplantaci HLA nesouhlasných kmenových buněk. Bacchetta et al. (1993) J. clin. Invest. 91: 1067-78. Bylo již dříve ukázáno, že tato tolerance je způsobena nemazacím (non deletional) mechanismem, který je zodpovědný za funkční deaktivaci T buněk, specificky rozeznávajících hostitelské alloantigeny. Roncarolo et al. (1988) J. Exp. Med. 167: 1523-34. Tyto hostitel-reaktivní CD4⁺ T buňky obecně mají nízkou proliferační schopnost a produkují velmi nízké úrovně EL-2 po stimulaci antigenem. Oproti tomu, buňky vylučují vysoké koncentrace IL-10 a vysoké úrovně IL-10 mRNA byly také pozorovány v PBMC u těchto pacientů ve srovnání s normálními kontrolními buňkami. Kromě toho bylo prokázáno, že vysoké úrovně vylučování IL-10 před transplantací korelují s úspěšným klinickým průběhem po transplantaci. Holler et al. (1994) Annual meeting of the EBMT, Davos, Švýcarsko. Kromě toho bylo ukázáno, že IL-10 indukuje dlouhodobý antigen-specifícký anergický stav v lidských CD4⁺T buňkách. Tato pozorování podporují hypotézu, že IL-10 může hrát roliv indukování tolerance.

fl · • ·

Anergické T buňky indukované s IL-10 nemohou proliferovat a produkovat cytokiny v odpovědi na stimulaci antigenem nebo zesíťovaným anti-CD3 mAb. Groux et al. (1996) J.

Exp. Med. 184: 1-11.

Například T-buněčná anergie indukovaná s IL-10 byla získána u lidských CD4⁺ T buněk. V krátkosti, CD4⁺ T buňky byly kultivovány při 10⁶ buněk/ml v jamkových deskách s 24 prohlubněmi a aktivovány buď se zesíťovaným anti-CD3 mAb (SPV-T3, 100 ng/ml) nebo s čištěnými ozařovanými allogeneickými monocyty (10⁶ buněk/ml) v přítomnosti IL-10 (100 U/ml). Po 10 dnech byly buňky sebrány, rozvrstveny na Ficoll gradientu a centrifugovány po dobu 30 min při 1200 otáčkách za minutu aby byly odstraněny mrtvé buňky. Životaschopné buňky byly sebrány z rozhraní, dvakrát promyty a klonovány. Klonování bylo provedeno pomocí FACS třídění. Buňky byly označeny s anti-CD4-FITC mAb (Becton, Dickinson) a životaschopné buňky byly tříděny při koncentraci jedna buňka/prohlubeň na deskách pokrytých s anti-CD3 (SPV-T3-100 μg/ml) ve 100 μΐ. Po roztřídění byla přidána směs ozařovaných živných buněk (EBV-LCL 10⁵ buněk/prohlubeň a PBMC 10⁶/ml) a 10 U/ml rekombinantního IL-2 ve 100 μΐ. Klony byly expandovány sIL-2 :(10 U/ml) a opakovanou restimulací s vysokými dávkami zesíťovaného anti-CD3 mAb (100 pg/ml).

Zde je ukázáno, že velmi vysoké dávky zesíťovaného anti-CD3 mAb (700 pg/ml) vedou k částečnému obnovení proliferativní odezvy CD4⁺ T buněk, které byly anergizovány s IL-10, tyto odezvy byly stále ještě 3 až 5 krát nižší než odezvy získané s jejich neanergizovanými protějšky (Tabulka 9). Zvrácení anergie vysokými dávkami antigenů bylo také popsáno u anergizovaných muších CD4⁺ T buněk. Schwartz (1990) Science 248: 1349-56. Je zajímavé, že profil produkce cytokinů u anergických lidských T buněk, po stimulaci s vysokými dávkami zesíťovaného anti-CD3 mAb, nesouhlasí s fenotypy ThO, Thl nebo Th2 (Tabulka 9). Mosmann a Coffman (1989) Ann. Rev. Immunol. 7: 145-73. Nej význačnější charakteristikou těchto buněk je jejich neobyčejně vysoký stupeň produkce EL-ΊΟ. Kromě toho buňky ne vylučujjí prakticky žádný EL-4 a velmi nízké úrovně IL-2, zatímco jejich úrovně produkce IL-5, IFN-γ, TGF-β a TNF-a jsou srovnatelné s úrovněmi u lidských ThO klonů (Tabulka 9).

Tabulka 9 ukazuje produkci cytokinů u lidských Tri buněk. CD4⁺ T buňky byly stimulovány se zesíťovanými anti-CD3 mAb (100 ng/ml) v přítomnosti (anergické buňky) nebo bez přítomnosti (kontrolní buňky) IL-10 (100 U/ml). Po 10 dnech v kultuře byly buňky kultivované sEL-10 anergické po restimulací s anti-CD3 mAb (100 ng/ml). Aktivace těchto

CD4⁺ T buněk, anergizovaných s IL-10, s vysokými koncentracemi zesíťované anti-CD3 mAb · ·· • · 4 · • 4 4 · · • ······· • 44 · · ·* (700 pg/ml) částečně obnovila buněčnou proliferaci (24,569 cpm). Proliferativní odezva kontrolních buněk kultivovaných 10 dní bez přítomnosti IL-10 byla ovšem vždy vysoká (75,236 cpm). Úroveň produkce cytokinů byla měřena pomocí ELISA v kapalině z kultury u těchto dvou populací buněk, aktivovaných 48 h se zesíťovaným anti-CD3 mAb (700 pg/ml). Výsledky představují data z jednoho reprezentativního experimentu a jsou vyjádřeny v pg/ml.

Buňky z těchto dvou populací byly klonovány a po expanzi byly různé klony stimulovány se zesíťovaným anti-CD3 (10 μg/ml) a anti-GD28 (1 pg/ml) mAb. Produkce cytokinů byla analyzována s ELISA v kapalině kultury sebrané po 48 h kultivace. Výsledky představují střední hodnoty dat, získaných z jednotlivých T-buněčných klonů.

Ke generování antigen-specifických T-buněčných klonů byly CD4^ T buňky z donorových JDV stimulovány s ozařovanými čištěnými allogeneickými monocyty v přítomnosti nebo bez přítomnosti IL-10 (100 U/ml). Po 10 dnech byly CD4⁺ T buňky klonovány. Různé T-buněčné klony byly namnoženy a byla provedena selekce podle jejich specifity proti stejným monocytům. Pro měření produkce cytokinů byly T buňky aktivovány se zesíťovaným anti-CD3 (10 pg/ml) a anti-CD28 (1 pg/ml) mAb a kapaliny z kultury byly sebrány 48 h kultivace nebo po 72 h u TGF-β. Výsledky shromážděné v Tabulce 9 reprezentují data z různých nezávislých experimentů.

f* • fl · • fl fl • flfl množství TGF-β bylo měřeno s využitím komerční ELISA soupravy (R&D System) po aktivaci kyselinou, podle instrukcí výrobce.

Oproti tomu, pouze Thi, Th2 a ThO klony byly izolovány z kontrolní T-buněčné populací, které byly kultivovány v nepřítomnosti IL-10 (Tabulka 9). Aktivace lidských CD4⁺ T buněk tedy v přítomnosti IL-10 vede ke generování nového T-buněčného podsouboru s unikátním cytokinovým profilem a nízkou schopností proliferace. Tyto buňky jsou podle svých funkcí určovány v mladých Th3 buňkách a znovu určovány zde v Tri buňkách.

Jak alloantigen-specifické Tri CD4⁺ klony (JDV 24) tak i alloantigen-nespecifické Tri klony (JDV 15 a JDV 308) byly izolovány zCD4⁺ T-buněčné populace, která byla původně stimulována s allogeneickými monocyty v přítomnosti IL-10 (Tabulka 9). Oproti tomu, z kontrolní populace CD4⁺ T buněk, prvotně stimulovaných allogeneickými monocyty v nepřítomnosti IL-10 nebyly izolovány žádné Tri klony, ale pouze ThO (JDV 305) a Thi klony, což dále demonstruje, že IL-10 řídí diferenciaci CD4⁺ T buněk na Tri fenotyp.

Tri buňky mohou být také izolovány z myší. OVA-specifické CD4⁺ T buňky, získané z OVA-specifických TCR transgenických myší (Murphy et al. (1990) Science 250: 1970-1722), které byly opakovaně stimulovány v přítomnosti IL-10, nebo v kombinaci IL-10 a IL-4, vykazují cytokinový profil Tri buněk. Viz Murphy et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 901-13.

Průtoková cytometrická analýza syntézy intracelulámích cytokinů.

Byla provedena analýza intracelulámích cytokinů pomocí průtokové cytometrie. Kuhn et al. (1993) Cell 75: 263-274. Buňky (10⁶ buněk/ml) byly aktivovány se zesíťovaným anti-CD3 a anti-CD28 mAb (Pharmingen) po dobu 4 h. Dvě hodiny před sebráním byl přidán Brefeldin A při 10 pg/ml. Buňky byly sebrány, promyty a fixovány s formaldehydem (2%). Pro intracelulámí barvení byly buňky inkubovány s následuj ící cmi mAb: anti-IL-4-FITC nebo PE (11B11, 5 pg/ml), anti-IFN-γ-ΡΕ (XMG1.2-PE, 5 pg/ml), anti-IL-5-PE (TRFK5, 2,5 pg/ml), anti-IL-10FITC (JES-16E3, 5 pg/ml), anti-IL-2-PE (JES6-5H4, 2,5 pg/ml) nebo s antiklonotypem KJ1-26FITC (5 pg/ml). Vzorky byly analyzovány na FACScan™ (Becton Dickinson).

Tyto buňky byly charakteristické vysokými stupni vylučování IL-10 a IL-5 a nízkými stupni sekrece IL-2 a IL-4 (Obrázek 19). Oproti tomu, kontrolní CD4⁺ T buňky izolované z OVA-specifických TCR transgenických misí, stimulovaných v přítomnosti IL-4, vykazují typický Th2 typový profil a vylučují IL-4, IL-5 a IL-10 (Obrázek 19). Kromě toho, několik OVAspecifických CD4⁺ T klonů s Tri cytokinovým profilem bylo izolováno z populace T buněk, které byly opakovaně stimulovány v přítomnosti IL-10.

I j

í

I

j.· ·· • · · flfl · • ··» • 9 • · · · • · ···* • · · *· · «· · ·· ·· • · »·

Tabulka 10 ukazuje cytokinovou produkci u myších OVA-specifických CD4⁺ T buněčných klonů, odvozených od T buněk DO 11-10 TCR-transgenické myši, anergizovaných s IL-10. Naivní (MEL14 bright) CD4⁺ T buňky z D011-10-transgenické myši byly stimulovány s OVA peptidem (0,6 μΜ) v přítomnosti nebo bez přítomnosti IL-10 (100 U/ml). Po opakované stimulaci za stejných podmínek byly CD4⁺ T buňky z těchto dvou populací klonovány mezním zředěním při 0,3 buňky/prohlubeň v desce pokryté s 50 pg/ml anti-CD3 mAb v PBS a obsahující ozařované úplné splenocyty (10⁷ buněk/ml) a 20 U/ml IL-2. Klony byly namnoženy s IL-2 (20 U/ml) a IL-4 (20 U/ml) a opakovaně stimulovány s OVA peptidem (2 μΜ) a ozařovanými splenickými APC (10⁷ buněk/ml) v přítomnosti IL-2 a IL-4. Ovšem z T-buněčných kultur, které byly stimulovány v přítomnosti IL-4, nebyly získány žádné Tri klony. Po namnožení byly Tbuněčné klony stimulovány OVA peptidem (1 μΜ) a ozařovanými úplně splenickými APC. Cytokiny byly analyzovány pomocí ELISA vkapalině z kultury, sebrané po 48 h kultivace.

Pro měření TGF-β byly buňky kultivovány v Ysselově médiu bez séra po dobu 72 h a množství neaktivní TGF-β bylo měřeno pomocí ELISA (R&D Systems) po aktivaci kyselinou, podle pokynů výrobce. Výsledky představují data shromážděná z reprezentativních experimentů.

Tabulka 10

T-buněčné klony	Počáteční inkubace s IL-10	IL-2 (pg/ml)	IL-4 (pg/ml)	IL-10 (pg/ml)	IFN-γ (ng/ml)	TGF-β (pg/ml)	klonový typ
A-10-1	ano	<40	<50	12301310	105127		Tri
A-10-9	ano	<40	<50	1020+120	87117	4 3519	Tri
A-10-11	ano	<40	<50	1850+410	217+68	74719	Tri
A-10-14	ano	<40	<50	1820+120	198167		Tri
A-10-2	ano	102±26	250±45	8501130	789+124		ThO
A-10-7	ano	97±27	897±102	4101120	2671247		ThO
A-10-15	~⁷ ano	52+19	89+17	205+80	420141		ThO
A-10-19	ano	69±27	890±48	3101120	107157		ThO
A-3	ne	<40	1247+157	510+110	<75		Th2
A-5	ne	<40	879+87	310+60	<75		Th2
A-7	ne	129±48	<50	<75	975197	715+2	Thl
A-13	ne	89±28	598±59	215+30	143113		ThO
A-14	ne	203+49	<50	<75	1249+49		Thl

• · ·» *

Proliferace Tri klonů byla také částečně obnovena neutralizujícím anti-TGF-β mAb (Obrázek 20A a 20B), zatímco proliferace Thl klonů zůstala opět neovlivněna (Obrázek 20A a 20B). Je zajímavé, že vliv kombinace anti-IL-10 a anti-TGF-β měl aditivní efekt, obzvláště při obnovení proliferativních odezev lidských Tri klonů (Obrázek 20A a 20B). Podobná data byla získána u myších Tri buněk (Obrázek 20A a 20B), což potvrzuje obecný princip, že endogenně produkovaný IL-10 a TGF-β hrají hlavní úlohu v řízení proliferativních odezev Tri buněk.

Pozorování, že Tri buňky vylučují vysoké úrovně imunosupresivních cytokinů IL-10 a RGF-β a nízké úrovně cytokinů IL-2 a IL-4, podporujících růst T-buněk, naznačuje, že antigenspecifická aktivace Tri buněk může vést k inhibici antigen-specifické proliferace nezúčastněných T buněk. Aby bylo možno zodpovědět tuto otázku, byly provedeny experimenty s využitím kokultivace (transwell systém). Klidové lidské CD4⁺ T buňky, autology k různým JDV klonům, byly stimulovány s ozařovanými allogeneickými monocyty donoru N ve spodní části, zatímco alloantigen-specifické JDV24 a antigen-nespecifické JDV308 Tri klony byly stimulovány v horním koši s monocyty donoru N. Obrázek 21A ukazuje, že alloantigen-specifická stimulace Tri klonu JDV24 silně snižuje proliferativní odezvy naivních lidských CD4⁺ T buněk, zatímco antigen-nespecifický Tri klon JDV 308 byl neúčinný. Slabé zvýšení proliferace naivních CD4⁺ T buněk bylo zaznamenáno při sledování kokultivace s antigen-specifickým ThO klonem (JDV 305) (Obrázek 21A). Přídavek neutralizující anti-IL-10 a anti-TGF-β částečně obnovil proliferativní odezvy naivních CD4⁺ T buněk v přítomnosti Tri buněk, zatímco přídavek dvou protilátek měl aditivní efekt a obnovil proliferativní odezvy CD4⁺ T buněk z 80%.

Podobná data byla získána s myšími Tri klony. Na Obrázku 21B je ukázáno, že proliferace naivních CD4⁺ T buněk v odezvě na OVA-peptid a splenické APC je dramaticky snížena po kokultivaci s Tri klony aktivovanými s OVA peptidem nebo s aktivovanými Trlbuněčnými populacemi, generovanými v přítomnosti IL-10. Oproti tomu, kontrolní OVAspecifické Thl klony a Th2-buněčné populace, generované v přítomnosti IL-4, neměly žádný supresivní efekt a spíše zvyšovaly proliferaci CD4⁺ T buněk.

Přídavek neutralizujích anti-IL-10 nebo anti-TGF-β protilátek částečně obnovil OVAspecifickou proliferativní odezvu myších T buněk, zatímco kombinace dvou protilátek měla aditivní efekt a obnovila proliferaci na 70% kontrolní úrovně (Obrázek 21B). Tato data demonstruj í, že supresivní aktivity jak lidských tak i myších Tri buněk jsou převážně mediovány pomocí IL-10 a TGF-β.

Předložená fakta ukazují, že stimulace CD4⁺ T buněk v přítomnosti IL-10 generuje novou podskupinu CD4⁺ T buněk, která může podregulovávat antigen-specifické imunitní odezvy prostřednictvím vylučování EL-10 a TGF-β. Cytokinový profil se zdá být stabilní, protože Tri klony, kultivované více než 6 měsíců, produkovaly po aktivaci stejný cytokinový profil.

T regulační buňky byly popsány v několika modelech orální tolerance. Chen et al. (1994) Science 265: 1237-1240, Miller et al. (1992) Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 89: 421-5. CD8⁺regulační T buňky byly izolovány v Lewisových krysách po stimulaci s myelinovým basickým proteinem coby orálním antigenem (Miller). Tyto regulační T buňky zprostředkovaly aktivní potlačení sekrecí TGF-β. Kromě toho, antigen-specifické regulační CD4⁺ T-buněčné klony byly izolovány z SJL myší po indukci orální tolerance vyvolané krmením zvířat s myelinovým bazickým proteinem. Transfer těchto CD4⁺ T-buněčných klonů, generovaných po indukování orální tolerance, potlačoval experimentální alergickou encefalomyelitidu. Toto potlačení bylo ulehčeno s anti-TGF-β, což naznačuje, že také tyto klony zprostředkovávají svoji supresi prostřednictvím TGF-β. Tyto T-buněčné klony opravdu, na rozdíl od zde popsaných Tri buněk, produkovaly velmi vysoké úrovně aktivní TGF-β (až 1000 pg/ml), zatímco byly detekovány pouze nízké úrovně EL-10 a EL-4. Kromě toho, T-buněčné klony, izolované z MBP transgenických myší, produkovaly pouze TGF-β a žádný EL-10, IL-4, EL-2 nebo TNF-α. Weiner et al. (1996) FASEB Meeting, New Orleans, Louisiana, A 2558. Tyto myší buňky, označované jako Th3 buňky, tedy vylučují TGF-β jako primární cytokin, který zprostředkovává jejich supresorovou aktivitu. Narozdíl od Th3 buněk, zde popsané Tri buňky produkují nízké úrovně aktivního TGF-β. Pouze stopová množství TGF-β (méně než 40 pg/ml) byla detekována v kapalinách z aktivovaných Tri-buněčných klonů a úrovně latentního TGF-β byly srovnatelné s úrovněmi kontrolních T buněk (Tabulka 9 a 10). Kromě toho, tyto Tri buňky produkují vysoké úrovně IL-10, což přispívá k jejich supresorové aktivitě. Zdá se tedy pravděpodobné, že Tri buňky mohou působit jak vylučováním IL-10 tak i zvyšováním aktivace TGF-β prostřednictvím mechanismu, který stále ještě zbývá vyřešit. V souhrnu, tato data naznačují, že Th3 a Tri buňky jsou dvě rozdílné populace CD4⁺ regulačních T buněk. Th3 buňky jsou specificky generovány po orální expozici antigenům a působí prostřednictvím vylučování TGF-β. Tri buňky mohou být výsledkem antigen-specifické stimulace v lymfoidních orgánech a jsou závislé na produkci IL10. Izolace podobných Tri buněk zperiferální krve SCEĎ pacientů, u kterých jsou vysoké úrovně IL-10 in vivo spojené s tolerancí po transplantaci allogeneických kmenových buněk, podporuje tuto hypotézu a naznačuje, že Tri buňky mohou být generovány in vivo expozicí naivních T • · fr buněk alloantigenům v přítomnosti IL-10. Na základě in vivo imunosupresivních aktivit Tri buněk se kromě toho zdá, že tyto hostitel-reaktivní Tri buňky mají podobné vlastnosti in vivo a jsou tedy zodpovědné za transplantační toleranci.

Zápalné onemocnění střev u myší vyvolané nedostatkem IL-10 lze u mladých myší předcházet podáváním IL-10. Kuhn et al. (1993) Cell 75: 263-274. Kromě toho, podávání IL.-10 významně brání rozvoji kolitidy indukované přenesením CD45RB^hl CD4⁺ T buněk do SCID myší. Powrie et al. (1994) Immunity 1: 553-562. Kolitida indukovaná sCD45RB^hl CD4⁺ T buněk do SCID myši může být také zabráněna kotransferem CD45RB*⁰ CD4⁺ T buněk. Powrie et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 589-600. Ochranné účinky však byly zcela potlačeny s anti-TGF-β mAb. Powrie et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 2669-74. Tyto výsledky ukazují, že jsou zjevné podobnosti mezi těmito regulačními buňkami zabraňujícími kolitidě a mezi zde popsanými Tri buňkami. Mělo by být zdůrazněno, že všechny až dosud popsané regulační buňky byly izolovány po in vivo naplnění s antigenem. Možnost generování Tri buněk po expozici antigenu in vitro může být velkou výhodou při získávání těchto buněk pro další funkční analýzy a potenciální klinické aplikace.

V souhrnu tato data demonstrují, že IL-10 jak u lidí tak i u myší, indukuje generování Tri buněk, které podregulovávají antigen-specifické T-buněčné odezvy a tudíž jsou potenciálně důležité pro obecnou indukci a udržování tolerance.

Autoři tohoto vynálezu uložily samostatné kultury E. coli MCI061 nesoucí pH5C, pH15C a pBCRFl(SRa) v Americké sbírce typových kultur (American Type Culture Collection), Rockville, MD, USA (ATCC) dne 20. prosince 1989 pod přístupovými čísly 68191, 68192 a 68193. Tyto úložky byly zhotoveny za podmínek uvedených v ATCC’ agreement for Culture Deposit for Patent Purposes, které zajišťují, že deposit bude dostupný „U.S. Commissioner of Patents and Trademarks“ podle 35 U.S.C. §122 a 37 C.F.R. §1.14 a bude veřejně přístupný po vydání U.S. patentu, který vyžaduje, aby byla položka udržována. Dostupnost uloženého kmene nelze vykládat jako licenci na provádění vynálezu v rozporu s právy garantovanými úřední mocí vlády v souladu s příslušnými zákony.

Popisy předcházejících provedení vynálezu byly uvedeny pro účely ilustrace a popisu. Nejsou zamýšleny jako vyčerpávající a limitující pro daný vynález v přesně popsané formě a je zřejmé, že jsou možné mnohé modifikace a variace podle výše uvedených faktů. Provedení vynálezu byla vybrána a popsána z důvodů co nej lepšího vysvětlení principů vynálezu, aby tím bylo umožněno dalším odborníkům v oboru využít vynález v různých provedeních a modifikacích, které jsou zamýšleny pro určité vhodné využití. Rozsah vynálezu je definován zde připojenými nároky.

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel: Schering Corporation (ii) Název vynálezu: Použití interleukinu-10 k produkci populace supresorových buněk (iii) Počet sekvencí: 25 (iv) Adresa pro korespondenci:

(A) Adresa: Schering-Plough Corporation (B) Ulice: 2000 Galloping Hill Road (C) Město: Kenilworth (D) Země: New Jersey (E) Stát: USA (F) ZIP: 07033 (v) Počítačová forma:

(A) Typ média: Floppydisk (B) Počítač: Macintosh (C) Operační systém: 7.5.3 (vi) Data této přihlášky:

(A) Číslo přihlášky:

(B) Datum podání:

(C) Klasifikace:

(viii) Data předchozí přihlášky:

(A) Číslo přihlášky: US 08/643,810 (B) Datum podání: 6. května 1996 (A) Číslo přihlášky: US 07/846,208 (B) Datum podání: 4. dubna 1992 (C) Klasifikace:

(viii) Data právního zástupce/agenta:

(A) Jméno: Foulke, Cynthia L.

(B) Registrační číslo: 32,364 (C) Referenční/rejstřikové číslo: DX0261K1 (ix) Telekomunikační data:

(A) Telefon: 908-298-2987 (B) TELEFAX: 908-298-5388 (2) Informace pro Sekvenci č. 1:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 178 aminokyselin (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 1:

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val

1

5

10

Cys 30

15 Thr His

Arg

Ala

Ser

Pro 20

Gly

Gin

Gly Thr

Gin 25

Ser

Glu

Asn

Ser

Phe

Pro

Gly 35

Asn

Leu

Pro

Asn

Met 40

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg 45

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg 50

Val

Lys

Thr

Phe

Phe 55

Gin

Met

Lys

Asp

Gin 60

Leu

Asp

Asn

Leu

Leu 65

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu 70

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys 75

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys 80

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu 85

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr 90

Leu

Glu

Val

Met 95

Pro ·

Gin

Ala-

Glu

ASn 100

Gin

Asp

Pro

'Asp

“Ile 105

Lys’

Ala’

His

Val

Asn 110

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn 115

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg 120

Leu

Arg

Leu

Arg

Arg 125

Cys

His

Arg

Phe

Leu 130

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys 135

Ser

Lys

Ala

Val

Glu 140

Gin

Val

Lys

Asn

Ala 145

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin 150

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr 155

Lys

Ala

Met

Ser

Glu 160

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile 165

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala 170

Tyr

Met

Thr

Met

Lys 175

Ile

Arg

Asn

(2) Informace pro Sekvenci č. 2:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 170 aminokyselin (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 2:

Met

Glu

Arg

Leu

Val

Thr

Leu

Gin

Cys

Leu

Val

Leu

Tyr

1

5

10

15

Leu

Ala

Pro

Glu

Cys

Gly

Thr

Asp

Gin

Cys

Asp

Asn

Phe

Pro

Gin

20

25

30

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

35

40

45

Gin

Thr

Lys

Asp

Glu

Val

Asp

Asn

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

50

55

60

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

65

70

75

80

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

85

90

95

Glu

Ala

Lys

Asp

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

100

105

110

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

11^

- - ........·. -

izu*

«1» Λί o

¹

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Ile

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu '

130

135

140

i

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

145

150

155

160

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Ile

Lys

Ala

Arg

165 170 (2) Informace pro Sekvenci č. 3:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 160 aminokyselin (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 3:

	Ser 1	Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn	Ser	Cys	Thr	His	Phe 15	Pro
5	10
	Gly	Asn Leu Pro Asn Met	Leu Arg Asp Leu	Arg	Asp	Ala	Phe	Ser	Arg
		20	25				30
	Val	Lys Thr Phe Phe Gin	Met Lys Asp Gin	Leu	Asp	Asn	Leu	Leu	Leu
		35	40			45
	Lys	Glu Ser Leu Leu Glu	Asp Phe Lys Gly	Tyr	Leu	Gly	Cys	Gin	Ala
		50	55		60
	Leu	Ser Glu Met Ile Gin	Phe Tyr Leu Glu	Glu	Val	Met	Pro	Gin	Ala
	65	70		75					80
	Glu	Asn Gin Asp Pro Asp	Ile Lys Ala His	Val	Asn	Ser	Leu	Gly	Glu
		85	90					95
	Asn	Leu Lys Thr Leu Arg	Leu Arg Leu Arg	Arg	Cys	His	Arg	Phe	Leu
		100	105				110
	Pro	Cys Glu Asn Lys Ser	Lys Ala Val Glu	Gin	Val	Lys	Asn	Ala	Phe
		115	120			125
	Asn	Lys Leu Gin Glu Lys	Gly Ile Tyr Lys	Ala	Met	Ser	Glu	Phe	Asp
4*		130	135		140
	Ile	Phe Ile Asn Tyr Ile	Glu Ala Tyr Met	Thr	Met	Lys	Ile	Arg	Asn

145 150 155 160 (2) Informace pro Sekvenci č. 4:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 147 aminokyselin (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 4:

Thr 1

Asp

Gin

Cys

Asp 5

Asn

Phe

Pro

Gin

Met 10

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg 15

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg 20

Val

Lys

Thr

Phe

Phe 25

Gin

Thr

Lys

Asp

Glu 30

Val

Asp

Asn

Leu

Leu 35

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu 40

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys 45

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys 50.

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu 55

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr 60

Leu

Glu

Val

Met 65

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn 70

Gin

Asp

Pro

Glu

Ala 75

Lys

Asp

His

Val

Asn 80

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn 85

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg 90

Leu

Arg

Leu

Arg

Arg 95

Cys

His

Arg

Phe

Leu 100

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys ¹⁰⁵

Ser

Lys

Ala

Val

Glu 110

Gin

Ile

Lys

Asn

Ala 115

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin 120

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr 125

Lys

Ala

Met

Ser

Glu 130

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile 135

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala 140

Tyr

Met

Thr

Ile

Lys Ala Arg (2) Informace pro Sekvenci č. 5:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 15 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 5: CTAAGGAGGT TTAAC (2) Informace pro Sekvenci ě. 6:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 10 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 6: ATGAGCTCAT (2) Informace pro Sekvenci č. 7:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 60 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 7:

AGCCCAGGCC AGGGCACCCA GTCTGAGAAC AGCTGCACCC ACTTCCCAGG TAACCGGTAC (2) Informace pro Sekvenci č. 8:

(i) Charakteristika sekvence: . .

(A) Délka: 56 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 8:

CGGTTACCTG GGAAGTGGGT GCAGCTGTTC TCAGACTGGG TGCCCTGGCC TGGGCT (2) Informace pro Sekvenci č. 9:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 62 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 9:

GTAACCTGCC TAACATGCTT CGAGATCTCC GAGATGCCTT CAGCAGAGTG-AAGACTTTCT TT (2) Informace pro Sekvenci č. 10:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 48 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 10:

CTTCACTCTG CTGAAGGCAT CTCGGAGATC TCGAAGCATG TTAGGCAG (2) Informace pro Sekvenci č. 11:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 35 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 11:

CAAATGAAGG ATCAGCTGGA CAACTTGTTC TTAAG (2) Informace pro Sekvenci č. 12:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 44 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě _____ (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid)

- (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 12:

CTTAAGAACA AGTTGTCCAG CTGATCCTTC ATTTGAAAGA AAGT (2) Informace pro Sekvenci č. 13:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 69 párů basí (B) Typ: nukleová kyselhia (C) Počet vláken: dvě (D) Topologie: lineární.. . . -λ. -.....~ ------- — - (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 13:

GAGTCCTTGC TGGAGGACTT TAAGGGTTAC CTGGGTTGCC AAGCCTTGTC TGAGATGATC CAGTTTTAT (2) Informace pro Sekvenci č. 14:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 73 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 14:

GATCATCTCA GACAAGGCTT GGCAACCCAG GTAACCCTTA AAGTCCTCCA GCAAGGACTC CTAGATAAAA CTG (2) Informace pro Sekvenci č.'l5· (i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 61 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 15:

CTAGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC CAAGACGCAG ACATCAAGGC GCATGTTAAC G (2) Informace pro Sekvenci č. 16:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 65 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 16:

GTTAACATGC GCCTTGATGT CTGGGTCTTG GTTCTCAGCT TGGGGCATCA CCTCCTCTAG TCGAC (2) Informace pro Sekvenci č. 17:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 63 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 17:

AACTCCCTGG GGGAGAACCT GAAGACCCTC AGGCTGAGGC TACGGCGCTG

TCATCGATCT GCA (2) Informace pro Sekvenci č. 18:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 59 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina , ....., . (C) Počet vláken: dvě.- — - · —....---=-- * ,...·.·..............

(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 18:

GATCGATGAC AGCGCCGTAG CCTCAGCCTG AGGGTCTTCA GGTTCTCCCC CAGGGAGTT (2) Informace pro Sekvenci č. 19:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 60 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 19:

CGATTTCTTC CCTGTCAAAA CAAGAGCAAG GCCGTGGAGC AGGTGAAGAA CGCGTGCATG (2) Informace pro Sekvenci ě, 20:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 54 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 20:

CACGCGTTGT TCACCTGCTC CACGGCCTTG CTCTTGTTTT GACAGGGAAG AAAT (2) Informace pro Sekvenci č. 21:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 58 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 21:

CGCGTTTAAT AATAAGCTCC AAGACAAAGG CATCTACAAA GCCATGAGTG AGTTTGAC (2) Informace pro Sekvenci č. 22:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 45 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě _ ______________ ....._ _ _ _ (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 22:

ACTCATGGCT TTGTAGATGC CTTTGTCTTG GAGCTTATTA TTAAA (2) Informace pro Sekvenci č. 23:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 51 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě _ ' _ (D) Topologie: lineární .= - · · (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 23:

ATCTTCATCA ACTACATAGA AGCCTACATG ACAATGAAGA TACGAAACTG A (2) Informace pro Sekvenci ě. 24:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 38 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 24:

AGCTTCAGTT TCGTATCTTC ATTGTCATGT AGGCTTCTAT GTAGTTGATG AAGATGTCAA ACTC (2) Informace pro Sekvenci č. 25:

“ - (i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 498 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (oligonukleotid) (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 25:

AATTCATGGA	GCGAAGGTTA	GTGGTCACTC	TGCAGTGCCT	GGTGCTGCTT	TACCTGGCAC	64
CTGAGTGTGG	AGGTACAGAC	CAATGTGACA	attttcccca	GACCTAAGAG	ATGCCTTCAG	120
TCGTGTTAAA	ACCTTTTTCC	AGACAAAGGA	CGAGGTAGAT	aaccttttgc	TCAAGGAGTC	180
TCTGCTAGAG	GACTTTAAGG	ATGCCAGGCC	CTGTCAGAAA	TGATCCAATT	CTACCTGGAG	240
GAAGTCATGC	CACAGGCTGA	AACCAGGACC	CTGAAGCCAA	AGACCATGTC	AATTCTTTGG	300
GTGAAAATCT	AAAGACCCTA	CGGCTCCGCC	TGCGCAGGTG	CCACAGGTTC	CTGCCGTGTG	360
AGAACAAGAG	TAAAGCTGTG	GAACAGATAA	AAAATGCCTT	TAACAAGCTG	CAGGAAAAAG	420
GAATTTACAA	AGCCATGAGT	GAATTTGACA	TTTTTATTAA	CTACATAGAA	GCATACATGA	480
CAATTAAAGC	CAGGTGAG					498

Průmyslová využitelnost

Vynález se zabývá látkami, inhibuj ícími odezvu imunitního systému na určitý antigen, popř. způsobem výroby, přípravků, založených na těchto látkách, především pajc na inter leukinu10. Aplikací těchto přípravků v medicíně je možné léčit nebo inhibovat syndrom odmítnutí tkáně po transplantacích popř. dalších poruch vyplývajících z činnosti imunitního systému.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY /V

1. Způsob výroby léků pro inhibici antigen-specifické odezvy imunitního sytému, včetně antigen-specifické odezvy na následnou přítomnost antigenu, vyznačující se tím, že se smíchá účinné množství interleukinu-10 a buď zmíněného antigenu nebo anti-CD3 protilátky.
2. Způsob výroby léků pro inhibici antigen-specifické odezvy imunitního sytému podle nároku 1, vyznačující se tím, že zmíněné účinné responderových T buněk.

množství je dostatečné pro snížení aktivace «'«iZpůsob výroby léků pro inhibici antigen-specifické odezvy imunitního sytému podle nároku 1, vyznačující se tím, že zmíněný interleukin-10 je lidský interleukin-10.
4. Prakticky čistá antigen-specifická T buňka vyznačující se tím, že po restimulaci produkuje:

a) málo IL-2

b) málo IL-5

c) střední množství IFN-γ

d) málo GM-SCF a

e) hodně IL-10
5. Prakticky čistá antigen-specifická T buňka podle nároku 4, vyznačující se tím, že po restimulaci dále produkuje velká množství TNF-a.
6. Prakticky čistá antigen-specifická T buňka podle nároku 4, vyznačující produkce: “ se t í m, že

a) IL-2 je nižší než přibližně 500 pg/ml,

b) IL-5 je mezi přibližně 300 pg/ml a 3000 pg/ml,

c) IFN-γ nejméně 1000 pg/ml,

d) GM-CSF je přibližně 300 až 3000 pg/ml a

e) IL-10 je nejméně 3000 pg/ml.

Ί. Prakticky čistá antigen-specifická T buňka podle nároku 6, vyznačující se tím, že zmíněná úroveň IL-10 po restimulaci je nejméně 5x vyšší než je tomu u Thl buňky.
8. Prakticky čistá antigen-specifická T buňka podle nároku 4, vy zn a č u j í c í set í m, že vykazuje antigen-specifickou anergii po dobu nejméně 21 dní.
9. Způsob přípravy prakticky čisté antigen-specifické anergické T buňky podle nároku 4, vyznačující se t i m, že se prekurzoru zmíněné T buňky podává kombinace:

i) exogeního IL-10 a ii) zmíněného antigenu nebo anti-CD3 protilátky.
10. Způsob přípravy prakticky čisté antigen-specifické anergické T buňky podle nároku 9, vyznačující se t í m, že zmíněný prekurzor je CD4⁺T buňka.
11. Způsob přípravy prakticky čisté antigen-specifické anergické T buňky podle nároku 9, vyznačující se t í m, že zmíněný EL-10 je podáván po dobu nejméně 7 dní.
12. Způsob přípravy prakticky čisté antigen-specifické anergické T buňky podle nároku 9, vyznačující se t í m, že zmíněný antigen je proteinový antigen, korpuskulámí antigen, alloantigen, autoantigen nebo MHC-asociovaný antigen.
13. Farmaceutický přípravek, vyznačující s e t í m, že zahrnuje EL-10, antigen nebo antiCD3 protilátku a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
14. Farmaceutický přípravek podle nároku 13, vyznačující se tím, že zmíněný IL-10 je lidský IL-10.
15. Farmaceutický přípravek podle nároku 13,vyznačující se tím, že zmíněný antigen je alloantigen, self-antigen, proteinový antigen, korpuskulámí antigen nebo MHC-asociovaný antigen.