CZ301395A3

CZ301395A3 - Process for preparing a mixture of glyoxylate and dialkylaminomethyl phosphonate, process for preparing n-(phosphonomethyl)glycine and process for preparing an intermediate

Info

Publication number: CZ301395A3
Application number: CZ953013A
Authority: CZ
Inventors: David Leroy Anton; Robert Dicosimo
Original assignee: Du Pont
Priority date: 1993-05-28
Filing date: 1994-05-20
Publication date: 1996-03-13
Also published as: WO1994028155A1; HU9503389D0; CA2163515A1; EP0701622A1; AU6831894A; CN1124981A; JPH08510644A; JP3937445B2; BR9406888A; HUT73395A; US5559020A

Description

Způsob výroby směsi glyoxylátu a dialkylaminomethylfosfonátu, způsob výroby N-(fosfonomethyl)glycinu a způsob výroby me z iproduktu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby směsi glyoxylátu a dialkylaminomethylfosfonátu, způsobu výroby N-(fosfonomethyl)glycinu a způsobu výroby meziproduktu pro výrobu N-fosfonomethylglycinu. Směs glyoxylové kyseliny a dialkylaminomethylfosfonátu je vhodným meziproduktem pro výrobu N-(fosfonomethyl)glycinu, což je postemergentní fytotoxická látka a herbicid se širokým spektrem účinnosti, užitečný při regulaci růstu širokého rozsahu rostlin.

Dosavadní stav techniky

Glykolát oxidasa je enzym, který se běžně nalézá v buňkách listů zelených rostlin a savčích buňkách a který katalyzuje oxidaci glykolové kyseliny na glyoxylovou kyselinu za současné tvorby peroxidu vodíku. Tuto reakci lze popsat následující chemickou rovnicí:

HOCH₂CO₂H + o₂ -> ochco₂h + H₂O₂

N. E. Tolbert et al., (J. Biol. Chem., sv. 181, str. 905 - 914 (1949)) poprvé oznámili objev enzymu extrahovaného z listů tabáku, který katalyzuje oxidaci glykolové kyseliny na kyselinu mravenčí a oxid uhličitý přes tvorbu meziproduktu, kterým je glyoxylová kyselina. Přídavkem určitých sloučenin, jako je ethylendiamin bylo možno omezit další oxidaci intermediární glyoxylové kyseliny. Podle této citace se oxidace provádějí při pH přibližně 8, obvykle za použití kyseliny glykolové v koncentraci přibližně 3 až 40mM (mmol/1). Optimální hodnota pH pro oxidaci glykolátu je údajně 8,9. Bylo oznámeno, že kyselina štavelová (v lOOmM koncentraci) inhibuje katalytické působení glykolát oxidasy. Podobně, K. E. Richardson a N. E. Tolbert, J. Biol. Chem., sv. 236. str. 1280 - 1284 (1961) ukázali, že pufry obsahující tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) inhibují tvorbu kyseliny šťavelové při oxidaci glykolové kyseliny, která je katalyzována glykolát oxidasou. C. 0. Clagett, N. E. Tolbert a R. H. Burris (J. Biol. Chem., sv. 178, str. 977 - 987 (1949)) oznámili, že optimální hodnota pH pro oxidaci glykolové kyseliny kyslíkem, která je katalyzována glykolát oxidasou, je přibližně 7,8 - 8,6 a optimální teplota leží v rozmezí od 35 do 40 °C.

I. Zelitch a S. Ochoa [J. Biol. Chem., sv. 201, str. 707 - 718 (1953)] a J. C. Robinson et al., [J. Biol. Chem., sv. 237, str. 2001 - 2009 (1962)] oznámili, že tvorba kyseliny mravenčí a oxidu uhličitého při oxidaci glykolové kyseliny působením glykolát oxidasy ze špenátu je důsledkem neenzymatické reakce peroxidu vodíku s glyoxylovou kyselinou. Tito autoři zjistili, že přídavkem katalasy, což je enzym, který katalyzuje rozklad peroxidu vodíku, je možno podstatně zlepšit výtěžky glyoxylové kyseliny tím, že se potlačí tvorba kyseliny mravenčí a oxidu uhličitého. Také bylo zjištěno, že lze podstatně zvýšit stabilitu glykolát oxidasy přídavkem FMN (flavinmononukleotidu).

N. A. Frigerio a H. A. Harbury [J. Biol. Chem., sv. 231, str. 135 - 157 (1958)] oznámili přípravu a vlastnosti glykolová kyselina oxidasy, izolované ze špenátu. Bylo zjištěno, že tento purifikovaný enzym je velmi nestálý v roztoku. Tato nestálost byla vysvětlována poměrně slabou vazbou flavinmononukleotidu (FMN) k účinnému místu enzymu a diso3 ciací enzymaticky účinných tetramerů a/nebo oktamerů tohoto enzymu na enzymaticky neúčinné monomery a dimery, které se nevratně agregují a srážejí. Přídavkem FMN (flavinmononukleotidu) k roztokům tohoto enzymu bylo možno dosáhnout podstatného zvýšení stability enzymu. Vysoká koncentrace proteinu nebo vysoká iontová síla je schopna enzym udržet ve formě oktamerů nebo tetramerů.

V US patentu č. 5 135 860 je popsán způsob výroby směsí glyoxylové kyseliny a aminomethylfosfonové kyseliny (AMPA). Tyto směsi se podle citovaného patentu vyrábějí reakcí kyseliny glykolové s kyslíkem ve vodném roztoku a za přítomnosti AMPA a dvou enzymatických katalyzátorů, glykolát oxidasy a katalasy. Je zde ukázáno, že za současného použití katalasy a AMPA se dostavuje synergicky účinek. Katalasa přitom rozkládá peroxid vodíku, vzniklý jako vedlejší produkt, který je zodpovědný za tvorbu formiátu. AMPA naproti tomu představuje aminovou přísadu, která je schopna vytvořit s glyoxylátem N-substituovaný hemiaminalový a/nebo iminový komplex, a tím omezuje další oxidaci glyoxylátu. Podle tohoto patentu se údajně dosahuje výtěžků glyoxylové kyseliny až 92 %. Vzniklých směsí glyoxylové kyseliny a AMPA se dále používá pro výrobu N-(fosfonomethyl)glycinu, což je postemergentní fytotoxické činidlo a herbicid.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob výroby směsí glyoxylové kyseliny a dialkylaminomethylfosfonátů, jehož podstata spočívá v tom, že se kyselina glykolová oxiduje kyslíkem ve vodném roztoku za přítomnosti dialkylaminomethylfosfonátu a dvou enzymatických katalyzátorů, tj. glykolát oxidasy [ (S)-2-hydroxykyselina oxidasy, EC 1.1.3.15] a katalasy (EC 1.11.1.6). Nahrazení dříve používané aminomethylfosfonové kyseliny (AMPA) dialkylaminomethylfosfonátem se pro4 jevuje neočekávaným zlepšením výtěžku glyoxylové kyseliny při reakcích, při nichž AMPA inhibuje aktivitu katalasy. Vzniklých směsí glyoxylové kyseliny a dialkylaminomethylfosfonátu se dále může použít pro výrobu N-(fosfonomethyl)glycinu, což je postemergentní fytotoxické činidlo a herbicid.

V US patentu č. 5 135 860 je popsán způsob výroby směsí glyoxylové kyseliny s aminomethylfosfonovou kyselinou (AMPA), při němž se jako katalyzátorů používá současně rozpustné glykolát oxidasy ze špenátu a rozpustné katalasy (například rozpustné katalasy z Aspergillus niger).

V US patentu č. 5 180 846 je popsán způsob hydrogenace těchto směsí, při němž vzniká N-(fosfonomethyl)glycin.

V příbuzné patentové přihlášce USA č. 07/951 497 je popsán způsob výroby směsí glyoxylové kyseliny a AMPA za použití genetickým inženýrstvím vyrobeného mikrobiálního transformantu, jako katalyzátoru. Tento mikrobiální transformant exprimuje současně enzym glykolát oxidasu ze špenátu a endogenní katalasu. Bylo pozorováno, že AMPA reversibilně inhibuje působení endogenní katalasy produkované transformanty Hansenula polymorpha nebo Pichia pastoris spočívající v rozkladu peroxidu vodíku na vodu a kyslík, a tato inhibice vede k tvorbě podstatných množství formiátu (produktu oxidace glyoxylátu peroxidem vodíku). Přídavkem druhého zdroje katalasy (například rozpustné katalasy z Aspergillus niger) k reakční směsi bylo v případě použití transformantů Hansenula polymorpha nebo Pichia pastoris, jako katalyzátorů, dosaženo vysokých výtěžků glyoxylové kyseliny.

V současné době byly jako katalyzátory rozkladu peroxidu vodíku vznikajícího při oxidaci směsí glykolátu a AMPA zkoušeny katalasy z Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris a hovězích jater. Přitom byla objevena dosud neznámá reversibilní inhibice katalasy z H. polymorpha, P. pastoris a hovězích jater působením AMPA. K této inhibici dochází bez ohledu na to, zda se jako katalyzátoru použije rozpustné katalasy, immobilizované katalasy nebo celých buněk obsahujících katalasu. Přitom se zjistilo, že lze místo přidávání přídavného zdroje katalasy, odolné vůči inhibici, k reakčním směsím glykolát/AMPA, ve kterých se používá jako katalyzátoru zdroje katalasy inhibované aminomethylfosfonovou kyselinou (AMPA) (například transformantů H. polymorpha nebo P. pastoris) použít alternativního přístupu. Tento přístup spočívá v nahrazení aminomethylfosfonové kyseliny aminomethylfosfonátem. Neočekávatelným důsledkem takopvého nahrazení je, že se odstraní nebo podstatně sníží inhibice určitých katalas, k níž by za normálních okolností došlo, pokud by se jako aminové přísady použilo aminomethylfosfonové kyseliny.

Aminomethylfosfonová kyselina (AMPA) a diethylaminomethylfosfonát (DEAMPA) byly porovnávány jako aminové přísady při oxidaci kyseliny glykolové za použití rozpustné glykolát oxidasy a bud rozpustné katalasy z Aspergillus niger (která není inhibována AMPA) nebo rozpustné katalasy z H. polymorpha (která je inhibována AMPA), jako katalyzátoru. Výtěžky glyoxylové kyseliny a kyseliny mravenčí, kterých bylo dosaženo za reakčních podmínek optimálních pro tvorbu kyseliny glyoxylové (tyto podmínky jsou popsány v dále uvedených příkladech) jsou uvedeny v následující tabulce. Výtěžky kyseliny glyoxylové produkované za použití DEAMPA byly vyšší než výtěžky dosažené za použití AMPA, at již bylo použito rozpustné katalasy z A. niger nebo H. polymorpha.

Zlepšení výtěžku glyoxylátu při nízkých koncentracích katalasy z A. niger je možno vysvětlit nižší hodnotou pK_aDEAMPA-protonovaného aminu (pK_a asi 6,4) ve srovnání s AMPA (pK_a 10,8). Nižší hodnota pK_a v případe DEAMPA upřednostňuje tvorbu oxidačně odolného hemiaminalového nebo iminového komplexu neprotonovaného diethylaminomethylfosfonátu (DEAMPA) s kyselinou glyoxylovou při hodnotách pH, při nichž byly reakce prováděny (pH 8,3 až 8,5).

Amin Zdroj katalasy

Konc. katalasy (m.j./ml)

Obsah glyoxylátu (%)

Obsah formiátu (%)

AMPA	A. niger	1	400	70	20
AMPA	A. niger	14	000	92	2
DEAMPA	A. niger	1	400	95	4
DEAMPA	A. niger	14	000	97	1
AMPA	H. polymorpha	5	600	43	45
AMPA	H. polymorpha	14	000	64	24
AMPA	H. polymorpha	56	000	68	6
DEAMPA	H. polymorpha	1	400	84	12
DEAMPA	H. polymorpha	14	000	98	1

Z porovnání výtěžku glyoxylátu a tvorby formiátu při reakcích, při nichž bylo použito bud DEAMPA nebo AMPA a rozpustné katalasy z H. polymorpha (viz tabulka uvedená výše) ilustruje neočekávané a významné zvýšení výtěžku glyoxylátu a snížení tvorby formiátu za použití DEAMPA jako aminové přísady. Pro dosažení vyšších výtěžků glyoxylátu za použití DEAMPA je možno použít podstatně nižších koncentrací rozpustné katalasy z H. polymorpha. Při zvýšení koncentrace stejné katalasy za použití AMPA se nedosáhlo výtěžků glyoxylátu, které by byly srovnatelné s výtěžky dosaženými s DEAMPA. Podobného zlepšení výtěžku glyoxylátu a snížení tvorby formiátu bylo dosaženo také za použití transformantů H. polymorpha nebo P. pastoris, jako katalyzátoru, při nahrazení aminomethylfosfonové kyseliny diethylaminofosfonátem (viz dále uvedené příklady).

Následuje popis přednostních provedení vynálezu.

Katalytická oxidace glykolové kyseliny se účelně provádí tak, že se glykolová kyselina uvádí do styku se zdrojem molekulárního kyslíku za přítomnosti enzymatického katalyzátoru, který katalýzuje reakci glykolové kyseliny s kyslíkem za vzniku glyoxylové kyseliny. Jedním takovým katalyzátorem je enzym glykolát oxidasa (EC 1.1.3.15), který je též znám pod označením kyselina glykolová oxidasa. Glykolát oxidasa se může izolovat z četných zdrojů, které jsou v tomto oboru dobře známy (viz výše). Glykolát oxidasa, které se při reakci používá, by měla být přítomna v účinné koncentraci, obvykle v koncentraci od asi 0,01 do asi 1000 m.j./ml, přednostně od asi 0,1 do asi 10 m.j./ml. Jednotka m.j. (mezinárodní jednotka) je definována jako množství enzymu katalýzu jící transformaci 1 μιηοΐ substrátu za minutu. Způsob stanovení tohoto enzymu je popsán v I. Zelitch a S. Ochoa [J. Biol. Chem., sv. 201, str. 707 - 718 (1953)]. Této metody se také používá pro stanovení aktivity regenerované nebo recyklované glykolát oxidasy.

Optimálních výsledků za použití glykolát oxidasy, jako katalyzátoru oxidační konverse kyseliny glykolové na kyselinu glyoxylovou, se dosahuje, když se do reakčního roztoku přidá katalyzátor rozkladu peroxidu vodíku. Jedním takovým katalyzátorem, který způsobuje rozklad peroxidu a který je účinný v kombinaci s glykolát oxidasou, je enzym katalasa (E.C.1.11.1.6). Katalasa katalyzuje rozklad peroxidu vodíku na vodu a kyslík a předpokládá se, že příčinou zlepšení výtěžků glyoxylové kyseliny při způsobu podle vynálezu, je urychlení rozkladu peroxidu vodíku vznikajícího jako vedlejší produkt spolu s glyoxylovou kyselinou při glykolát oxidasou katalyzované reakci glykolové kyseliny s kyslíkem. Koncentrace katalasy by měla být v rozmezí od 50 do 50000 m.j./ml, přednostně 2000 až 15000 m.j./ml.

Koncentrace katalasy a glykolát oxidasy se přednostně nastavují na hodnoty ležící ve výše uvedených rozmezích tak, aby poměr (v němž je množství každého enzymu vyjádřeno v m.j.) katalasy ke glykolát oxidase byl přinejmenším asi 250:1.

Kromě rozpustných enzymů lze jako katalyzátorů použít mikrobiálních transformantů, které exprimují glykolát oxidasovou aktivitu současně s endogenní katalasovou aktivitou. Tak lze jako mikrobiálního buněčného katalyzátoru použít podle vynálezu transformované methylotrofní kvasinky Hansenula polymorpha. Bylo připraveno několik transformantů H. polymorpha s dostatečnou glykolát oxidasovou aktivitou insercí DNA pro glykolát oxidasu do expresního vektoru, kde je pod kontrolou formiát dehydrogenasového (FMD) promotoru. Hansenula polymorpha byla transformována tímto vektorem a vybraný kmen produkující glykolát oxidasu na vysoké úrovni byl označen názvem H. polymorpha G01.

Buněčné katalyzátory na bázi Hansenula polymorpha se typicky vyrábějí tak, že se nejprve napěstuje inokulum transformantů H. polymorpha v 500 ml YPD (Difco) při pH

4,4. Vzniklou kulturou se potom zaočkuje 10 litrů kvasinkové dusíkaté báze (YNB, Difco) ve fermentoru. Použité médium obsahuje 14 g aminokyselin, 50 g síranu amonného a 100 g methanolu a má pH 5,0. Fermentor se provozuje při 37°C, frekvenci míchání 400 min”¹, konstantní hodnotě pH 5,0 za přítomnosti 40 % rozpuštěného kyslíku (tato hodnota se reguluje) a za přetlaku vzduchu 96 kPa po dobu 42,5 hodiny.

Na závěr fermentace se do fermentoru přidá 1,0 kg glycerolu a buňky se odstředí, zmrazí v kapalném dusíku a skladují při -80°C.

Jako druhého mikrobiálního buněčného katalyzátoru je možno podle vynálezu použít transformované methylotrofní kvasinky Pichia pastoris, která exprimuje enzym glykolát oxidasu ze špenátu spolu s endogenní katalasou. Bylo zhotoveno několik transformantů Pichia pastoris s dostatečnou glykolát oxidasovou aktivitou vložením fragmentu DNA obsahujícího gen špenátové glykolát oxidasy do expresního vektoru pro Pichia pastoris (pHIL-D4) tak, aby zde byl pod kontrolou alkohol oxidasového promotoru I (který je indukovatelný methanolem) za vzniku plasmidu pMPl. Plasmidem pMPl byl potom transformován kmen Pichia pastoris GTS115 (NRRL Y-15851) a byla provedena selekce pro umožnění integrace linearizovaného plasmidu pMPl do chromosomálního alkohol oxidasového místa I a nahrazení alkohol oxidasového genu glykolát oxidasovým genem. Směs takových transformantů byla dále selektována na maximální počet integrovaných kopií expresní kazety. Byl izolován transformant s vysokým počtem kopií a tento transformant byl označen názvem Pichia pastoris kmen GS115-MSP10 a uložen ve sbírce mikroorganismů NRRL, Peoria, Illinois, USA 24. září 1992 pod přírůstkovým číslem NRRL Y-21001.

Buňky P. pastoris je přitom možno obecně získat následujícím postupem; napěstuje se inokulum ve 100 ml YNB s obsahem 1 % glycerolu. Po 48 hodinách růstu při 30’C se buňky převedou do fermentoru obsahujícího 10 litrů média, které se skládá z kvasinkové dusíkaté báze (YNB obsahující w/o 134 g aminokyselin, 100 g glycerolu a 20 mg biotinu). Fermentace se provádí při pH 5,0 (které se reguluje hydroxidem amonným) teplotě 30°C za míchání při frekvenci otáčení 200 min“¹, zavzdušňování (5 Nl/min) vzduchem o tlaku 34 kPa, přičemž rozpuštěný kyslík se udržuje na hodnotě odpovídající alespoň 50 % rovnovážného nasycení. Po vyčerpání glycerolu se buňky indukují pro expresi glykolát oxidasy tak, že se nechají růst ve stejném médiu pouze s tím rozdílem, že se glycerol vymění za methanol (50 g). Glykolát oxidasová aktivita se během indukce sleduje enzymatickým stanovením. Po 24 hodinách indukce, po níž následuje zpracování glycerolem (1 kg), se buňky sklidí. Potom se buňky zmrazí v kapalném dusíku a skladují při -80°C.

Aby se mohlo transformovaných buněk H. polymorpha a P. pastoris použít jako katalyzátorů oxidace kyseliny glykolové na kyselinu glyoxylovou, je zapotřebí je předem permeabilizovat. Pro výrobu buněk s dostatečnou glykolát oxidasovou aktivitou lze použití různých známých metod permeabilizace (viz Felix Η. , Anal. Biochemistry, sv. 120, 211 až 234 (1982)). Obvykle se při tomto postupu suspenze vlhkých buněk (o hmotnostní koncentraci 10 %) míchá v 0,1% (objemově) roztoku smáčedla Triton X-100 ve 20mM fosfátovém pufru o pH 7,0 po dobu 15 minut, potom se zmrazí v kapalném dusíku, nechá roztát a promyje 20mM fosfátovým/0,lmM FMN pufrem (o pH 7,0). Při druhém permeabilizačním postupu se suspenze vlhkých buněk (o koncentraci 10 % hmotnostních) v roztoku benzalkoniumchloridu (o koncentraci 2 g/litr) ve 20mM fosfátovém pufru o pH 7,0 míchá po dobu 60 minut a potom se permeabilizované buňky promyjí 20mM fosfátovým/O,lmM FMN pufrem (o pH 7,0). Množství permeabilizovaného celobuněčného katalyzátoru, které se přidává k reakční směsi, se volí tak, aby se dosáhlo potřebné koncentrace glykolát oxidasové a katalasové aktivity, která je popsána výše pro odpovídající rozpustné enzymy. Regenerace glykolát oxidasové a katalasové aktivity nad 100 % jejich počáteční hodnoty je způsobena zvýšením permeabilizace celobuněčného katalyzátoru v průběhu reakce.

Mikrobiální buněčné transformanty se zkoušejí na glykolát oxidasovou aktivitu následujícím způsobem: do 3ml kyvety z křemenného skla obsahující magnetickou míchací tyčinku a 2,0 ml roztoku obsahujícího 2,6-dichlorfenolindofenol (DCIP) v koncentraci 0,12mM a TRIS pufr o koncentraci 80mM (pH 8,3) se přesně naváží asi 5 až 10 mg vlhkých buněk (z nichž byl na filtračním papíře odsát nadbytek vlhkosti). Kyveta se uzavře kaučukovým uzávěřem a roztok se zbaví kyslíku pětiminutovým probubláváním dusíkem. Potom se do kyvety injekční stříkačkou přidá 40 μΐ l,0M kyseliny glykolové v l,0mM TRIS pufru o pH 8,3 a směs se míchá, přičemž se měří změna absorpce při 605 nm (e =

000) v závislosti na čase.

Aktivita katalasy se stanovuje následujícím způsobem: do 3ml kyvety z křemenného skla obsahující magnetickou míchací tyčinku a 2,0 ml destilované vody se přidá 1,0 ml 59mM roztoku peroxidu vodíku v 50mM fosfátovém pufru o pH 7,0 a měří se změna absorpce při 240 nm (e = 39,4) na čase. Aktivita glykolát oxidasy a katalasy ve vlhkých (permeabilizovaných) buňkách H. polymorpha a P. pastoris kultitovaných v různých médiích leží v rozmezí od 20 do 120 DCIP m.j./g vlhkých buněk (pro glykolát oxidasu) a v rozmezí od 30 000 do 200 000 m.j./g vlkých buněk (pro endogenní katalasu).

Případnou, ale často prospěšnou přísadou k reakční směsi je flavinmononukleotid (FMN), kterého se obvykle používá v koncentraci až do asi 2,0mM, přednostně asi 0,01 až asi 0,2mM. Předpokládá se, že FMN zvyšuje produktivitu glykolát oxidasy, čímž je míněno množství glykolové kyseliny převedené na glyoxylovou kyselinu, vztažené na jednotku enzymu. Uváděná koncentrace přidaného FMN představuje přídavnou koncentraci FMN k množství FMN, které je popřípadě do reakčního systému zavedeno spolu s enzymem (FMN se totiž často přidává k enzymu v průběhu jeho přípravy). Struktura FMN a způsob jeho analýzy jsou popsány v K. Yagai, Methods of Biochemical Analysis, sv. X, Interscience Publishers, New York, 1962, Str. 319 - 355.

Konverze glykolové kyseliny na glyoxylovou kyselinu se účelně a přednostně provádí ve vodných prostředích. Glykolová kyselina (kyselina 2-hydroxyoctová) je obchodně dostupná. Při reakci podle vynálezu leží její počáteční koncentrace v rozmezí od 0,10 do 2,0, přednostně od 0,25 do l,0M. Může se jí používat jako takové nebo ve formě kompatibilní soli, tj. soli, která je rozpustná ve vodě a jejíž kation nenarušuje požadovanou konverzi glykolové kyseliny na glyoxylovou kyselinu nebo následující reakci získané glyoxylové kyseliny s dialkylaminomethylfosfonátem, kterou se připravuje N-(fosfonomethyl)glycin. Vhodná kompatibilní solitvorná kationtová skupina se snadno může zjistit pokusně. Jako reprezentativní příklady vhodných solí je možno uvést soli alkalických kovů, kovů alkalických zemin, amonné soli, substituované amoniové soli, fosfoniové soli a substituované fosfoniové soli.

Dialkylaminomethylfosfonáty, kterých se používá podle vynálezu mají strukturu odpovídající obecnému vzorci

11/ ox h₉n-ch₉-p \

OY kde každý ze symbolů X a Y nezávisle představuje alkylskupinu, jako je methylskupina, ethylskupina, propylskupina, isopropylskupina atd. tak, aby byl výsledný dialkylaminomethylfosfonát z části nebo úplně rozpustný ve vodné reakční směsi. Dialkylaminomethylfosfonát se přidává až do dosažení molárního poměru dialkylaminomethylfosfonát/glykolová kyselina (výchozí množství) v rozmezí od 0,01 do 3,0 přednostně od 0,25 do 1,05. Po smísení dialkylaminomethylfosfonátu s glykolovou kyselinou ve vodném roztoku se hodnota pH výsledné směsi nastaví na 6 až 10, přednostně

7,0 až 9,0. V tomto rozmezí pH se může přesná hodnota pH nastavit na požadovanou hodnotu přídavkem jakékoliv kompatibilní neinterferující báze, jako je hydroxid, uhličitan, hydrogenuhličitan a fosforečnan alkalického kovu. V průběhu reakce hodnota pH reakční směsi poněkud klesá, takže je často užitečné zahajovat reakci v blízkosti horní meze rozmezí pH, v němž má enzym maximální aktivitu, tj. při asi 9,0 až 8,5, aby mohla hodnota pH v průběhu reakce poklesnout. Hodnota pH se popřípadě také může udržovat separátním přidáváním neinterferujícího anorganického nebo organického pufru, poněvadž aktivita enzymu se mění s pH.

Je známo, že glykolová kyselina a glyoxylová kyselina je vysoce disociována ve vodě a při pH v rozmezí od 7 do 10 je převážně, pokud ne úplně, přítomna ve formě glykolátových či glyoxylátových iontů. Odborníkům v tomto oboru je také zřejmé, že glyoxylová kyselina (a konjugovaná báze, glyoxylátový anion) může být též přítomna v hydratované formě, například ve formě sloučeniny vzorce (HO)₂CHCOOH a/nebo ve formě hemiacetalu vzorce HOOCCH(OH)OCH(OH)COOH, kteréžto sloučeniny a jejich aniontové varianty jsou ekvivalentní glyoxylové kyselině a jejímu aniontu v tom smyslu, že jsou vhodnými reakčními složkami pro tvorbu N-(fosfonomethyl)glycinu. Podobně může být i dialkylaminomethylfosfonát z části nebo úplně přítomen ve formě protonovaného aminového kationtu, přičemž jako protion může být přítomen jeden nebo více protiiontů zvolených ze souboru vhodných aniontů přítomných v reakční směsi.

Kyslík (O₂), tj . oxidační činidlo pro konverzi glykolové kyseliny na glyoxylovou kyselinu, se může k reakční směsi přidávat v plynné formě tak, že se kapalná fáze míchá na fázovém rozhraní plyn-kapalina nebo se může zavádět prostřednictvím membrány propustné pro kyslík. Předpokládá se, že za většiny podmínek je reakční rychlost přinejmenším zčásti kontrolována rychlostí, kterou se kyslík rozpouští ve vodném prostředí. Přestože se tedy může kyslík přidávat do reakční směsi ve formě vzduchu, přednostně se používá kyslíku v poměrně čisté formě a dokonce se pracuje za zvýšených tlaků. Ačkoliv neexistuje žádná horní hranice tlaku kyslíku, je možno uvést, že lze používat tlaku kyslíku až do 5 MPa, přičemž přednostní horní hranice tlaku kyslíku je

1,5 MPa. Míchání je důležité pro zajištění vysokého stupně rozpouštění kyslíku a tedy vysoké reakční rychlosti. Může se použít jakékoliv vhodné formy míchání, jako například míchání rotačním míchadlem. Na druhé straně, jak je dobře známo odborníkům v oboru enzymů, mohou vysoké střižné síly při míchání nebo míchání s vysokou tvorbou pěny mít za následek snížení aktivity rozpustného enzymu nebo enzymů a pokud se používá rozpustných enzymů, je zapotřebí se mu vyhnout.

Reakční teplota je důležitou proměnnou, poněvadž ovlivňuje reakční rychlost a stabilitu enzymů. Může se pracovat při reakční teplotě od o do 40°C, ale přednostní rozmezí reakční teploty je 5 až 15°C. Jestliže se pracuje v přednostním teplotním rozmezí, maximalizuje se regenerovaná aktivita enzymu na konci reakce. Teplota by neměla být tak nízká, aby vodný roztok začal mrznout. Teplotu lze regulovat běžnými metodami jako například tím, že se pracuje v duplikátorové reakční nádobě a duplikátorovým pláštěm se vede teplosměnná kapalina o vhodné teplotě. Reakční nádoba může být zhotovena z jakéhokoliv materiálu, který je inertní vůči reakčním složkám.

Po skončení reakce se mohou rozpustné enzymy oddělit filtrací nebo odstřeďováním a mohou se recirkulovat. Alternativně se mohou denaturovat a vysrážet zahřátím, například pětiminutovým zahříváním na 70 °C a/nebo se mohou ponechat v reakční směsi, pokud jejich přítomnost při násle15 dujících stupních konverze na N-(fosfonomethyl)glycin a izolace N-(fosfonomethyl)glycinu z reakční směsi není na závadu. Mikrobiální buněčné transformanty je možno pro recirkulaci oddělovat filtrací nebo centrifugací.

Po ukončení kontaktu reakčního roztoku s kyslíkem a přednostně po odstranění rozpustných enzymů nebo celobuněčných katalyzátorů se může popřípadě odstranit z reakční směsi flavinmononukleotid (FMN) tím, že se roztok uvede do styku s aktivním uhlím.

Výsledné směsi obsahující glyoxylovou kyselinu a dialkylaminomethylfosfonát (o nichž se předpokládá, že jsou v rovnováze s odpovídajícím hemiaminalem a iminem) se zpracovávají jakýmkoliv vhodným způsobem, který je znám v tomto oboru pro výrobu N-(fosfonomethyl)glycinu.

Katalytická hydrogenace směsi kyseliny glyoxylové a dialkylaminomethylfosfonátu a následná hydrolýza vzniklého N-(dialkoxyfosfinylmethyl)glycinu představuje přednostní metodu pro přípravu N-(fosfonomethyl)glycinu ze směsi glyoxylové kyseliny a dialkylaminomethylfosfonátu. Hydrogenační katalyzátory, které jsou vhodné pro tento účel zahrnují (uvedený výčet není omezující) různé kovy ze skupiny platiny, jako je iridium, osmium, rhodium, ruthenium, platina a paladium a také různé jiné přechodové kovy, jako je kobalt, měď, nikl a zinek. Katalyzátor může být čistý (tj. bez nosiče), například Raneyův nikl nebo oxid platiny nebo může být nanesen na nosiči, jako například platina na uhlíku, paladium na oxidu hlinitém nebo nikl na křemelině. Přednost se dává paladiu na uhlíku, niklu na křemelině a Raneyovu niklu.

Hydrogenace se může provádět při pH v rozmezí od 4 do 11, přednostně od 5 do 10. Hydrogenační teplota a tlak mohou kolísat v širokých mezích. Teplota může být obecně v rozmezí od 0 do 150, přednostně od 20 do 90°C, zatímco tlak vodíku leží obvykle v rozmezí přibližně od tlaku atmosférického do asi 10 MPa, přednostně od 0,1 do 1,0 MPa.

N-(Dialkyloxyfosfinylmethyl)glycin vyrobený hydrogenací směsi glyoxylové kyseliny s dialkylaminomethylfosfonátem se může hydrolyzovat na N-(fosfonomethyl)glycin přídavkem nadbytku kyseliny chlorovodíkové nebo kyseliny bromovodíkové k vodné produkční směsi z hydrogenačního stupně a zahříváním vzniklé směsi. N-(fosfonomethyl)glycin, který je užitečný jako postemergentní herbicid, se může izolovat z výsledné směsi libovolným způsobem izolace známým v tomto oboru.

V následujících příkladech, které mají za úkol dále objasnit vynález, aniž by jej omezovaly, jsou výtěžky glyoxylátu, formiátu a oxalátu a regenerovaného glykolátu uváděny v procentech, vztažených na celkové množství glykolové kyseliny přítomné na počátku reakce. Analýzy reakční směsi se provádějí za použití vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC) za použití sloupce Bio-Rad HPX-87H pro analýzu organických kyselin.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Do 85ml Fischer-Porterovy skleněné aerosolové reakční nádoby se umístí magnetická míchací tyčinka a 10 ml vodného roztoku obsahujícího glykolovou kyselinu (0,25M), aminomethylfosfonovou kyselinu (AMPA, 0,263M), FMN (0,01mM), kyselinu propionovou (vnitřní standard pro HPLC, 0,125M), glykolát oxidasu (ze špenátu, 1,0 m.j./ml) a rozpustnou katalasu (z Aspergillus niger, 1400 m.j./ml) při pH 8,5.

Reakční nádoba se uzavře, směs uvnitř se ochladí na 15°C a potom se nádoba propláchne kyslíkem tím, že se uvede kyslík až do tlaku 481 kPa a potom se tlak uvolní na tlak atmosférický, přičemž tento postup se provádí za míchání a opakuje se 5x. Potom se do nádoby uvede znovu kyslík až do tlaku 481 kPa a směs se míchá při 15°C. Vzorkovacím otvorem se z nádoby injekční stříkačkou odebírají alikvotní vzorky (0,10 ml) (bez poklesu tlaku v nádobě) v pravidelných intervalech a tyto vzorky se analyzují HPLC, za účelem sledování postupu reakce. Po 5 hodinách reakce ukazuje HPLC obsah glyoxylátu 70,4 %, formiátu 19,6 % a oxalátu 2,2 % a obsah zbývajícího glykolátu 5,3 %. Zbytková aktivita glykolát oxidasy je 27 % a katalasy 100 % jejich počáteční hodnoty.

Příklad 2

Opakuje se reakce popsaná v příkladu 1 za použití vodného roztoku obsahujícího kyselinu glykolovou (0,500M), AMPA (0,500M), FMN (0,01mM), kyselinu isomáselnou (vnitřní standard pro HPLC, 0,100M), špenátovou glykolátoxidasu (1,0 m.j./ml) a rozpustnou katalasu z Aspergillus niger (14000 m.j./ml) při pH 8,5 a teplotě 5’C. Po 21 hodinách reakce ukazuje HPLC obsah glyoxylátu 85,2 %, formiátu 1,5 % a oxalátu 3,3 % a obsah zbývajícího glykolátu 5,5 %.

Zbytková aktivita glykolát oxidasy je 49 % a katalasy 93 % jejich původní hodnoty.

Příklad 3

Opakuje se reakce popsaná v příkladu 1 za použití vodného roztoku obsahujícího kyselinu glykolovou (0,500M), AMPA (0,375M), FMN (0,01mM), kyselinu isomáselnou (vnitřní standard pro HPLC, 0,100M), špenátovou glykolát oxidasu (1,0 m.j./ml) a rozpustnou katalasu z Aspergillus niger, Saccha18 romyces cerevisiae, hovězích jater nebo Hansenula polymorpha (14000 m.j./ml) při pH 8,5 a teplotě 5’C. Po 21 hodinách reakce ukazuje HPLC obsah glyoxylátu 85,2 %, formiátu 1,5 % a oxalátu 3,3 % a obsah zbývajícího glykolátu 5,5 %.

Zbytková aktivita glykolát oxidasy je 49 % a katalasy 93 % jejich původní hodnoty. Reakční doba, výtěžky regenerované aktivity katalasy a glykolát oxidasy, jakož i výtěžky kyseliny glyoxylové, kyseliny mravenčí, kyseliny šťavelové a kyseliny glykolové jsou uvedeny v následující tabulce:

Rozpustná	Doba	Katalasa	Glykolát	Kyselina gly-	Kyselina	Kyselina	Kyselina
katalasa	(h)	(*)	oxidasa (?)	oxylová (?)	mravenčí (?)	šťavelová (?)	glykolová
A. niger	19	81	39	92,1	1,9	4,7	1,8
S. cerevisiae	18	59	37	94,2	2,6	0	3,0
hovězí játra	18	34	27	40,0	51,4	2,5	5,3
B. polymorpha	19	75	46	64,3	23,7	4,0	2,7

Příklad 4

Opakuje se reakce podle příkladu 3 při 15°C za použití rozpustné katalasy (14 000 m.j./ml) z Aspergillus niger nebo Hansenula polymorpha. Reakční doba, výtěžky regenerované aktivity katalasy a glykolát oxidasy, jakož i výtěžky kyseliny glyoxylové, kyseliny mravenčí, kyseliny šťavelové a kyseliny glykolové jsou uvedeny v následující tabulce:

Rozpustná Doba Katalasa Glykolát Kyselina gly- Kyselina Kyselina Kyselina katalasa (h) (i) oxidasa (I) oxylová (?) mravenči (i) šťavelová (?) glykolová (?)

A. niger 20 84 12 87,3 1,8 2,7 8,2

H. polymorpha 20 64 17 62,0 27,9 2,9 4,7

Příklad 5

Opakuje se reakce podle příkladu 3 za použití rozpustné katalasy (5 600, 14 000 nebo 56 000 m.j./ml) z Hansenula polymorpha. Reakční doba, výtěžky regenerované aktivity katalasy a glykolát oxidasy, jakož i výtěžky kyseliny glyoxylové, kyseliny mravenčí, kyseliny šťavelové a kyseliny glykolové jsou pro všechny tři koncentrace uvedeny v následující tabulce:

Katalasa z H.	Doba	Katalasa	Glykolát	Kyselina gly-	Kyselina	Kyselina	Kyselina
polymorpha (m.j./ml)	(h)	(*)	oxidasa (?)	oxylová (?)	mravenčí (?)	šťavelová (?)	glykolová
5 600	22	48	25	42,9	44,5	0,0	1,6
14 000	20	64	17	62,0	27,9	2,9	4,7
56 000	22	12	14	68,4	6,3	2,4	6,5

Příklad 6

Opakuje se reakce popsaná v příkladu 1 za použití vodného roztoku obsahujícího kyselinu glykolovou (0,500M), diethylaminomethylfosfonát (DEAMPA, 0,398M), FMN (0,01mM), kyselinu isomáselnou (vnitřní standard pro HPLC, 0,100M), špenátovou glykolát oxidasu (1,0 m.j./ml) a rozpustnou katalasu z Aspergillus niger (14000 m.j./ml) při pH 8,5 a teplotě 5°C. Po 20 hodinách reakce ukazuje HPLC obsah glyoxylátu 97,4 %, formiátu 0,8 % a oxalátu 1,8 % a obsah zbývajícího glykolátu je nulový. Zbytková aktivita glykolát oxidasy je 10 % a katalasy 95 % jejich původní hodnoty.

Příklad 7

Opakuje se reakce popsaná v příkladu 6 za použití vodného roztoku obsahujícího kyselinu glykolovou (0,500M), DEAMPA (0,525M), FMN (Ο,ΟΙιηΜ), kyselinu isomáselnou (vnitřní standard pro HPLC, 0,100M), špenátovou glykolát oxidasu (1,0 m.j./ml) a rozpustnou katalasu z Aspergillus niger (14000 m.j./ml) při pH 8,5. Po 23 hodinách reakce ukazuje HPLC obsah glyoxylátu 95,3 %, formiátu 3,9 % a oxalátu 1,5 % a obsah zbývajícího glykolátu je nulový. Zbytková aktivita glykolát oxidasy je 12 % a katalasy 100 % jejich původní hodnoty.

Příklad 8

Opakuje se reakce podle příkladu 7 za použití DEAMPA (0,525M) a rozpustné katalasy (1 400 nebo 14 000 m.j./ml) z Hansenula polymorpha. Reakční doba, výtěžky regenerované aktivity katalasy a glykolát oxidasy, jakož i výtěžky kyseliny glyoxylové, kyseliny mravenčí, kyseliny štavelové a kyseliny glykolové jsou uvedeny v následující tabulce:

Katalasa z B. Doba Katalasa Glykolát Kyselina gly- Kyselina Kyselina Kyselina polymorpha (h) (S) oxidasa (i) oxylová (i) mravenčí (I) štávelová (i) glykolová (i) (m.j./ml)

400 10 76 31 84,2 11,5 0,6 2,3

000 10 79 38 98,2 1,3 0,4 2,8

Příklad 9

Do 85ml Fischer-Porterovy skleněné aerosolové reakční nádoby se umístí magnetická míchací tyčinka a 10 ml vodného roztoku obsahujícího glykolovou kyselinu (0,500 aminomethylfosfonovou kyselinu (AMPA, 0,375M), kyselinu isomáselnou (vnitřní standard pro HPLC, 0,100M) a flavinmononukleotid (FMN, 0,01mM) o pH 8,3 (hodnota pH se nastaví 50% roztokem hydroxidu sodného) a roztok se ochladí na 5°C. Potom se do baňky přidá 0,47 g transformantu Hansenula polymorpha GO1 (10 m.j. glykolát oxidasy a 22 100 m.j. katalasy), který byl předem premeabilizován zpracováním s 0,1% roztokem smáčedla TRITON X-100 a jedním cyklem zmrazení tání. Potom se reakční nádoba uzavře a reakční směs se uchladí na 5°C. Nádoba propláchne kyslíkem tím, že se uvede kyslík až do tlaku 481 kPa a potom se tlak uvolní na tlak atmosférický, přičemž tento postup se provádí za míchání a opakuje se 5x. Potom se do nádoby uvede znovu kyslík až do tlaku 481 kPa a směs se míchá při 5°C. Vzorkovacím otvorem se z nádoby injekční stříkačkou odebírají alikvotní vzorky (0,10 ml) (bez poklesu tlaku v nádobě) v pravidelných intervalech a tyto vzorky se analyzují HPLC, za účelem sledování postupu reakce. Po 16 hodinách reakce ukazuje HPLC obsah glyoxylátu 57,6 %, formiátu 32,5 % a oxalátu 2,6 % a obsah zbývajícího glykolátu 8,9 %. V permeabilizovaných buňkách je zbytková aktivita glykolát oxidasy 60 % a katalasy 378 % jejich počáteční hodnoty.

Příklad 10

Opakuje se reakce popsaná v příkladu 9 pouze s tím rozdílem, že se k reakční směsi také přidá rozpustná katalasa z Aspergillus niger (14000 m.j./ml). Po 16 hodinách reakce ukazuje HPLC obsah glyoxylátu 90,1 %, formiátu 1,3 % a oxalátu 5,9 % a obsah zbývajícího glykolátu 3,0 %. Zbytková aktivita glykolát oxidasy je 86 % a katalasy 136 % jejich původní hodnoty.

Příklad 11

Opakuje se reakce popsaná v příkladu 9 pouze s tím rozdílem, že se místo transformantu Hansenula polymorpha použije 0,75 g transformantu Pichia pastoris MSP10 (13,2 m.j glykolát oxidasy a 21 200 m.j. katalasy), který byl předem premeabilizován zpracováním s 0,1% roztokem smáčedla TRITON X-100 a jedním cyklem zmrazení - tání. Po 16 hodinách reakce ukazuje HPLC obsah glyoxylátu 30,5 %, formiátu 59,2 % a oxalátu 10,7 % a obsah zbývajícího glykolátu 0,8 %.

Příklad 12

Do 85ml Fischer-Porterovy skleněné aerosolové reakční nádoby se umístí magnetická míchací tyčinka a 10 ml vodného roztoku obsahujícího glykolovou kyselinu (0,500 DEAMPA (0,525M), kyselinu isomáselnou (vnitřní standard pro HPLC, 0,100M) a flavinmononukleotid (FMN, 0,01mM) o pH

8,3 (hodnota pH se nastaví 50% roztokem hydroxidu sodného) a roztok se ochladí na 5°C. Potom se do baňky přidá 1,5 g transformantu Hansenula polymorpha GO1 (8,0 m.j. glykolát oxidasy a 38 000 m.j. katalasy), který byl předem premeabilizován zpracováním s 0,1% roztokem smáčedla TRITON X-100 a jedním cyklem zmrazení - tání. Potom se reakční nádoba uzavře a reakční směs se uchladí na 5°C. Nádoba propláchne kyslíkem tím, že se uvede kyslík až do tlaku 481 kPa a potom se tlak uvolní na tlak atmosférický, přičemž tento postup se provádí za míchání a opakuje se 5x. Potom se do nádoby uvede znovu kyslík až do tlaku 481 kPa a směs se míchá při 5°C. Vzorkovacím otvorem se z nádoby injekční stříkačkou odebírají alikvotní vzorky (0,10 ml) (bez poklesu tlaku v nádobě) v pravidelných intervalech a tyto vzorky se analyzují HPLC, za účelem sledování postupu reakce. Po 9 hodinách reakce ukazuje HPLC obsah glyoxylátu 98,4 %, formiátu 0 a oxalátu 2,0 % a obsah zbývajícího glykolátu je nulový. V permeabilizovaných buňkách je zbytková aktivita glykolát oxidasy 63 % a katalasy 250 % jejich počáteční hodnoty.

Příklad 13

Opakuje se reakce popsaná v příkladu 12 za použití směsi obsahující kyselinu glykolovou (0,500M), AMPA (0,525 Μ), kyselinu isomáselnou (vnitřní standard pro HPLC, Ο,ΙΟΟΜ), flavinmononukleotid (0,01mM) a 0,72 g transformantu Hansenula polymorpha G01 (43,0 m.j. glykolát oxidady a 39,880 m.j. katalasy), který byl předem permeabilizován zpracováním 0,2% benzalkoniumchloridem (Lonza Barquat OJ-50) při pH 8,3 (hodnota pH se nastavuje 50% roztokem hydroxidu sodného) a 5’C. Po 1 hodině reakce ukazuje HPLC obsah glyoxylátu 50,2 %, formiátu 48,4 % a oxalátu 1,2 % a obsah zbývajícího glykolátu 2,2 %. V permeabilizovaných buňkách je zbytková aktivita glykolát oxidasy 95 % a katalasy 105 % jejich počáteční hodnoty.

Příklad 14

Opakuje se reakce popsaná v příkladu 13 buď za použití AMPA (0,375M) nebo DEAMPA (0,375M), jako aminové přísady. Reakční doba, výtěžky regenerované aktivity katalasy a glykolát oxidasy, jakož i výtěžky kyseliny glyoxylové, kyseliny mravenčí, kyseliny štavelové a kyseliny glykolové jsou uvedeny v následující tabulce:

Amin Doba Katalasa Glykolát Kyselina gly- Kyselina Kyselina Kyselina (h) (í) oxidasa (t) oxylová (1) mravenčí (l) šťavelová (i) glykolová (1)

AMPA 5 99 54 42,7 47,3 10,7 4,7

DEAMPA 1 122 108 83,5 15,5 5,6 0,0

Příklad 15

Opakuje se reakce popsaná v příkladu 12 za použití směsi obsahující kyselinu glykolovou (0,500M), AMPA (0,375M) nebo DEAMPA (0,375M), kyselinu isomáselnou (vnitřní standard pro HPLC, Ο,ΙΟΟΜ), flavinmononukleotid (0,01mM) a 0,23 g transformantu Pichia pastoris GS115-MSP10 (12,3 m.j. glykolát oxidady a 39 420 m.j. katalasy), který byl předem permeabilizován zpracováním 0,2% benzalkoniumchloridem (Lonza Barquat OJ-50) při pH 8,3 (hodnota pH se nastavuje 50% roztokem hydroxidu sodného) a 5’C. Reakční doba, výtěžky regenerované aktivity katalasy a glykolát oxidasy, jakož i výtěžky kyseliny glyoxylové, kyseliny mravenčí, kyseliny šiavelové a kyseliny glykolové jsou uvedeny v následující tabulce:

Amin Doba Katalasa Glykolát Kyselina gly- Kyselina Kyselina Kyselina (h) (i) oxidasa (t) oxylová (i) mravenčí (() šťavelová (í) glykolová (i)

AMPA 4 130 214 59,7 36,2 4,3 1,5

DEAMPA 1 124 268 92,9 3,6 3,9 0,0

Příklad 16

Opakuje se reakce popsaná v příkladu 15 bud za použití AMPA (0,525M) nebo DEAMPA (0,525M), jako aminové přísady. Reakční doba, výtěžky regenerované aktivity katalasy a glykolát oxidasy, jakož i výtěžky kyseliny glyoxylové, kyseliny mravenčí, kyseliny šřavelové a kyseliny glykolové jsou uvedeny v následující tabulce:

Amin Doba Katalasa Glykolát Kyselina gly- Kyselina Kyselina Kyselina (h) (I) oxidasa (I) oxylová (S) mravenčí (I) šťavelová (I) glykolové (J)

AMPA 1 130 246 58,2 34,6 3,6 1,9

DEAMPA 1 118 276 95,1 1,6 3,3 0,0

Příklad 17

Směs glyoxylové kyseliny (0,49M) a DEAMPA (0,525M) vyrobená ze směsi kyseliny glykolové (0,50M) a DEAMPA (0,525M) za použití mikrobiálního transformantu popsaného v příkladu 12, jako katalyzátoru, se přefiltruje za použití koncentračního zařízení Amicon Centriprep 10 (vylučovací mez molekulové hmotnosti 10 000), aby se odstranily rozpustné proteiny, k filtrátu se přidá 0,10 g aktivního uhlí, aby se odstranil FMN, směs se přefiltruje a filtrát se umístí do Fisher-Porterovy baňky o objemu 85 ml, která je vybavena magnetickou míchací tyčinkou. Potom se do této baňky přidá 0,100 g 10% palladia na uhlíku, baňka se uzavře, propláchne plynným dusíkem, uvede se do ní vodík do tlaku 344 kPa a směs se míchá při 25°C. Klesající tlak vodíku se vyrovnává dávkováním vodíku tak, aby se výsledný tlak udržoval na hodnotě 344 kPa. Po ustálení tlaku vodíku se reakce zastaví odvětráním a propláchnutím plynným dusíkem. K výslednému vodnému roztoku obsahujícímu N-(diethoxyfosfinylmethyl)glycin se přidá nadbytek koncentrované kyseliny chlorovodíkové a směs se zahřeje k varu, přičemž dojde k hydrolýze dialkylfosfonátového esteru. Výsledná směs se zkoncentruje a N(fosfonomethyl)glycin se izoluje krystalizací.

to cn glyoxylátu a dialkylamino-

Claims

PATENTOVÉ

1. Způsob výroby směsi methylfosfonátů, vyznačující se tím, že zahrnuje stupeň oxidace glykolátu kyslíkem ve vodném roztoku za přítomnosti dialkylaminomethylfosfonátu a enzymů glykolát oxidasy a katalasy.
2. Způsob výroby meziproduktu pro výrobu N-(fosfonomethyDglycinu, kterýžto meziprodukt zahrnuje směs obsahující glyoxylát a dialkylaminomethylfosfonát vyznačující se tím, že zahrnuje enzymatickou konverzi glykolátu na glyoxylát za přítomnosti dialkylaminomethylfosfonátu .
3. Způsob výroby N-(fosfonomethyl)glycinu, vyznačující se tím, že se

a) vyrobí směs glyoxylátu a dialkylaminomethylfosfonátu oxidací glykolátu kyslíkem ve vodném roztoku za přítomnosti dialkylaminomethylfosfonátu a enzymu glykolát oxidasy a katalasy a

b) směs vyrobená ve stupni a) se redukuje, na N-(dialkoxyfosf inylmethyl)glycinu a

c) N-(dialkoxyfosfinylmethyl)glycin vyrobený ve stupni b) se hydrolyzuje za vzniku N-(fosfonomethyl)glycinu.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i m , že se použije katalasy z Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris nebo hovězích jater.
5. Způsob podle nároku 2, vyznačující se t í m , že se enzymatická konverze glykolátu na glyoxylát provádí za přítomnosti enzymu glykolát oxidasy a katalasy, přičemž jako katalasy se použije katalasy z Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris nebo hovězích jater.
6. Způsob podle nároku 3, vyznačující se t i m , že se jako katalasy použije katalasy z Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris nebo hovězích jater.
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i m , že se katalasy a glykolát oxidasy použije ve formě celobuněčného mikrobiálního katalyzátoru zvoleného ze souboru zahrnujícího Hansenula polymorpha a Pichia pastoris.
8. Způsob podle nároku 2, vyznačující se t i m , že se enzymatická konverze glykolátu na glyoxylát provádí za přítomnosti enzymu glykolát oxidasy a katalasy, přičemž katalasy a glykolát oxidasy se použije ve formě celobuněčného mikrobiálního katalyzátoru zvoleného ze souboru zahrnujícího Hansenula polymorpha a Pichia pastoris.
9. Způsob podle nároku 3, vyznačující se t i m , že se katalasy a glykolát oxidasy použije ve formě celobuněčného mikrobiálního katalyzátoru zvoleného ze souboru zahrnujícího Hansenula polymorpha a Pichia pastoris.