CZ301378B6 - Lécivo pro lécení hepatocelulárního karcinomu - Google Patents

Abstract

Predkládané rešení je založeno na zjištení, že docetaxel je v koncentracích až do 1 .mi.mol znatelne úcinnejší proti bunkám hepatocelulárního karcinomu než paclitaxel. Proto predkládané rešení pojednává také o použití docetaxelu, nebo jeho hydrátu, k príprave léciva pro použití k lécení hepatocelulárního karcinomu.

Description

Léčivo pro léčení hepatocelulárního karcinomu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká léčiva pro léčení hepatocelulárního karcinomu.

Dosavadní stav techniky

Hepatocelulární karcinom (HCC) je v jihovýchodní Asii a v afrických zemích jedna z nejobvyklejších rakovin, V Taiwanu je hepatocelulární karcinom vůdčí příčinou úmrtí u mužských pacientů trpících rakovinou. Míra přežití pacientů s hepatocelulámím karcinomem je velmi nízká. Toto je způsobeno především nedostatkem účinné léčby. U ozařování a chemoterapie nebylo až dosud t5 prokázáno, že jsou uspokojivé; nejúčinnéjší léčbou pro hepatocelulární karcinom je léčba chirurgická. Chirurgická léčba je však vhodná pouze pro pacienty s malým resekovatelným nádorem.

Nedávno se obnovil zájem o antimitotická léčiva, jako je paclitaxel. Paclitaxel byl původně izolován z kůry tisu, Protinádorový účinek paclitaxelu je známý od roku 1971. Paclitaxel inhibuje dělení nádorových buněk pomocí svého působení na mikrotubulámí aparát. Analýzy in vitro s použitím nádorových buněk ukázaly, že paclitaxel zastavuje buňky hlavně v G2/M fázi buněčného cyklu (SchiffPB a Horwikz SB> Proč. Nati Acad Sci 77, 1561-1565, 1980). Nedávné studie ukázaly, že paclitaxel je účinný proti rozličným zhoubným nádorovým buňkám, jako jsou buňky mozkových nádorů, rakoviny žaludku a prostaty, rakoviny prsu, melanomu a rakoviny vaječníků.

Nicméně, paclitaxel není účinný proti hepatocelulární mu karcinomu. V British Journal of Cancer, 78 (1), 34-39, 1998 je popsána fáze II klinické studie paclitaxelu na pacientech s hepatocelulámím karcinomem. Závěrem tohoto článku je, že paclitaxel nemá znatelné protinádorové účinky u pacientů s hepatocelulámím karcinomem.

Jak je vysvětleno výše, bylo zjištěno, že cytotoxický účinek paclitaxelu je závislý na buněčném cyklu, a že k zastaveni buněčného cyklu dochází hlavně v G2/M fázi. Nyní však bylo zjištěno, že u docetaxelu lze dosáhnout cytotoxicity u buněk hepatocelulárního karcinomu nezávislé na buněčném cyklu. Toto ukazuje, že cytotoxického účinku docetaxelu na buňky hepatocelulárního karcinomu je dosaženo pomocí jiného mechanismu než u paclitaxelu. Dále je in vitro účinnost docetaxelu na buňky hepatocelulárního karcinomu je znatelně vyšší než účinnost paclitaxelu v koncentracích až do 1 gmol. Vzhledem k vysoce cytotoxické povaze taxoidů, ukazuje zvýšená účinnost při nízké koncentraci, že docetaxel, narozdíl od paclitaxelu, lze použít v praxi ke klinic40 kému léčení hepatocelulárního karcinomu.

US 5 670 536 popisuje farmaceutickou kompozici docetaxelu umožňující dosáhnout vysoké koncentrace účinné látky a vhodnou pro injekční podání, avšak nenaznačuje vhodné použití pro léčení hepatocelulárního karcinomu.

Podstata vynálezu

Proto předkládaný vynález pojednává o použití docetaxelu, nebo jeho hydrátu, k přípravě léčiva pro použití k léčení hepatocelulámiho karcinomu.

Předkládaný vynález se dále týká také způsobu léčení pacienta trpícího hepatocelulámím karcinomem, který zahrnuje podávání účinného množství docetaxelu, nebo jeho hydrátu, uvedenému pacientovi. Předkládaný vynález také pojednává o způsobu zlepšováni stavu pacienta trpícího

-1 CZ 301378 B6 hepatocelulámím karcinomem, který zahrnuje podávání účinného množství docetaxelu, nebo jeho hydrátu, uvedenému pacientovi.

Docetaxel je známá sloučenina. Její vzorec vypadá následovně:

t-Bu	znamená terc.butyl
Bz	znamená benzoyl
Ac	znamená acetyl

ío Způsoby přípravy docetaxelu jsou popsány v EP-A 253738 a EP-A 336841.

Docetaxel lze použít například v bezvodé formě nebo jako hydrát. V rámci tohoto vynálezu zmínka o docetaxelu zahrnuje též jeho hydráty.

Hydráty docetaxelu lze připravit rozpuštěním bezvodého docetaxelu v organickém rozpouštědle, jak jsou aceton, ethanol, acetonitril, nebo Ν,Ν-dimethylformamid, a rekrystalizací hydrátu docetaxelu přidáním takto získaného roztoku k vodě. Hydrátem docetaxelu je typicky dihydrát, trihydrát nebo tetrahydrát. Zejména o trihydrátu bylo zjištěno, že je obzvláště stabilní, a proto je trihydrát docetaxelu výhodný, Trihydrát docetaxelu lze připravit pomocí postupů popsaných v EP-A 770070.

Docetaxel je neočekávaně účinný proti hepatocelulámím karcinomům. Zejména jej lze použít k léčení karcinomů z jatemích buněk, fibrolamelámích variant a smíšených hepatocelulámích cholangiokarcinomů.

Podle předkládaného vynálezu lze docetaxel podávat libovolnou z obvyklých cest známých pro podávání docetaxelu. Proto jej lze podávat například parenterálně. Typicky je podáván intravenózně, výhodně prostřednictvím íntravenózní infúze.

jo Podle předkládaného vynálezuje docetaxel připravený k podávání ve formě farmaceuticky přijatelné kompozice obsahující docetaxel a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo. Mezi vhodné nosiče a ředidla patří netoxická rozpouštědla a suspenzní prostředky, například sterilní vodný prostředek. Výhodně jsou tyto kompozice ve formě vodných roztoků nebo suspenzí, například roztoků vhodných k injekčnímu nebo infúznímu podávání, které mohou obsahovat emulgátory, barviva, konzervační prostředky nebo stabilizátory.

Mezi farmaceutické kompozice vhodné k parenterálnímu podávání patří sterilní vodné nebo jiné než vodné roztoky nebo suspenze. Vhodné sterilní, jiné než vodné roztoky a suspenze zahrnují roztoky a suspenze v přírodních rostlinných olejích, jako jsou olivový olej, sezamový olej nebo vazelínový olej nebo injikovatelné organické estery, jako je ethyl-oleát. Vhodné sterilní vodné roztoky zahrnují roztoky docetaxelu ve vodě. Typicky se pH sterilních vodných roztoků vhodných k parenterálnímu podávání vhodně upravuje. Dále jsou tyto sterilní vodné roztoky obecně upravovány na isotonické, například pomocí dostatečného množství chloridu sodného nebo glukózy. Je obzvláště výhodné, když máji roztoky vhodné k infúznímu podávání podobné pH jako pH krve a když jsou připraveny jako isotonické.

-2CZ 301378 B6

Sterilizaci lze provést pomocí zahřátí nebo libovolným jiným způsobem, který nemá škodlivé účinky na kompozici.

Farmaceutické kompozice obsahující docetaxel vhodné pro použití podle předkládaného vynálezu mohou dáte obsahovat surfaktant. Výhodnými surfaktanty jsou polysorbáty, estery polyoxyethylenglykolu a estery-ethery polyethylenglykolu a ricinových olejů. Příklady vhodných surfaktantů, a farmaceutických kompozic obsahujících surfaktanty, lze nalézt v AU-A 666859.

to Docetaxel lze také k použití podle předkládaného vynálezu připravit jako lyofylizovanou kompozici. Tyto lyofylizované kompozice mají dobrou fyzikální a chemickou stabilitu, a lze je proto skladovat po dlouhou dobu. Lyofylizované kompozice obsahující docetaxel lze připravit lyofylizací vodného roztoku docetaxelu standardními postupy. Dále mohou obsahovat bobtnavá činidla, jako je laktóza. Také mohou obsahovat činidla upravující tonicitu, jako jsou cukry a polymery.

Mezi příklady vhodných činidel upravujících tonicitu patří glukóza, dextróza a mannitol a polymery, například polyvinylpyrrolidon.

Lyofylizované kompozice lze před použitím opětovně rozpustit v libovolném slučitelném a farmaceuticky přijatelném injikovatelném prostředku. Lyofylizát lze výhodně obnovit pomocí dvakrát destilované vody injekčního stupně čistoty, v objemu, který odpovídá počátečnímu objemu roztoku určeného k lyofylizaci.

Farmaceutická kompozice obsahující docetaxel, vhodná k použití podle předkládaného vynálezu obsahuje typicky alespoň 0,01 % hmotn. terapeuticky účinného produktu. Obecně obsahuje farmaceutická kompozice od 0,01 do 1000 mg, výhodně od 0,1 do 500 mg, terapeuticky účinného produktu.

Roztok vhodný k intravenózní injekci výhodně obsahuje od 38 do 42, výhodněji okolo 40 mg/ml účinného produktu. Typicky jsou tyto roztoky poskytovány v ampulkách obsahujících 20 nebo

80 mg účinného produktu.

Roztok vhodný pro infúzi výhodně obsahuje od 0,1 do 11, výhodně od 0,1 do 10, výhodněji od 0,3 do 0,9 mg/ml účinného produktu,

Terapeutická léčba pomoci docetaxelu podle předkládaného vynálezu může být prováděna současně s dalšími terapeutickými léčbami, které zahrnují léčby jinými antineoplastickýmí léčivy, monoklonálními protilátkami, imunoterapií nebo radioterapii nebo léčby modifikátory biologické odezvy. Mezi vhodné modifikátory biologické odezvy patří lymfokiny a cytokiny, jako jsou interleukiny, interferony, (α, β nebo δ) a TNF. Další chemoterapeutická činidla, která jsou použi40 telná k léčení poruch způsobených abnormální buněčnou proliferací, zahrnují alkylační činidla, jako jsou mechlorethamin, cyklofosfamíd, melfalan a chlorambucil, alkyl-sulfonáty, jako je busulfan, nitrosomočoviny, jako jsou carmustin, lomustin, semustin a streptozocin, triazeny, jako je dacarbazín, antimetabolity, jako jsou analoga kyseliny listové, například methotrexát, pyrimidinová analoga, jako jsou fluoruracil a cytarabin, purinová analoga, jako jsou merkaptopurin a thioguanin, přírodní produkty, například vinca alkaloidy, jako jsou vinbiastin, vincristin a vindesin, epipodophyliotoxiny, jako jsou etoposid a teniposid, antibiotika, jako jsou dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, bleomycin, plicamycin a mitomycin, enzymy, jako je L-asparagináza, rozličná činidla, jako jsou koordinační komplexy platiny, například cisplatina, substituované močoviny, jako je hydroxymočovina, methylhydrazinové deriváty, jako je procarbazin, adreno50 kortikální supresanty, jako jsou hydrazin a aminoglutethimid, hormony a antagonisté jako jsou adrenokortikosteroidy, jako je prednison, progestiny, jako jsou hydroxyprogesteron-caproát, methoxyprogesteron-acetát a meges-trol-acetát, estrogeny, jako jsou diethylstilbestrol a ethynylestradiol, antiestrogeny, jako je tamoxifen, a androgeny, jako jsou testosteron-propionát a fluoxymesteron.

-3CZ 301378 B6

Výhodná je současná léčba cyklofosfarnidem, 5-fluoruracilem, etoposidem, vinorelbinem nebo methotrxátem, neboť lze dosáhnout synergického účinku mezi těmito sloučeninami a docetaxelem. Další účinnou látkou proti hepatocelu lamímu karcinomu je 2-methoxyestradiol, o němž se zjistilo, že byl u myši dobře snášen po dobu jednoho měsíce denní léčby (Klauber a kol., Cancer

Research, 57, 81-86, 1997). Proto je také výhodná současná léčba 2-methoxyestradiolem, zejména pokud je žádoucí chronická léčba.

Podle předkládaného vynálezu se docetaxel podává v dávce, která dovoluje léčení hepatoceluJarního karcinomu. Dávka se liší v závislosti na cestě podávání a fyzikálních vlastnostech pacienta, io Mezi vhodné dávky patří dávky, které jsou terapeuticky účinné pro léčbu poruch způsobených abnormální buněčnou proliferaci. Docetaxel lze podávat tak často, jak je nutné k dosažení požadovaného terapeutického účinku.

Typická dávka docetaxelu k léčení lidí se pohybuje od 50 do 150, výhodně od 60 do 100, výhod15 něj i okolo 100 mg docetaxelu na ιττ povrchu kůže pacienta. Pokud se docetaxel podává infůzně, pohybuje se rychlost infúze typicky od 1 do 200, výhodně okolo lOOmg/nr docetaxelu za hodinu.

Výše uvedené dávky lze opakovat podle potřeby. Typicky se opakují denně nebo týdně. Výhodně se opakují každé tři týdny. Docetaxel lze například podávat v dávce okolo 100 mg/m³ prostřednictvím intravenózní infúze po dobu 1 hodiny každé tři týdny.

Následující příklad provedení vynálezu slouží k ilustraci předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Látky a metody

Pokud není uvedeno jinak, jsou použitými metodami standardní biochemické postupy. Všechny použité buněčné linie jsou komerčně dostupné.

Buněčné kultury

V pokusech podrobně popsaných níže byly použity lidské hepatomové buněčné linie Hep3B (ATCC označení HB 8064), HepG2 (ATCC označení HB 8065) a HA22T/VGH, a myši hepatomové buněčné linie Hepa 1-6. Tyto buňky byly kultivovány v Dulbeccem modifikovaném Eaglově médiu (GIBCO, BRL), obsahujícím 10% fetální telecí sérum (Hyclone), 0,01 mg/ml gentamycinu a 0,1 mmol neesenciální aminokyseliny. Buňky byly kultivovány v CO? inkubátoru při 37 °C, s 5 % COi a 95 % filtrovaného vzduchu.

Působení léčiv

V rámci pokusu podrobně popsaného níže byly výše uvedené hepatomové buňky podrobeny různým koncentracím pacíitaxelu (0,001 až 10 pmol) a docetaxelu (0,001 až 10 pmol) na 24 hodin a 72 hodin. Paclitaxel byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (DMSO) a docetaxel byl rozpuštěn v ethanolu v podobě zásobních roztoků. Konečná koncentrace vehikula Činila méně než 0,1 %.

Studie životaschopnosti buněk: MTT analýza

Buňky byly kultivovány na 96ti jamkové desce pro buněčnou kultivaci (COSTAR) v hustotě činící 4x10⁴ buněk/ml. Po působení léčiv po dobu 24 hodin nebo 72 hodin bylo médium odstraněno a nahrazeno odpovídajícím objemem (100 μΙ) čerstvého media obsahujícího MTT (0,456 mg/ml; 3-[4,5-dimethylthiazoI-2-yl]-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid) a následovně

-4CZ 301378 B6 inkubováno po dobu 1,5 hodiny při 37 °C. Poté bylo odstraněno čerstvé médium a bylo přidáno 100 μΙ DMSO. Životaschopnost buněk byla stanovena pomocí kolorimetrického srovnávání odečítáním hodnot optické denzity (OD) z mikrodeskového čtecího zařízení (SPECTRA MAX 250) při absorpční vlnové délce činící 570 nm.

Výsledky jsou znázorněny na obrázku 1, na kterém plné kruhy představují data následující po léčbě po dobu 24 hodin a prázdné kruhy představují data následující po léčbě po dobu 72 hodin. Data jsou průměry ± standardní odchylka průměru ze zdvojených vzorků tří nezávislých pokusů.

i o Propidiumiodidová (PI) vylučovací analýza

Buňky byly kultivovány na 5 cm² miskách (CORNING) a podrobeny paclitaxelu a docetaxelu, jak je popsáno výše. Poté byl přidán propidiumiodid (10 pg/ml) a buňky byly inkubovány po dobu 15 minut při 37 °C. Poté bylo ještě před sebráním spojených buněk odstraněno médium, is Pak byly odebrány jak suspendované tak i spojené buňky a poté byly resuspendovány 500 μΐ fosfátem pufrovaného roztoku chloridu sodného (PBS) pro průtokovou cytometrickou analýzu, jak je popsáno níže. Zbytkové signály byly odstraněny pomoci FSC-SSC.

Průtoková cytometrická analýza obsahu DNA

Lytický pufr (0,5 % Triton X-100, 0,2 pg/ml Na₂EDTA.2H₂O, a 1 % bovinního sérového albuminu v PBS) byl přidán k buněčným peletám, které byly poté ponechány na ledu na 15 minut. Poté byl ke směsi přidán 100% methanol předchlazený na -20 °C, která byla poté odstřeďována při 300 x g po dobu 5 minut. Supematant byl odstraněn a buněčné pelety byly promyty pomocí PBS. Promyté pelety byly poté barveny roztokem barvicím DNA (50 pg/ml propidiumiodídu, a 5 kunitz/ml RNázy A) po dobu 30 minut při 4 °C v temnu. Obsah DNA v každé z buněk byl stanoven pomocí průtokového cytometru Becton Dickinson FACSCcilibur, jak je popsáno níže.

Průtoková cytometrie

Buňky (10000) byly analyzovány pomocí průtokového cytometru Becton Dickinson FACSCalibur použitím argonového-ionového laseru (15 mW) s dopadajícím paprskem 488 nm. Pro PI vylučovací analýzu byla shromažďována červená fluorescence pomocí 585 nm filtru a zbytkové buněčné signály byly odstraněny pomocí FSC-SSC. Data byla získána a analyzována použitím softwaru FACS/CELLQuest na počítači Power Macintosh 7600/120. Apoptotické buňky a buňky ve specifických fázích cyklu byly stanoveny pomocí softwaru ModFit LT.

Výsledky průtokové cytometrie jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2 a na obrázku 2. Tabulka 1 uvádí hodnoty permeability buněčné membrány hepatomových buněk, následující po působení paclitaxelu a docetaxelu. Tabulka 2 uvádí procentuální podíly apoptotických (sub-GO/Gl) buněk zjištěné po působení paclitaxelu a docetaxelu. Obrázek 2 zobrazuje histogramy DNA analýzy popisující účinek paclitaxelu a docetaxelu na progresi buněčného cyklu.

-5CZ 301378 B6

Tabulka 1

Permeabilita buněčné membrány hepatomových buněk po působení paclitaxelu a docetaxelu

	Paclitaxel (ajdoI )	Docetaxel (/imol)
0.01	0.1	1	0.01	0.1	1
Hep G2
24 h	93.63+1.1	85.71+6.8	66.7117.2	94.86+1.3	85.49+1.2	81.2413.2
72 h	56.58128.7	43.79111.7	13.27+4.3	61.06+9.6	40.0319.0	27.4218.8
Hep 3B
24 h	77.35111.7	63.50+4.0	52.2814 1	93.80±10.7	57.4116.8	57.3914.3
72 h	57.0017.9	8.0912.3	1.9010.3	36.81+14.7	36.25+13.5	20.25114.4
HA22T/VGH
24h	94.08118.6	40.0317.8	34.24+8.3	98,6619.0	38.71111.2	40.7915.0
72 h	92.58121.3	93.38132.5	49.32+8.3	55.4415.6	21.2410.4	22.0313.1
Hepa 1-6
24 h	93.1713.8	67.20+4.4	62.6517.6	94.4511.9	83.35+7.2	81.8818.7
72 h	62.9515.6	27.7911.3	15.5111.0	77.1811.4	43.94+3.4	38.9014.2

Data jsou průměry ± standardní odchylka průměru ze zdvojených vzorků alespoň tří nezávislých pokusů. Buňky byly podrobeny působení léčiv po dobu 24 až 72 hodin, a permeabilita membrány byla měřena pomocí průtokové cytometrické analýzy propidiové exkluze u životaschopných buněk. Data představují procentuální podíl buněk s neporušenou buněčnou membránou vztažený ke kontrole.

io Tabulka 2

Paclitaxelem a Docetaxelem indukovaná apoptóza

	Paclitaxel (πτποί)	Docetaxel (r	nmol) 1
0.01	0.1	1	0,01	0.1
Hep G2 24 h 72 h Hep 3B 24 h 72 tt HA22T/ 24 b		38.37	47.01	45.24 42.45 59.14 64.12 41.75	38.77 42.44 58.67 81.66 18.61	28.33 56.66 65.74 79.33 22.94
VGH 72 h		0	0	56.64	58.61	60.98
Hepa 1-6 24 h 72 h	24.02	55.64 N/A	64.38 N/A	52.81 31.25	50.76 53.95	53.80 62.49

N/A znamená nezjištěno

Údaje představují procentuální podíl apoptotických (sub-GO/Gl) buněk, jak bylo stanoveno průtok vou cytometrií.

Elektroforetická analýza fragmentace DNA

-6CZ 301378 B6

Odhad fragmentace DNA byl proveden podle metody popsané v Herrmcmn a kol., Nucleic Acids Res., 22, 5506-5507,1994.

Stručně byly buňky HEP G2 (2x10⁷) podrobeny po dobu 72 hodin působení paclitaxelu a doceta5 xelu, jak je popsáno výše a poté odstřeďovány. Takto získané buněčné pelety byly resuspendovány lytickým pufrem NP-^0 (1 % NP-40 ve 20 mmol EDTA, 50 mmol Tris-HCl, pH 7,5). Po proběhnutí lýzy buněk během několika málo sekund byly shromážděny supematanty (5 minut při 1600 g). Extrakce byla opakována se stejným lytickým pufrem. Poté byly k supematantům přidány SDS (konečná koncentrace 1 %) a RNáza (konečná koncentrace 2,5 pg/μΐ) a vše inkubo10 váno po dobu 2 hodin při 56 °C, což bylo následováno trávením pomocí proteinázy K. (2,5 pg/pl) po dobu 2 hodin při 37 °C. Poté byly směsi přidány k 10M ammoniumacetátu, a to před precipitací pomocí 100% ethanolu po dobu 30 minut při -20 °C. DNA byla shromážděna pomocí odstřeďování (10 minut při 12000 g), následovaného v elektroforézou na 1,5% agarosovém gelu.

Výsledky jsou zobrazeny na obrázku 3. Na obrázku 3 znamená M markér obsahující 100 párů bází. Dráha 1 ukazuje mediovou kontrolu. Dráhy 2 a 3 ukazují průměr skupin podrobených působení paclitaxelu (0,1 a 1 pmol). Dráhy 4 a 5 ukazují průměr skupin podrobených působení docetaxelu (0,1 a 1 pmol).

Výsledky

Studie životaschopnosti buněk

Obrázek 1 ukazuje na dávce závislý účinek paclitaxelu a docetaxelu na životaschopnost buněk u hepatomových buněčných linií (Hep G2, Hep 3B, HA22T/VGH a Hepa 1-6). Jak je patrno z obrázku 1, docetaxel dosáhl v téměř každém případě poklesu životaschopnosti při 0,01 a

0,1 pmol.

U buněk Hep G2 vykazovala životaschopnost buněk po působení paclitaxelu nebo docetaxelu klesající trend. Životaschopnost buněk Hep G2 činila 61,81 a 39,45 % kontroly u skupin podrobených působení paclitaxelu (10 pmol) po dobu 24 resp. 72 hodin. U buněk Hep G2 podrobených působení docetaxelu byl pozorován maximální pokles životaschopnosti u 1 pmol docetaxelu, u

10 pmol docetaxelu nebyl již zaznamenán další pokles životaschopnosti. Životaschopnost činila

65,03 a 48,99 % u buněk podrobených působeni 1 gmol docetaxelu po dobu 24 resp. 72 hodin.

U buněk Hep 3B stojí za zmínku to, že znatelný pokles životaschopnosti (37,06%) byl pozorován po působení 1 pmol docetaxelu po dobu 72 hodin.

U buněk Hepa 1-6 podrobených působení docetaxelu byla pozorována maximální cytotoxicita (65,34 a 30,71 %) u skupin podrobených působení 1 pmol docetaxelu po dobu 24 resp. 72 hodin. Propidiumiodidová vylučovací analýza

Tabulka 1 ukazuje, že permeabilita membrány buněk Hep G2 a buněk Hep 3B, následující po působení paclitaxelu a docetaxelu, byla závislá na dávce a času.

U buněk HA22T/VGH byl pozorován menší vzestup permeability membrány po působení paclitaxelu (0,01 až 1 pmol) po dobu 72 hodin, ve srovnání se skupinami podrobenými působení docetaxelu. Za zmínku stojí, že pouze u 55,44 % buněk byly membrány po působení 0,01 μιηοΙ docetaxelu po dobu 72 hodin neporušené, zatímco po působení stejné dávky paclitaxelu byly membrány neporušené u 92,58 % buněk.

Analýza buněčného cyklu

Obrázek 2 ukazuje, že výsledkem působeni 1 pmol paclitaxelu na buňky Hep G2 po dobu 24 hodin je zřejmé zastavení ve fázi G2/M. Podobné DNA histogramy byly pozorovány po 72 hodinové expozici.

-7CZ 301378 B6

Jak ukazuje tabulka 2, byly apoptotické buňky (sub-GO/Gl) pozorovány po působení 0,001 pmol, 0,01 gmol, 0,1 pmol a 1 pmol docetaxelu po dobu 24 hodin s procentuálními podíly apoptotických buněk činícími 31,02, 45,24, 38,77 resp. 28,33 %. Po 72 hodinách působení docetaxelu (0,001-1 pmol) činily procentuální podíly 21,92, 42,45, 42,44 resp. 56, 66 %.

Výsledkem působení 0,1 pmol nebo 1 pmol paclitaxelu po dobu 24 hodin byla u buněk Hep 3B zástava ve fázi G2/M a výsledkem inkubace s 0,1 pmol nebo l pmol paclitaxelu po dobu 72 hodin bylo zvýšeni procentuálních podílů buněk v sub-GO/Gl na 38,37 % resp. 47,01. Naproti tomu působení 0,01 pmol, 0,1 pmol nebo 1 pmol docetaxelu na buňky Hep 3B po dobu 24 hodin io nebo 72 hodin vedlo k vysokým podílům populací sub-GO/Gl, a to ve výši 59,14, 58,69 a 65,74 % po 24 hodinách a 64,12, 81,66 a 79,33 % po 72 hodinách.

U buněk HA22T/VGH byly zvyšující se koncentrace paclitaxelu (0,001 pmol až 1 pmol) v souladu se zvýšenými procentuálními podíly buněk ve fázi G2/M po 24 hodinách. Po 72 hodi15 nách působeni 0,1 pmol nebo l pmol paclitaxelu nebyla u skupin těchto buněk pozorována znatelná populace sub-GO/Gl. Oproti tomu je zřetelné, že u buněk HA22T/VGH podrobených působení 0,01 pmol docetaxelu po dobu 24 hodin je výsledkem vyšší procentuální podíl subGO/Gl (41,75 %) než u skupin podrobených působení 0,1 pmol (18,61 %) nebo 1 pmol (22,94%) docetaxelu, V případě, že byly buňky podrobeny působení docetaxelu po dobu

72 hodin, byly zjištěny znatelné procentuální podíly sub-GO/Gl u buněk HA22T/VGH podrobených působení 0,01 pmol (56,64 %), 0,1 pmol (58,61 %) a 1 pmol (60,98 %) docetaxelu.

U buněk Hepa 1-6 vedlo působení paclitaxelu (0,01, 0,1 nebo 1 pmol) po dobu 24 hodin ke zvýšené tvorbě populací sub-GO/Gl (24,02, 55,64 resp. 64,38 %) přičemž zástava ve fázi G2/M byla pozorována u skupin podrobených působení 0,1 pmol a 1 pmol paclitaxelu. Pokud byly buňky Hepa 1-6 podrobeny působení 0,1 pmol a 1 pmol paclitaxelu po dobu 72 hodin, byla většina buněk mrtvá a nebyl zřejmý stupeň buněčného cyklu. Působení docetaxelu (0,01, 0,1 a 1 pmol) na buňky Hepa 1-6 vedlo k tvorbě buněk sub-GO/Gl (52,81, 50,76 a 53,8 % po 24 hodinách resp. 31,25, 53,95 a 62,49 % po 72 hodinách).

Analýza fragmentace DNA

Obrázek 3 ukazuje, že působeni paclitaxelu (0,1 a 1 pmol) a docetaxelu (0,1 a 1 gmol) indukuje u buněk Hep G2 fragmentaci DNA.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití kompozice obsahující jako účinnou složku docetaxel nebo jeho hydrát pro přípravu léčiva k léčení hepatocelulamího karcinomu.

   45
2. 2. Použití podle nároku 1, při němž je uvedeným hydrátem trihydrát.
3. 3. Použití podle nároku 1 nebo 2, při němž je léčivo určeno k parenterálnímu podání.
4. 4. Použití podle nároku 3, při němž je léčivo vhodné k podávání pomoct infúze a obsahuje od

   50 0,1 do 11 mg/ml účinné látky.