CZ299988B6

CZ299988B6 - Zpusob in vitro k rozpoznání a diagnostice akutních koronárních syndromu

Info

Publication number: CZ299988B6
Application number: CZ20010281A
Authority: CZ
Inventors: Danne@Oliver; Frei@Ulrich; Zschunke@Adolf; Mügge@Clemens
Priority date: 1998-08-12
Filing date: 1999-08-11
Publication date: 2009-01-14
Also published as: EP1104547A1; PT1104547E; DE19836617A1; AU5621999A; US6830932B1; CA2339023C; IL141152A0; HUP0102984A3; IL141152A; DK1104547T3; ES2201764T3; DE19836617C2; CZ2001281A3; AU761226B2; NZ509406A; JP2002522791A; WO2000010014A1; DE59905860D1; EP1104547B1; CA2339023A1

Abstract

Zpusob zahrnuje následující postupné kroky: odebrání vzorku vhodné telní tekutiny nebo telní cásti,stanovení obsahu cholinu, derivátu cholinu a/neboderivátu trimethylamonia, vybraných ze skupiny zahrnující fosforylcholin, plazmalogeny a lysoplazmenylcholin a/nebo jejich reakcní produkty, vybrané ze skupiny zahrnující 1-O-alk-1´-enyl-2-substituovaný glycerol a 1-O-alk-1´-enyl-2-substituovaný glycerolfosfát, stanovení jejich množství vhodným analytickým zpusobem (nukleární magnetická rezonance,biochemické, enzymatické, klinicky chemické, chromatografické, hmotove spektrometrické, elektrochemické, fotometrické postupy); zhodnocení namerenýchvýsledku se zohlednením mezní hodnoty k rozpoznání, resp. k vyloucení akutních koronárních syndromu, predevším akutního infarktu myokardu.

Description

Oblast techniky

Vynález se vztahuje na způsob in vitro k rozpoznání a diagnostice akutních koronárních syndromů, především akutního infarktu myokardu (AMI) ti člověka.

Dosavadní stav techniky

Akutní koronární syndromy zahrnují obrazy nemocí akutního infarktu myokardu (AMI) a instabilní (nestabilní) angíny pektoris, které jsou definovány podle klasifikace W11O (AMI) a Braunwaldovy klasifikace instabilní angíny pektoris (Gillum R. F. a spol, 1984, Am. Heart. J. 108: 150-158; Braunwald E, a spol. 1994, Circulation 90: 613—622). Akutní koronární syndromy představují častý a život ohrožující komplex nemocí, u kterého jsou včasné rozpoznám a správná diagnóza a terapie rozhodující pro přežití pacienta. To platí především u akutního infarktu myokardu, u kterého opožděné určení správné diagnózy a terapie mohou mít závažné následky pro pacienta. Známé postupy diagnostiky infarktu myokardu jsou elektrokardiogram a určení rozličných laboratorních znaků. Elektrokardiogram a dosud známé laboratorní znaky se vyznačují v časné fázi akutního infarktu myokardu příliš malou citlivostí, než aby u většiny pacientů mohla být stanovena správná diagnóza. Tak leží citlivost na změny typické pro infarkt na RKG (STstahy) u 46% (Rudé, R. E. a spol. 1983, Am. J. Cardiol. 52: 936-942). Citlivost laboratorní zkoušky na aktivitu kreatin kinázy (CK). aktivitu CK- MB, hmotu CK-MB, izo formy CK-MB, na myoglobin a srdeční troponíny dosahuje v prvních dvou hodinách po začátku bolestí 11 až 29 % (Mair J.. a spol. 1994, Mitteilungen der deutschen Gesellschaft fůr klinisehe Chemie 25: 1 6). Omezené diagnostické použití známých postupů v počátečních stadiích akutního infarktu myokardu je příčinou řady klinických problémů, jako je nebezpečí stanovení chybné diagnózy, zahájení neindikovaných terapií a opoždění terapií vedoucích k záchraně života.

LJ instabilní angíny pektoris je možno rizikové pacienty poměrně snadno a spolehlivě rozpoznat stanovením kardiálního troponinu, ale pomalá- rychlost vylučování umožňuje i v tomto případě v prvních stadiích chybně-negativní nálezy. lo je problematické, protože pacienti v tomto případě mohou mít stejně špatnou prognózu jako pacienti s AMI, kteří potřebují rychlou a cílenou ant ischemiekou therapii. Je proto zapotřebí rychlý vývoj metod, které by umožňovaly včasné rozpoznání akutních koronárních syndromů, především akutního infarktu myokardu.

Podstata vynálezu

Předložený vynález si proto klade za úkol podat způsob, který umožňuje včasné rozpoznání akutních koronárních syndromů a tím umožní zlepšení diagnostiky a terapii nemocných pacientů.

Tento úkol je vyřešen způsobem in vitro pro rozpoznání a diagnostiku akutních koronárních syndromů. zvláště akutního infarktu myokardu, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom. že se v tělních tekutinách nebo tělních částech stanoví obsah cholinu, derivátů cholinu a derivátů trimethylamonia vybraných ze skupiny zahrnující fosforyleholin. plazmalogeny a lysopiazmenylcholin nebo že se v tělních tekutinách nebo tělních částech stanoví reakční produkty cholinu, derivátů cholinu a derivátů trimethy lamonia vybraných ze skupiny zahrnující fosforyleholin, plazmalogeny a lysopiazmenylcholin, přičemž jsou reakční produkty vybrané ze skupiny zahrnující 1-O-alk-l '-enyl-2-substituovaný glycerol a 1-O-alk-l -enyl-2-substituovaný glycerol fosfát.

Vynález je též možno s výhodou provádět tak, že se obsah cholinu, derivátů cholinu a derivátů trimethylamonia. vybraných ze skupiny zahrnující fosfory Icholin. p lázni a loge ny a lysoplazmenylcholín vyhodnotí s ohledem na mezní hodnotu.

Vynález je též možno s výhodou provádět tak, že se v tělních tekutinách nebo tělních částech pozoruje stav nebo pochody způsobené obsahem cholinu, cholinových derivátů nebo derivátů triincíiivlaiiioma v\bíaiivcli ze skupiny fo^íoíylciioiiii. plazmalogeny a lysoplazmenylcholin a/nebo jejich reakčních produktů vybraných ze skupiny zahrnující l-O-alk-1.'-enyl-2-substituovaný glyeerol a l-O-alk-1 '-enyl-2-substituovaný glycerolfosfát.

Vynález je též možno s výhodou prováděl tak, žc se provede polokvantitativní nebo kvalitativní pozorování a hodnocení obsahu cholinu, cholinových derivátů nebo derivátů trimethylamonia vybraných ze skupiny fosfory Icholin, plazmalogeny a lysoplazmenylcholin a/nebo jejich reakčních produktů vybraných ze skupiny zahrnující l^O—alk—1 '—2—substituovaný glyeerol a l-Oalk-1 '-enyl-2-substituovaný glycerolfosfát nalezených při jejich stanovení v tělních tekutinách a tělních částech.

Vynález je též možno s výhodou provádět tak, že se pro stanovení obsahu cholinu, cholinových derivátů nebo derivátů trimethylamonia vybraných ze skupiny fosfory Icholin, plazmalogeny a lysoplazmenylcholin a/nebo jejich reakčních produktů vybraných ze skupiny zahrnující 1-0alk-1 '-cnyl-2-substituovaný glyeerol a 1-0-alk-l '-enyl-2-substituovaný glycerolfosfát použijí analytické způsoby zahrnující nukleární magnetickou rezonanci (NMR), biochemické, enzymatické, imunologické klinicky chemické, chromatografické. hmotově speklromelrícké, elektrochemické a fotometrické postupy.

Vynález jc též možno s výhodou provádět tak, Žc se provede NMR spektroskopie tělních tekutin nebo tělních částí a vyhodnocení podle „základního rozpoznání (pattem-recognition) více látek, zvláště cholinu, cholinových derivátů a/nebo derivátů trimethylamonia vybraných ze skupiny fosforylcholin, plazmalogeny a lysoplazmenylcholin, a jejich reakčních produktu, vybraných ze

3(i skupiny zahrnující 1-O-alk-l' enyl 2 substituovaný glyeerol a I O alk 1' -enyl 2 substituovaný glycerolfosfát, a dále kreatin a dimethylamin.

Vynález je tčž možno s výhodou provádět lak. žc se z tělních tekutin nebo tělních částí, zahrnujících sérum, plazma, krev, zpracované krevní vzorky nebo, moč, provede stanovení cholinu, cholinových derivátů a/nebo derivátů trimethylamonia vybraných ze skupiny zahrnující fosforylcholin. plazmalogeny a lysoplazmenylcholi a/nebo jejich reakčních produktů vybraných ze skupiny zahrnující l-O-alk 1' enyl 2 substituovaný glyeerol a I -O-alk-i -enyl-2-substituovaný glycerolfosfát. V předloženém vynálezu metodiky k rozpoznání akutních koronárních syndromů, zvláště pak akutního infarktu myokardu, je zahrnuto stanovení a zhodnocení obsahu cholinu,

4d derivátů cholinu a/nebo tri methy lamou iovýc li derivátů, vybraných ze skupiny zahrnující fosforylcholin, plazmalogeny a lysoplazmenylcholin, které se nacházejí v tělních tekutinách nebo v tělních částech odebraných pacientovi.

Cholin, deriváty cholinu a trimethylamoniové deriváty vybrané ze skupiny zahrnující fosfory I45 cholin, plazmalogeny a lysoplazmenylcholin, jsou molekuly lipidové látkové výměny a jsou v následujícím společné označovány jako ,,CCTD, které mají následující obecné chemické vzorce;

Cholin:

5(1

CH?

Tl C.ll < -II OH 1)11' (vzorec I) ch.

CZ 299988 Bó

Cholinové deriváty:

CH?

II3C C?H C₂H O Rl (obecný vzorec 2)

CH?

Rl - zbytek 1

Trimctylamoniové deriváty:

Cíl·

H3C .........R2 (obecný vzorec 3)

CH?

R2 zbytek 2

Rl a R2 představují určité chemické substituenty, charakterizující skupinu látek zahrnující fosforylcholin, plazmalogeny a lysoplazmenyleholin. Plazmalogeny a lysoplazmenyleholin obsahují v těchto molekulových podílech alkenylovou skupinu.

Vzorec 1 představuje cholin [2-hydroxyethyl]trimethylamonium se svým proti iontem. Vzorec 2 io představuje obecný vzorec chollnových derivátů a vzorec 3 je obecný vzorec trimetalamoniových derivátů jako jsou fosforylcholin a plazmalogeny, jako plazmcnylcholin a lysoplazmenyleholin.

Negativní náboj se muže nalézat ve stejné molekule nebo v proti iontu. Většina CCD i jsou buď díly fosfolipidů, představující stavební kameny biologických membrán nebo jsou úzce spojeny s látkovou výměnou fosfolipidů. Buňky srdečního svalu jsou obzvláště bohaté plaznienylcholi15 nem, představujícím fosfolipidy obsahující charakteristickou alkenylovou skupinu v molekule. Plazmenylcholiny jsou součástí membrán mitochondrií, tvořící podstatnou část hmoty myokardu. Aktivace rozličných myokardiálních fosfolipáz při těžké ischemii myokardu vede podle výsledků přihlašovatelů vynálezu ke zřetelnému uvolňování chol inu, chol i nových derivátů a chemicky příbuzných trimethy lamoniových derivátů, jako jsou fosforylcholin, plazmalogeny nebo lysoplaz20 menylcholin, a způsobují zvýšení koncentrace CCDT v určitých tělních tekutinách a tělních částech. Není známo, do jaké míry' se toho zúčastňují nemyocytární prvky včetně endotcl 11 a buněk hladkého svalstva. Chemická příbuznost eholinu. eholinovýeh derivátů a trimethylamoniových derivátů, vybraných ze skupiny zahrnující fosforylcholin, malogeny a lysoplazmenyleholin a jejich podobné chování při patologických procesech, tj. velmi brzké uvolňování ze srdce ve

2? spojení s destrukcí i schem ických membrán, vytváří souhrnný názor na CCTD.

Možné rozdíly mezi jednotlivými CCTD ustupují do pozadí před rozhodujícím společným působením při velmi rychlém uvolňování myokardiálních látek při akutním koronárním syndromu, a tento společný a souhrnný vliv je pro předložený vynález rozhodujícím znakem metodiky včasné diagnostiky v prvních hodinách po začátku bolestí.

Diagnostické využití uvolňování chol inu, eholinovýeh derivátů a tri methy lamoniových derivátů, vybraných ze skupiny zahrnující fosforylcholin, plazmalogeny a lysoplazmenyleholin a sloužící k rozpoznání akutních koronárních syndromů a akutního infarktu myokardu u člověka nebylo >5 dosud popsáno. Je pouze známo, že při experimentálním uspořádání zkoušek v časném stadiu Íschemie myokardu byl pozorován vzestup obsahu lysofosfoglyceridů (např. lysofosfatidylcholinu) v myokardu a v žilním a lymfatickém efluátu (Corr P. B. a spol., 19 878, J. Mol. Cell Cardiol. 19: 34-53; Snyder D. W. 1981, Am. J. Physiol. 241; H700 H707; Akitall. a spol., 1986, J. Clin. Invest. 78: 271-280). Do žádné z publikací nebyla zařazena zmínka o postupu zhodnocení obsahu chol inu, derivátů chol i nu a trimethy lamoniových derivátů vybraných ze skupiny fosforylcholin, plazmalogenů a lysoplazmenylcholinu, obsažených v tělních tekutinách pro určení diagnózy akutního koronárního syndromu, resp. akutního infarktu myokardu u člověka.

V pozadí uvedených publikací stojí pozorování, že lysofosfatidylcholin vykazuje zřejmě proarytmické efekty a žc léčiva, mající anti -lysofosfatidylcholinový účinek by možná mohla být účelnými terapeutiky.

Vynález se vztahuje na postup ke stanovení cholinu, chol lnových a/nebo trimethy I· amoniových derivátu, jako jsou fosforyleholin, plazmalogeny a lysoplazmcnyl-cholin a nebo určitých reakčmeli pioduktu ke včasně diagnóze akutních kúiúilaiítich Syndromu, rři ÍOiii jc třeba iOziiSOvaí mezi ve vynálezu nezařazeným diacyl-fosfatidyleholinem a do vynálezu zahrnutými plazmenylcholiny. Stejně je třeba rozlišovat mezi do vynálezu nezařazenými lysofosfatidvlcholiny sjednou acylovou skupinou v molekule a do vynálezu spadajícími lysoplazmenylcholiny s jednou alkenylovou skupinou v molekule. Nespecifické postupy hodnocení, neodlišující do vynálezu spadající substance od jiných fosfolipidu nebo jejich součástí, nevy kazují znaky postupu zahrnutého do vynálezu, které jsou podstatné pro včasnou diagnostiku akutních koronárních syndromů, a nemohou proto být postaveny na úroveň popisovaného postupu.

Tak nespecifické postupy stanovení celkové skupiny fosfolipidů nebo lysofosfatidylcholinů v plazmě, séru, nebo celkové krvi neukazují charakteristické znaky postupu podle vynálezu pro včasnou diagnostiku akutních koronárních syndromů. Tyto v literatuře popisované nespecifické postupy stanovují obsah fosfoltpidů v krvi, v podstatě tedy hepatitieké fosfolipidy, které právě neobsahují plazmenyleholiny a lysoplazmeny lcholin podle předloženého vynálezu, ale obsahují ve zcela převažujícím díle chol inové fosfolipidy bez alkeny lové skupiny, např, diaeyl fosfatidylcholin. Protože tyto do vynálezu nespadající analytické postupy neměří specificky substance, které jsou při akutním koronárním syndromu uvolňovány ze srdce do krve, nemají z tohoto důvodu znaky podle postupu zahrnutého ve vynálezu. Analytickými postupy pro stanovení fosfolipidu, které nespadají do předloženého vynálezu, se bud¹ nezjistí žádné podstatné koncentrační změny nebo dokonce se zjišťuje snížení jejich obsahu, a je tedy jasné, že tyto postupy nezachytí uvolňování látek ze srdce s odpovídajícím navýšením koncentrace v krvi. Při stanovení celé skupiny lysolecilínů se při akutním infarktu myokardu často změří úbytek koncentrace, protože v rámci nespecifické akutní fáze reakce dochází ke snížené tvorbě rozličných acyl lysofosfatidy Icholinů redukcí aktivity leeitinové cholesterolové aeyl transferázy' (LCAT). Měření za použití nespecifických analytických postupů fosfolipidů vedou ledy často k právě opačným výsledkům a závěrům, které se neobjevují u postupu zahrnutého do předloženého vynálezu.

Analytický postup podle předloženého vynálezu je možno provést různými analytickými teehni55 kami. pokud mohou být látky podle předloženého vynálezu dostatečně specificky stanoveny. Tak např. je možná spektroskopie NMR po předcházející odstředivé ultrafiItraci zkušebního vzorku a odstranění špatně rozpustných diaeyl fosfatidylcholinů vázaných na proteiny. Stejně dohřeje možno použít chromatografickou. biochemickou nebo imunologickou analytickou techniku nebo i jiné postupy. Analytický postup může být proveden podle publikovaných analytických postupů, jako jsou např. biochemické nebo enzymatické postupy (Takayama M. a spol., 1977, Clin. Chini. Acta 79: 93-98), vysokovýkonná kapalinová chromatografie (HPLC) (Brouwers .1. Γ. 11. a spol., 1988. J. Lipid. Res. 39: 344-353; Potter P. a spol.. 1983, J. Neurochem. 41: 188-94) nebo plynová chromatografie a/nebo hmotová spektrometrie (Myher J. J. a spol., 1989 Lipids 24: 396407; Pomfret A. a spol., 1998, Anal. Biochem, 180:95) nebo imunologické postupy (Smál M. a spol., 1991, Lipids 26: 1130-1135; Baldo B. A. a spol., 1991, Lipids 26: 1136-1139). Přehled analytiky fosfolipidů byl publikován Olssonem (OIssonN. U. a spol.) Tyto publikace jsou zahrnuty ve vynálezu.

U biochemických postupů zahrnutých do vynálezu jsou např. přísadou reageneií (např. enzymů) 50 vyvolány chemické reakce nebo vytvořeny reakční produkty, které pak umožňují detekovat a měřit celkovou skupinu, nebo podskupinu nebo poddruhy CCDT (viz příklady použití).

U imunologických postupů podle vynálezu se např. používají imunologické reageneie (např. antilátky). zpravidla v kombinaci s dalšími chemickými a/nebo imunologickými reagenciemi, které

-4CZ 299988 Bó vyvolávají reakce nebo dávají vznik reakčním produktům, které umožňují detekci a měření celkové skupiny, podskupiny nebo poddruhů CCTD (viz příklady použití).

U chromatografie kých postupů se např. podle vynálezu provede po předběžné úpravě vzorku dělení na klidnou (stacionární) a pohyblivou (mobilní) fázi, které mají odpovídající kvalitativní a kvantitativní schopnost výpovědi o CCTD (viz příklady použití).

II každého jednotlivého analytického postupu a u vznikajících reakčních produktů je třeba uvážit, že mohou vznikat jednotlivé vrstvy CCTD, dvojité vrstvy, membrány, micely a/nebo vezikuly, a že tyto jevy mohou mít pro analytické určení svůj význam.

Vždy podle zvolené analytické techniky a podle postupuje možné na základě látek uvedených v předloženém vynálezu činit kvantitativní závěry na základě analytického určení jednotlivých určitých seskupení nebo celkových skupin. Jmenované tisky jsou převzaty do předložené přihláš15 ky.

Při uvolnění kardiálních CCTD v rámci ischemieké membránové destrukce buněk srdečního svalstva mají význam určité aktivované fosfolipázy. Tyto fosfolipázy odštěpují fosfolipidy. takže kromě CCTD vznikají také jednoduché reakční produkty, které sice nemají žádnou trimethyl20 amoniovou skupinu, ale jsou uvolňovány shodným postupem. Protože tyto jednoduché reakční produkty CCTD jsou podílem společného uvolňovacího mechanizmu, je možné provést postup podle vynálezu také stanovením takových jednoduchých reakčních produktů. Kromě fosfolipázy A_?. která kromě jiného přispívá k uvolňování zmíněného lysoplazmenylcholinu, jsou další významné enzymy této skupiny fosfolipázy A a D, které atakují esterovou vazbu mezi hydroxy2? skupinou na atomu 3-sn-C glycerolu a fosforylcholinu (důsledek působení fosfolipázy C) nebo vazbu mezi fosforylovou skupinou glycerolfosfátu substituovaného v polohách 1,2 a mezi fos fóry lovou skupinou zaestero váného cholinu (působení fosfolipázy D). Reakční produkty aktivity obou těchto fosfolipáz ve vlivu na plazmalogeny jsou podle toho 1-O-alk-l ^f-enyl-2 substituovaný glyeerol (fosfolipázou C), resp, 1-O-alk-l' enyl 2 substituovaný glycerolfosťát (fosfolipázou D). Tyto reakční produkty se uvolňují společně s cholínem, resp. fosforylcholinem při působení jmenovaných fosfolipáz na plazmenyleholiny. Proto může postup podle vynálezu být použit k časné diagnóze akutních koronárních syndromů tím. že se stanoví eholin, deriváty cholinu a/nebo trimethylamoniovc deriváty vybrané ze skupiny zahrnující fosfory lcholin, plazmalogeny a lysoplazmenylcholin, a/nebo jejich reakční produkty, vybrané ze skupiny 1-03? alk -Γ enyl-2-substituovaného glycerolu a 1 O alk—1 '-enyl-2-substituovaného glyeerol fosfátu.

Kromě zesílené aktivity fosfolipáz mohou být pro stoupající obsah CCT D a jejich reakčních produktů významné i další následující pochody. Snížené odbourávání a/nebo zvýšení syntézy

CCTD a jejich reakčních produktů (s odpovídajícími změnami za tuto činnost zodpovědných enzymů) a uvolňování buněčných oddílů a membrán jinými faktory (mechanické faktory, natékání buněk a jiné jevy myocytárního poškození).

Přehled obrázků na výkresech

Vynález je vysvětlován na následujících příkladech provedení podle připojených výkresů, na nichž:

so obr. I znázorňuje spektrum 'H-NMR krevního vzorku pacienta, obr. 2 znázorňuje zvětšené úseky analogického spektra obr, 1 u pacienta s akutním infarktem myokardu (A) a u pacienta bez akutního infarktu myokardu (B). Analogické zvýšení plochy singletů N (CTT,)i složky CCTD je možno pozorovat u pacienta s akutním infarktem myokardu,

SS obr.3 znázorňuje data k diagnostické hodnotě CCTD pro diagnózu akutního infarktu myokardu v celé době průběhů zkoušek.

obr. 4 znázorňuje data diagnostického hodnocení CO L) pro diagnózu akutního infarktu myokar> du v časném stadiu AMI (0 až 6 hodin), obr. 5 znázorňuje data diagnostického hodnocení CCTD pro diagnózu akutního infarktu myokardu ve velmi časném stadiu AMI (0 až 3 h). a ío obr. 6 znázorňuje data diagnostického hodnocení CCTD pro diagnózu akutního infarktu myokardu v pozdním stadiu AMI (7 až 35 h).

Příklady provádění vynálezu

Výběr a odběr vhodného zkušebního vzorku tělní tekutiny:

K provedení zkoušky podle vynálezu je třeba odebrat vzorek tělní tekutiny. Při tom diagnostická hodnota zkoušky je závislá od volby této tekutiny. Provedení zkoušky je možné např. zkouškou

2o vzorku krve. resp. zpracovaného vzorku krve na plazmu, sérum, nebo i z původního vzorku krve. Kromě vzorku krve je možné pro zkoušku použít i jiné tělní tekutiny, např. moč. CCTD se z určitého podílu glomerulámč odfiltruje a objeví se tím např. částečně také v moči. Dále je třeba počítat s určitým časovým zpožděním v porovnání sc zkouškou provedenou ze vzorku krve v důsledku časového opoždění koncentračních změn, což je právě při zkoušce moce nevýhodné.

2? Kromě toho není v každém případě tak snadné získat vzorek moče. jako vzorek krve, což rovněž představuje nevýhodu. Výhodná je v případě použití vzorku moče skutečnost, že je obvykle k dispozici větší množství vzorku, a že měřením koncentrace ve vzorku moče se zachytí vzorek produkovaný v delším časovém období, takže sc zachytí pato fyziologické pochody v delším časovém intervalu. Ale i tak je provedení uváděného postupu ze vzorku krve, resp. zpracovaného vzorku krve z dříve uvedených důvodů výhodnější. Provedení zkoušky z jiných částí těla a tělních tekutin, jako vzorků tkáně, lymfy nebo kapilární krve, je rovněž vhodné. Při odběru vzorků by se měly respektovat i další skutečnosti. Exogenní přívod většího množství cholinu, cliol i nových derivátů nebo trimethylamoniových derivátů před provedením zkoušky by měl být vyloučen. Kromě toho by pro včasné rozpoznání akutních koronárních syndromů se měl odběr us vzorku uskutečnit co nejdříve, případné periodicky opakovat.

Stanovení obsahu CC I D ve vzorku tělní tekutiny:

Diagnostický a vyhodnocovací postup podle předloženého vynálezu je dalekosáhle nezávislý na způsobu stanovení, pokud existuje dostatečná specifická citlivost pro jednotlivé látky, podskupiny, nebo všechny látky podle vynálezu. Podle vynálezu se stanovují látky jako cliolin, deriváty cholinu a/nebo deriváty tri methyl amonia, vybrané ze skupiny obsahující fosforyIcholin, plazmalogeny a lysoplazmenylcholin, a dále určité jednoduché reakční zplodiny CCTD, vybrané ze skupiny, která zahrnuje 1-O-alk-l'-enyl-2-substituovaný glycerol a l-O-alk-l '-enyl-2· substituovaný glycerol-fosfát. Jako příklad výkladu byla použita ^!H-NMR spektroskopie, která může jako primární analytický postup být použila i pro vyhodnocení. Kromě nukleární magnetické rezonance (metody NMR) mohou být použity postupy, založené na biochemických, enzymatických. imunologických, klinicky chemických, chromatografickýeh, hmotově spektrometrických. elektrochemických nebo fotometrických a jiných postupech, pokud jsou schopné

5ϋ s dostatečnou selektivitou zachytit kardiálně uvolněné CCTD (resp. jejich jednoduché reakční produkty) u pacientů, u kterých existuje podezření na akutní koronární syndromy.

Klinicky chemické nebo jiné způsoby jakož i ryehloíesty ke stanovení látek typu CCTD by se měly před použitím přezkoušet a vyhodnotit na analytickou vhodnost. Pro diagnostiku akutních

5? koronárních syndromů by sc měly pokud možno použít jen takové způsoby, které jsou v porov-6CZ 299988 B6 ηάηί s *1 i-NMR spektroskopií diagnosticky dalekosáhle stejně vhodné nebo i výkonnější. V následujícím jmenované analytické postupy jsou příklady; tj. mohou být použity kvalitativně i kvantitativně jiné chemikálie, roztoky, reageneie a přístroje, pokud se jimi dosáhnou porovnatelné výsledky. Zásadně postačí pro provedení zkoušky využití jedné hodnotné měřící metody pro sta5 novení obsahu CCTD v jedné tělní tekutině.

Pnklad:Stanovení CCTD ¹ H-NMR spektroskopií io Příprava vzorku • Odběr 10 ml krve.

• Příprava zkoušky krve podle voleného zkušebního materiálu (sérum, plazma nebo plná krev).

• Odstředivá filtrace 4 ml zkušebního materiálu filtrem 10—kD (např. U!trafree4 B 10; Millipore).

2(i · Odpipetování 600 μί ultrafiltrátu do 5 mm NMR trubičky např. 527-PP-7. Willmad. Buena,

SA).

• Odpipetování 100 μί roztoku 3,5-mM-d4-TST-D?O jako koncentračního standardu na objem vzorku 700 μΙ (TST - sodná sůl írimethylsilylpropionové kyseliny).

• Měření pH v trubičce 5 mm NMR (např. 3 mm Minitrode, Hamilton). bezprostředně před nebo po zkoušce.

Vysokorozlišující spektroskopie 'H NMR

Spektroskopie ^!H NMR se provede např. na spektrometru 600 MHz (např. Bruker AMX 600) při n á s 1 ed uj íe í e h pod m ί n k áe h:

• Jednoduchá pulzní technika.

• Potlačení vody předcházející sátu rač ní technikou.

• RF impulz 30° až 90°.

io · Doba opakování pulzů 5 až 15 s, • 64 až 128 skenů na vzorek.

Chemické posuny 'll se vztahují interně na TSP,. Charakterizace skupin CH- CH; a CH;45 jakož i dalších nosičů protonových skupin známých substancí se provádí za použití publikovaných posunových dat 'H. Jako doplněk mohou být protonové rezonance u nezávislých zkoušek získány po přidání čistých látek. Stanovení koncentrací jednotlivých látek se provede integrací odpovídajících protonových rezonancí a koncentračního standardu TSP, s ohledem vždy na odpovídající počet rezonancí a na zředovací faktor. Kvantitativní vyhodnocení spektra se

5(i provede podle následujícího vzorce:

T rsu/Tu Ntsp

Cu .......... ..... (vzorec 4)

A tsf Α'μ

Cm - Koncentrace metaholitů (M).

C_Tps - Koncentrace koncentračního standardu.

T_M = Integrál pod zájmovým pikem (M).

T_Tsp ⁼ Integrál koncentračního standardu.

F_d = Zřeďovací faktor přidáním koncentračního standardu,

V_M Počet protonů M.

jV|_Sp- Počet protonů v koncentračním standardu.

κι Zkušební postup byl přihlašovateli hodnocen a korelován pro stanovení nízkomolekulárníeh látek s korelačním koeficientem r - 0.998 za použití enzymatických metod. Obr. 1 ukazuje spektrum 'li NMR jednoho pacienta. Typický singlet skupiny NÁCH;); cholinu. cholinovýeh derivátů a derivátů trimcthylamonia je ve spektrech ¹H NMR zpravidla dokazatelný v rozsahu mezí 2,5 až 4.5 ppm. Změny v protonové rezonanci jsou možné v důsledku předanalytických vlivů, jako pi l, i? které mohou teoreticky vést k posunům, rozštěpení a překladům, a musí být proto při vyhodnocování zohledněny. Je vhodné chemické posuny protonových rezonancí CCTD pro zvolené zkušební podmínky analytiky NMR přesně stanovit separátní řadou zkoušek. Singlet NÁCH;).; je zvláště vhodný pro kvantifikaci, protože reprezentuje devět ekvivalentních protonů. Singlet N(Cll·); představující typický nález u akutního infarktu myokardu znázorňuje obr. 2. Koncentrace CCTD byla stanovena podle shora uvedených postupů. Spektroskopie NMR umožňuje např. změnou analytiky a vyhodnocením stanovit celkovou skupinu, podskupinu nebo poddruh CCTD, zatím co imunologické nebo biochemické postupy podle předloženého postupu často určují podskupinu nebo poddruh CCTD. Další příklady provedení postupu podle vynálezu je možné za použití jiných postupů pro stanovení CCTD než je spektroskopie NMR. U biochem ie kých postupů podle vynálezu se umožní reakce, resp. se připraví reakční produkty (např. přísadou enzymů), kterc následně umožní detekci a měření celkové skupiny, podskupiny nebo poddruhu CC I D. l akový postup podle vynálezu může představovat např. modifikace postupu publikovaného Takayamou (Takayama M. a spol., 1977, Clin. Chim. Acta 79: 93-98). Stanovení cholinu se podle toho provede oxidací cholinu za použití ehinolinodázy, a získají se reakční produkty beta i n a peroxid vodíku (ITO|). Vznik peroxidu vodíku (ILOi) se dokáže barevnou reakcí, např. kopulací 4aminoantiporínu a fenolu za přítomnosti peroxidázy, a koncentrace se stanoví proměřením absorpce při 500 nm na cejchovaném spektrofotometru proti slepé zkoušce.

Podobný postup, avšak nespadající do předmětu vynálezu, může být použit pro stanovení celkové skupiny cholinovýeh fosfolipidů, ale použití nespecifické fosfolipázy D bez předcházejícího dalšího dělení nevykazuje znaky vynálezu, protože sc současné měří i velká skupina diaeyl fos foli pidů, které do předmětu vynálezu nespadají. Specifičnost v analytickém postupu použité fosfolipázy, resp. využití předcházejícího dělení rozhoduje o specifičnosti, resp. o druhu analyzované látky. Použije ti se nespecifická fosfolipáza D bez následného dělení, stanovuje se nespecifická celková skupina cholinovýeh fosfolipáz. a tím nejsou splněny základní znaky postupu podle vynálezu. Použijí—li se specifická fosfolipáza D nebo specifická lyso fosfolipáza D, specifické pro substráty podle vynálezu pro plazmenyleholin a/nebo lysoplazmenylcholin, je možné provedení postupu podle vynálezu, protože se měří látky specifické podle předmětu vynálezu. Použití specifických fosfolipáz pro plazmalogeny, resp. lysofosfolipázy pro analytiku CCTD nebylo dosud zveřejněno, zvláště ne pro diagnostické využití podle předmětu vynálezu při akutním koronárním syndromu. Je-li před použitím fosfolipázy vzorek speciálně upraven (např. chromatografíekým dělením, filtrací nebo postupy obohacení), takže se odstraní do předmětu vynálezu nespadající fosfolipidy, zvláště diaeyl fosfolipidy, pocházející z jater, nehraje substrátová specifičnost použité fosfolipázy, resp. lysofosfolipázy již žádnou takovou významnou roli, a specifičnost postupu je určena předcházejícím dělicím procesem. Vyloučení všech fosfolipáz, resp, lysofosfolipáz umož-8CZ 299988 B6 ňuje v průběhu prováděné analytické zkoušky podle shora uvedeného stanovení obsahu eholinu, což je postup pro diagnostiku akutního koronárního syndromu odpovídající předloženému vynálezu. Stanovení obsahu eholinu je možno provést rovněž po jednoduché srážecí reakci s následným fotometrickým měřením, ale v každém případe by sc měla při provedení tohoto jedno5 duchého způsobu analytického stanovení látek podle vynálezu ověřit specifičnost postupu. Při biochemickém stanovení eholinu nebo jiných CCTD v krvi podle vynálezu je možno před kvaniilaiivílím stanovením provést lieinolý/.u eiytióCyíů, např. pomocí saponuiú.

Při použití imunologických postupů podle předloženého vynálezu jsou použity' např. imunologičtí) ké reagencie (např. anti látky), zpravidla v kombinaci s dalšími chemickými a/nebo imunologickými reageneiemi, přičemž se reakcemi získají reakční produkty, které umožňují detekci a stanovení celkové skupiny; podskupiny nebo poddruhu CCTD. K provedení imunologických zkoušek podle vynálezu může být použita metodika uveřejněná Smaleni a Baldou (Smál M. A. a spol., Lipids 26: 1130-1135; Baldo B. A. a spol.. L.ipids 26: 1136-1139). Tyto publikace jsou is zahrnuty. Při vývoji imunologického zkušebního postupu podle vynálezu se v prvé řadě připraví imunogen CCTD. Při tom se syntetizované nebo dobře přečištěné CCTD přemění na analogy

CCTD a pak jsou navázány na protein (např. methylovaný sérunialbumin skotu). Potom se živočichové (např. zajíci nebo ovce) imunizují konjugátem CCTD proteinu a vytvořené CCTD anti látky se izoluji a přečistí, např. pomocí afiniční chromatografie. Specifičnost anti látek na

CCID a/nebo podskupiny nebo poddruhy CCTD by se měla náležitě přezkoušet. CCTD anti látky jc konečně možno využít při různé technice ke kvantitativní diagnostice.

Při provedení radioimunní zkoušky radioaktivitou značené antigeny (např. ^Ι2Ί CCTD) s antigenem zkoušené látky (CCTD) zkoušky ruší malé přítomné množství antiCCTD-antilátek ve zku25 šebním vzorku. Vytlačení radioaktivně značených CCTD antiCCD T-anti látkám i je v kvantitativním vztahu ke koncentraci CCTD ve zkoušeném vzorku, a je možno je stanovit podle standardní křivky, např. po vysrážení radioaktivních CCTD vázaných na anti látky.

Pomocí podobného principu je možno provést stanovení CCTD pomocí chemiluminiscenčního postupu (CCTD CEL1A). CCTD a luminolem značené antigeny ruší limitované množství antilátek vázaných na pevnou fázi. Měřený světelný signál je nepřímo úměrný koncentraci CCTD ve vzorku z pacienta.

Dále může být imunologické stanovení CCTD provedeno též fluorescenčně polarizovanou imuni35 začni zkouškou. Přitom ruší definované množství přítomných korespondujících CCTD značených fluoroforem s CCTD ve vzorku nepatrné množství přítomných odpovídajících anti-CCTD-antilátek ve vzorku, Registruje se vliv fluoroforem značené CCTD po vytvoření anti látek. K. měření se použije technika fluorescenční polarizace, při které se měří změna úhlu polarizovaného fluorescenčního záření, které po vybuzení emituje fluofor. Pokud jsou přítomné fluoroforem značené

CCTD vázané na antilátky, mohou se málo, ale ve volném stavu dobře otáčet v čase mezi absorpcí a emisí. Polarizace je při nízké koncentraci CCTD veliká (změna úhlu emitovaného záření malá) a pří vysoké koncentraci CCTD malá (změna úhlu veliká).

Imunologické stanovení obsahu CCTD podle vynálezu může být rovněž provedeno sendvičovou

4? zkouškou, pokud sledované CCTD, resp. podskupiny nebo poddruhy CCTD mají nejméně dva rozdílné epitopy; nebo se nechají specifickou reakcí převést na látku s nejméně dvěma epitopy; V tomto případě je možné provedení imunoabsorpění zkoušky (linked immunoabsorbent assay) (CCTD-ELIS A). Anti CCTD antilátky jsou v tuhé formě vázány, např. na mikrotitrační desce, na magnetických částicích, na plastických perlách nebo konečně na stěnu trubičky. Přidá-li se nále50 žité zpracovaný vzorek, váže se CCTD vzorku na antilátky. Množství vázaného antigenu CCTD se stanoví přidáním značené druhotné antilátky, která váže antigen CCTD za vzniku sendviče. Čím vyšší je koncentrace vázaného CCTD, tím větší je množství vázané v sendviči, lj. enzymem značená druhotná antilátka. Pro určitý rozsah koncentrace CCTD platí lineární vztah mezi koncentrací CCTD a aktivitou enzy mu.

-9CZ 299988 Bó

Podobny je podle vynálezu postup stanovení CCTD pomocí tzv. zkoušky mikrobeadenzymimmunoassay (CCTD-MEIA - enzymová mikroperlová imunitní zkouška), při které antiCCTD-antilátka je vázána na mikroperly. Při prvním kroku postupu se inkubuje vzorek s mikroperlami antilátky, pak se přidá druhotná značená antilátka ve formě alkalické fosfatázy (AP). Dochází k vytvoření sendviče na mikroperlách. V dalším postupu se část reakční směsi odpipetuje na matrici zc skleněných vláken, která má vysokou afinitu k mikroperlám a váže je. Po promytí matrice ze skleněných vláken s roztokem substance a po odstranění nevázané značené druhotné AP—látky se může v sendviči vázaná AP na mikroperlách zc substrátu, např. methyl umbcllifcrry!fosfátu, odštěpit jako fosfátová skupina. Fluorescence vzniklého methylumbelliferonu se proměří v dopadajícím světle při 448 nm. Sendvičové techniky jsou nevhodné pro malé molekuly jen s jedním cpitopcm aje možno je použít jen u vybraných CCTD s nejméně dvěma epitopy. resp. u takových CCTD, které je možné specifickou chemickou reakcí převést na analogické molekuly s nejméně dvěma epitopy.

Dále je možné ke stanovení množství CCTD využít další varianty a specifikace imunologických metod. K tomu se přičítají přímá imunologická stanovení antigenů. stanovení jako rozpustné imunokomplexy. nepřímá imunologická stanovení, další stanovení antigenů, resp. antilátky značením reakčního partnera, stanovení pomocí vázání ligandů a další heterogenní a homogenní imunologické metody. V rámci imunologických metod pro stanovení obsahu CCTD mohou být

2o využity dělicí techniky jako adsorpce. srážení, imunní srážení a/nebo princip tuhé fáze a stejně i rozličné postupy využívající značení, jako radioaktivní značení (např. ’^I), enzymatické značení (např. alkalická fosfatáza, křenová peroxidáza. glukóza-6-fosfat-dehydrogenáza), nebo fluorescenční a luminiscenční značení (např. chemiluminiscence, bioluminiscencc). Rozhodujícím kriteriem je specifické stanovení CCTD, resp. některé podskupiny nebo poddruhu CCTD nebo někte25 rého reakčního produktu a použití pro diagnostiku akutních koronárních syndromů.

U chromatografie kých postupů pro stanovení CCTD podle vynálezu je možné použít např. po předběžné úpravě vzorku dělení látek rozdělením na klidnou (stacionární) a pohyblivou (mobilní) fázi s odpovídající kvalitativní a kvantitativní výpovědí ohledně CCTD. Stanovení CCDT podle ín vynálezu sc může provést podle metody Brouwcrse (BrouwersJ. F. Η. A spol., 1998, J. Lipid.

Res. 39: 344-353). Po preparaci vzorku a extrakci lipidu se napřed oddělí fosfát idylchol iny od jiných lipidů. To se může uskutečnit pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) např. jako normální fáze I1PCL (NP-HPLC). Po odpovídajícím dělení a sběru eluátu sc provede reverzní chromatografická fáze (RP-HPLC). např. aceton itr i lem, methanolem a triethy lam i nem jako rozpouštědlem. Jako detektorový systém je vhodný Iiglit-scattcring-dctection - měření rozptylu světla). Proměřením standardních roztoků v kombinaci se stanovením fosforu je možné vytvořit cejchovní křivky umožňující kvantitativní stanovení CCTD a zvláště stanovení určitých poddruhů CCTD.

•to Postupy pro chroinatografické a imunologické stanovení mají v porovnání sNMR přednost vtom. že např. je možno specificky rozlišit určité poddruhy plazmenylcholinu s definovanou alkenyíovou skupinou v poloze sn I a určitou acylovou skupinou v poloze sn-2, resp. odlišit od jiných podobných molekul a tím tak zvýšit specifičnost zkoušky ve vztahu ke sledovanému orgánu.

Odborníkovi je zřejmé, že podle vynálezu je možné ke stanovení obsahu reakčních zplodin CCTD použít pracovní postupy příbuzné shora uvedeným způsobům.

Pro stanovení poddruhů CCTD jsou vhodné především molekuly, s kterými sc získá jen malý

5o počet nesprávných pozitivních zkušebních výsledků pro diagnostiku koronárních syndromů. Kromě jiných poddruhů mají význam následující poddruhy CCTD včetně jejich reakčních produktů a mohou podle vynálezu být stanoveny buď samostatně nebo v libovolné kombinaci: 16:0-20:3 plazmenylcholin, 16:0-18:3 plazmenylcholin. 17:0-18:2 plazmenylcholin, 15:0-18:2 plazmenylcholin. 17:0-18:1 plazmenylcholin, 17:0-18:3 plazmenylcholin, 16:0 17:1 plazmcnyl55 cholin, 14:0-18:2 plazmenylcholin, 15:0-18:1 plazmenylcholin, 16:0 lysoplazmenyIcholin. 17:0

-10CZ 299988 B6 lysoplazmenylcholin. 15:0 lysoplazmenylcholin, 14:0 lysoplazmenylcholin a reakční produkty f6:0<alk—l—enyl)—20:3 glycerol 16:0(alk-l-enyl)-l8:3 glycerol, 17:0(alk—l—enyl)_18:2 glyceroL 15:0(alk-1 —enyl)-18:2 glycerol. 17:0(alk—l —enyl)—18:1 glycerol 17.0(alk—l—enyl)—18:3 glycerol. 16:0(alk—1 —enyl)—17:1 glycerol, 14:0(alk—1—enyl) 18:2 glycerol. 15:0(alk—1 —enyI)—18:1 glycerol, 16:0(alk-l enyl) 20:3 glyeerolfosfát, 16:0(alk—1 —enyl)—18:3 glycerol fosfát. 17:0(alk1 enyl) 18:2 glyeerolfosfát, 15:0(alk—1—enyl)—18:2 glyeerolfosfát, 17:0(aIk—1—enyl)—18:l giyceruiiosiai, i / ;u^aiK— i —eny 1i o:j giyceronosiai, ιοάληικ- i —eny i/-- t /; i giyeeronoMaL 14:0(a!k-1 -eny!)—18:2 glyeerolfosfát a Ϊ5:0(aík—1 —eny!) 18:1 glyeerolfosfát. Další poddruhy CCTD a reakční produkty mohou být voleny pro postup podle předloženého vynálezu, pokud jejich stanovení splní znaky podle vynálezu.

Při provedení analytického postupu pomocí spektroskopie NMR mohou být do analytického stanovení vztaženy kromě N (CLl·,);, singletu také jiné molekuly. Kromě toho může být NMR spektroskopie provedena jako jedno, dvou nebo vícerozměrná NMR spektroskopie nebo ve spojení s jinými zkušebními technikami NMR nebo také v napojení na ehromatografícké postupy {např. jako LC NMR),

Jednotnost rozličných možných metod analýzy a techniky podle vynálezu je ve vysoké specifičnosti metody stanovení CCTD, takže jsou podle vynálezu splněny požadavky na včasnou diag2» nostiku akutních koronárních syndromů. Pro selektivní stanovení kardiálnč uvolněných CCTD metodou podle vynálezu mohou být významné určité postupy přípravy vzorku. Tak např. podle popisované metodiky se předcházející ultrafiltrací redukuje nebo podle druhu filtru zcela odstraní množství přítomných a do vynálezu nespadajících hepatiekých diacyI-cholinfosíolipidů, vázaných na protein, zatím co rozpustná frakce kardiálně uvolněných CCTD včetně plazmalogenů se v ultrafíltrátu stanoví. Mohou být použity jíně metodické postupy čištění a/nebo extrakce nebo biochemická modifikace, které vedou k porovnatelným výsledkům. Dále je možné metodiku podle vynálezu provést tak. aby jedna, více nebo všechny molekulové poddruhy kardiálně uvolněných CCTD, resp. jejich reakční produkty, byly analyticky podchyceny.

5(i Kromě stanovení CCTD nabízí ¹ H -NMR spektroskopie možnost ve stejném analytickém postupu stanovit další metabolity; jako krcatin (singlet 3,93 ppm) a dimethylamin (singlet 2,727 ppm), které mají rovněž význam pro diagnostiku infarktu. Kombinace a vyhodnocení vícero metabo li tú v jednom analytickém postupu (např. CCTD, krcatin a dimethylamin) je zde označováno jako základní rozpoznání (pattern-recognition, vzorové stanovení). V porovnání s izolovaným stano35 ven í ni koncentrace CCTD zlepšuje vyhodnocení podle uvedeného základního rozpoznání modus diagnostické schopnosti výpovědi metodiky pro rozpoznání akutních koronárních syndromů.

Zhodnocení výsledku stanovení CCTD:

Zhodnocení výsledků stanovení je provedeno s ohledem na mezní hodnotu. Mezní hodnota je závislá na zkoušené tělní tekutině a na zvoleném analytickém postupu a musí být určena odpovídajícími stanoveními. Je-li naměřená hodnota CCTD vyšší než mezní hodnota, jedná se o akutní případ infarktu myokardu. Je-li naměřená hodnota CCTD nižší než mezní hodnota, je možno akutní infarkt myokardu téměř vyloučit. Analogické platí pro diagnózu instabilní angíny pektoris, přičemž je třeba mezní hodnoty stanovit přezkoušením dostatečného množství pacientů s ohledem na diagnostická zjištění. Při námi prováděném postupu stanovení koncentrace CCTD leží mezní hodnota podle způsobu vyhodnocení mezi 15 až 40 μηιοΙ/I. Uváděná klinická data se vztahují na vyhodnocení s mezní hodnotou 22 μιηοΙ/I. Při tom jc třeba mezní hodnotu, jak již bylo uvedeno, určit jednotlivě pro zvolenou analytickou metodiku, způsob vyhodnocování a přes50 né stanovení požadavku a může ležet např. při imunologickém nebo ehroinatografiekém stanovení obsahu poddruhů CCTD také v jiném měřícím rozsahu, např. v nanomolárním nebo subnanomolamím rozsahu.

Při použití ^]H NMR spektroskopie může dodatečně k izolovanému stanovení koncentrace CCTD být provedeno vyhodnocení podle postupu základního rozpoznání (pattern-recognition) (např.

CZ 299988 Bó dodatečné stanovení kreatinu a dimethylaminu). Při vyhodnocování podle způsobu základního rozeznání se zvýšení obsahu CCTD nebo kreatinu při současné normální koncentraci dimethylaminu využije pro diagnózu AMÍ.

Nálezy u pacientů:

vcelku nyio steuovano zo pacientů a pronanuu tpacientu svomycn kc zkoušce - ň zen. iz muzu; ve věku od 22 do 68 let. zčásti periodicky, s celkovým množstvím provedených, zkoušek 44. Další vzorky byly zkoušeny ze speciálních důvodů. 10 pacientů mělo akutní infarkt myokardu io (4 infarkty přední stěny: 6 infarktů zadní stěny). Vzorky byly odebrány v různých intervalech od do 35 h po začátku bolestí. 60 % vzorků bylo odebráno v prvních šesti hodinách po začátku bolestí. U všech pacientů byla provedena koronární angiograťika (9 akutních pacientů a 1 pacient průběžně). U 9 pacientů s AMI byla provedena reperfuzní terapie, tj. trombolýza, primární perkutánní transluminální koronaroangioplaztika (PTCA). trombolýza srescue-PTCA nebo akutní koronární tepenní bypassová operace (ACVB-OP). IJ jedné pacientky došlo při akutně provedené koronaroangiografii ke spontánní rekanalizaci v infarktu í komoře a ke zbytkovému trombu s dobrým poststenotickým tokem, takže žádná primární PTCA již nebyla provedena. V porovnávané skupině byl jeden pacient se silnými bolestmi toraxu akutně koronaroangio-grafován. přičemž mohlo být koronární srdeční onemocnění vyloučeno. V porovnávané skupině byla pří?o temná různá onemocnění, jako instabilní angína pektoris, stabilní angína pektoris. trauma kosterních svalů, myopatie, z.n. cmbolic plic. plcuritida a ledvinová nedostatečnost. U pacientů s akutním infarktem myokardu došlo k typické vzorové komplikaci jako nedostatečnost levé části srdce a k poruchám srdečního rytmu. Pacient s infarktem přední stěny dostal reanimační kardiogenní šok. který však přežil po trombolýze. akutní PTCA s implantací stentu a intraaortálního balono25 vého čerpadla (IABP).

U všech vzorků bylo provedeno stanovení koncentrace CCTD.

Hodnocení dosažených analytických výsledků určení koncentrace CCTD bylo provedeno s ohlesu dem na stanovenou mezní hodnotu. Jak bylo již uvedeno, ukazují naměřené hodnoty nad mezní hodnotou na akutní infarkt myokardu; hodnoty pod mezní hodnotou naproti tomu na nepřítomnost akutního infarktu myokardu. Určení diagnostické hodnoty bylo vztaženo na vzorek, tj. hodnocení jednotlivých dosažených výsledku bylo provedeno bez ohledu na dřívější nebo pozdější výsledky stanovení u téhož pacienta. U 29 z 30 infarktových vzorků byly nalezeny hodnoty vyšší než mezní. Naopak s výjimkou jednoho vzorku byly hodnoty CCTD u všech pacientů bez infarktu nižší než mezní hodnota. Obr. 3 ukazuje data sloužící k diagnostickému hodnocení CCTD pro diagnózu akutního infarktu myokardu pro celkové časové období 0 až 35 li. Obr. 3 ukazuje, že CCTD má s 96,6 % nejvyšší citlivost a s 95,4 % nejvyšší diagnostickou hodnotu v porovnání se všemi ostatními ukazateli infarktu. Vysoká diagnostická hodnot nost CCTD je i proto pozor u•to hodná. Žc byla zkoušena u mnohých diagnosticky obtížných pacientů, tj. u pacientů s mikroinfarkty (4 z 10 pacientů), u pacientů v prvních hodinách infarktu a u pacientů s traumatem kosterních svalů.

CCTD byla z hlediska diagnostického hodnocení v převaze především v časné fázi konvenčních 45 ukazatelů AMI. Všichni infarktoví pacienti v časovém rozpětí 0 až 6 hodin po začátku bolestí byly na CCTD pozitivní, zatím co jen 37,5 % vzorků pacientů vykazovalo patologické hodnoty

CK nebo CK-MB (viz obr. 4). Myoglobin v důsledku své rychlé kinctiky uvolňování vykazoval druhou nejvyšší citlivost s 62,5 %, je ale, jak známo, nespecifický pro myokard. V prvních 6 h vykazovalo jen 50 % vzorků pacientů s AMI patologickou koncentraci troponinu I/T.

5u

Přednosti CCTD jsou ještě výraznější, uvazují—li se pouze vzorky pacientů v čase 0 až 3 h po začátku bolestí (obr. 5). Zatím co konvenční ukazatele infarktu v prvních třech hodinách po začátku bolestí sotva vykazovaly diagnostickou průkaznost s výkonností mezí 50% a 71 %, rozpoznal se u vzorků pacientů postižených akutním infarktem stanovením CCTD inlárkt již v prvních třech hodinách po začátku bolestí. Další výsledky zkoušek přihlašovatelů potvrzují

CZ 299988 Bó rychlé uvolňování CCTD při akutních koronárních syndromech a jejich vy sokou diagnostickou výpovědní hodnotu v časné fázi po začátku symptomatiky. V pozdní fázi AMI dochází k nepatrnému snížení citlivosti CCTD.

Obr. 6 ukazuje diagnostickou hodnotu CCTD v pozdní fázi AMI. V pozdní fázi AMI ležela citlivost CCTD u 91,6 %. U jednoho vzorku došlo k chybnému negativnímu výsledku zkoušky.

Zvýšení koncentrace CCTD byla až na 92,8 % specifická pro akutní infarkt myokardu. IJ jednoho vzorku byla rovněž nalezena vyšší koncentrace CCTD. bez nálezu akutního infarktu myokardu.

io

Vyhodnocení spekter 'H-NMR způsobem základního rozpoznání (pattern-recogn iti on modus - současné stanovení CCTD, reakěníeh zplodin, kreatinu a dimethylaminu. jakož i jejich libovolné kombinace) zlepšilo hodnotu diagnostické výpovědi metodiky, takže mohly být u všech provedených analýz infarkty myokardu prokázány nebo vyloučeny se 100% citlivostí a 100% speci15 fičností.

Pacienti s instabilní angínou pektoris mají. jak známo, horší prognózu, pokud se v průběhu vyšetřování zjistí vyšší hodnoty kardiálního troponinu (Ohman E. Μ. 1996, N. Engl. J. Med. 335: 1333-41). Předpokládá se, že tito pacienti prodělávají nejen ischemii myokardu, ale také myokar20 diální mikronekrózu, takže nelze vyloučit, že tito pacienti v budoucnosti podle nového klasifikačního systému AMI budou klasifikováni jako mikro infarkty. Rychlá identifikace takových pacientů jc významná především proto, že by se měli pokud možno terapeuticky ošetřit bez ztráty času a případně je nouzově podrobit angiografii. Zkoušky přihlašovatelů ukázaly, že pacienti s angínou pektoris a nekomplikovaným průběhem nemají zvýšené hodnoty CC I D, a že naproti tomu pacienti s myokard iální mikronckrózou vykazují vyšší hodnoty CCTD. Na základě dosavadních poznatků vykazují všichni pacienti s akutním koronárním syndromem, kteří jsou CCTD pozitivní, během času zvýšené hodnoty troponinu. Sériové zkoušky rovněž ukázaly, že pacienti s mikronekrózami ukazují pozitivní hodnoty CCTD o několik hodin dříve než na troponin I nebo troponin T. Dále je třeba vycházet z toho, žc metodika je rovněž účelná při diagnostice těžkých io myokard iálních ischemii, např. při katetrizační intervenci na koronáriích, nebo při nemoceeh s účastí myokardu, např. myokarditidč. Výsledky přihlašovatelů dokazují, že metodika je cenná jak při akutních infarktech myokardu, a stejně tak u nestabilní angíny pektoris, tj. všeobecně při podezření na akutní koronární syndrom.

Různými biochemickými procesy uvolněné CCTD dále metabolizují, resp. modifikují, a vzniká cholin, cholinové deriváty a deriváty trimethylamonia a množství reakěníeh produktů CCTD. Tyto reakční produkty mohou být zlomky nebo určité metabolity CCTD. Jak jc např. známo z izoenzymů CK. může současné stanovení takových reakěníeh produktů být diagnosticky významně jako ukazatelé infarktu myokardu. Sledování přihlašovatelů prokázalo u jedné části

4o pacientu s infarktem vznik takových reakěníeh produktů CCTD. Vznik reakěníeh produktů je kromě jiného zapříčiněno zvýšenou aktivitou určitých fosfolipáz. Kromě fosfolipázy A₂, která kromě jiného přispívá k uvolňování jmenovaného lysoplazmenylcholinu, jsou ve hře, jak bylo úvodem řečeno, další významné enzymy této skupiny, fosfolipázy C a D. Reakční produkty aktivity těchto dvou fosfolipáz při vlivu na plazmalogeny jsou např. 1—O—alk—l -enyl 2 substi4? tuovaný glycerol (prostřednictvím fosfolipázy C), resp. 1 - O -alk-1 '-enyl-2-substituovaný glycerol fosfát (prostřednictvím fosfolipázy D). Tyto reakční produkty vznikají ve zvýšené míře společně s cholinem, resp. fosforyIcholinem, pokud při ischemii myokardu spolupůsobí obě jmenované fosfolipázy na plazmenylcholiny. Popisovaný postup je tedy možno rovněž využít pro stanovení uvedených jednoduchých reakěníeh produktů CCTD, případně jejich kombinaci

5» společně se stanovením CCTD.

.·>

Časový průběh uvolňování CCTD při akutním infarktu myokardu:

Analýzy všech dostupných naměřených hodnot prokázaly (kromě vyloučení jednoho nereprezentativního vzorku), že CCTD se stanou během 60 minut po začátku bolestí pozitivní a vykazují zřejmě dvoufázovou kinetiku uvolňování s včasným maximem po 2 až 3 hodinách a druhým maximem po 5 až 6 hodinách. Porovnání s jinými ukazateli infarktu prokázalo, že k i netiká uvolňování CCTD. s odpovídající nízkou molekulární hmotností, pí obíhá podstatně lycliieji něž uvolňování dosud známých ukazatelů, eož vysvětluje vysokou diagnostickou hodnotu v časné fázi.

io Další zkoušky provedené přihlašovateli u více než 100 pacientu s bolestmi na prsou prokázaly převahu postupu podle vynálezu oproti konvenčním příznakům a podle vynálezu potvrdily vlastnosti vhodné pro včasnou diagnostiku koronárních syndromů.

Metodika k rozpoznání akutního infarktu myokardu a těžkých forem instabilní angíny pektoris i? stanovením a zhodnocením obsahu eholinu, eholinových a/nebo trimclhylamoniových derivátů, vybraných ze skupiny zahrnující fosfory'leholin, plazmalogeny a lysoplazmenyleholin a jejich jednoduché reakční produkty v tělních tekutinách zřejmě předčí všechny dosud zavedené neinvazivní postupy, včetně stanovení známých biochemických znaků pro diagnostiku akutních koronárních syndromu. Kromě akutního infarktu myokardu mohou být uvedeným postupem včas rozpoznány i těžké formy instabilní angíny pektoris s myocytárnínii nekrózami, které ve svém průběhu vykazují zvýšený obsah tropou inu. Výsledky dokazují, že předložený postup je cenný jak pro určení akutního infarktu myokardu, tak i pro stanovení nestabilní angíny pektoris, tj. všeobecně při podezření na akutní koronární syndrom. Zvláštní výhoda vynálezu je podtržena tím. že postupem in—vitro podle vynálezu bude prvně umožněno pacienty s akutním koronárním syndromem a akutním infarktem myokardu včas a s určitostí diagnostikovat, tj. v prvních třech hodinách po začátku bolestí, resp, stanovit vylučující diagnózu. To neumožňuje žádný uveřejněny postup in vitro s podobnou vysokou jistotou. American Heart Association a American Collcgc of Cardiology zjišťují, že „existuje jednoznačná potřeba pro lepší metody k okamžité identifikaci pacienta s akutním infarktem myokardu, které musí být přesné a použitelné tak brzy. jak je jen možné (přeloženo z Ryan 1, J, a spol., ACC7A11A Guidelines for the Management of Patients with Acute Myocardial lnfarctíon, 1996, J. Am, Cardiol, 28: 1328-1428, str. 1340). l aková metoda t.č. neexistuje a podle dat uvedených přihlašovateli splňuje postup podle vynálezu požadované požadavky.

Postup se vztahuje na diagnostiku jasně definovaných obrazů nemoci akutních koronárních syndromů, zahrnující instabilní angínu pektoris a akutní infarkt myokardu, který může probíhat jako infarkt typu Q-wave nebo jako non-Q-wave. Sledování jiných obrazů nemoci, jako např. mozkový infarkt, které jsou s ohledem na jejich palomorfologii a palobiochemii v mnohém ohledu rozdílné, nedovolují analogické úsudky podle postupu podle předloženého vynálezu.

Postup pro včasnou diagnostiku akutních koronárních syndromů podle vynálezu je možné provést různými analytickými postupy, resp. technikami, vzhledem ktomu. že stejné hodnotné výsledky stanovení určitých látek je možné získat různými způsoby, které jsou pro případ CCTD často v literatuře popisovány. Postup zahrnuje kromě výběru jedné vhodné metody měření i výběr jedné vhodné tělní tekutiny, zahrnuje odpovídající postupovou a zkušební techniku přípravy vzorku, specifické stanovení obsahu CCTD a/nebo jejich reakčních produktů, vybraných ze skupiny zahrnující 1—O—alk—1 '—enyl—2—substituovaný glycerol a 1-O—alk—1enyí—2—siibstituovany glyeerol-fosfát, a odpovídající vyhodnocení pro diagnostiku pacienta s akutním koronárním syndromem. Protože uvolněné CCTD pronikají do různých tělních tekutin a tělních částí, je ui použití postupu možné i při zkouškách jiných tělních částí. např. tkání. Existuje ovšem možnost, že se diagnostická hodnota v porovnání s popsaným příkladem využití sníží. Protože v rámci uvolňování CCTD vzniká i větší množství reakčních produktů CC 1 D, spadající do skupiny zahrnující 1-O-alk-l' enyl-2-substituovaný glycerol a 1-O-alk-l -enyl-2-substituovaný glycerol fosfát, je možné podle předloženého postupu stanovit a tím i dokázat přítomnost lakových reakčních produktů. Dále je možné postup provádět tak, aby byly získány polokvantita-14CZ 299988 B6 tivní nebo kvantitativní výpovědi, tj. rych lote sty na CCTD barevnou reakcí a tím dokázat, zda sc jedná o infarkt myokardu nebo ne. Postup může být prováděn tak, že se stavy nebo pochody determinované obsahem CCTD nebo reakčními zplodinami CCTD pozorují nebo vy volají.

Kromě rozpoznání akutních koronárních syndromů nabízí předložený postup výhled na získání dalších diagnostických informací jako je velikost infarktu, prognózy , kontrolu terapie a prognózy určitých možných komplikací, rizika a o klinickém průběhu. Zvláštní hodnota předloženého postupu podle vynálezu je zdůrazněna tím, že vykazuje diagnostické vlastnosti, které jsou již dlouho požadovány mezinárodní komisí expertů, jako American Heart Assoeiation a American College of Cardiology, pro vývoj metodiky in—vitro pro včasnou diagnostiku akutních koronár10 nich syndromů.

Vcelku má popsaný postup pomoci snížit značné problémy současné včasné diagnostiky akutních koronárních syndromů a zlepšit diagnostiku a terapii nemocného pacienta.

is Ve shora uvedeném popisu, nárocích a výkresech znázorněné ukazatele mohou jak jednotlivě, tak i v libovolné kombinaci mít význam pro uskutečnění vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob in vitro pro rozpoznání a diagnostiku akutních koronárních syndromů, zvláště akut25 ního infarktu myokardu, vyznačující se t í m , že se v tělních tekutinách nebo tělních částech stanoví obsah choi i nu, derivátů choi inu a derivátů trimethy lamou i a vybraných ze skupiny zahrnující fosforylcholin, plazmalogeny a lysoplazmenylcholin nebo že se v tělních tekutinách nebo tělních částech stanoví reakění produkty choi i nu, derivátů cholínu a derivátů trimethy 1amonia vybraných ze skupiny zahrnující fosforylcholin, plazmalogeny a lysoplazmenylcholin

3o přičemž jsou reakění produkty vybrané ze skupiny zahrnující I—O—alk—l '-enyl-2-substituovaný glycerol a 1-O-alk-l '-enyl-2-substiluovaný glycerol fosfát.
2. Způsob in vitro podle nároku 1. vyznačuj ící se t í m , že se obsah cholínu, derivátů choi inu a derivátů tr imethy lamonia vybraných ze skupiny zahrnující fosforylcholin, plazmalo15 geny a ly soplazmenylcholin vyhodnotí s ohledem na mezní hodnotu.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2. vyznačující se tím. že se v tělních tekutinách nebo tělních částech pozoruje stav nebo pochody způsobené obsahem cholínu. choi inových derivátů nebo derivátů trimethylanmonia vybraných ze skupiny zahrnující fosfory lcholin. plazmalogeny
4ó a lysoplazmenylcholin a/nebo jejich reakčních produktů vybraných zc skupiny zahrnující I -O-alk- 1' enyl-2-substituovaný glycerol a lO alk— 1 -enyl-2-substituovaný glycerolfosfát.

4. Způsob in vitro k rozpoznání a diagnostice akutních koronárních syndromů, zvláště akutního infarktu myokardu, vyznačující se t í m , že se provede polokvantitativní nebo kvalita45 tivní pozorování a hodnocení obsahu choi inu, choi inových derivátů nebo derivátů trimethyIamonia vybraných zc skupiny zahrnující fosforylcholin, plazmalogeny a lysoplazmenylcholin a/nebo jejich reakčních produktů vybraných ze skupiny zahrnující 1-O-alk-l -enyl-2-substituovaný glycerol a 1-O-alk-l -enyl-2-substituovaný glycerolfosfát nalezených při jejich stanovení v tělních tekutinách a tělních částech.
5. Způsob in vitro podle jednoho z předcházejících nároků, vyznačující se t í m , že se pro stanovení obsahu choi inu, choi i nových derivátů nebo derivátů tri methyl anion i a vybraných zc skupiny fosforylcholin, plazmalogeny a lysoplazmenylcholin, a/nebo jejich reakčních produktu vybraných ze skupiny zahrnující 1—O—alk—I '—eny 1—2—substituovaný glycerol a 1-0 alk 1'

55 enyl-2-substituovaný glycerolfosfát použijí analytické metody zahrnující nukleární magnetickou

15C7. 299988 B6 rezonanci (NMR), biochemické, enzymatické, imunologické, klinicky chemické, chromatografické. hmotově spektrometrické. elektrochemické a fotometrické postupy.
6. Způsob in vitro k rozpoznání a diagnostice akutních koronárních syndromů, zvláště infarktu myokardu, vyznačující se t í m , že se provede NMR spektroskopie tělních tekutin nebo tělních částí a vyhodnocení podle vzorkového rozpoznávání látek (pattern--recognitton). zvláště cholinu. choluiovýcli derivátů a/nebo derivátů ů imethy lainmoiiia, vybraných ze skupiny fosforyicholin. plazmalogeny a lysoplazmenylcholin. ajejich reakčních produktů, vybraných ze skupiny zahrnující 1 O alk-1 '-enyl-2-substituovaný glycerol a 1-O-alk-l -enyl-2-substituovaný glycerol fosfát a dále kreatin a dimcihylamin.
7. Způsob in vitro podle jednoho z předcházejících nároků, vyznačující se t í m , že se z tělních tekutin nebo tělních částí zahrnujících sérum, plazma, krev. zpracované krevní vzorky nebo moč provede stanovení cholinu, chol inových derivátů a/nebo derivátů tri methyl amonia

5 vybraných ze skupiny zahrnující fosfory Icholin, plazmalogeny a lysoplazmenylcholin, a/nebo jejích reakčních produktů, vybraných ze skupiny zahrnující 1-O-alk-l -enyl-2-substituovaný glycerol a 1-O-alk-l'-enyl-2 substituovaný glyeerolfosfát.