CZ299740B6 - Kontinuální systém vysoce výkonného screeningu s použitím planárních matric - Google Patents
Kontinuální systém vysoce výkonného screeningu s použitím planárních matric Download PDFInfo
- Publication number
- CZ299740B6 CZ299740B6 CZ20002078A CZ20002078A CZ299740B6 CZ 299740 B6 CZ299740 B6 CZ 299740B6 CZ 20002078 A CZ20002078 A CZ 20002078A CZ 20002078 A CZ20002078 A CZ 20002078A CZ 299740 B6 CZ299740 B6 CZ 299740B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- matrix
- assay
- gel
- substance
- ligand
- Prior art date
Links
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 title description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 150
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 140
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 43
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 34
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000000151 deposition Methods 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 83
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 72
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 43
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 15
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 4
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 4
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 2
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 claims 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 abstract 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 113
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 78
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 51
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 40
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 40
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 40
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 38
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 35
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 30
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 28
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 28
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 21
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 102000009816 urokinase plasminogen activator receptor activity proteins Human genes 0.000 description 16
- 108040001269 urokinase plasminogen activator receptor activity proteins Proteins 0.000 description 16
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 15
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 15
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 15
- 239000010408 film Substances 0.000 description 15
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 15
- 108010030694 avidin-horseradish peroxidase complex Proteins 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 13
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 11
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 11
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 11
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 9
- 239000005033 polyvinylidene chloride Substances 0.000 description 9
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 8
- 229920001328 Polyvinylidene chloride Polymers 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 8
- 101710088786 Elongation factor 3 Proteins 0.000 description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- GNNALEGJVYVIIH-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydrochloride Chemical compound Cl.NC1=CC=CC=C1N GNNALEGJVYVIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- -1 compound compound Chemical class 0.000 description 7
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 5
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 4
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 4
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 229920002457 flexible plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 3
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 3
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 3
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 3
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M (R)-lactate Chemical compound C[C@@H](O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N D-Cycloserine Chemical compound N[C@@H]1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N D-Cycloserine Natural products NC1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 2
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 2
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 2
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 2
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 2
- 238000012801 analytical assay Methods 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 239000006177 biological buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 2
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M malachite green Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940107698 malachite green Drugs 0.000 description 2
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000131 polyvinylidene Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000005201 scrubbing Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002911 sialidase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O vancomycin(1+) Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C([O-])=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)[NH2+]C)[C@H]1C[C@](C)([NH3+])[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- SXAMGRAIZSSWIH-UHFFFAOYSA-N 2-[3-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,2,4-oxadiazol-5-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NOC(=N1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 SXAMGRAIZSSWIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JINJZWSZQKHCIP-UFGQHTETSA-N 2-deoxy-2,3-dehydro-N-acetylneuraminic acid Chemical class CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C=C(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO JINJZWSZQKHCIP-UFGQHTETSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 101100094968 Caenorhabditis elegans sam-10 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010018976 Interleukin-8A Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- JINJZWSZQKHCIP-UHFFFAOYSA-N Neu5Ac2en Natural products CC(=O)NC1C(O)C=C(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO JINJZWSZQKHCIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940123424 Neuraminidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZHJMEDXRYGGRV-UHFFFAOYSA-N Vinyl chloride Chemical compound ClC=C BZHJMEDXRYGGRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPKUGWDQUVWHIC-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine tetrahydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.NNC1=CC=C(C=C1)C1=CC=C(NN)C=C1 GPKUGWDQUVWHIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009833 antibody interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005282 brightening Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000013626 chemical specie Substances 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 229940042406 direct acting antivirals neuraminidase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000469 ethanolic extract Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 108010038415 interleukin-8 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010681 interleukin-8 receptors Human genes 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000670 ligand binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000003541 multi-stage reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000013148 permeation assay Methods 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 1
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00277—Apparatus
- B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
- B01J2219/00527—Sheets
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00585—Parallel processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00596—Solid-phase processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
- B01J2219/0061—The surface being organic
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
- B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
- B01J2219/00623—Immobilisation or binding
- B01J2219/0063—Other, e.g. van der Waals forces, hydrogen bonding
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00639—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium
- B01J2219/00641—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium the porous medium being continuous, e.g. porous oxide substrates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
- B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
- B01J2219/00707—Processes involving means for analysing and characterising the products separated from the reactor apparatus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Paper (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Image Processing (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Pyrane Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Geophysics And Detection Of Objects (AREA)
Abstract
Zpusob soucasného testování množství vzorku ruzných látek na jejich zpusobilost zesilovat nebo inhibovat biologický proces, zahrnuje (g) uložení malého objemu každého z více než 96 vzorku rozdílnýchlátek v usporádání na matrici tak, že každá jednotlivá látka je soustredena na své vlastní odlišenémísto a identita každé látky muže být urcena z jejího místa uložení, (h) uvedení této matrice do styku s první porézní matricí obsahující nebo nesoucí rovnomerne rozptýlené zkušební cinidlo a umožnení, aby cást z každé látky difundovala do uvedené porézní matrice takovým zpusobem, že prostorové umístení každé difundované látky muže být korelováno s místem na uvedené matrici, na kterém byla uvedená látka puvodne uložena, a (i) provedení testu prostanovení zpusobilosti každé difundované látky zesilovat nebo inhibovat uvedený biologický proces pozorováním interakce každé látky s uvedeným zkušebním cinidlem, kde uvedenou matricí je planární matrice.
Description
Oblast techniky
Kontinuální systém vysoce výkonného screeningu (CF-HTS), používající nejméně jednu porézní matrici, ve farmaceutickém průmyslu umožňuje, aby se prozkoumávalo veliké množství chemických jedinců na široký rozsah biologické nebo biochemické účinnosti současně. CF-HTS je mimo to užitečný při provádění vícestupňových analytických testů (esejů).
Dosavadní stav techniky
Biochemické a biologické analytické eseje jsou určeny k testování aktivity v širokém rozpětí sys15 témů v rozmezí od protein-protein interakcí, enzymové katalýzy, vazeb malých molekul na proteiny až do buněčných funkcí. Při „vysoce výkonném screeningu“ (HTS) se tyto druhy analytických esejů používají k testování velikého množství chemických jedinců, aby se odhalily dříve neznámé biologické nebo biochemického účinnosti chemických entit.
Homogenní versus heterogenní eseje
Všechny různé druhy biologických esejů mohou být rozděleny do dvou větších tříd: homogenních a heterogenních esejů. Při homogenních esejích jsou všechny reagenty přidávány společně a výsledky ze změří nebo interpretují bez jakékoliv dodatečné manipulace. Například buňky pčsto25 váné na Petriho misce mohou být vystaveny chemikálii. Jestliže je chemikálie pro buňky toxická, bude při prostém pozorování indikovat toxicitu vyjasňující se zóna. V jiném příkladě se mohou použít buňky, jež exprimují protein, který mění barvu buněk. V případě buněk exprimujících βgalaktosidázu, rostoucích na agaru obsahujícím x-gal, se buňky více nebo méně zabarvují modře v závislosti na tom, kolik β—gal proteinu je exprímováno. Takto se může provést homogenní esej pro jakýkoliv biologický krok, který ovlivňuje expresi reportér genu tak, jako je gen β-galaktosidázy. Ještě jiný příklad homogenního eseje používá substrát, který mění barvu nebo fluorescenci, když se zpracuje enzymem. Konečně technologie jako Amershamovy „Scintillation Proximity Assays“ (SPA) měří přímo vazbu radiačně značkovaného ligandu na protein nebo jakékoliv ligandové substance fixované na perle obsahující zářič. Všechny z předcházejících pří35 kladů jsou homogenními eseji, protože nevyžadují jiné kroky než přidání reagentů před konečnou detekcí, měřením nebo záznamem signálu.
Ná druhé Straně heterogenní eseje vyžadují nejméně dva kroky, kťeré nemohou být spojeny do kroku jednoho, protože jsou do určitého stupně inherentně nekompatibilní. Mnohé heterogenní eseje vyžadují na příklad přidávání reagentů podle určitého pořádku (např. když by některé reagenty interferovaly s dřívějšími kroky eseje a jsou však požadovány pro splnění kroků pozdějších), Obecné příklady tohoto druhu zahrnují eseje, při kterých se přidávají reagenty signalizující průběh, aby nepřímo poskytovaly údaj o přítomnosti nebo koncentraci reakčního produktu. Jiný obecný krok při heterogenních esejích je vypírací stupeň. Často musí být v počátcích eseje přidá45 ván nadbytek činidel pro esej a ten je nezbytné před následujícími kroky vymýt, aby reakce mohly probíhat bez vysokého signálu pozadí. Na příklad u eseje vazby s radiačním ligandem je značkovaný ligand nejprve inkubován s proteinem, který je vázán na pevný povrch, avšak ve skutečnosti se pouze malá frakce ligandu váže na omezený počet vazebných míst proteinu. Po inkubaci se musí vymýt přebytek ne svázaného ligandu předem, aby mohlo být provedeno přesné stanovení vázaného radioaktivního ligandu. Vymytí lze dosáhnout různými alternativními metodami, včetně filtrace, opakovaného promývání a dekantace, oddělování precipitátu a fáze a/nebo centrifugace.
Mnohé biologické a biochemické procesy mohou být zkoumány pouze heterogenními metodami,
Dále, navzdory existenci cest pro adaptaci jiných biologických a biochemických procesů na
-1CZ 299740 B6 homogenní metody, tyto jiné procesy pracují při heterogenních metodách s efektivnějšími náklady a/nebo se snadněji dostupnými reagenty. Komerčně jsou dostupné různé metody a soupravy pro homogenní techniky jako SPA (Amersham), fluorescenční polarizace (Jolley ajiní) a časově rozkládaná fluorescence (Packard ajiní), aby byly vyjmenovány jen některé. Užití těchto druhů metod vždy vyvolává dodatečné náklady a spotřebu času. Heterogenní metody se pro mno- j ho esejů více osvědčují a jsou snadnější pro rychlé zavedení. Z tohoto důvodu pokračuje rozšiřo- $ vání heterogenních metod jako je ELISA, vazba na filtrech, RJA, buněčné eseje s luciferázou atd.
Některé z těchto metod budou detailněji popsány níže.
io Vysoce výkonný screening (HTS) *
Pro vyhledávání kandidátů na léčiva se farmaceutický průmysl po léta stále více spoléhal na HTS souborů chemických sloučenin. HTS popisuje metodu, kdy se mnohé jednotlivé sloučeniny testují paralelně tak, že se velký počet testovaných sloučenin prozkoumává na biologickou aktivitu simultánně nebo skoro simultánně. Nejrozšířeněji používané techniky běžně využívají mikrotitrační desky s 96 jamkami, V této úpravě se provádí 96 nezávislých testů současně na jednotlivé 8,cm x 12 cm plastové desce, která obsahuje 96 jamek pro reakci. Typicky vyžadují tyto jamky objemy eseje v rozsahu 50 až 500 μΐ. Vedle desek jsou komerčně dostupné mnohé nástroje, materiály, pipetovače, automatické techniky, myčky desek a odečítače desek vhodné pro 96 jamkovou úpravu pro širokou řadu homogenních a heterogenních esejů.
Až dosud byly snahy zlepšovat HTS soustředěny na zmenšování jamek (miniaturizace). Když je zmenšována velikost jamek, může se zvyšovat počet jamek na každé desce pro uskutečnění více paralelních testů. Dále se snižováním objemů eseje se snižují náklady na reagenty pro testování.
Kromě toho, protože je možné paralelně provádět testy s menšími objemy eseje, je také možné současně testovat více sloučenin pro vyhledávání kandidátů na léčiva. Až dosud miniaturizace výrazně zlepšila 96-ti jamkovou technologii poskytnutím úpravy s 384 jamkami (96 x 4). Viz Comley a spol., J. Biomol. Screening, sv. 2(3), str. 171-78 (1997). Ve skutečnosti byly publikovány i úpravy s vyšší hustotou, včetně úpravy s 9 600 jamkami. Miniaturizace má však neodmys30 litelné náklady a komplikace.
Tyto náklady a komplikace se přímo vztahují na tři primární součásti miniaturizace screeningové úpravy. Za prvé se musí zvládnout udělání menších nádobek pro testování (trubičky, jamky, důlky, atd.). Za druhé se musí zvládnou přesné rozdělování všech pro esej potřebných reagentů do více a menších jamek (zpravidla prováděné pomocí automatických zařízení pro kapaliny, která simultánně rozdělují reagenty do mnoha jamek). Za třetí se musí zvládnout „přečtení“ výsledků testů u souboru s vysokou hustotou.
Za daných požadavků na souběžně prováděné nezávislé eseje, každá složka určuje úkoly a omezení nakolik je miniaturizace vhodné nebo efektivní z hlediska nákladů. Na příklad novější zmenšení úprava může vyžadovat úplně odlišnou metodu rozdělování reagentů, nebo vyžaduje čtecí instrument, který má rozlišení, citlivost a technické provedení, které jsou s novější zmenšenou úpravou kompatibilní. Když se zredukuje velikost každé jamky, stává se způsobilost vyrobit řadu nádobek, rozdělit reagenty po malých kvantech a přečíst každý vzorek testu, také nesnadnější, časově náročnou a nákladnou. Menší velikost vzorku dále také zvyšuje statistické kolísání od vzorku ke vzorku kvůli nepřesnostem tkvícím v rozdělování malých objemů reagentů a v zaznamenávání slabších signálů vzorku. Kromě toho jakmile velikost vzorku klesne za určitý bod, přispějí k větším nákladům a složitosti realizace novější, miniaturizované úpravy i faktory jako je odpařování a povrchové napětí. Pro zásadní pokrok v HTS technologii si průmysl toužebně přeje možnost „esejů s volnou úpravou“ nebo esejů, u nichž nejsou fyzikální bariéry mezi vzorky. Ve skutečnosti nikdo nepopsal použití volné úpravy při HTS se standardními kolekcemi oddělených sloučenin předpovídané typicky jako testování malých kapiček v úpravě postrádající jakékoliv jamky.
-2CZ 299740 B6
Kombinatomí screeningové soubory - metody gelové permeace
S nástupem kombinatomí chemie mohou být na pevných podkladech (obvykle perličkách) produkovány miliony chemických entit. Přestože 96-ti jamková úprava byla použita k prozkoumávání souborů na bázi perliček, je tato úprava obecně považována jako neefektivní, protože (1) každá perle nese pouze malá množství chemického jedince: (2) počet sloučenin, které mají být testovány je enormně veliký; a (3) s perličkami se nesnadno manipuluje na mikrotitračmích deskách s 96 jamkami.
Aby se vyhnuli problémům vlastní při screeningu kornbinatomích souborů v úpravě s 96 jamkami, uvádějí někteří použití jednoduchých homogenních esejů, které by mohly být popsány jako „volná úprava“. Jako příklad byl Jayawickremem a spol, v Proč. Nati. Acad. Sci. (USA), sv; 191, str. 1614-18 (březen 1994) publikován esej používající pigmentové buňky (melanocyty) v jednoduchém homogenním eseji pro kombinatomí peptidovou sbírku. Autoři umístili do petri misek buňky pod agarózu, potom na povrch agarózý umístili perle, které nesly kombinatomí sloučeniny a potom sloučeniny z perel částečně uvolnili. Aktivní sloučeniny byly vidět jako oblasti tmavého pigmentu, protože aktivní sloučeniny způsobily, že buňky měnily barvu, jakmile sloučeniny místně difundovaly do matrice gelu.
Jiným recentním příkladem je práce Daniela Chelsky-ho „Stratég ies for Screening Combinatorial Libraires“ publikovaná na First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening ve Filadelfii, PA (listopad 7-10 1995). Chelsky umístil jednoduchý homogenní enzymový esej pro uhličitou anhydrátu dovnitř agarózového gelu tak, aby enzym v gelu způsobil změnu barvy gelu. Na to pak byly dovnitř gelu umístěny perle nesoucí kombinatomí sloučeniny cestou foto25 citlivých spojů a sloučeniny byly částečně uvolněny UV-světlem. Sloučeniny, které inhibovaly enzym byly zaznamenávány jako místní zóny inhibice vykazující menší změnu barvy. Konečně v Molecular Diversity, sv, 2, str, 57-63 (1966) popisuje Satmon a spol. metodu podobnou metodě ' Jayawickreme-ho a spol., při níž jsou kombinatomí soubory prozkoumávány na sloučeniny, které mají cytotoxické účinky na rakovinové buňky rostoucí na agaru.
Všechny tři příklady jsou variace dlouhodobých testů gelových esejů pro antibakteriální nebo protirakovinná činidla a jsou také podobné běžným imunologickým esejům, při kterých se v gelu zjišťují interakce antigen / protilátka. I když tyto gelově permeační eseje byly velmi vhodné pro screening kornbinatomích souborů na bázi perel, nikdo nepublikoval rozšíření této úpravy na heterogenní eseje nebo na soubory, které nejsou na perlách založeny. Konvenční rozumová úvaha odrazovala výzkumníky od testování vzorků v kontinuální úpravě, která by dovolovala smíchávání vzorků. Mezí omezenými druhy publikovaných esejů a záležitostí, kdy vzorky byly společně zkoumány v kontinuální úpravě, byly analyzovány pouze soubory založené na perlách. Díky těmto omezením výzkumníci věřili, že 96-ti jamková úprava byla vhodnější pro heterogenní screening souborů a nikoliv screening založený na perlách. Bylo by žádoucí provádět heterogenní eseje v rámci volné úpravy. Bylo by dále žádoucí testovat individuální sloučeniny v rámci volné úpravy.
Podstata vynálezu
Zde popisovaný vynález, kontinuální úprava vysoce výkonného screeningu (CF-HTS), úspěšně uskutečňuje koncept volné úpravy pro každý homogenní nebo heterogenní esej, který může být provádět v 96-ti jamkové úpravě. Vedle toho je CF-HTS rovněž užitečný ^prozkoumávání kornbinatomích souborů pomocí heterogenních esejů a nejen esejů homogenních. Navíc dále se mohou při CF-HTS analyzovat individuální sloučeniny bez nákladů a komplikací, které jsou spojeny $ miniaturizací, Obavy týkajíc se možnosti, že reagenty a výsledky testování budou spolu probíhat společně během následujících kroků se ukázaly jako neopodstatněné.
-3CZ 299740 B6
Předmětem vynálezu je způsob současného testování množství vzorků různých látek na jejich způsobilost zesilovat nebo inhibovat biologický proces, zahrnující (a) uložení malého objemu každého z více než 96 vzorků rozdílných látek v uspořádání na matrici tak, že každá jednotlivá látka je soustředěna na své vlastí odlišené místo a identita každé látky může být určena z jejího místa uložení, (b) uvedení této matrice do styku s první porézní matricí obsahující nebo nesoucí rovnoměrně rozptýlené zkušební činidlo a umožnění, aby část z každé látky difundovala do to uvedené porézní matrice takovým způsobem, že prostorové umístění každé difundované látky může být korelováno s místem na uvedené matrici, na kterém byla uvedená látka původně uložena, a (c) provedení testu (eseje) pro stanovení způsobilosti každé difundované látky zesilovat nebo inhibovat uvedený biologický proces pozorováním interakce každé látky s uvedeným zkušebním činidlem, přičemž podstata vynálezu spočívá v tom, že uvedenou matricí je planámí matrice.
Detailní.popis vynálezu
Ústřední ideou CF-HTS je umístit testované vzorky do kontextu s porézní matricí. Metoda zahrnuje umístění jedné nebo více složek eseje dovnitř, navrch nebo naspod matrice jako je gel, plastová fólie, filtr nebo jiné formy snadno manipulovatelného pevného podkladu. Když se do porézní matrice zavedou vzorky, difundují dostatečně pomalu tak, že eseje je možné provádět, aniž by testované vzorky probíhaly spolu. Takto CF-HTS úprava rozděluje testované vzorky difúzí, spíše než neprůchodnou bariérou. Jestliže se nechají běžet testy příliš dlouho, budou eventuálně testované vzorky a výsledky probíhat společně. Avšak při pečlivém načasování dovoluje CF-HTS simultánní screening velmi vysoké hustoty sloučenin ještě individuálně, bez potřeby plnit jednotlivé jamky nebo reakční jímky rozpouštědly nebo složkami eseje. K tomu navíc, se v této úpravě mohou manipulací s matricemi, které nesou reakční komponenty, provádět i složité heterogenní eseje. Manipulace s matricemi pro heterogenní eseje je zcela bezprecedentní a činí CF-HTS ve své schopnosti prozkoumávat široký rozsah biologických a biochemických procesů tak flexibilní jako 96-ti jamkovou úpravu. CF-HTS dosahuje dále druhy výhod předpokládaných pro miniaturizaci bez závažných nevýhod a má jedinečné výhody. CF-HTS využívá širokou řadu matric a komponent pro eseje. Matrice zahrnují, ale neomezují se jen na gely složené7 z agarózy, akrylamidu nebo jiných želatinózních materiálů, membrány, filtry a plasty. Matrice mohou být složeny z materiálů včetně, ale nejenom, z polystyrenu, polypropy40 lénu, jiných plastů, papírových vláken, skla, skleněných vláken, křemeliny, polykarbonátu, polyesteru, póly viny lenchloridu a polyethylenu. Matricemi mohou být impermeabilní tuhé látky, porézní tuhé látky jako filtry nebo gely. Složky esejů zahrnují, ale neomezují se jen na makromolekuly jako nukleové kyseliny, proteiny a jiné syntetické nebo přírodní makromolekuly; buňky, lyzáty buněk, biologické extrakty, organely a jiné složité biologické entity a směsi; a malé molekuly jako pufry, soli, inhibitory, substráty, peptidy, barviva, nukleotidy, kofaktory, ionty a rozpouštědla.
CF-HTS esej je esejem, v němž se mnohočetné testované vzorky nebo sloučeniny rozdělují difúzí spíše než neprůchodnou bariérou. Kritickou složkou je zavedení vícečetných (více než 1) testovacích vzorků dovnitř nebo na porézní matricí eseje, která případně obsahuje jednu nebo více složek eseje. Porézní matrice eseje, obsahující komponentu(y) pro esej, se připravují přidáváním, míšením, litím, rozmísťováním nebo namáčením komponent eseje do matrice. Porézní matrice se připravuji také spojováním, natíráním, vazbou, fixováním, napojením, konjugací nebo přichycováním komponent eseje do vnitřku nebo na povrch matrice. Mimo to se porézní matrice . připravuje dále také vytvářením tenkého filmu roztoku nebo kapaliny na buněčném podkladu,
-4CZ 299740 B6 enzymu nebo jiné imobilizované složce eseje. Porézní matrice pro esej se používají, aby se kontrovalo pořadí a/nebo doba přidávání komponent a rozsah míšení a difúze, když se komponenty eseje kombinují. CF-HTS může využívat i matrice neporézní. Neporézní matrice pro esej se připravují spojováním, natíráním, vázáním, fixováním, napojením, konjugací nebo přichycová5 ním komponent nebo testovaných vzorků do vnitřku nebo na povrch matrice. Použití neporézních matric pří CF-HTS fixuje prostorově jednu nebo více složek eseje.
Když se složky eseje zavedou na povrch matrice, jsou komponenty eseje připojeny kovalentně nebo nekovalentně, specifickými nebo nespecifickými interakcemi s matricemi, které jsou nederi10 vatizovány, derivatizovány nebo jinak předem upraveny, aby se připojení složek eseji usnadnilo. Složka eseje je po připojení prostorově fixována, takže je pro účely eseje imobilizována. V tomto případě buď musí být testované vzorky schopny difundovat matricí, aby dosáhly na komponenty eseje a/nebo subkomponenty nebo produkty eseje musí být schopny difundovat matricí, aby dosáhly na testované vzorky.
V jednom nebo některém zvíce následujících kroků se používá nejméně jedna porézní matrice obsahující vzorky testu.
(1) Uvedení povrchu porézní matrice do kontaktu s nejméně jednou jinou (porézní nebo neporézní) matricí tak, že vzorky a/nebo více složek eseje mohou difundovat přes rozhraní.
(2) Oddělení dvou nebo více matric, aby se zastavila interakce mezi komponentami a/nebo vzorky.
(3) Uvedení povrchu dvou nebo více porézních matric do kontaktu tak, že mohou složky eseje interagovat.
(4) Promytí, propláchnutí nebo eluování matrice kapalnými pufry nebo jinými rozpouštědly, aby se odstranily nenavázané a/nebo nespecificky vázané složky eseje.
(5) Rozdělení, nalévání, přidávání nebo namáčení složek eseje v roztoku na matrici nebo filtrování uvedených komponent skrze matrici.
(6) Zobrazení, přečtení, skenování, detekování nebo jiné zviditelnění radiometrických, fluorescenčních, spektrofotometrických nebo elektromagnetických signálů přítomných na nebo v jedné nebo více matricích.
CF-HTS poskytuje proti dřívějšímu způsobu mnohé výhody. Nepřítomnost oddělených jamek 40 eliminuje nutnost současně a přesně rozdělovat do jamek složky eseje nebo reagenty. Místo toho se složky eseje rozdělují a mísí homogenní manipulací dohromady. Vzhledem k tomu, že složky eseje se připravují pohromadě jako homogenní vzorek nebo jako matrice, existuje minimální statistické kolísání od vzorku ke vzorku. Pro srovnání přítomnost jamek v 96-ti jamkové úpravě způsobuje velké statistické kolísání od vzorku ke vzorku.
CF-HTS dále zajišťuje pro veliký počet sloučenin sereening s mimořádně vysokou četností. Dokonce i když zaznamenávané zásahy „probíhají společně“ v omezeném rozsahu, je zapotřebí pouze znovu otestovat sloučeniny, které jsou umístěny blízko zásahu. Tak jestliže bylo 10 000 testovaných vzorků schopno zredukovat se na 50 kandidátů v okolí zviditelněné oblasti, je pak snadné zredukovat 50 kandidátů na aktivní sloučeninu(y) i pomocí staré technologie s 96-ti jamkami.
Rozdělením a vysušením jednotlivých sloučenin na plastových fóliích ve vysoce naplněných souborech a potom jejich aplikováním v CF-HTS, se odstraní všechny kritické problémy mini55 aturizace. Tato úprava nevyžaduje pro miniaturizaci inovaci co do plastů nebo jiných materiálů,
-5CZ 299740 B6 protože miniaturizace je dosaženo jednoduše omezením množství vzorku, který difunduje do matice. Tato úprava také nevyžaduje mikrofluidika pro rozdělování činidel pro esej, protože celý esej probíhá v podstatě v Jedné obří jamce“, kde jsou reagenty a roztoky manipulovány ve velkém množství. Rozdělování pomocí mikrofluidik vyžadují pouze testované vzorky. Vedle toho při této úpravě existuje mnohem méně statistických výkyvů, protože je pouze zapotřebí vyhledat lokalizované zóny heterogenity v jinak homogenní matrici. Nemusí se přečítat a srovnávat . mnoho rozdílných jamek. Vedle toho ke všem předpokládaným blahodárným stránkám miniaturizace (náklady, výkon, využití reagentů, využití testovaných sloučenin), poskytuje CF-HTS také překvapující výhody jako je schopnost uskutečnit většinu kroků eseje pohromadě.
10
Ústředním hlediskem CF-HTS je pozorování, že složky eseje a testované vzorky stranově nedifundují rychle ani na rozhraních mezi matricemi. Když se na příklad agarózový gel umístí na plastovou desku, objeví se výrazná kapalina na rozhraní povrchu gelu. Když se vyžaduje interakce mezi složkou eseje v gelu a složkou eseje na desce (jako v příkladu ELISA), je kritické, že komponenta v gelu je schopna difundovat z gelu ven a na desku, Avšak CF-HTS vyžaduje, aby průvodní stranová difúze byla značně pomalejší, takže interakce na desce je lokalizována do blízkosti původního umístění složky z gelu. Tytéž principy se týkají každého rozhraní matricematrice mezi gely, filtry nebo povrchy (nebo každé jiné matrice) v jakékoliv kombinaci. Představa, že toto difuzní chování je kontrolovatelné, a že je obecně aplikovatelné na rozhraní všech matric, je bezprecedentní a protichůdná konvenčním představám.
Preferovanou metodou zavádění testovaných vzorků nebo sloučenin do matrice (jako gelu nebo navlhčeného filtru) je rozmísťování a sušení malých objemů každého vzorku na povrchu, jako je povrch plastové fólie, v takovém uspořádání, že se dva vzorky nemohou smísit nebo překrývat . a každý je specificky umístěn. Když se plastová fólie umístí na matrici, vzorky se rozpustí a difundují do matrice v místech odpovídajících jejich předem definovaným umístěním v počátečním uspořádání.
Alternativním způsobem rozdělování testovaných vzorků nebo sloučenin do souboru je rozmísťo30 vat vzorky na porézní matrici jako filtr, kde objem každého odděleného vzorku je dostatečně nízký, takže vzorky se uvnitř matrice nepřekrývají. Po kontaktu s jinou porézní matricí, která obsahuje více kapaliny, sloučeniny difundují, aby nastartovaly esej.
Preferovanou metodou zavádění kombinatomích sloučenin na bázi perel do matrice je rozmisťo35 vání perel náhodně nebo v pravidelném uspořádání na povrch jako je povrch plastové fólie. Perle mohou být potom zpracovány tak, aby uvolnily (odštěpily) testované sloučeniny, pokud jsou na perly vázány kovalentně labilním spojem (v praxi je dobře známé fotolytické štěpení a štěpení kyselinou v plynné fázi). Každá sloučenina je pak nekovalentně spojena s oblastí obsazenou její původní perlou a suché sloučeniny pak mohou být zavedeny dovnitř nebo na povrch matrice.
Alternativním způsobem pro zavedení jednotlivých sloučenin do matrice je namáčení nebo jiný způsob nekovalentního připojení každé sloučeniny do nebo na perly. Při použití tohoto způsobu může být velké množství sloučenin najednou smíseno dohromady s perlami tak, že každá perle má na sobě stále jedinou komponentu. Potom může být směs perel snadno rozprostřena na povrch pro zavedení do matrice. Tento postup zcela eliminuje nutnost manipulace s malým objemem kapaliny.
Když počáteční soubor vzorků zavedených do matrice při CF-HTS zkoumání má vysokou hustotu, takže jednotlivé zóny aktivity prostorově pokrývají počáteční umístění více než jednoho vzorku, potom je každý z těchto vzorků potenciálním zdrojem pozorované aktivity. Při vyšších počátečních hustotách, podle rozmanitosti sloučenin, které budou vjednotlivýcb zónách přítomny, bude více sloučenin kandidáty pro každou zónu. Sloučeniny mohou navzájem difundovat, avšak budou mít stále svůj vlastní prostorový gradient a nebudou se kvantitativně mísit v žádném místě. Proto střed zóny bude stále korelovat s přesným umístěním aktivní komponenty
-6CZ 299740 B6 v počátečním souboru. V praxi jsou dosti vzácné zásahy, že je běžné opakované testování mnoha vzorků, aby se zaručila identifikace aktivních sloučenin pro každou aktivní zónu.
Alternativním provedením vynálezu je zavedení fyzikální bariéry (tedy v přísném slova smyslu provedení nekontinuální úpravy) do matric esejů, aby se omezila vzdálenost, po kterou by mohly vzorky difundovat. Na příklad každý ze dvou gelů obsahujících enzym respektive substrát může být pokrájen pletivem („kráječ sušenek“) tak, že každý gel je dále rozčleněn na mnoho oddělených poloh. Potom se ještě uvedou oba gely do kontaktu tak, aby substrát a enzym mohly spolu difundovat dovnitř každého rozčleněného kousku gelu. Potom se do každého rozčleněného kouslo ku gelu zavedou vzorky tak, aby eseje mohly probíhat zcela nezávisle bez difúze mezi eseji. Toto provedení efektivně eliminuje některé z výhod CF-HTS tím, že zanáší statistické odchylky mezi testovanými vzorky a fixuje objem, a tudíž omezuje signál u souborů o vysoké hustotě. Ale toto provedení bude ještě sklízet dobrodiní heterogenního eseje založeného na matrici, při němž komponenty eseje nepotřebují být rozdělovány do velikého množství paralelních reakčních nádo15 bek a eliminuje částečné míšení vzorků, g ELISA
Enzymem spojované imunosorpční eseje (ELISA) jsou heterogenní eseje, které detekují vazbu mezi ligandy v roztoku a imobilizovanými receptory. ELÍSA vyžaduje mnoho kroků míšení reagentů a vypírání, které jsou nesnadno proveditelné v 96-ti jamkové úpravě a je možné představit si i větší nesnáz, když se jamky redukují z 96-ti jamkové úpravy na 384-jamkovou úpravu. Autoři vynálezu aplikovali CF-HTS metodu pro detekci inhibice vazby mezi ligandy a imobilizovanými cílovými receptory (gELlSA).
Receptorem je každá molekula, která může vázat jinou molekulu. Neomezujícími příklady jsou • proteiny, peptidy, nukleové kyseliny, sacharidy a komplexy předchozích příkladů. Receptor je imobilizován na jedné z několika matric (receptorová matrice) včetně, neomezující se však jen na plastové povrchy [např. petri miska nebo plastová deska (Nunc)], membrány nebo filtry, které mají vysokou cílovou vazebnou kapacitu [např. nítrocelulóza, nylon nebo PVDF (Millipore, Corning Costar, Schleicher & Schuell, BioRad) nebo der i váti zo váné membrány jako SAM membrány (Promega)]. Porézní ligandová matrice (např. agarózový gel nebo porézní membrána) se připraví tak, že se ligand pro imobil izo váný receptor rozdělí dovnitř nebo na matrice. Testované sloučeniny nebo vzorky se rozmísťují přímo na lígandovou matrici nebo alternativně na nebo dovnitř matrice pro testované vzorky [např. polystyren (Tekra)], polyvinyliden (např, od Dow Brands) nebo jiné flexibilní plastové fólie nebo membrány. Testovaná matrice se uvede do styku s lígandovou matricí a vzorky se nechají difundovat do ligandové matrice. Po vhodné inkubační periodě se ligandová matrice uvede do kontaktu s receptorovou matricí a umožňuje se, aby ligand a vzorky přišly do kontaktu a potenciálně difúzí reagovaly s receptorem (obrázek 1 ukazuje vazbu imobilizovaného receptorů R na biotinylizovaný ligand Lp). Během inkubace se budou ligandy vázat na imobilizovaný receptor pokud sloučenina vzorku neinhibuje vazbu ligand / receptor.
Po příslušné inkubační periodě se receptorová matrice odstraní a promyje vhodným pufrem, aby .se odstranil nenavázaný nebo nespecificky vázaný ligand a vzorky. Receptorová matrice se potom namočí v roztoku obsahujícím reagenty eseje, které budou interagovat s ligandem (např. anti látka, avidin nebo střep tavidin v případě biotinyl izovaného ligandu) a schopnými být detekovány bud’ přímo (např. fluorescencí nebo radioaktivitou) nebo nepřímo [např. peroxidázou křenu (HRP), alkalickou fosfatázou (AP) nebo konjugátem β-galaktosidázy]. (Obrázek 2 ukazuje kon50 jugát avidin-HRP, AHRP, připojený na biotinylizované ligandy). Po příslušné inkubační periodě se receptorová matrice odstraní z roztoku a promyje se vhodným pufrem, aby se odstranil nenavázaný nebo nespecificky vázaný reagent. V případě přímé detekce signálu se matrice zobrazí za použití vhodné metody ( např. fotometrickými skenery, CCD kamerami, filmem, vyvolávací fosforescence nebo přístroji pro detekci scintilace). Nepřímé signály (např. HRP nebo
AP) vyžadují dodatečnou reakci pro vyvinutí signálu, dosahovanou rozdělením substrátů nebo
-7CZ 299740 B6 jí jiných nezbytných reakčních komponent do nebo na porézní substrátovou matrici a umístění této J matrice do kontaktu s matricí receptorů. Enzym (např. HRP nebo AP) pak reaguje se substrátem. j (Obrázek 3). Alternativně se precipítující substrát zavede do roztoku namísto do matrice. Při každé zobrazovací metodě oblasti vazby ligand / receptor budou vytvářet viditelnou reakci, poně- J vadž oblasti, v nichž byla vazba ligand / receptor inhibována viditelnou reakci vytvářet nebude. í
Vazba buňka / ligand 1
CF-HTS může být rovněž užíván pro detekování inhibice vazby ligand / buněčný receptor. Při ío tradičním eseji se kombinuje testovaná sloučenina, radiačně značkované ligandy a buňky, které exprímují odpovídající receptor v nádobce jako je jamka. Potom se poskytne dostatečná doba, aby se dovolilo receptorů vázat se na ligand, pokud nebyla taková vazba inhibována testovanými sloučeninami. Jakékoliv z nenavázaných nebo nespecificky vázaných komponent jsou z buněk odstraněny a měří se množství radioaktivity připadající na buňky. Autoři vynálezu přizpůsobili
CF-HTS metodu pro detekci inhibice vazby ligandů na buňky. Buňky exprimující žádaný receptor jsou pěstovány nebo navrstveny na matrici (buňková matrice) jako jsou, ale neomezuje se to jen na ně, gely, filtry nebo membrány [např. Transwe 11 membrány tkáňových kultur (Corning Costar) nebo chemotaxní membrány (Neuroprobe)]. Porézní matrice (např. agarózový gel nebo porézní membrána) se připraví tak, že se značkovaný ligand pro receptor rozdělí na nebo do matrice (matrice s ligandem). Testované sloučeniny se rozdělí přímo na ligandovou nebo buňkovou matrici nebo alternativně na nebo do jiné matrice [např. polystyren (Tekra), polyvinyliden nebo jinou plastovou fólii nebo membránu; membrána se vzorky]. Membrána se vzorky se uvede do kontaktu $ ligandovou matricí a takto ,se umožní vzorku difundovat dovnitř ligandové matrice. Po příslušné inkubační periodě se ligandová matrice uvede do kontaktu s buň25 kovou matricí, nejlépe na straně matrice bez buněk a umožní se, aby docházelo ke styku ligandu a vzorku a difúzí k reakci s receptorem (Obrázek 4). Během inkubace se budou značkované ligandy vázat na imobilizované buňky pokud vzorek neinhibuje vazbu ligand / buňka.
Po inkubaci se buňková matrice oddělí od ligandové matrice a promyje se vhodným pufrem aby se odstranil nenavázaný nebo nespecificky vázaný ligand a vzorek. Buňková matrice se zobrazí za použití vhodné metody (např. fotometr ic kým i skenery, CCD kamerami, filmem, fosforografy nebo přístroji pro detekci scintilace). (Obrázek 5 ilustruje vyvolání eseje na film).
Jakje shora ukázáno, CF-HTS dosahuje všech výhod předpokládaných pro eseje s „volnou úpra35 vou“ a může být aplikován pro všechny různé druhy biologických nebo biochemických esejů, při všech různých typech úprav a se všemi různými reagenty a zařízeními. Vzhledem k široké aplikovatelnosti je nejlépe ilustrován pomocí následujících příkladů. Avšak tyto příklady ilustrují preferovaná provedení předkládaného vynálezu a neomezují pateritové nároky á specifikace.
Běžný pracovník si snadno uvědomuje, že změny a modifikace specifických provedení mohou být provedeny bez odchýlení se od rozsahu a ducha vynálezu. Na všechny citace se zde nakonec odkazuje.
Přehled obrázků na výkresech a
Obrázek 1 ukazuje vzorky gELISA testu na neporézní matricí stýkající se sjednou stranou 1 porézní gelové matrice obsahující reagent eseje, která pak se stýká s neporézní matricí nesoucí :
další reagent eseje. Obr. IA znázorňuje ve větším přiblížení oblast označenou na obr. 1 „OBR. 1 A“ a ukazuje imobilizované receptory R vázající se na biotinylované ligandy Lp.
Obrázek 2 ukazuje odstranění matrice vzorků gELISA testu a porézní gelové matrice, následované promytím a přidáním kapalných reagentů nebo roztoků reagentů pro vytvoření reportního komplexu na neporézní matrici reagentů. Oblast označená na obr. 2 jako „OBR. 2A“ znázorňuje ve větším přiblížení rozhraní mezí ligandovými a receptorovými matricemi (LM a RM) a ukazuje
-8CZ 299740 B6 konjugáty avidin-HRP (AHŘP) napojené na biotinylované ligandy Εβ, které pak jsou napojeny na imobilizované receptory R.
Obrázek 3 ukazuje vizualizaci gELISA eseje spojením matrice s reportním komplexem s porézní gelovou matricí obsahující reportní substrát. Oblast označená na obr. 3 jako „OBR. 3A“ znázorňuje ve větším přiblížení rozhraní mezi matricí substrátu HRP a receptorovou matricí RM a ukazuje konjugáty avidin-HRP (AHRP), napojené na biotinylované ligandy ίβ, které pak jsou napojeny na imobilizované receptory R.
ío Obrázek 4 ukazuje, jak je ligandová matrice aplikována na povrch filtru protilehlý tomu povrchu filtru, který nese buňky. Oblast označená na obr. 4 jako „OBR. 4A“ znázorňuje ve větším přiblížení rozhraní mezi matricí značeného ligandu a matricí buněčné monovrstvy a ukazuje uspořádání buněk vzhledem k pórům filtru a ligandové matrici.
Obrázek 5 ukazuje, co se může vytvořit na povrchu filtru nesoucího buňky, když se esej vizualizuje.
Obrázek 6 ukazuje výsledek Van A eseje za použití různých koncentrací známého na dávce závisejícího inhibitoru.
Obrázek 7 ukazuje výsledek EF-3 eseje za použití různých koncentrací známého inhibitoru.
Obrázek 8 ukazuje kontrolní experiment gELISA eseje pro interakci protein-protein.
Obr. 8A znázorňuje vizualizaci vazby β-uPA/uPAR na agarózovych čtvercích napuštěných uvedenými koncentracemi β-uPA. Obr. 8B představuje graf průměrné hodnoty v pixelech pro každý čtverec z obr. 8A.
Obrázek 9 ukazuje gELISA výsledek „inhibice“ pro interakci protein-protein. Obr. 9A znázor30 ňuje výsledek experimentu, kde se zabraňuje, aby Pro~uPa vázal β-uPA/uPAR. Obr. 9B znázorňuje výsledky obr. 9A v kvantitativní grafice,
Obrázek 10 ukazuje na dávce závisející vazbu radiačně značené ITAM na imobilizovaném LCK.
Obrázek 11 mapuje hodnoty pixelů proti ITAM koncentraci pro znázornění typické vazebné křivky vazby ligandu na receptor.
Obrázek 12 ukazuje kontrolní experiment pro interakci liganď-buňka u radiačně značeného IL-8.
Obrázek 13 ukazuje „inhibici“ interakce ligandu IL-8 s buňkou.
Obrázek 14 ukazuje esej pro inhibitory neuraminidázy.
Obrázek 15 ukazuje simultánní esej 10 080 jednotlivých sloučenin na inhibici neuraminidázy.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Kolorimetrický dvoustupňový gelový esej pro stanovení fosfátu generovaného rezistentním vankomycin enzymem VanA
-9CZ 299740 B6
Van A je klíčovým enzymem při vankomycinové rezistenci a katalyzuje připojení D-alaninu k D-alaninu nebo D-alaninu k D-laktátu. Tento enzym se obvykle analyzuje vyvoláváním barvy z fosfátu, který se uvolňuje, když je enzym aktivní (aktivita VanA způsobuje hydrolýzu ATP na ADP a fosfát). Vědcům je známo, že D-cykloserin inhibuje VanA způsobem závisejícím na dávce, a že se tento inhibitor používá jako pozitivní kontrola proti jiným potencionálním inhibitorům.
Gel s enzymem
Gel s enzymem byl připraven přidáním enzymu VanA k roztavené 1% agaróze (vysokotající agaróza Gibco BRL) při 45 °C v 50 mM HEPES (kyselina N-[2-hydroxyethyl]piperazin-N'-[2ethansulfonová]), 20 mM MgCl2, 20 mM KCl, pH 7,3 do konečné koncentrace VanA 2 μΜ. Tato agarová směs byla potom nalita do BioRad aparátu pro formování gelu a při 2 až 8 °C ponechána 30 minut ztuhnout.
Gel se substrátem
Gel se substrátem byl připraven přidáním ATP, D-alaninu a D-laktátu k roztavené agaróze tak, aby jednotlivé z komponent měly lmM, 1,5 mM respektive 1,75 mM a připravením gelu jak bylo popsáno pro gel s enzymem.
Matrice se vzorkem
Řady Ι μΐ alikvotních podílů série ředění 5000, 2000, 1000, 500, 200, 100 μΜ D-cykloserinu, známého inhibitoru použitého jako kontrolní vzorek, v l : 1 směsi ethanolu a vody, byly rozdíleny na kousek polyvinylidenchloridového (PVDC) filmu a 10 minut ponechány k usušení. Inkubace enzymu se substrátem v přítomnosti inhibitoru
Gel s enzymem byl na 5 minut uveden do styku s matricí vzorku. Potom byl navrch gelu s enzymem umístěn gel se substrátem a ponechán k inkubaci po 15 až 20 minut. Poté byly oba gely odstraněny odděleny. Má se za to, že se během inkubace, kdy enzym katalyzuje spojení substrátů, vytvoří fosfát v celém gelu s výjimkou těch zón, v nichž byl D—cykloserin v dostatečné koncentraci, aby inhiboval reakci.
Vizualizace eseje
Na gely s enzymem a substrátem byla nalita a stejnoměrně rozdělena směs pro detekci fosfátu sestávající z čerstvě připraveného roztoku 0,15 % Malachitové zeleně a 1,4 % molybdenanu amonného v 1,33 N HC1. Tato činidla reagují s fosfátem a jako funkci zvyšujících se koncentrací fosfátu vyvolávají stoupající měrou tmavnoucí odstíny zelené. Zbarvení se nechalo vyvolávat po 5-10 minut (Obrázek 6 ukazuje vývoj zbarvení gelu, když se množství inhibitoru měnilo od 5 nanomol do 0,5 nanomol). Zeleně zbarvené gely byly fotografovány CCD kamerou „StrategeneEagle Eye“ Stupeň, při němž inhibované zóny byly méně zelené, koreloval podle očekávání s koncentrací přidaného inhibitoru. Proto může být tento esej použit pro zkoumání inhibitorů VanA při řazení kombinatomích perel nebo sloučenin rozdělovaných na jakýkoliv jiný povrch, který je potom uveden do styku s gelem eseje.
Tento esej také ukazuje, že úpravu gelového screeningu lze přizpůsobit vícestupňovým reakcím, so Takové provedení je potřebné, aby tato úprava byla užitelná pro širokou řadu esejů, protože mnoho esejů více stupňů vyžaduje. V tomto případě VanA esej je dvoustupňovým esejem enzymové aktivity následovaným vyvoláním zbarvení. Homogenní (jednotlivý stupeň) verze tohoto eseje nejsou snadno proveditelné, protože zbarvení vyvolávající reagenty a podmínky interferují s aktivitou VanA a jsou tudíž inkompatibilní s jejich dodáváním do agarového gelu. Proto je tedy
-10CZ 299740 B6 žádoucí prostorové a časové oddělení těchto dvou stupňů, obsahující nejprve esej gelu s enzymem, následovaný vyvoláním zbarvení ve fázi roztoku.
Příklad 2
Dvoustupňový esej detekce fosfátu generovaného S. cerevisiae. Elongační faktor aktivity 3 ATPázy stimulovaná vazbou ribosomů ío Když s ribosomy interaguje fungální elongancní faktor 3 (EF-3) stimuluje se aktivita fosfatázy. Autoři vynálezu aplikovali pro tuto aktivitu CF-HTS. Byl připraven gel s enzymem obsahující EF-3 (vysoce teplotně citlivý enzym) a kvasinkové ribosomy v pufru EF-3 eseje. Připraven byl také gel substrátu obsahující 1 mM ATP v pufru eseje. Oba gely obsahovaly 2 % dimethylsulfoxidu v nízkotající agaróze (Gibco BRL) a byly připraveny při 37 °C a ponechány 30 minut stát při 4 °C. Na PVDC film byly natečkovány a vysušeny (matrice se vzorkem) série ředění poly-Llysinu, inhibitoru EF-3 použitého jako kontrolního vzorku. Potom po předcházející inkubaci gelu enzymu s inhibitory na matrici vzorku, byl jako v příkladě 1 proveden esej. Potom byl gel s enzymem na 20 minut umístěn do styku s gelem se substrátem. Jako v příkladu l byly gely s enzymem a substrátem obarvovány barvu vyvolávající směsí Malachitové zeleně s molybdenanem amonným. Gel s enzymem byl potom zobrazen CCD kamerou. Skvrny inhibitoru se objevují jako světlejší zóny v zeleném pozadí. Obrázek 7 ukazuje vývoj zbarvení na gelu, kde se množství inhibitoru měnilo od 5 pikomol do 200 pikomol. Výsledky ukazují na dávce závisející signál inhibitoru, indikující, že při tomto eseji mohou být prozkoumávány sloučeniny, aby se odhalily nové EF-3 inhibitory. Příklad 2 demonstruje užitečnost CF-HTS spolu s komplikovaností způso25 benou přítomností organel nebojiných surových biologických směsí nebo extraktů.
Příklad 3
Nepřímá gELISA detekce zbarvení inhibitorů interakce protein - protein
Jak bylo diskutováno shora, je ELISA obvykle používán k detekci inhibice ligand - receptor, kdy jsou receptory imobilizovány v mikrotitračních jamkách. Páry „ligand - receptor“ užívané při ELISA mohou obsahovat každý pár vázajících se molekul od proteinů nebo jiných makromolekul až do malých molekul. Tyto eseje jsou komplexními, vícestupňovými eseji, jež vyžadují imobilizování receptorů, inkubování receptorů s ligandem, promytí k odstranění nechtěného nespecificky zadržovaného ligandu, který by jinak mohl způsobovat vysoký signál pozadí, vázání zviditelňujících činidel (např. specifické protilátky ligandu konjugované s reportním enzymem) na ligand vázaný k receptorů a generování viditelného signálu poskytnutím substrátu pro reportní enzym. Je zřejmé, že komplexnost ELISA vedla HTS průmysl k závěru, že ELISA nemůže být adaptován pro eseje s volnou úpravou. Přesto však autoři vynálezu adaptovali tento komplexní, vícestupňový esej na CF-HTS úpravu pro analýzu různých interakcí protein - protein, protein ligand a vazeb jiných ligandu.
Aktivátor plazminogenu urokinázového typu (uPA) se váže na jemu odpovídající receptor (uPAR). Interakce uPA / uPAR byla prokázána při metastáze různých typů rakoviny. Autoři vynálezu adaptovali tradiční uPA / uPAR ELISA na CF-HTS za použití vyčištěných receptorů a ligandů.
Matrice uPAR
Plastové desky (7,5 cm x 11,5 cm od Nunc, lne. Naperville, IL) byly přes noc pokryty 15 ml 118 nM vyčištěného uPAR ve fosfátem pufrované solance (PBS) (Life Technologies, Grand Island, NY) při pH 7,4 a 4 °C. Po pokrytí plastových desek přes noc byl roztok uPAR dekantován a zbylá vazebná místa na plastové desce byla blokována přidáním 15 ml PBS, obsahujícími
-11 CZ 299740 B6 % (hm./obj.) kaseinu a inkubována 2 hodiny při teplotě místnosti (RT). Po blokování byl blokační roztok dekantován a plastová deska byla pětkrát promyta 20 ml pracího pufru sestávajícího z 0,05 % Tween 20 (monolaurát polyoxyethensorbitanu) v PBS. Po promytí byla plastová deska sušena 10 minut při RT. Bylo to načasováno tak, že krátce na to mohla být plastová deska použita v eseji popsaném níže, aby se zabránilo přeschnutí matrice, které by mohlo vést ke ztrátě aktivity. Matrice β - uPA
Pro účely eseje byla používaná uPA označena biotinem (β-uPa). Gely obsahující β-uPA byly io připraveny namáčením β-uPA do agaru kvůli vyhnutí se vysokým teplotám (což je opakem lití do roztaveného agaru z příkladů 1 a 2). Agar byl připraven nejprve míšením 0,1 g agarózy (Sigma, St. Louis MO) s 10 ml PBS, zahřátím dokud neroztála a potom odlitím do přístroje pro gel 8 x 7 x 0,075 cm3 (Βίο-Rad, Hercules, CA). Po ztuhnutí (buď při pokojové teplotě nebo 4 °C) byly gely při 4 °C přes noc namočeny do 15 ml β-uPA (kolem lOnM) v pufru eseje sestávajícím z PBS, 0,05 % Tween-20 a 0,1 % kaseinu (obojí od Sigma, St. Louis, MO), Rovnou před použitím byl gel 20 minut sušen při RT.
Matrice se vzorkem
Jako kontrolní vzorek inhibitoru β-uPA / uPAR vazby byl za nepřítomnosti známého inhibitoru vazby uPA / uPAR o malé molekule, použit nebiot inyl ováný uPA (Pro-uPA). Pěti mikro litrové alikvotní podíly 0,0,03, 0,1, 0,3, 1 a 3 μΜ pro-uPA v pufru eseje byly rozmístěny na PVDC film (Dowbrands L. P., Indianopolis, IN) a 2 h sušeny při RT.
Inkubace uPAR s pro-uPa a β-uPA
Matrice se vzorkem byla umístěna na jednu stranu gelu obsahujícího β-uPA se suchými tečkami pro-uPA do styku s povrchem gelu s β-uPA. 10 minut bylo při RT ponecháno, aby pro-uPA do gelu difundoval. Na to potom druhá strana gelu s β-uPA byla umístěna do plastové desky, aby se β-uPA (působící jako ligand) a pro-uPA (působící jako kompetitivní inhibitor) nechaly interagovat s uPAR na povrchu plastové desky. Vazba / kompetitivní reakce byly Ínkubovány při RT po 20 minut. Po inkubaci byla plastová deska oddělena od gelu a rychle 4krát promyta 20 ml vypíracího pufru. Roztok konjugátu avidin-peroxidáza křenu (avidin-HRP) byl připraven rozředěním avidin-HRP (Sigma, St. Louis, MO) 1 až 25.000 v pufru eseje a přidáním 15 ml k plastové desce.
Reakce byla 10 minut inkubována při RT s následujícím dekantováním roztoku avidiň-HRP a . promytím plastové desky jako nahoře. Plastová deska byla 20 minut sušena.
.sfee:
Avidin se v avidin-HRP váže na biotin specificky tak, že pouze ty oblasti matrice, kde še projeví vazba „ligand / receptor“, budou eventuálně vykazovat vývoj zbarvení. Ty oblasti matrice, kde je vazba „ligand / receptor“ kompetitivně inhibována účinkem pro-uPA, zbarvení vykazovat nebudou.
Vyvolání zbarvení
Gel pro vyvolání zbarvení obsahující kolorimetrický HRP substrát (OPD gel) byl připraven rozpuštěním dvou tablet hydrochloridu o-fenylendiaminu (OPD) v 7 ml rozpouštědla (oboje z „Abbot kit no.6172-30“, Abbot Labs., Abbot Park, IL) a spojením tohoto roztoku s roztokem agarózy získaném roztavením 0,1 agarózy v 1 ml vody. 10 ml vzniklé směsi bylo odlito do miniprotein II přístroje pro gel 8 x 7 x 0,075 cm a 15 minut při 4 °C ponecháno ztuhnout. Gel byl ze skleněných desek odlévacího stojánku přenesen na PVDC film nebo flexibilní plastovou fólii a při RT byl 10 minut ponechán sušit se na vzduchu. Potom byl přenesen na jiný PVDC film nebo flexibilní plastovou fólií, aby se 10 minut ponechala sušit druhá strana. Potom byl OPD gel umístěn na plastovou desku k zahájení vývoje zbarvení. Během inkubace OPD, v různých časech, byla plastová deska umístěna navrch filtru propouštějícího pás 440 nm (Omega Optical, lne,,
-12CZ 299740 B6
Brattleboro, VT), který střídavě byl navrchu difuzní desky s optickými vlákny osvětlované světelným zdrojem Fiber-Lite (oboje od Dolan-Jenner Industries, lne., Lawrence, ΜΆ). Vznikající obrázky byly získány CCD kamerou (systém „Eagle Eye“, Stratagene, La Jolla CA).
Kontrolní pokus |
Obrázek 8 ukazuje kontrolní pokus pro příklad 3. V obrázku 8A byly čtverečky agarózy (1 cm2) ] namočeny do roztoků s různými β-uPA koncentracemi, jak je naznačeno pod každým čtvereckem (s výjimkou 50 nM roztoku, který je označen nalevo od čtverečku agarózy). Poté, když byly ·?<
io čtverečky agarózy inkubovány na plastové desce s imobilizovaným uPAR, byly odstraněny. 1
Plastová deska byla potom omyta a oblasti matrice, kde došlo k β-uPA / uPAR vazbě byly zviditelněny jak je shora popsáno. Obrázek 8B ukazuje křivku průměrných hodnot pixelů (bez pozadí) pro každý čtvereček (jak bylo určeno analýzou digitálního obrázku z digitální kamery pomocí software „NIH Image Analys i s“) proti koncentraci β-uPA v každém čtverečku agarózy v různém čase během vyvíjení zbarvení OPD. β-uPA získané zagarózového gelu vykázaly typickou vazebnou křivku receptor - ligand s půlmaximem vazby (Kd) kolem 3-5 nM, což je konzistentní s publikovanými hodnotami pro tuto reakci při standardní ELISA a jiných esejích, které tento parametr měří. Obrázek 8 ukazuje, že nepřímý kolorimetrický signál generovaný při gELISA je kvantitativně závislý na rozsahu interakce ligand-receptor.
Výsledky kompetice pro-uPA / β-uPA
Obrázek 9 ukazuje inhibici β-uPA / uPAR vazby pomocí pro-uPA. Skvrny v obrázku 9A vyznačují oblasti, kde byla inhibována β-uPA / uPAR vazba. Tudíž se v těchto oblastech avidin- HRP nevázal. V důsledku toho HRP se substráty v OPD gelu na generování vývoje zbarvení nereagoval. Obrázek 9B je alternativní cestou zobrazení dat téhož CCD obrázku, která zvyšuje schopnost lidského oka vidět kvantitativní titraci.
Příklad 4
Přímá radiometrická detekce inhibitorů interakce protein - protein
Aktivace T-buněk je součástí imunitní odezvy těla. Aby nastaly během aktivace T-buněk přípa35 dy v tomto směru, musí p561ck (LCK protein) interagovat s ITAM oblastí (s imunoglobulinem související aktivační jednotka na bázi tyrosinu) cytoplazmatických domén receptoru antigenu T. buněk. Sloučeniny, které inhibují tuto interakci protein - protein jsou potenciálními iirtunosupresivy. Autoři vynálezu použili CF-HTS pro analýzu této interakce protein - protein, při níž je LCK imobilizován na membráně.
LCK matrice
Biotinylovaný LCK se imobilizuje na biotin zadržující membráně (SAM membrána) (Promega Corp., Madison, WI) přelitím proužku 11 cm x 2 cm 5 ml 3 μΜ LCK v PBS obsahujícím 5 mM
DTT (dithiothreitol) na 10 minut při RT, po čemž se pufr odstraní. Je to načasováno tak, aby SAM membrána mohla být v níže popsaném eseji použita krátce nato (během minut). .
ITAM* matrice
Agarózový gel obsahující radiačně značený ITAM peptid (ITAM*) se připraví smísením 0,1 g agarózy s 10 ml pufru, zahříváním dokud nedojde k roztavení a potom odlitím do přístroje pro gel 8x 7 x 0,075 cm. ITAM* se do finální koncentrace 10 nM přidává právě před odléváním nebo alternativně namáčením po ztuhnutí gelu.
-13 CZ 299740 B6
Matrice se vzorky
Vzorky, které máji být podrobeny screeningu, se rozdělí na plastový povrch nebo PVDC a vysuší, aby vznikla matrice se vzorky.
Inkubace a vizualizace ITAM*, LCK a testovaných vzorků
Matrice se vzorky se uvede do styku $ jednou stranou gelu s ITAM* tak, že testované vzorky mohou difundovat do gelu s ITAM*. Nato se druhá strana gelu s ITAM* uvede do styku se SAM ío membránou, na které byl imobilizován LCK. Po 15 - 45minutové inkubaci se SAM membrána odstraní, promyje a zobrazí fosforografem nebo filmem. Inhibitory interakce ITAM - LCK jsou indikovány zónami nižší radioaktivity, což na zobrazení odpovídá nižší intenzitě signálů.
Kontrolní pokus pro vazbu ITAM* / LCK
Agarózové gely se připraví smísením 0,1 g agarózy s 10 ml pufru, zahříváním dokud nedojde k roztavení a potom odlitím do přístroje pro gel 8 x 7 x 0,075 cm. Po ztuhnutí se z gelu vypíchají kolečka o průměru l cm a přes noc se při 4 °C namočí do 400 μΐ pufru s 0,1,0,3, 1,3,10 a 20 nM ITAM značkovaným s l25I (Amersham, Arlington Heights, IL). Gelová kolečka se potom z roz20 toku vyjmou a ponechají po 20 minut při RT k usušení. Potom se umístí na LCK - mobilizovanou SAM membránu a inkubuje 45 minut při RT. Gely se odstraní a membrány se čtyřikrát promyjí pufrem. Po vysušení se SAM membrány zobrazí pomocí fosforografu.
Obrázek 10 naznačuje na dávce závisející vazbu mezi I - ITAM a i mobil izo váným LCK na
SAM membráně.
Obrázek 11 ukazuje diagram průměrných hodnot pixelů (bez pozadí) pro každý l25I - ITAM gel (jak bylo stanoveno analýzou digitalizovaného obrazu z fosforografu pomocí software ImageQuant od Molecular Dynamics) proti 123I - ITAM koncentraci v gelovém kolečku 125I - ITAM poskytnutý z gelu do imobilizovaného LCK vykázal typickou vazebnou křivku receptor - ligand.
Příklad 5
Esej reportního genu celých buněk za použití úpravy gel / filtr
Ledvinové buňky, známé jako HEK buňky, byly transfikovány plazmidem, který obsahuje promotor základní složky cyklické AMP odezvy (CREB). spojený s genem luciferázy (reportní gen luciferázy od Promega). Když jsou transfikované buňky podrobeny působení forskolinu, indukuje se exprese reportního genu luciferázy. Potom pak, když se k HEK buňkám přidá biologický pufr, obsahující substrát luciferázy (hmyzí luciferin od Promega) a vhodné kofaktory (20 mM Tricinu pH 7,8, 0,1 mM EDTA, 33 mM koenzymu A, 0,5 mM adenosin trifosfátu a 1 mM MgCI2), generuje se emise fotonů, která může být pomocí běžné instrumentace detekována.
Matrice s buňkami
Buňky byly v kultuře podrobeny působení trypsinu, přeneseny do Corning / Costar TRANSWELL membrány (3 mikronový polykarbonátový filtr s plastovou prsténcovou podlož50 kou) a přes noc ínkubovány při 37 °C, 5 % CO2 v přítomnosti média pro kultivaci tkáně. Potom bylo médium z membrány odstraněno a filtr, k němuž byly buňky přichyceny, byl 15 minut na vzduchu sušen a krátce potom použit v níže uvedených krocích.
-14CZ 299740 B6
Matrice s vyvolávačem
Gel obsahující vyvolávač exprese luciferázy se připraví přidáním 12 μΐ 10 mM výtažku forsko- 3 linu (Sigma, výtažek v ethanolu) do 6 ml 1% nízkotajícího agarózového gelu. Gel se při teplotě J místnosti ztuží forskolinem na konečnou koncentraci 20 μΜ.
Matrice se vzorky .jj
Vzorky, které by mohly blokovat indukci forskolinem se rozmístí a suší na oddělených místech na PVDC s vysokou hustotou.
Inkubace reagentů a detekce inhibice
Strana PVDC s inhibitorem se inkubuje s gelem obsahujícím vyvolávač. Pak se gel obsahující forskolinový vyvolávač umístí na bezbuněčnou stranu matrice s buňkami, připravené jak uvedeno shora. Ty se spolu inkubují při 37 °C a 5 % CO2 20 minut. Potom se gel s forskolinem odstraní a matrice s buňkami se inkubuje při 37 °C a 5 % CO2 další čtyři hodiny kvůli maximální expresi konstruktu luciferázy. K detekci enzymatické aktivity (nebo její inhibice), se buňková matrice filtru fyzicky odstraní od svého podložního prstence a umístí do petri misky. Petři miska se zapla20 ví substrátem luciferázy (hmyzí lucíferin od Promega) v biologickém pufru s příslušnými kofaktory, aby se vyvolalo světlo jako signál. Protože signál je lokalizován uvnitř imobilizovaných buněk exprimujíctch luciferázu, výsledkem inhibitorů počátečního indukčního kroku budou zóny s nižší emisí fotonů.
Příklad 6
CF-HTS gel / filtr pro přímé stanovení inhibitorů interakcí ligand - buňka
Vazba ligand - receptor na površích buněk iniciuje v buňkách signální cesty, které na konci vedou k funkčním odezvám (např. proliferace nebo sekvence biologicky aktivních substancí). Pro regulaci biologických odezev buněk při chorobných stavech se často usiluje o inhibici ligandových vazeb na povrchu buněk. Obecnou metodou pro vyhodnocení inhibitorů vazby ligand / buněčný receptor je zhodnocení schopnosti inhibitoru redukovat vazbu mezi přírodním, radiačně značeným ligandem a buňkami. To zahrnuje inkubaci buněk s radiačně značeným ligandem a inhibitorem, následovanou odstraněním nenavázaného a nespecificky vázaného, radiačně značeného ligandu promytím a pak změřením množství vázané radioaktivity.
Interleukin-8 (IL—8) je chemotaktický chemický druh, vyskytující se při zánětech ve vazbě na receptory na různých typech buněk. Autoři vynálezu vyvinuli CF-HTS esej ligand - buněčný receptor pro hodnocení inhibitorů této interakce.
Matrice s buňkami
HEK buňky (ATCC, Bethesda, MD) exprimujíeí IL—8 receptor byly nakladeny na membránový filtr o průměru 75 mm (Corning Costar Corp., Cambridge, MA) s hustotou kolem 20 milionů buněk na desku. > Pro přichycení se k membránovému filtru byly ponechány přes noc v pufru (RPMI od Life Technologies, Grand Island, NY) obsahujícím 10 mM Hepes (Sigma, St. Louis,
MO) při pH 7,2 a 37 °C. Potom, když byly buňky přichyceny na filtr, byla média odstraněna a buňky byly promyty čerstvým pufrem, aby se odstranily jakékoliv nepřichycené buňky. Filtry byly obráceny stranou s buňkami dolů a šikmo natočeny, aby mohl přebytek médií odtéci a pak byly 20 minut sušeny. Bylo to načasováno tak, že matrice s buňkami mohla být bezprostředně použita v níže popisovaném eseji.
-15CZ 299740 B6
Matrice s ligandem
Matrice s ligandem byla připravena nasáknutím IL-8 značeného l25I (Amersham, lne., Arlington
Heights, IL) do agarózového gelu vytvořeného smísením 0,1 g agarózy s 10 ml pufru, zahříváním ; dokud nedojde k roztavení a potom odlitím do přístroje pro gel 8 x 7 x 0,075 cm. Gely byly namáčeny přes noc při RT, za pomalého míchání na rotující desce (New Brunswick Scientifíc *
Co., Inc., Edison, NJ). Po nasáknutí byly gely, právě před použitím, sušeny 20 minut při RT. ;
Bylo to načasováno tak, že gel mohl být bezprostředně použit v eseji.
io Matrice se vzorky
Radiačně neznačený IL-8 (Genzyme Corp., Cambridge, MA) byl za nepřítomnosti známého inhibitoru vazby IL-8 l buněčný receptor použit jako kontrolní vzorek inhibitoru pro sledování inhibice vazby 125I-IL-8 na HEK buňky. Na plastovou fólii jako PVDC bylo rozděleno po jednom mikrolitru 0, 0,03, 0,1, 0,3 1,3, 10 a 100 μΜ IL-8 a sušeno bylo l h ve vakuu při RT.
Inkubace
Matrice se vzorkem byla umístěna na jednu stranu matrice s ligandem tak, že vysušené tečky s IL-8 přicházejí do styku s povrchem gelu. Gel byl otočen, aby se nechala 10 minut při RT sušit druhá strana, a aby mohl „inhibitor“ difundovat do gelu. Nato potom byly gely umístěny na tu stranu matrice s buňkami, kde buňky nebyly. Pro reakci vzniku vazby se nechalo inkubovat 45 minut při RT. Potom byly gely odstraněny a strana membrány bez buněk byla 4-krát promyta pufrem. Membrány se nechaly úplně vysušit předtím, než byly odstraněny ze své plastové prsten25 cové podložky. Potom byly membrány zobrazeny buď X-paprsky na film nebo fosforografem (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Obrázek 12 ukazuje odezvu dávky pro 125I-IL-8 v agarózových gelech difundujících skrze matrici s buňkami a tvořících vazbu s HEK buňkami exprimujícími receptor IL-8a. Jak je naznačeno, byly některé z agarózových čtverečků o jednom cm2 nasáknuty roztoky s různými koncentracemi l25I-IL-8. Následně byly ligandem nasáknuté čtverečky uvedeny do styku s matricí s buňkami jak je popsáno shora. Po inkubaci byly čtverečky z matrice s buňkami odstraněny a strana membrány bez buněk byla promyta pufrem. Pro lokalizaci na buňky vázaného 12SI-IL-8 byl použit fosforograf. Data ukazují, že přímé radiometrické odečítání při tomto, na gelu založeném eseji s buňkami, je kvantitativně závislé na rozsahu interakce ligand-receptor. Obrázek 12 také naznačuje, že vazebné oblasti zůstávají rozdílné ve tvaru a potvrzuje, že boční difúze signálu není při eseji problémem.
Obrázek 13 ilustruje výsledky pokusu kompetitivní inhibice. Inhibice vazby mezi l25I-IL-8 a HEK buňkami je vyznačena světlými skvrnkami. Je také hned zřejmé, že inhibice neznačkovaným IL-8 je kvantifikovatelně závislá na dávce. Tato data značí, že inhibitory, v tomto případě představované neznačkovaným IL-8, mohou projít matricí s buňkami a redukovat vazbu mezi 25I-IL-8 a buňkami.
í
Příklad 7 1
Esej gel - méně funkční buňky na filtru 1
Změny buněčných funkcí se často měří sledováním účinků testovaných sloučenin nebo vzorků na !
reportní systémy vmanipulované do buněk. Příklady zahrnují pozorování účinku na syntézu j fluoreskujících intracelulámích proteinů jako zelený fluoreskující protein (GFP), extracelulámí proteiny jako receptory nebo adhezní molekuly, nebo specifické enzymy jako luciferázu, :
chloramfenikolovou acetyltransferázu, nebo β-galaktosidázu (Promega). Nejprve se s buňkami inkubují testované sloučeniny. Potom se buňky ponechají, aby po vhodnou dobu exprímovaly J
-16CZ 299740 B6 reportní protein (mohou to být minuty, hodiny nebo dny). Potom se přímými metodami (např.
GFP) nebo nepřímými metodami (např. ELISA techniky s proteiny vázanými na membránu) j analyzuje úroveň reportního proteinu. Dále, v případě enzymů, může být buňka rozrušena, aby se mohl extrahovat reportní protein a analyzovat enzymová aktivita. Při jiných esejích funkčních J buněk se měří chování nebo lokalizace specifických molekul jako barviv nebo radiačně znače- j ných metabolitu při odezvě na stimulaci reeeptoru nebo změnách fyziologie buněk jako je I potenciál membrány. i
ELISA esej měření účinku sloučenin na expresi intracelulární adhezní molekuly-1 (ICAM-1) ’?
může být pro CF-HTS upraven následovně. Endotelových buněk exprimuj ících ICAM-1 bylo kolem 5.000 buněk / mm2 nakladeno na polykarbonátovou chemotaxní membránu (Neuroprobe).
Buňky byly v médiu inkubovány přes noc při 37 °C. Médium bylo odstraněno a membrány se nechaly částečně usušit 10 minut při RT. Vzorky nebo sloučeniny, které byly testovány na indukci ICAM-1 byly sušeny na plastových fóliích a uvedeny do styku stou stranou vlhké membrány, kde nebyly buňky. Sloučeniny se ponechaly 1 h při 37 °C interagovat s buňkami ve vlhké komoře a potom byly buňky smočeny v médiu a inkubovány 5 h při 37 °C.
Po poskytnutí času, v němž buňky indukovaný protein syntetizovaly, bylo médium z membrány odstraněno a buňky byly inkubovány v pufru obsahujícím anti-ICAM-1 protilátku (Genzyme,
R&D systémy) buď nekonjugovanou nebo konjugovanou s fluorescein-izothiokyanátem (FITC) nebo biotinem, Po 30 minutách inkubace při RT byl pufr odstraněn a buňky byly několikrát pro- , myty, aby se odstranil nenavázaný anti-ÍCAM-1. V případě konjugované FITC protilátky byla j membrána zobrazena za použití CCD kamery (Stratagene, Imaging Research) s excitací při u
485 nm á emisi při 520 nm. Sloučeniny, které stimulovaly expresi ICAM-1 budou rezultovat <
v zóně se zvýšenou fluorescencí díky vázání FITC-anti-ICAM-1 protilátky. V případě protilátky konjugované s biotinem se buňky inkubují při RT 10 minut v pufru obsahujícím avidin-HRP.
Pufr se odstraní a nenavázaný avidin-HRP se vymyje. Membrány se potom namočí do pufru obsahujícího substrát precipitující HPRjako tetrachlorid diaminobenzidinu (Pierce) a pozoruje se vývoj zbarvení v místech, kde podložené buňky byly indukovány, aby exprimovaly ICAM-1.
. 30 V případě nekonjugované anti-ICAM-1 protilátky se s buňkami nechá reagovat konjugovaná sekundární anti-anti-lCAM-l protilátka a pak následuje vyvolání signálu příslušným substrátem pro konjugát. Obrázky se snímají CCD kamerou. Všechny z těchto variací (FITC, avidin-HRP a anti-anti-ICAM-1) jsou alternativními stanoveními, která by měla poskytovat tytéž kvalitativní výsledky - totiž vzorky, které ovlivňují expresi ICAM-1 mohou být korelovány k zónám zvýše35 něho nebo sníženého signálu.
Je třeba poznamenat, že matrice pro kontinuální úpravu v tomto případě jsou membrány a plastická fólie. Pro CF-HTS není gel nezbytný.
Příklad 8
CF-HTS esej jednotlivých sloučenin pro inhibicí neuraminidázy
Matrice se vzorkem
Sbírka 528 jednotlivých, strukturně příbuzných sloučenin byla testována pomocí CF-HTS. Pro ředění sloučenin z lahviček do 96-jamkových desek a pro ředění a transfer sloučenin na plastové fólie byl použit Packard Multiprobe MP204 DT. Na začátku byly sloučeniny zředěny ze 40 mM 50 v DMSO z lahviček na 4 mM v DMSO do 96-jamkových desek. Potom byly zředěny ze 4 mM v DMSO na 200 μΜ v 50% EtOH / H2O v 96-jamkových deskách. Tyto vzorky byly v Ιμΐ duplikátech přeneseny na plastové fólie 8 cm x 8 cm, průměrně s 5m rozestupy mezi vzorky (Βίο-Rad kat. č. 1,65 - 2965), pro celkem 192 vzorků na fólii. Každá Ιμΐ tečka tedy obsahovala přibližně 200 pmol jednotlivé sloučeniny ze sbírky. Jako kontrola byly na každou fólii blízko 55 sloučeninám ručně rozděleny série ředění 2,3~dehydro-2-deoxy-N-acetylneuraminové kyseliny itrÁE·
-17CZ 29974(1 B6 (DANA), známého inhibitoru neuraminidázy (Boehringer Mannheim č. 528544). Fólie byly vysušeny ve vakuové sušárně tak, že každá sloučenina byla vysušena na svém vlastním miste na fólii.
Matrice s enzymem
Před esejem byl enzym chřipkové neuraminidázy 1500krát naředěn z fosfátem pufrované solanky s 25 % glycerolu do zkapalněného agarového gelu sestávajícího z 1 % agarózy, 50 mM citrátu sodného pH 6,0 a 10 mM chloridu vápenatého při 40 °C. Bylo odlito 8 cm x 8 cm x 0,75 mm io enzymového gelu a ztuženo snížením teploty na 4 °C.
Matrice se substrátem
Syntetický substrát chřipkové neuraminidázy, 2'-(4-methyIumbeliferyl)-a-D-N-acetylneurami15 nová kyselina (Sigma, kat. č. 8636), byl zředěn z 3 mM v DMSO na 30 μΜ do zkapalněného agarového gelu a to bylo odlito podobným způsobem jako je shora popsáno pro gel s enzymem.
Inkubace a detekce
Matrice s enzymem byla umístěna na matrici se vzorkem na tu stranu, kde byly usušeny sloučeniny, o něž se jedná. Potom byla matrice se substrátem naskládána navrch matrice s enzymem. Matrice byly inkubovány 30 minut při RT. Během této doby zhašený fluorescenční substrát a enzym difundovaly spolu mezi dvěma gely, substrát byl enzymem štěpen a způsoboval vzrůst intenzity fluorescence. Bylo to monitorováno excitací při 340 nm a emisí při 450 nm. Sloučeniny, které jsou schopny inhibovat aktivitu enzymu, vzrůst intenzity fluorescence snižovaly na nejmenší míru. Jak u gelů vzrostla ve většině míst intenzita fluorescence, oblasti, které obsahovaly inhibitory enzymu, jež difundovaly do gelu z plastové fólie, byly vidět jako tmavější místa s nižší fluorescencí. To se snadno monitorovalo pomocí CCD kamery s vhodnými filtry pro kontrolu vlnových délek emise a excitace. Identita sloučenin vykazujících zóny inhibice byla stanovena podle umístění zón vzhledem k matrici s inhibitorem. Srovnáváním fluorescence DANA kontroly se známými množstvími každého testovaného inhibitoru, bylo pro každou sloučeninu provedeno kvantitativní stanovení 1C5O.
Všech 528 sloučenin sbírky bylo testováno dvojmo. Celkový objem použitého gelu s enzymem byl 33 ml nebo 31,25 μί na test. Dále byly všechny sloučeniny testovány současně a podmínky eseje byly ve srovnání s tradičním 96-jamkovým esejem konstantní. Navíc dále, jak ukazuje obrázek 14, byl esej dostatečně citlivý, aby detekoval inhibitory o síle pouhých 100 μΜ. ICjq hodnoty náležené pro aktivní sloučeniny dobře souhlasí stěmi, které býly zjištěný pro tytéž sloučeniny při nákladnějším 96-jamkovém eseji, který na test vyžadoval 200 μί. Viz tabulku „Výsledky kvantitativního gelového eseje“. Tyto příklady ukazují, že testování sloučenin ve skupinách s vysokou hustotou snižuje náklady a čas. Na příklad i menší redukce rozestupu sloučenin na 2,5 mm namísto 5 mm má za následek čtyřnásobný vzrůst počtu sloučenin testovaných v jednotce objemu. U tohoto pokusu by to na testovanou sloučeninu přineslo snížení objemu pod 10 μί. S reagenty se ještě zachází pohromadě, bez nutnosti mít zařízení pro manipu45 láci s malými objemy kapalin používaných při miniaturizovaném screeningu.
Jako příklad sledovaný pro demonstraci výhod této miniaturizace bylo pomocí CF-HTS testováno 10 080 jednotlivých sloučenin při celkovém objemu enzymového gelu 17 ml (méně než 2 μΐ na test). Pro rozmístění 30 nl každého ze vzorků oddělených po 1 mm byla použita „Packard
Multipette“. Sloučeniny byly rozmísťovány v DMSO při koncentraci 5 mM tak, že přibližně 150pmol každé sloučeniny bylo naneseno na plast. Jako kontrolní inhibitor byl znovu použit DANA. Vedle obvyklé kontrolní titrace mimo soubor sloučenin, byl uvnitř samotného souboru zahrnut slepý pokus, při kterém byly kontrolní vzorky ošetřeny stejně jako 10 080 neznámých, když byly rozmísťovány na plast. Jako předtím byly fólie usušeny a použity v eseji s neuramini-18CZ 299740 B6 dázou. Všech 10 080 vzorků bylo touto metodou současně prozkoumáno za méně než jednu hodinu. Opět nebyla zapotřebí mikrofluidika a/nebo manipulace s malými objemy kromě okamžiku, když byly sloučeniny na počátku rozmísťovány na fólii. Extrémně vysoká hustota při tomto eseji neinterferovala s detekcí inhibitoru. Navíc dále vysoká hustota nekomplikovala identifikaci j aktivních sloučenin i když fluorescenční sloučeniny (snadno pozorovatelné v gelu jako jasnější 3 skvrny) byly v nejbližším sousedství aktivních sloučenin. Viz obrázek 15. |
Výsledky kvantitativního gelového eseje ' 1
Vzorek č. | Přibližné max. Ki (μΜ) z gelů | ICso (μΜ) zjištěné při 96-jamkovérn: eseji |
34 | 100 | >100 |
35 | 80 | >100 |
36 | 8Ó | 42 |
37 | 100 . | >100 |
33 | 100 | >100 |
39. | 100 | >400 |
40 | 40 | 32 |
41 | T00 | >100 |
42 | 40 | 50 |
43 | 100 | >100 |
44 | >200 | >100 |
45 | 100 | >100 |
46 | 100 | >100 |
47 | 10 | 7,5 |
48: | 100: | >100 |
49 | 100 | >100 |
50 | 100 | >100 |
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (12)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob současného testování množství vzorků různých látek na jejich způsobilost zesilovat nebo inhibovat biologický proces, zahrnující20 (a) uložení malého objemu každého z více než 96 vzorků rozdílných látek v uspořádání na matrici tak, že každá jednotlivá látka je soustředěna na své vlastí odlišené místo a identita každé látky může být určena z jejího místa uložení, (b) uvedení této matrice do styku s první porézní matricí obsahující nebo nesoucí rovno25 měrně rozptýlené zkušební činidlo a umožnění, aby část z každé látky difundovala do uvedené porézní matrice takovým způsobem, že prostorové umístění každé difundované látky může být korelováno s místem na uvedené matrici, na kterém byla uvedená látka původně uložena, a-19CZ 299740 B6 (c) provedení testu pro stanovení způsobilosti každé difundované látky zesilovat nebo inhibovat uvedený biologický proces pozorováním interakce každé látky s uvedeným zkušebním činidlem, vyznačující se tím, že uvedenou matricí je planámí matrice.
- 2. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že zahrnuje další stupeň (bl) uvedení uvedené první porézní matrice do styku s druhou matricí nesoucí nebo obsahující rovnoměrně rozptýlené druhé zkušební činidlo a umožnění, aby druhé zkušební10 činidlo difundovalo do první porézní matrice, nebo umožnění, aby každá látka a první činidlo difundovaly do druhé matrice, přičemž se v posledním případě zajistí, že difúze probíhá takovým způsobem, že umístění každé látky na druhé matrici může být korelováno s místem na uvedené planámí matrici, na kterém byla uvedená látka původně uložena, a (d) provedení stupně (c).
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se t í m , že jedním z rovnoměrně rozptýlených zkušebních činidel je makromolekula.
- 4. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jedním z rovnoměrně rozptýlených zkušebních činidel je enzym.
- 5. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se t í m , že jedním z rovnoměrně roz25 ptýlených zkušebních činidel je surový biologický extrakt.
- 6. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jedním z rovnoměrně rozptýlených zkušebních činidel jsou organely.30
- 7. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jedním z rovnoměrně rozptýlených zkušebních činidel jsou celé buňky.
- 8. Způsob podle nároku 1 nebo 2, v y z n a Č u j í c í se t í m, že jedním z rovnoměrně rozptýlených zkušebních činidel jsou celé buňky nesené na jednom povrchu planámí porézní matri35 ce.
- 9. Způsob podle nároku 8, v y z n a č u j í c í se t í m , že se uvedená interakce zaznamenává stykem uvedené porézní matrice s roztokem nebo kapalnou suspenzí činidla nebo porézní matrice obsahující činidlo, které v jednom i ve druhém případě napomáhá zviditelnění proteinu, jehož40· exprese v uvedených celých buňkách je biologickým procesem, který je hodnocen.
- 10. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že prvním zkušebním činidlem je značený ligand a druhým zkušebním činidlem je imobilizovaný receptor pro uvedený ligand.45
- 11. Způsob podle nároku 10, v y z n a č u j í e í se t í m, že se druhá planámí matrice vymývá pro odstranění veškerého značeného ligandu, který difundoval na nebo do uvedené druhé planární matrice, ale nenavázal se na uvedený imobilizovaný receptor.
- 12. Způsob podle nároku 11, vy značu j ící se t í m , že se uvedená druhá matrice uvede 50 do styku s roztokem nebo kapalnou suspenzí činidla nebo porézní matrice obsahující činidlo, které v jednom i druhém případě napomáhá při vizualizaci značeného ligandu, neodstraněného ve vymývacím stupni.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/990,168 US5976813A (en) | 1997-12-12 | 1997-12-12 | Continuous format high throughput screening |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ20002078A3 CZ20002078A3 (cs) | 2000-09-13 |
CZ299740B6 true CZ299740B6 (cs) | 2008-11-05 |
Family
ID=25535858
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20002078A CZ299740B6 (cs) | 1997-12-12 | 1998-12-11 | Kontinuální systém vysoce výkonného screeningu s použitím planárních matric |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5976813A (cs) |
EP (1) | EP1038179B1 (cs) |
JP (1) | JP4558197B2 (cs) |
KR (1) | KR100657777B1 (cs) |
CN (2) | CN101256187A (cs) |
AT (1) | ATE336001T1 (cs) |
AU (1) | AU759538B2 (cs) |
BG (1) | BG65264B1 (cs) |
BR (1) | BR9815059A (cs) |
CA (1) | CA2310684C (cs) |
CY (1) | CY1106220T1 (cs) |
CZ (1) | CZ299740B6 (cs) |
DE (1) | DE69835537T2 (cs) |
DK (1) | DK1038179T3 (cs) |
ES (1) | ES2270539T3 (cs) |
HK (1) | HK1032996A1 (cs) |
HU (1) | HU228578B1 (cs) |
IL (1) | IL135793A (cs) |
NO (1) | NO326662B1 (cs) |
NZ (1) | NZ504112A (cs) |
PL (1) | PL194813B1 (cs) |
PT (1) | PT1038179E (cs) |
SK (1) | SK286095B6 (cs) |
TR (1) | TR200001647T2 (cs) |
TW (1) | TW555967B (cs) |
WO (1) | WO1999030154A2 (cs) |
Families Citing this family (64)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2177922T3 (es) | 1996-01-26 | 2002-12-16 | Virco Bvba | Metodo de valoracion la quimioterapia de pacientes hiv-positivos basado en la sensibilidad fenotipica a los farmacos de las cepas de hiv delpaciente. |
US6790652B1 (en) * | 1998-01-08 | 2004-09-14 | Bioimage A/S | Method and apparatus for high density format screening for bioactive molecules |
US6410332B1 (en) * | 1998-09-08 | 2002-06-25 | Symyx Technologies, Inc. | Sampling and analysis of reactions by trapping reaction components on a sorbent |
EP1149282A2 (en) * | 1998-12-18 | 2001-10-31 | Symyx Technologies, Inc. | Apparatus and method for characterizing libraries of different materials using x-ray scattering |
US20040185432A1 (en) * | 1999-01-08 | 2004-09-23 | Bioimage A/S | Method and apparatus for high density format screening for bioactive molecules |
US6690399B1 (en) * | 1999-05-07 | 2004-02-10 | Tropix, Inc. | Data display software for displaying assay results |
US6800437B1 (en) | 1999-08-06 | 2004-10-05 | Tibotec Bvba | Method of monitoring a biological system by labeling with an apo metal binding protein |
US6544480B1 (en) | 1999-10-26 | 2003-04-08 | Tibotec Bvba | Device and related method for dispensing small volumes of liquid |
WO2001073125A2 (en) * | 2000-03-24 | 2001-10-04 | Lyles Mark B | High throughput screening array containing porous material |
US20030031675A1 (en) | 2000-06-06 | 2003-02-13 | Mikesell Glen E. | B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation |
DE60127867T2 (de) * | 2000-06-13 | 2008-01-17 | Glaxo Group Ltd., Greenford | Hochdurchsatzscreening von verbindungen für biologische wirksamkeit |
US7087375B1 (en) | 2000-06-23 | 2006-08-08 | Johan Lennerstrand | Method for determining the mechanism of HIV RT inhibitors |
US7052659B1 (en) | 2000-07-18 | 2006-05-30 | General Electric Company | Sequential high throughput screening method and system |
US6653124B1 (en) | 2000-11-10 | 2003-11-25 | Cytoplex Biosciences Inc. | Array-based microenvironment for cell culturing, cell monitoring and drug-target validation |
AUPR224600A0 (en) * | 2000-12-21 | 2001-01-25 | Polymerat Pty Ltd | Novel polymers |
US20030060695A1 (en) * | 2001-03-07 | 2003-03-27 | Connelly Patrick R. | Implantable artificial organ devices |
US7244232B2 (en) * | 2001-03-07 | 2007-07-17 | Biomed Solutions, Llc | Process for identifying cancerous and/or metastatic cells of a living organism |
US20020142304A1 (en) * | 2001-03-09 | 2002-10-03 | Anderson Daniel G. | Uses and methods of making microarrays of polymeric biomaterials |
US20080009019A1 (en) * | 2001-06-13 | 2008-01-10 | Smithkline Beecham Corporation | High throughput method for screening candidate compounds for biological activity |
DE10138766A1 (de) * | 2001-08-07 | 2003-02-20 | Bayer Cropscience Ag | Verfahren zum Identifizieren von makrocyclischen Polyketiden |
US20030032198A1 (en) * | 2001-08-13 | 2003-02-13 | Symyx Technologies, Inc. | High throughput dispensing of fluids |
EP1298433A1 (en) * | 2001-09-28 | 2003-04-02 | EMC microcollections GmbH | Device and method for the generation of arrays of substance mixtures by diffusion |
CA2469464A1 (en) * | 2001-12-07 | 2003-06-19 | Dyax Corporation | Method and apparatus for washing magnetically responsive particles |
EP1463807A4 (en) * | 2001-12-19 | 2006-04-12 | Bristol Myers Squibb Co | FORMATHYDROGENASE FROM PICHIA PASTORIS AND USES THEREOF |
US20050054118A1 (en) * | 2002-02-27 | 2005-03-10 | Lebrun Stewart J. | High throughput screening method |
EP1520037A4 (en) * | 2002-02-27 | 2006-06-07 | Miragene Inc | CHEMICAL COMPOSITION WITH IMPROVED SUBSTRATE FOR IMMOBILIZATION OF PROTEIN ON RIGID SUPPORT |
US20040072274A1 (en) * | 2002-05-09 | 2004-04-15 | Lebrun Stewart J. | System and method for visualization and digital analysis of protein and other macromolecule microarrays |
ES2373714T3 (es) | 2002-05-10 | 2012-02-08 | Bio-Layer Pty Limited | Generación de diversidad de recubrimientos de superficie. |
EP1900827A3 (en) | 2002-05-21 | 2008-04-16 | Bayer HealthCare AG | Methods and compositions for the prediction, diagnosis, prognosis, prevention and treatment of malignant neoplasia |
US20040028804A1 (en) * | 2002-08-07 | 2004-02-12 | Anderson Daniel G. | Production of polymeric microarrays |
US20040032058A1 (en) * | 2002-08-13 | 2004-02-19 | Neeper Robert K. | Systems and methods for casting and handling assay matrices |
EP1535042A2 (en) * | 2002-08-13 | 2005-06-01 | Discovery Partners International | Spotting pattern for placement of compounds in an array |
US8557743B2 (en) * | 2002-09-05 | 2013-10-15 | Dyax Corp. | Display library process |
US20040058327A1 (en) * | 2002-09-20 | 2004-03-25 | Pan Jeffrey Y | Method for using a blank matrix in a continuous format high throughput screening process |
WO2004092903A2 (en) * | 2003-04-09 | 2004-10-28 | Discovery Partners International | Spot finding algorithm using image recognition software |
US7025935B2 (en) * | 2003-04-11 | 2006-04-11 | Illumina, Inc. | Apparatus and methods for reformatting liquid samples |
US20070128603A1 (en) * | 2003-05-28 | 2007-06-07 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostic and therapeutics for diseases associated with 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 7 (5-ht7) |
JP2005046121A (ja) * | 2003-07-31 | 2005-02-24 | Japan Science & Technology Agency | オンチップバイオアッセイ方法及びキット |
US20050136536A1 (en) * | 2003-09-15 | 2005-06-23 | Anderson Daniel G. | Embryonic epithelial cells |
US20050069949A1 (en) * | 2003-09-30 | 2005-03-31 | International Business Machines Corporation | Microfabricated Fluidic Structures |
US20050069462A1 (en) * | 2003-09-30 | 2005-03-31 | International Business Machines Corporation | Microfluidics Packaging |
EP1892306A3 (en) | 2003-10-06 | 2008-06-11 | Bayer HealthCare AG | Methods and kits for investigating cancer |
US20060127963A1 (en) * | 2003-11-21 | 2006-06-15 | Lebrun Stewart J | Microarray-based analysis of rheumatoid arthritis markers |
US20070003934A1 (en) | 2003-12-02 | 2007-01-04 | Basf Akiengesellschaft | 2-Methyl-6-solanylbenzoquinone methyltransferase as target for herbicides |
US20050124017A1 (en) * | 2003-12-05 | 2005-06-09 | Stewart Lebrun | Quantitative alkaline-phosphatase precipitation reagent and methods for visualization of protein microarrays |
AU2004296412B2 (en) * | 2003-12-12 | 2011-03-10 | Anteo Technologies Pty Ltd | A method for designing surfaces |
US20090253769A1 (en) * | 2004-01-21 | 2009-10-08 | Gessica Filocamo | Inhibitors of mammalian hdac 11 useful for treating hdac 11 mediated disorders |
EP1564556A1 (de) * | 2004-02-17 | 2005-08-17 | DST Diagnostic Science & Technology GmbH | Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung mehrerer Analyten mit simultaner interner Kontrolle |
US8101431B2 (en) | 2004-02-27 | 2012-01-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements and reagent delivery systems |
US8105849B2 (en) | 2004-02-27 | 2012-01-31 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements |
WO2006002472A1 (en) | 2004-07-02 | 2006-01-12 | Bio-Layer Pty Ltd | Use of metal complexes |
US20080206855A1 (en) * | 2005-05-06 | 2008-08-28 | Kalypsys, Inc. | Automated Compound Screening Using Gel-Permeation Matrix and Pin-Based Sample Transfer |
US7629115B2 (en) * | 2005-05-13 | 2009-12-08 | Honeywell International Inc. | Cell-based platform for high throughput screening |
CA2610793A1 (en) | 2005-05-31 | 2007-05-10 | Labnow, Inc. | Methods and compositions related to determination and use of white blood cell counts |
EP1955077B1 (en) | 2005-12-02 | 2012-06-13 | Sirtris Pharmaceuticals, Inc. | Mass spectrometry assays for acetyltransferase/deacetylase activity |
WO2007076580A1 (en) * | 2005-12-30 | 2007-07-12 | Bio-Layer Pty Limited | Binding of molecules |
EP2851091B1 (en) | 2007-04-13 | 2017-12-27 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for treating cancer resistant to ERBB therapeutics |
US20090118135A1 (en) * | 2007-06-08 | 2009-05-07 | The Burnham Institute | Methods and compounds for regulating apoptosis |
US20090272657A1 (en) * | 2008-05-01 | 2009-11-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Devices and processes for analyzing nucleic acid damage and repair using electrophoresis |
CN104583226B (zh) * | 2012-07-25 | 2018-05-04 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 通过图案化转移片材的试剂靶向递送 |
US9447135B2 (en) | 2012-12-14 | 2016-09-20 | University Of Kentucky Research Foundation | Semi-synthetic mithramycin derivatives with anti-cancer activity |
GB201318814D0 (en) * | 2013-10-24 | 2013-12-11 | Petroleum & Chemical Corp | Microfluidic devices and arrangements for supplying such devices with reagents and biological samples |
WO2015097560A2 (en) | 2013-12-23 | 2015-07-02 | Basf Se | Methods for determining modulators of insect transient receptor potential v (trpv) channel |
US11467168B2 (en) | 2017-07-27 | 2022-10-11 | University Of Southern California | Methods of identifying a moldulator of otopetrin-mediated proton translocation activity |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0063810A1 (en) * | 1981-04-29 | 1982-11-03 | Ciba-Geigy Ag | New devices and kits for immunological analysis |
WO1994002515A1 (en) * | 1992-07-21 | 1994-02-03 | Bunsen Rush Laboratories Inc. | Oligomer library formats and methods relating thereto |
WO1997016569A1 (en) * | 1995-11-03 | 1997-05-09 | Pharmacopeia, Inc. | Lawn assay for compounds that affect enzyme activity or bind to target molecules |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4447526A (en) * | 1981-04-20 | 1984-05-08 | Miles Laboratories, Inc. | Homogeneous specific binding assay with carrier matrix incorporating specific binding partner |
US4591570A (en) * | 1983-02-02 | 1986-05-27 | Centocor, Inc. | Matrix of antibody-coated spots for determination of antigens |
JP2564181B2 (ja) * | 1988-11-24 | 1996-12-18 | コニカ株式会社 | 特定成分の分析方法 |
DE4208645A1 (de) * | 1992-03-18 | 1993-09-23 | Bayer Ag | Optischer festphasenbiosensor auf basis fluoreszenzfarbstoffmarkierter polyionischer schichten |
CA2130947C (en) * | 1993-11-12 | 2001-02-06 | Robert E. Emmons | Dry elements, test devices, test kits and methods for chemiluminescent detection of analytes using peroxidase-labeled reagents |
CA2189634A1 (en) * | 1994-05-06 | 1995-11-16 | John J. Baldwin | Combinatorial dihydrobenzopyran library |
DK0774116T3 (da) * | 1994-07-22 | 2000-05-08 | Zeneca Ltd | Fremgangsmåde til screening af biblioteker af forbindelser |
-
1997
- 1997-12-12 US US08/990,168 patent/US5976813A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-12-10 TW TW087120533A patent/TW555967B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-12-11 PL PL341655A patent/PL194813B1/pl unknown
- 1998-12-11 HU HU0100207A patent/HU228578B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-12-11 AT AT98963130T patent/ATE336001T1/de active
- 1998-12-11 NZ NZ504112A patent/NZ504112A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-12-11 EP EP98963130A patent/EP1038179B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-11 DK DK98963130T patent/DK1038179T3/da active
- 1998-12-11 IL IL13579398A patent/IL135793A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-12-11 PT PT98963130T patent/PT1038179E/pt unknown
- 1998-12-11 TR TR2000/01647T patent/TR200001647T2/xx unknown
- 1998-12-11 KR KR1020007006322A patent/KR100657777B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-11 BR BRPI9815059-6A patent/BR9815059A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-12-11 CN CNA2008100817676A patent/CN101256187A/zh active Pending
- 1998-12-11 CZ CZ20002078A patent/CZ299740B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-12-11 WO PCT/US1998/026465 patent/WO1999030154A2/en active IP Right Grant
- 1998-12-11 CA CA2310684A patent/CA2310684C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-11 CN CN98812079A patent/CN1281552A/zh active Pending
- 1998-12-11 ES ES98963130T patent/ES2270539T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-11 AU AU18216/99A patent/AU759538B2/en not_active Ceased
- 1998-12-11 SK SK836-2000A patent/SK286095B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-12-11 DE DE69835537T patent/DE69835537T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-11 JP JP2000524662A patent/JP4558197B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-04-19 NO NO20002079A patent/NO326662B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-06-27 BG BG104564A patent/BG65264B1/bg unknown
-
2001
- 2001-03-14 HK HK01101849A patent/HK1032996A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-10-26 CY CY20061101543T patent/CY1106220T1/el unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0063810A1 (en) * | 1981-04-29 | 1982-11-03 | Ciba-Geigy Ag | New devices and kits for immunological analysis |
WO1994002515A1 (en) * | 1992-07-21 | 1994-02-03 | Bunsen Rush Laboratories Inc. | Oligomer library formats and methods relating thereto |
WO1997016569A1 (en) * | 1995-11-03 | 1997-05-09 | Pharmacopeia, Inc. | Lawn assay for compounds that affect enzyme activity or bind to target molecules |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ299740B6 (cs) | Kontinuální systém vysoce výkonného screeningu s použitím planárních matric | |
RU2217498C2 (ru) | Способ специфического детектирования одного или более аналитов в образце (варианты), способ идентификации или величины по меньшей мере одного типа клетки или организма в образце, способ детектирования присутствия или величины по меньшей мере одного аналита в типе клетки или организма, способ отслеживания клетки или организма, способ идентификации или определения характеристик потенциального фармацевтического агента | |
CA2734029C (en) | Methods for determining the concentration of an analyte in solution | |
US20030166015A1 (en) | Multiplexed analysis of cell-substrate interactions | |
CA2291621A1 (en) | High-throughput assay | |
US6756014B2 (en) | Biochemical sensor and biochemical testing system using the same | |
AU2002323317B2 (en) | A screening system for identifying drug-drug interactions and methods of use thereof | |
US20040043398A1 (en) | Use of the multipin platform as anchor device | |
PT2282206E (pt) | Método e aparelho para testar vários analitos simultaneamente com um controlo interno | |
AU2002323317A1 (en) | A screening system for identifying drug-drug interactions and methods of use thereof | |
EP1852186A1 (en) | Method and means for multiparametric assays being compartmentalized | |
MXPA00005800A (en) | Continuous format high throughput screening | |
US9588106B2 (en) | Methods and compositions for measuring cell permeability | |
US20040018507A1 (en) | Support plate and method for carrying out functional tests | |
EP1298433A1 (en) | Device and method for the generation of arrays of substance mixtures by diffusion | |
WO2003076900A2 (en) | Multiplexed analysis of cell-substrate interactions | |
WO2007024014A1 (ja) | 分子間相互作用測定方法及びこの方法を用いた測定装置 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20171211 |