CZ298605B6

CZ298605B6 - Zpusob nefermentativní produkce 2-keto-L-gulonovékyseliny a hostitelská bunka

Info

Publication number: CZ298605B6
Application number: CZ20012285A
Authority: CZ
Inventors: G. Boston@Matthew; A. Swanson@Barbara
Original assignee: Genencor International, Inc.
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2007-11-21
Also published as: CN1331749A; DE69931394T2; AU2485500A; US6599722B2; PL351711A1; CA2371534C; BR9916848A; WO2000037667A1; MXPA01006337A; KR20010093149A; JP2003517278A; EP1141368B1; DK1141368T3; US20040180413A1; KR100750363B1; CA2776920A1; DE69931394D1; US20020177198A1; CN1247790C; CA2371534A1

Abstract

Zpusob nefermentativní produkce 2-keto-L-gulonovékyseliny z uhlíkového zdroje zahrnuje v jakémkoliv poradí kroky enzymatické oxidace uhlíkového zdroje nejméne jednou oxidativní enzymatickou aktivitou na oxidacní produkt a enzymatické redukce tohotooxidacního produktu nejméne jednou redukcní enzymatickou aktivitou na 2-keto-L-gulonovou kyselinu, kde uvedená oxidativní enzymatická aktivita vyžaduje oxidovanou formu enzymatického kofaktoru a uvedená redukcní enzymatická aktivita vyžaduje redukovanou formu uvedeného enzymatického kofaktoru a kdese tato oxidovaná forma kofaktoru i redukovaná forma kofaktoru recykluje mezi alespon jedním oxidacním stupnem a alespon jedním redukcním stupnem. Rešení poskytuje geneticky zmanipulované hostitelskébunky obsahující nukleovou kyselinu kódující heterologickou aktivitu dehydrogenázy glukózy a nukleovou kyselinu kódující heterologickou aktivitu reduktázy tak, že heterologická aktivita dehydrogenázyglukózy vyžaduje oxidovanou formu kofaktoru a reduktáza vyžaduje redukovanou formu kofaktoru.

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká manipulování cest a zejména biokatalytických metod pro produkci intermediátů askorbové kyseliny. Vynález poskytuje především způsoby produkování intermediátů kyseliny askorbové v systémech nefermentativních.

Dosavadní stav techniky

Kyselina L-askorbová (vitamin C, ASA) nalézá použití ve farmaceutickém a potravinářském průmyslu jako vitamin a antioxidant. Syntéza ASA získala značnou pozornost po mnoho let díky jejímu relativně velkému objemu na trhu a vysoké ceně jako speciální chemikálie. Chemická cesta z glukózy na ASA, Reichsteinova-Grussnerova methoda, byla poprvé publikována v roce 1934 (Helv. Chim. Acta 17: 311-328). Lazarus a spol. (1989, „Vitamin C: Bioconversion via a Recombinant DNA Approach“, Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, American Society for Microbiology, Washington D.C., vydal C. L. Hershberger) publikovali metodu biokonverze pro výrobu intermediátů ASA, kyseliny 2-keto-L-gulonové (2-KLG, KLG), která může být chemicky konvertována na ASA. Tato biokonverze uhlíkového zdroje na KLG zahrnuje různé intermediáty, přičemž biochemický proces je sdružen s působením reduktázy závislé na kofaktoru. Enzymatická regenerace kofaktoru zahrnuje použití enzymů k regeneraci kofaktorů jako NAD+ na NADH nebo NADP+ na NADPH na účet jiného substrátu, který je potom oxidován.

Stále zůstává potřeba ekonomicky přijatelných metod pro výrobu intermediátů kyseliny askorbové. Zejména když takové metody zahrnují enzymatické aktivity, které vyžadují kofaktor, by bylo zvlášť žádoucí ovládat způsoby, které by zajišťovaly regeneraci kofaktorů. Předkládaný vynález se na takovou potřebu zaměřuje.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká nefermentativní produkce intermediátů ASA, konkrétně 2-keto-Lgulonové kyseliny (KLG), pro jejich konverzi na žádaný finální produkt, např. erythorbát a askorbovou kyselinu, v biokatalytickém prostředí, řečené biokatalytické prostředí se zde uvádí jako bioreaktor. Biokatalytické prostředí může obsahovat životaschopné nebo neživoucí hostitelské buňky, které mají nejméně jednu enzymatickou účinnost, schopnou zpracování uhlíkového zdroje na žádaný intermediát. V jednom provedení je požadovaný intermediát před konverzí na žádaný finální produkt z bioreaktoru rafinován pomocí elektrodialýzy. Pro schematickou představu produkce těchto intermediátů a produktů viz obrázek 2.

Předkládaný vynález je částečně založen na zjištění, že katalytické množství kofaktoru může být pro produkci KLG z uhlíkového zdroje regenerováno nefermentativním nebo in vitro způsobem. V jednom provedení předkládaného vynálezu je požadovaný kofaktor vyčištěn z bioreaktoru pomocí nanofiltrace a znovu použit.

Podle vynálezu je bioreaktor opatřen uhlíkovým zdrojem, který je biokatalyticky konvertován přes nejméně jeden oxidační stupeň a přes nejméně jeden redukční stupeň na KLG. V závislosti na použité hostitelské buňce může hostitelská buňka obsahovat mutaci(e) v genu (genech) kódujícím(ch) oxidační nebo redukční enzymatický účinek tak, že KLG není na další intermediáty dále konvertována. Jestliže oxidační stupeň a redukční stupeň vyžadují kofaktor, metoda poskytuje způsoby pro regeneraci kofaktoru.

-1 CZ 298605 B6

V jednom provedení jsou hostitelské buňky rekombinantní a mají nejméně jednu heterologickou enzymatickou aktivitu. U jednoho provedení je enzymatické působení vázáno na membrány hostitelské buňky; v jiném provedení je enzymatický účinek v roztoku; u dalšího provedení je enzymatická aktivita rozpustná uvnitř buňky a při jiném provedení je enzymatický účinek imobilizo5 ván. Proces může být uskutečněn postupováním po násadách nebo jako proces kontinuální. Hostitelské buňky jsou nejvhodněji čeledi Enterobacteriaceae a při jednom provedení je členem rod Pantoea a zvláště Pantoea citrea. Pantoea citrea se dá získat z ATCC a má například ATCC přístupové číslo 39140.

Hostitelské buňky mohou být lyofilizovány, permeabilizovány nebo jinak zpracovány, aby snížila životaschopnost, nebo zmutovány, aby se eliminovalo využití glukózy pro růst buněk nebo metabolismus dokud je k dispozici enzymatická aktivita pro konverzi uhlíkového zdroje na požadovaný intermediát. Intermediáty mohou být zpracovány dále na finální produkty jako erythorbát nebo ASA.

Předmětem vynálezu je způsob nefermentativní produkce 2-keto-L-gulonové kyseliny z uhlíkového zdroje, který zahrnuje v jakémkoliv pořadí kroky enzymatické oxidace uhlíkového zdroje nejméně jednou oxidativní enzymatickou aktivitou na oxidační produkt a enzymatické redukce tohoto oxidačního produktu nejméně jednou redukční enzymatickou aktivitou na 2-keto-L-gulo20 novou kyselinu, kde uvedená oxidativní enzymatická aktivita vyžaduje oxidovanou formu enzymatického kofaktoru a uvedená redukční enzymatická aktivita vyžaduje redukovanou formu uvedeného enzymatického kofaktoru a kde se tato oxidovaná forma kofaktoru i redukovaná forma kofaktoru recykluje mezi alespoň jedním oxidačním stupněm a alespoň jedním redukčním stupněm.

Ve výhodném provedení způsob zahrnuje dále uvedené kroky v jakémkoli pořadí:

a. enzymatickou oxidaci uhlíkového zdroje první oxidační enzymatickou aktivitou na první oxidační produkt;

b. enzymatickou oxidaci prvního oxidačního produktu druhou oxidační enzymatickou aktivitou na druhý oxidační produkt;

c. enzymatickou oxidaci druhého oxidačního produktu třetí oxidační enzymatickou aktivitou na třetí oxidační produkt a

d. enzymatickou oxidaci třetího oxidačního produktu redukční enzymatickou aktivitou na 2keto-L-gulonovou kyselinu, kde alespoň jedna z uvedené první, druhé a třetí oxidativní enzymatické aktivity vyžaduje oxidovanou formu enzymatického kofaktoru a uvedená redukční enzymatická aktivita vyžaduje redukovanou formu uvedeného enzymatického kofaktoru a kde se tato oxidovaná forma kofaktoru i redukovaná forma kofaktoru recykluje mezi alespoň jedním oxidačním stupněm a redukčním stupněm.

Při jednom provedení probíhá proces v prostředí obsahující organická rozpouštědla a v jiném probíhá proces v prostředí obsahujícím dlouhé polymery. Ještě v jiném provedení probíhá proces v prostředí obsahujícím sůl v rozsahu koncentrací soli.

Předkládaný vynález poskytuje také vektory a rekombinantní hostitelské buňky obsahující enzymatické aktivity, které se používají ve způsobech produkce intermediátů ASA. V jednom provedení obsahují hostitelské buňky heterologickou nukleovou kyselinu kódující GDH, získatelnou z druhů včetně T. acidophilum, Cryptococcus uniguttalatus a Bacillus species a/nebo DKG reduktázu získatelnou z Corynebacterium nebo Erwinia.

-2CZ 298605 B6

Podrobný popis preferovaných provedení

Definice

Následující zkratky, které se zde používají, se vztahují na glukózu (G); D-glukonát (GA); 2keto-D-glukonát (2KDG); 2,5-diketo-D-glukonát (2,5DKG nebo DKG); kyselinu 2-keto-Lgulonovou (2KLG nebo KLG); kyselinu L-idonovou (ID); kyselinu askorbovou (ASA); dehydrogenázu glukózy (GDH); reduktázu 2,5-diketo-D-glukonátu (DKGR) a reduktázu 2-keto-Dglukonátu (KDGDH).

io

Zde používaný termín „nefermentativní“ nebo „in vitro“ se vztahuje na biokatalytický proces, který využívá enzymatickou aktivitu buněk. Buňky mohou být neživoucí nebo životaschopné a nevýrazně rostoucí. Buňky mohou být geneticky změněny, aby se u nich eliminovala spotřeba glukózy a/nebo kterýchkoliv produkovaných intermediátů. Proces in vitro v předkládaném vyná15 lezu zahrnuje použití buněčných membrán, které obsahují enzymatickou aktivitu spojenou s biokatalytickým procesem, použití permeabilizovaných buněk nebo lyofylizovaných buněk obsahujících enzymatickou aktivitu spojenou s biokatalytickým procesem a použití hostitelských buněk nebo membrán či fragmentů hostitelských buněk v jakékoliv formě, která poskytuje potřebnou enzymatickou aktivitu pro biokatalytickou konverzi uhlíkového zdroje na kterýkoliv z intermediátů ASA, včetně, ale neomezuje se jen na GA, KDG, DKG a KLG. Buňka může být rekombinantní buňkou, jež obsahuje heterologickou nukleovou kyselinu kódující žádanou enzymatickou aktivitu, nebo přirozeně se vyskytující buňkou, jež obsahuje žádanou enzymatickou aktivitu. Zde použitý termín „bioreaktor“ se vztahuje na prostředí uvnitř něhož probíhá nefermentativní nebo in vitro proces.

Mnohé enzymy jsou aktivní pouze v přítomnosti kofaktoru, jako například NAD+ nebo NADP+. Termín kofaktor, jak je zde používán, se vztahuje na substrát druhotný co do povahy enzymatické reakce, avšak pro enzymatickou reakci životně zásadní. Jak je zde termín „kofaktor“ používán zahrnuje, ale neomezuje se na NAD+/NADH, NADP+NADPH, ATP, ADP, FAD/FADH₂ a

FMN/FMNH₂. Spojení „regenerace kofaktoru“ nebo „recyklace kofaktoru“ v systému in vitro se vztahuje na fenomén kontinuální oxidace a redukce požadovaného kofaktoru vlivem biokatalýzy tak, že požadovaný kofaktor je přítomen ve formě vhodné ktomu, aby došlo k enzymatické katalýze. V předkládaném vynálezu regeneraci kofaktoru obstarává prostředí, v němž redukovaná forma kofaktoru je dostupná pro redukující enzym a oxidační forma kofaktoru je k dispozici pro oxidující enzym. Předkládaný vynález zahrnuje regeneraci kofaktoru mezi jakýmkoli enzymatickým oxidačním stupněm a jakýmkoli enzymatickým redukčním stupněm při biokatalytickém postupu od uhlíkového zdroje k intermediátů ASA, např. KLG. Požadovaný kofaktor může být přítomen v katalytických množstvích poskytovaných prostředím hostitelských buněk, nebo může být poskytován exogenně ve stechiometrických množstvích, buď v oxidované, nebo redukované formě, při zahájení procesu bioreaktoru.

Zde používaný termín uhlíkový zdroj zahrnuje vhodné uhlíkové zdroje obvykle využívané kmeny Enterobacteriaceae, jako šestiuhlíkové cukry zahrnující, ale neomezující se na glukózu, gulosu, sorbózu, fruktózu, idosu, galaktózu a manózu, všechny buď v D- nebo L-formě, nebo kombinaci šestiuhlíkových cukrů jako sacharosu, nebo šestiuhlíkové cukerné kyseliny včetně ale neomezující se na kyselinu 2-keto-L-gulonovou, kyselinu idonovou, kyselinu glukonovou, 6-fosfoglukonát, kyselinu 2-keto-D-glukonovou, 5-keto-D-glukonovou, 2-ketoglukonátfosfát, kyselinu 2,5-diketo-L-gulonovou, 2,3-diketo-L-gulonovou, kyselinu dehydroaskorbovou, kyselinu erythroaskorbovou a kyselinu D-mannonovou nebo enzymatické deriváty takových, pokud je uhlíkový zdroj schopen konverze na intermediát ASA jako je na příklad KDG, DKG a KLG.

Jak je zde používána čeleď „Enterobacteriaceae“ vztahuje se na bakteriální kmeny, jejichž obecnou charakteristikou je, že jsou gramnegativní, a že jsou schopné existovat za anaerobních podmínek. Preferovanými kmeny Enterobacteriaceae jsou ty, které produkují 2,5-diketo-D55 gulonovou kyselinu z roztoků D-glukózy. V čeledi Enterobacteriaceae rody, které jsou schopné

-3 CZ 298605 B6 produkovat 2,5-diketo-D-gulonovou kyselinu z roztoků D-glukózy zahrnují na příklad rod Erwinia, Enterobacter, Gluconobacter a Pantoea. Intemediáty na mikrobiální cestě cukrů z uhlíkového zdroje k ASA zahrnují, ale neomezují se na GA, 2KDG, 2,5DKG, 5DKG, 2KLG a ΙΑ. V předkládaném vynálezu preferovaným Enterobacteriaceae fermentačním kmenem je druh

Pantoea a zejména Pantoea citrea. Jsou možné čtyři stereoisomery askorbové kyseliny: kyselina L-askorbová, kyselina D-araboaskorbová (kyselina erythorbová), která vykazuje C-vitaminovou aktivitu, kyselina L-araboaskorbová a kyselina D-xyloaskorbová. Zde používaný termín intermediát ASA zahrnuje jakýkoliv produkt na cestě k ASA včetně KDG, DKG a KLG, ale není to na ně omezeno.

Zde používaný termín „rekombinantní“ se vztahuje na hostitelskou buňku, která obsahuje nukleovou kyselinu, která se v organismu nevyskytuje přirozeně a/nebo na hostitelskou buňku, která má další kopie endogenní nukleové kyseliny zavedené rekombinantně. Termín „heterologický“, jak se zde používá, se vztahuje na sekvence nukleové kyseliny nebo aminokyselin, které se v hosti15 telské buňce nevyskytují přirozeně. Jak je zde používán termín „endogenní“, týká se nukleové kyseliny přirozeně se vyskytující v hostiteli.

Zde používaný termín „nukleová kyselina“ se vztahuje na nukleotidovou nebo polynukleotidovou sekvenci a její fragmenty nebo části a na DNA nebo RNA genomického nebo syntetického původu, které mohou být dvouvláknové nebo jednovláknové, jestliže představují antikódující nebo kódující řetězec. Termín „aminokyselina“, jak se zde používá, se vztahuje na peptidové nebo proteinové sekvence nebo jejich části.

Zde používaný termín „mutace“ se vztahuje na každou změnu v nukleové kyselině tak, že pro25 dukt této nukleové kyseliny je inaktivován nebo eliminován. Příklady mutací zahrnují, ale neomezují se jen na bodové mutace, posunové mutace a delece části nebo všech z genů kódujících enzymatickou aktivitu, jako oxidační enzymatickou aktivitu nebo redukční aktivitu. Při jednom zde uváděném provedení pro produkci KLG, pomocí něhož je regenerován kofaktor, nukleová kyselina kódující membránovou vázanou GDH je takto mutována inaktivující endogenní GDH aktivita. V jiném provedení je inaktivována aktivita dehydrogenázy 2-keto-D-glukonátu poskytující takto optimalizovanou produkci intermediátu KDG.

Zde používaná fráze „oxidační enzym“ se vztahuje na enzym nebo enzymový sytém, který může katalyzovat konverzí substrátu s daným oxidačním stavem na produkt s vyšším oxidačním sta35 vem než má substrát. Fráze „redukční enzym“ se vztahuje na enzym nebo enzymový sytém, který může katalyzovat konverzi substrátu s daným oxidačním stavem na produkt s nižším oxidačním stavem než má substrát. Oxidační enzymy spojené s biokatalýzou D-glukózy na KLG zahrnují mezi jinými dehydrogenázu D-glukózy, dehydrogenázu D-glukonátu a dehydrogenázu 2-ketoD-glukonátu. Redukční enzymy spojené s biokatalýzou postupných intermediátů ASA na KLG zahrnují mezi jinými reduktázu 2,5-diketo-D-glukonátu (DKGR), 2-ketoreduktázu (2-KR) a 5ketoreduktázu (5-KR). Takové enzymy zahrnují ty, které jsou přirozeně produkovány hostitelskou kvasinkou nebo ty, které jsou zavedeny pomocí rekombinantních způsobů. Při jednom zde uvedeném provedení probíhá proces v hostitelské buňce Pantoea citrea mající eliminovánu přirozeně se vyskytující GDH aktivitu, membránou vázanou, na NADP+ nezávislou, a rekombi45 nantně zaveden na GDH závisející cytosolický NADP+. Při jiném provedení je do hostitelské buňky zavedena heterologická nukleová kyselina kódující aktivitu reduktázy. U preferovaného provedení se aktivita reduktázy dá získat ze species Coryneform a Erwinia species. Zde používaný termín „cesta enzymu“ se vztahuje na jakýkoliv enzym zúčastněný na biokatalytické konverzi uhlíkového zdroje na intermediát ASA např. KDG, DKG a KLG.

Termín „izolovaný“ nebo „vyčištěný“ jak je zde používán, se vztahuje na nukleovou kyselinu nebo protein anebo peptid ěi kofaktor, který je vyjmut nejméně z jedné komponenty, ke které je přirozeně přidružen. V předkládaném vynálezu může izolovaná nukleová kyselina zahrnovat vektor obsahující nukleovou kyselinu.

-4CZ 298605 B6

V praxi je dobře známo, že deriváty kyselin sacharidů mohou existovat v různých ionizačních stavech v závislosti na médiu, které je obklopuje, zda jsou v roztoku nebo mimo roztok, z něhož jsou preparovány, pokud jsou v tuhé formě. Použitím termínu, jako je například idonová kyselina, pro označení takových molekul se rozumí, že zahrnuje všechny ionizační stavy organické molekuly, o níž se referuje. Tak například „idonová kyselina“, její cyklizovaná forma „idonolakton“ a „idonát“, se týká stejného organického podílu a není zamýšleno, aby specifikovaly jednotlivé ionizační stavy nebo chemické formy.

Podrobný popis

Předkládaný vynález se týká biokatalytické produkce intermediátů ASA, např. KDG, DKG a KLG, z uhlíkového zdroje v prostředí in vitro nebo prostředí nefermentativním. V závislosti na intermediátů, který má být produkován, může proces vyžadovat přítomnost enzymatického kofaktoru. Ve zde popisovaném preferovaném provedení je enzymatický kofaktor regenerován.

Kvůli nákladům na kofaktor je vysoce výhodné použít jej při procesu in vitro, který dovoluje regeneraci katalytických množství kofaktoru obstaranou prostředím hostitelské buňky nebo provedenou exogenně.

Nefermentativní produkce intermediátů ASA

Předkládaný vynález poskytuje způsoby pro produkci intermediátů ASA. Takové intermediáty mohou být zpracovány na ASA, stereoisomery ASA nebo jiné produkty jako erythorbát. V jednom provedení je požadovaným produkovaným ASA intermediátem KDG a bioreaktor je opatřen živoucími nebo neživotnými hostitelskými buňkami Pantoea citrea majícími zmutovaný gen kódující aktivitu dehydrogenázy 2-keto-D-glukonátu, jak je zde popsáno v příkladě II. V tomto provedení je uhlíkový zdroj biokatalyticky konvertován ve dvou oxidačních stupních na KDG, viz Obrázek 2. Při tomto provedení není regenerace kofaktoru zapotřebí.

Jestliže je žádaným ASA intermediátem DKG, je bioreaktor je opatřen živoucími nebo neživot30 nými hostitelskými buňkami Pantoea citrea a uhlíkový zdroj je biokatalyticky konvertován ve třech oxidačních stupních na DKG, viz Obrázek 2. Při tomto provedení není regenerace kofaktoru zapotřebí.

Jestliže je žádaným ASA intermediátem KLG, je bioreaktor je opatřen živoucími nebo neživot35 nými hostitelskými buňkami Pantoea citrea a uhlíkovým zdrojem, jako je glukóza, která je biokatalyticky konvertována ve třech oxidačních stupních a jedním redukčním stupněm na KLG, jak je ukázáno na Obrázku 2. V tomto provedení může být aktivita reduktázy kódována nukleovou kyselinou obsaženou uvnitř hostitelských buněk Pantoea citrea nebo dodanou exogenně. Při tomto provedení vyžaduje první oxidační enzymatická aktivita oxidovanou formu kofaktoru a redukční enzymatická aktivita vyžaduje redukovanou formu kofaktoru. Ve zde uvedeném preferovaném provedení je buňka Pantoea citrea modifikována, aby eliminovala přirozeně se vyskytující GDH aktivitu a do buňky Pantoea je zavedena heterologická GDH, kterou lze získat z T. acidophilum, Cryptococcus uniguttalatus nebo Bacillus species a mající specificitu pro NADPH+, aby poskytla kofaktor recyklující sytém, který vyžaduje a regeneruje jeden kofaktor.

Toto provedení poskytuje způsob pro regeneraci kofaktoru eliminující takto náklady na kontinuální přidávání exogenního kofaktoru do bioreaktoru pro produkci KLG v Pantoea buňkách.

V tomto provedení hostitelská buňka obsahuje dále nukleovou kyselinu kódující aktivitu 2,5DKG reduktázy neboje do bioreaktoru exogenně dodávána 2,5-DKG reduktáza.

V jiném provedení získávání KLG je bioreaktor opatřen buňkami Pantoea citrea obsahující nukleovou kyselinu kódující membránou vázanou GDH příslušné enzymy a kofaktor a přidá se glukonová kyselina, která je konvertována na DKG. Za anaerobních podmínek se potom k reakční směsi přidá glukóza. GDH konvertuje glukózu na GA a reduktáza konvertuje DKG na KLG, zatímco kofaktor je recyklován. Když jsou tyto reakce dokončeny, přidá se kyslík, aby konverto55 vat GA na DKG a cykly pokračují.

-5CZ 298605 B6

Biokatalytické prostředí in vitro

Biokatalytický proces konvertování uhlíkového zdroje na ASA intermediát začíná s vhodným uhlíkovým zdrojem využívaným kmeny Enterobacteriaceae, jako s šestiuhlíkovým cukrem, zahrnujícím například glukózu na šestiuhlíkovou cukernou kyselinou, jako například KGD. Jiné zdroje metabolitů představují, ale nejsou omezeny jen na galaktosu, laktosu, fruktosu nebo enzymatické deriváty z nich. Vedle příslušného uhlíkového zdroje musí média obsahovat vhodné minerály, soli, kofaktory, pufry a jiné komponenty, které jsou v oboru zkušeným známy pro udr10 žování kultur a podporování enzymatických pochodů nezbytných pro produkci žádaných finálních produktů. Preferovanými solemi do bioreaktoru jsou Na⁺, K⁺, NH/, SO₄~“ a acetát. Buňky jsou nejprve pěstovány a unefermentativního procesuje uhlíkový zdroj pro růst eliminován, pH je udržováno při tom mezi kolem pH 4 a kolem pH 9 a je přítomen kyslík.

Uhlíkový zdroj a metabolity z něj pocházejí při biokatalytickém procesu in vitro enzymatickými oxidačními stupni, které se mohou odehrávat mimo intracelulámí prostředí hostitelské buňky, a které využívají enzymatickou aktivitu s hostitelskou buňkou spojenou a probíhají cestou vedoucí k žádanému intermediátu ASA. Enzymatické stupně mohou v bioreaktoru probíhat postupně nebo současně a některé, aby produkovaly žádaný intermediát ASA, vyžadují kofaktor. Předklá20 daný vynález zahrnuje in vitro proces, při němž jsou hostitelské buňky ošetřeny organickou substancí, tak, že buňky jsou neživotné, nicméně enzymy zůstávají při biokatalýze uhlíkového zdroje na intermediáty ASA využitelné pro oxidaci a redukci žádaného uhlíkového zdroje a/nebo metabolitů z něj, jak je popsáno v příkladu V. Předkládaný vynález zahrnuje také in vitro proces, při němž jsou hostitelské buňky lyofilizovány, permeabilizovány jakýmikoli způsoby, sušeny spre25 jováním, rozrušeny nebo jinak ošetřeny tak, aby enzymy byly využitelné ke konverzi uhlíkového zdroje na intermediát ASA.

Oxidační nebo redukční enzymatické aktivity mohou být vázány na membránu hostitelské buňky, imobilizovány, jako na pryskyřici, například AminoLink spojovací gel (od Pierce Chemical Co.), na polymer, nebo rozpustné v prostředí bioreaktoru. Při preferovaném provedení je na membránu vázán nejméně jeden oxidační enzym. Prostředí se může uskutečňovat v organickém nebo vodném systému nebo při kombinaci obou a postup může probíhat v jedné nebo více nádobách. Při jednom provedení se proces uskutečňuje ve dvou nádobách, jedné, kde se využívá kyslík a jedné, která je anaerobní. Například na membránu vázané enzymy, které potřebují kyslík (GDH,

GADH, KDGDH), mohou být izolovány od oněch enzymů co kyslík nepotřebují (kofaktor závislá GDH, kofaktor závislá DKGR), což umožňuje použití nádob s menším objemem, které kyslík potřebují, a tím snížení nákladů. Bioreaktor může být provozován po násadách nebo kontinuálním postupem. Při systému s násadami, bez ohledu na to co se přidává, je v témž čase sklizena veškerá fermentační směs. Při kontinuálním systému je směs pravidelně odtahována prou40 dovým postupem a čerstvý substrát se naproti tomu přidává. Produkované intermediáty mohou být získány z fermentační směsi různými způsoby, včetně pryskyřic iontoměničů, absorpčních nebo ionty zadržujících pryskyřic, aktivního uhlí, zakoncentrování ke krystalizací, pasáže membránou atd.

Bioreaktorový proces může zahrnovat také více než jeden typ buněk, např. jedna buňka může mít oxidační aktivity a druhá buňka může obsahovat redukční aktivity. V jiném provedení se hostitelská buňka permeabilizuje nebo lyofilizuje [Izumi a spol., J. Ferment. Technol., 61 (1983) 135— 142] tak dlouho dokud jsou k dispozici enzymatické aktivity pro konverzi uhlíkového zdroje nebo jeho derivátů. Bioreaktor může probíhat s některými enzymatickými aktivitami, které jsou poskytovány exogenně a v prostředí, v němž jsou obsažena rozpouštědla nebo dlouhé polymery, které stabilizují nebo zvyšují enzymatické aktivity. V jednom zde popisovaném provedení je ke zvýšení aktivity reduktázy použit methanol nebo ethanol. V jiném provedení je ke stabilizaci reduktázy použit Gafquat (viz Gibson a spol., patent US 5 240 843).

-6CZ 298605 B6

V jednom, zde popisovaném ilustrativním bioreaktoru, je hostitelskou buňkou permeabilizovaná buňka Pantoea citrea obsahující glukózu jako uhlíkový zdroj, který podléhá enzymatickými konverzemi sériím oxidačních kroků. Oxidační enzymy zahrnují GDH, GADH a DGDH a redukční stupeň, který zahrnuje 2 DKGR (viz patent US 3 790 444), dávají výtěžek KLG. KLG připravená postupem podle předkládaného vynálezu může být konvertována dále na kyselinu askorbovou a KDG na erythorbát prostředky, které jsou zkušeným v oboru známy, viz například Reichstein a Grussner, Helv. Chim. Acta 17, 311-328 (1934).

Regenerace kofaktoru

Jedna z výhod postupu podle předkládaného vynálezu leží v regeneraci kofaktoru, která je pro enzymatický postup potřebná. Příklady kofaktorů, které mohou být použity v běžném postupu představují, ale nejsou omezeny naNAD+/NADH; NADP+/NADPH; ATP; ADP, FAD/FADH a FMN/FMNH².

V jednom provedení vynálezu je uhlíkový zdroj konvertován na KLG postupem, který obsahuje regeneraci kofaktoru, jak je ukázáno na Obrázku 1. Při tomto enzymatickém procesu regenerace kofaktoru je katalytickým působením GDH jeden ekvivalent D-glukózy oxidován najeden ekvivalent D-glukonátu a jeden ekvivalent NADP+je redukován najeden ekvivalent NADPH. Jeden ekvivalent D-glukonátu produkovaný účinkem GDH je potom oxidován na jeden ekvivalent 2KDG a potom na jeden ekvivalent 2,5-DKG působením membránou vázaných dehydrogenáz GADH, respektive KDGDH. Jeden ekvivalent vytvořeného 2,5-DKG je pak redukován najeden ekvivalent 2-KLG a NADPH je oxidován zpět najeden ekvivalent NADP+ působením 2,5-DKG reduktázy, účinně recyklující ekvivalentní kofaktor, aby byl k dispozici pro oxidaci druhého ekvivalentu D-glukózy. Ostatní metody regenerace kofaktoru mohou zahrnovat chemické, fotochemické a elektrochemické prostředky, kdy ekvivalent oxidovaného NADP+ je přímo redukován na ekvivalent NADPH buď chemickými, fotochemickými, nebo elektrochemickými prostředky. Množství kofaktoru přidaného exogenně do bioreaktoru je mezi asi 1 μΜ do asi 5 mM a u preferovaného provedení mezi asi 5 μΜ do asi 1 mM. Jak je zde v příkladech ukázáno, NaCl ovlivňuje Km pro NADPH, zatímco KLG, species s nábojem, Km neovlivňuje. Proto je-li v bioreaktoru přítomen NaCl, bude pro udržení optimální rychlosti zapotřebí více NADPH. Jak je v příkladech uvedeno dále, většina testovaných solí má účinek na tepelnou stabilitu reduktázy. Jak ocení zkušení odborníci, v závislosti na podmínkách bioreaktoru jako je teplota, mohou být pro získání rovnováhy mezi tepelnou stabilitou a přijatelnými rychlostmi, upravovány hladiny solí. Kofaktor dodávaný exogenně do systému in vitro, může být přidáván sám nebo v kombinaci s jinými substancemi spojenými s biokatalytickou konverzí uhlíkového zdroje na intermediát ASA. Přítomný proces zahrnuje užití kofaktoru imobilizovaného na nosiči, chemicky změněný kofaktor, jako je připojení k dlouhému polymeru a použití kofaktoru v izolované nebo rafinované formě.

Žádaný kofaktor může být také rafinován z biokatalytického prostředí pomocí nanofiltrace a použit znovu. Metody pro užívání nanofiltračních membrán na zachycení kofaktoru popisuje například Seelbach a spol. (1997, Enzyme and Microbial Technology, sv. 20, str. 389-392).

Rekombinační metody Hostitelské buňky

Jakékoli oxidační nebo redukční enzymy, nutné pro řízení cesty sacharidu hostitelské buňky na

ASA intermediát, jako například KDG, DKG nebo KLG, mohou být zavedeny pomocí pro zkušené odborníky běžných technik rekombinantní DNA, pokud se takové enzymy v hostitelské buňce přirozeně nevyskytují. Eventuelně enzymy, které by mohly bránit požadované cestě, mohou být metodami rekombinantní DNA zmutovány. Předkládaný vynález obsahuje rekombinantní introdukci nebo mutaci kteréhokoliv enzymu nebo intermediátu nezbytného pro dosažení požadované cesty.

-7CZ 298605 B6

V jednom provedení předkládaného vynálezu je uhlíkový zdroj, jako glukóza, konvertován na KLG přes četné oxidační stupně a redukční stupeň. Při tomto provedení první oxidační stupeň a redukční stupeň vyžaduje kofaktor. Hostitelskou buňkou je Pantoea citrea, přirozeně se vyskytu5 jící nukleová kyselina kódující dehydrogenázu glukózy (GDH) je zmutována tak, že je eliminována aktivita dehydrogenázy a do buňky je zavedena heterologická GDH. Předkládaný vynález zahrnuje hostitelskou buňku mající další mutaci enzymů v cestě koloběhu uhlíku, která ovlivňuje produkci. Pro obecné techniky viz například techniky popsané v Maniatis a spol., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. a Ausubel a spol., ío 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing „Associates and Wiley

Interscience“, N. Y.

V jednom provedení předkládaného vynálezu je do Pantoea fermentačního kmene rekombinantně zavedena nukleová kyselina kódující DKG reduktázu (DKGR). Byla nalezena řada druhů obsahujících DKGR, zvláště členové skupiny Coryneform, včetně rodů Corynebacterium, Brevibacterium a Arthrobacter. V jednom provedení předkládaného vynálezu je do Pantoea citrea rekombinantně zavedena 2,5-DKGR získatelná z Corynebacterum sp. kmen SHS752001 (Grindley a spol., 1988, Applied and Envirometal Microbiology 54: 1770-1775). V jiném provedení je do Pantoea citrea rekombinantně zavedena 2,5-DKG reduktáza získatelná z Erwinia herbicola popsaná v patentu US 5 008 193 pro Andersona a spol.

Zdroje pro nukleovou kyselinu kódující oxidativní nebo reduktivní enzymy zahrnují následující:

ENZYM CITACE dehydrogenáza glukózy Smith a spol. Biochem. J., 261:973 Neijssel a spol. 1989,

Antonie Van Leauvenhoek 56(1) 51-61 dehydrogenáza kyseliny glukonové Matsushita a spol., 1979 J. Biochem. 85:1173;

Kulbe a spol., 1987, Ann. N.Y. Acad Sci.

5 06:5 52 dehydrogenáza kyseliny 2-keto-D-glukonové Stroshane 1997 Biotechnol. BioEng 19(4) 459 reduktáza 2-ketoglukonátu J. Gen. Microbiol. 1991, 137: 1479 reduktáza 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny patenty US 5 795 761; 5 376 544; 5 583 025;

757 012; 4 758 514; 5 008 193; 5 004 690;

5 0 3 2 5 1 4

Vektorové sekvence

Expresivní vektory používané pro expresi enzymů při přeměnách u představovaného procesu v hostitelských organismech, např. dehydrogenáza nebo reduktáza, obsahují nejméně jeden promotor asociovaný k enzymu, přičemž tento promotor je funkční v hostitelské buňce. V jednom provedení předkládaného vynálezu je promotor promotorem standardního typu pro vybraný enzym a v jiném provedení předkládaného vynálezu je promotor pro enzym heterologický, ale stále funkční v hostitelské buňce. Při jednom provedení předkládaného vynálezu je nukleová kyselina kódující enzym stabilně integrována do genomu mikroorganismu.

V preferovaném provedení obsahuje expresivní vektor kazetu klonující četná místa, která nejvhodněji obsahuje nejméně jedno místo restrikční endonukleázy unikátní pro vektor, aby se napomohlo snadné manipulaci s nukleovou kyselinou. V preferovaném provedení obsahuje vek50 tor také jeden nebo více zvolitelných značkovačů. Zde používaný termín zvolitelný značkovač se vztahuje na gen schopný exprese v hostitelském mikroorganismu, kteiý umožní snadnou selekci těchto, vektor obsahujících hostitelů. Příklady takových zvolitelných značkovačů zahrnují, ale neomezují se na antibiotika jako erythromycin, aktinomycin, chloramfenikol a tetracyklin.

-8CZ 298605 B6

Preferovaným plazmidem pro rekombinantní introdukci přirozeně se nevyskytujících enzymů nebo intermediátů do kmene Enterobacteriaceae je RSF 1010, mobilizovatelný, ne však samopřenosný plazmid, který má schopnost replikovat v širokém rozsahu bakteriálních hostitelů, včetně gramnegativních a grampositivních bakterií. [Frey a spol., 1989, The Molecular Biology of IncQ Plasmids v Thomas (vyd.) Promiscuous Plasmids of Gram Negative Bacteria, Academie Press, London, str. 79-94]. Frey a spol. (1992, Gene 113:101-106) popisují tři oblasti, o nichž zjistili, že ovlivňují mobilizační vlastnosti RSF 1010.

ío Transformace

Obecné transformační procedury jsou vykládány v Current Protocols in Molecular Biology (sv, 1, vydal Ausubel a spol. John Wiley & Sons, Inc. 1987, kapitola 9) a představují kalcium fosfátové metody, transformace za použití DEAE-dextranu a elektroporaci. Pro odborníky v oboru zku15 šené, jsou běžné různé transformační procedury pro introdukci nukleové kyseliny kódující enzymatický pochod v dané hostitelské buňce. Předkládaný proces zahrnuje pochody enzymů produkovaných a rafinovaných z rekombinantních hostitelských buněk a exogenně dodaných do prostředí in vitro, právě tak jako procesy, v nichž cesta enzymu, pro hostitelskou buňku buď heterologického, nebo endogenního, je vyjádřena aktivně rostoucí hostitelskou buňkou nebo je pří20 tomna v membráně neživotné hostitelské buňky. Řada hostitelských buněk může být použita pro rekombinantní uskutečnění pochodů enzymů, které jsou dodávány exogenně, počítaje v to buňky bakterií, hub, savců, hmyzu a rostlin. Postupy pro transformaci rostlin jsou popsány Rodriquezem (WO 95/14099, vydán 26. května 1995).

U preferovaného provedení procesu patří hostitelská buňka do Enterobacteriaceae. Do skupiny Enterobacteriaceae jsou zahrnuty species Erwinia, Enterobacter, Glukonobacter a Pantoea. U předkládaného vynálezu preferovaným fermentačním kmenem je druh Pantoea a zejména Pantoea citrea. U jiného preferovaného provedení je hostitelskou buňkou Pantoea citrea obsahující procedurální enzymy schopné konvertovat uhlíkový zdroj na KLG. Předkládaný vynález zahrnuje cesty do uhlíkového zdroje na KLG přes jakýkoliv intermediát při mikrobiálním pochodu, který dokáže využívat uhlíkový zdroj k produkování KLG, procházejícím přes intermediáty představující, avšak neomezující se na GA, 2KDG, 2,5DKG, 5DKG a IA. Při jednom provedení se nukleová kyselina kódující enzym přeměny zavádí prostřednictvím plazmidového vektoru a při jiném provedení je nukleová kyselina kódující enzym přeměny stabilně integrována v genomu hostitelské buňky.

Identifikace transformantů

Zda byla hostitelská buňka transformována, může být detegováno přítomností/nepřítomností exprese značkovacího genu, který může naznačit, zda je přítomna nukleová kyselina, o kterou jde. Avšak jeho exprese musí být potvrzena. Jestliže se například nukleová kyselina kódující enzym přeměny vloží do sekvence značkovacího genu, rekombinantní buňky obsahující vložku mohou být identifikovány nepřítomností funkce značkovacího genu. Nebo může být značkovací gen umístěn jako druhý po nukleové kyselině kódující enzym přeměny za kontroly jediného promotoru. Exprese značkovacího genu v odezvě na dosazení nebo vybrání obvykle rovněž indikuje expresi enzymu.

Jinak hostitelské buňky, které obsahují kódující sekvenci pro enzym přeměny a enzym exprimují, mohou být identifikovány řadou metod, běžných pro ty, kdo mají v oboru zkušenosti. Tyto metody představují, ale neomezují se na DNA-DNA nebo DNA-RNA hydridizaci a techniky proteinového bioeseje nebo techniky imunoeseje, které, pro detekci a kvantifikaci nukleové kyseliny nebo proteinu zahrnují techniky založené na membráně, na roztoku nebo na čipech.

-9CZ 298605 B6

Vedle toho může být přítomnost sekvence polynukleotidu enzymu v hostitelském mikroorganismu detegována DNA-DNA nebo DNA-RNA hydridizací, nebo zmožením za použití vzorků, částí nebo fragmentů sekvence polynukleotidu enzymu.

Podmínky eseje

Metody detekce intermediátů ASA, ASA a stereoisomerů ASA představuje použití redox titrace s 2,6-dichlorindofenolem (Burton a spol., 1979, J. Assoc. Pub. Analysts 17:105) nebo jinými vhodnými činidly; vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) na iontoměniči (J. Chrom, ío 1980, 196:163); a elektro-redox postupy (Pachia, 1976, Anal. Chem. 48:364). Zkušení odborníci budou dobře obeznámeni s kontrolními metodami, které lze aplikovat při využívání těchto detekčních metod.

Získávání intermediátů

Jakmile vznikl, může být intermediát získán a/nebo rafinován jakýmkoliv způsobem, který je pro odborníky běžný, včetně lyofilizace, krystalizace, sušení ve spreji a elektrodialýzy atd. Elektrodialyzační metody pro rafinaci ASA a intermediátů ASA jako KLG jsou popsány například v patentu US 5 747 306 vydaném 5. května 1998 a v patentu US 4 767 870 vydaném 30. srpna

1998. Nebo mohou být intermediáty také formulovány přímo z bioreaktoru a granulovány nebo nasazeny do kapalné formulace.

Způsob a metoda provedení předloženého vynálezu může být zkušenými odborníky lépe pochopena s odkazem na následující příklady provedení, přičemž tyto příklady nejsou myšlenky tak, že by nějakým způsobem omezovaly rozsah předkládaného vynálezu anebo patentových nároků na to zaměřených. Všechny odkazy a patentové publikace, kterých se to týká, jsou tu citovány.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 je schematické zobrazení procesu in vitro, při němž jsou mezi oxidačním a redukčním stupněm recyklovány NADP+ a NADPH.

Obrázek 2 je schematické zobrazení cesty k intermediátům ASA. Stupně označené A jsou enzy35 matické; stupně označené B jsou konverzemi buď enzymatickými, nebo chemickými. V tomto zobrazení enzym, který konvertuje glukózu (Glc) na GA má GDH aktivitu; oxidační enzym, který konvertuje GA na KDG má GADH aktivitu; oxidační enzym, který konvertuje KDG na

DKG má KDGDH aktivitu a redukční enzym, který konvertuje DKG na KLG má DKGR aktivitu.

Obrázek 3 ilustruje aktivitu reduktázy v přítomnosti 0 až 40 % methanolu při pH 7 a 30 °C.

Obrázek 4 ilustruje aktivitu reduktázy v přítomnosti 0 až 50 % ethanolu při pH 7,22 a 30 °C.

Obrázek 5 ilustruje aktivitu reduktázy při pH 7 v přítomnosti NaCl, KC1, CaCl₂, K₂SO₄ nebo fosforečnanu draselného (KPi). Počáteční rychlosti byly měřeny po 1 min.

Obrázek 6 ilustruje aktivitu reduktázy zbývající po inkubaci při pH 7 a 45 °C v přítomnosti a nepřítomnosti až do 500 mM 2-KLG.

Obrázek 7 ukazuje spektrofotometrické měření NADPH při recyklační reakci kofaktoru in vitro. Absorbance byla měřena při 340 nm. Počáteční odečtení absorbance bylo 0,7 před přidáním enzymu. Další alikvoty GDH byly přidávány přibližně ve 12 a 23 minutě.

-10CZ 298605 B6

Obrázek 8 ukazuje spektrofotometrické měření NADPH při recyklační reakci kofaktoru in vitro. Absorbance byla měřena při 340 nm. Dostatečné množství NaCl bylo přidáno přibližně v 5 minutách, aby se dosáhlo finální koncentrace na 0,5 M.

Obrázek 9 ukazuje Km reduktázy a relativní Vmax pro 2,5-DKG v přítomnosti vzrůstajícího množství 2-KLG.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Tento příklad popisuje způsob produkce hostitelské buňky Pantoea citrea mající zmutovanou přirozeně se vyskytující GDH.

Klonování genu dehydrogenázy glukózy (GDH) z Pantoea citrea:

Gen dehydrogenázy glukózy byl klonován řetězovou reakcí polymerázy (PCR). Při PCR byly použity dva primery: 5'AGGGAGTGCTTACTACCTTATCTGCGGTATA3' a 5'CGCCTAGCTGTGCAATCCATTGATTTTGCACA3'. Po PCR byl DNA produkt kolem 2 kb klonován ve vektoru pGEM-T (Promega) a byla identifikována rekombinantní E. coli se správnou DNA vložkou a klon byl označen jako pRL. DNA vložka byla analyzována DNA sekvencováním a její sekvence byly shledány z 60 až 70 % identická s publikovanými sekvencemi GDH kmene

Pantoea citrea.

Generování deletovaného GDH genu insercí resistenčního genu chloramfenikolu:

Aby se v Pantoea citrea generoval deletovaný gen GDH, byla nejprve generována rekombinantní kopie genu, který měl být deletován, zavedením volitelného značkovače, resistenčního genu chloramfenikolu (CAT). In vitro generovaná kopie byla zavedena do Pantoea citrea a nechána, aby prostřednictvím homologické rekombinace rekombinovala se standardní kopií. pRL DNA byla potom analyzována digescí s různými restrikčními enzymy. Byly zjištěny dvě polohy Smal-štěpení umístěné kolem 700 bp odděleně v DNA kódující GDH. pRL byl digerován se Smál, aby se odstranil 700 bp fragment, který byl potom nahrazen se Smál digerovanou 1,05 kb DNA obsahující resistenční gen chloramfenikolu, aby byl generován rekombinantní plazmid, označený jako pRLcm4. Metoda použitá ke generaci pRLcm4 byly standardní techniky, které v oboru zkušení aplikují. GDH-CAT kódující sekvence z pRLcm4 byla transferována dále do plazmidu pgGP704. DNA kódující GDH-CAT kaseta byla z pRLcm4 odstraněna kombinovanou digescí a restrikčními enzymy Aatll a Spěl. Kohesivní konce digerované DNA byly odstraněny působením T4 DNA polymerásy v přítomnosti směsi trifosfátu deoxynukleotidu. GDH-CAT kazeta byla potom svázána sEcoRV digerovaným pGP704. Rekombinantní plazmid pGP704 obsahující GDH-CAT kazetu byl identifikován a označen jako p704RLcm.

Zavedení deletovaného GDH genu do chromosomu Pantoea citrea:

Plazmid p704RLcm byl zaveden do standardní Pantoea citrea elektroporací. Transformovaná buňka byla nejprve nanesena na agarové desky obsahující 12,5 pg/ml chloramfenikolu a byly sledovány resistentní kolonie. K rozlišování skutečně deletovaného mutanta (který by měl zobra50 zovat na chloramfenikol resistentní fenotyp) od buněk, které v sobě jednoduše chovají plazmid p704RLcm, byly resistentní kolonie zkoumány proti ampicilinu, jinému resistenci značkujícímu antibiotickému nosiči u p704RLcm- Byly identifikovány klony sensitivní na ampicilin. Příslušné klony, které měly správný fenotyp (resistentní na chloramfenikol a sensitivní na ampicilin) byly charakterizovány biochemickými eseji a všechny prokázaly GDH negativní fenotyp. Analýza skvrn DNA rovněž potvrdila, že standardní GDH gen byl nahrazen deletovanou kopií.

-11 CZ 298605 B6

Příklad II

Příklad II popisuje způsob produkce hostitelské buňky mající mutaci v přirozeně se vyskytující dehydrogenáze 2-keto-D-glukonátu (E3)

Dehydrogenáza 2-keto-D-glukonátu (EC 1.1.99.4) z Gluconobacter melanogenus se rafinuje podle postupu Mclntire-ho a spol. [Mclntire W., Springer T. P., Ameyama M., Adachi O., Matsushita K. a Shinagawa E.: Biochem. J. (1985) 231, 651-654] a odkazů tam uvedených. Rafinovaný protein se digeruje s trypsinem a chymotrypsinem nebo jinými proteázami, aby se ío připravily fragmenty, které se rozdělí HPLC nebo jinými technikami. Individuální peptidy se shromáždí a sekvencují. Ze sekvence se syntetizují sondy DNA, které budou zesilovat odpovídající sekvenci v hostitelském organismu nebo genomu příbuzného organismu. Pomocí standardních PCR technik jsou větší fragmenty žádaného genu zmnoženy, rafinovány a sekvencovány.

Tyto fragmenty jsou použity pro hydridizování ke genu a umožňují klonování a sekvencování celého genu. Jakmile je sekvence poznána, je deletován gen jak se popisuje pro dehydrogenázu D-glukonátu (GDH) v příkladu I.

Jiné způsoby pro redukci nebo eliminaci dehydrogenázy 2-keto-D-glukonátu zahrnují inhibitory [organické kyseliny jako citrát a sukcinát jsou uváděny, že inhibují dehydrogenázu 2-keto-D20 glukonátu; Shinagawa E. a Ameyama M.: Methods in Enzymology (1982) 89, 194-198] a změny pH a teploty.

Enzym může být analyzován na aktivitu nebo ztrátu aktivity pomocí esejů, které popsal Shinagawa a Ameyama.

Příklad III

Příklad III ilustruje metodu produkce KLG v bioreaktoru, kde je regenerován kofaktor.

Materiály a metody Permeabilizace buňky

400 ml buněk P. citrea majících mutaci v přirozeně se vyskytující, membránou vázané GDH, bylo pěstováno do 80 OD (600 nm) v 10 g/1 glukonátu a smíseno s 16 ml směsi 10 % toluenu a 90 % acetonu na 3 minuty při 22 °C. Permeabilizované buňky byly pak 10 minut centrifugovány při 9000 ot/min a vzniklý sbalek buněk byl promyt 400 ml 50 mM Tris, pH 7. Promývání bylo opakováno ještě dvakrát, aby se zajistilo odstranění residuálního organického rozpouštědla.

Plnění reaktoru

400 ml permeabilizovaných buněk v 50 mM Tris, pH 7, uvedených shora, bylo umístěno do jednolítrové baňky opatřené míchadlem, kontrolou teploty, trubicí přivádějící kyslík, základní pří45 vodní trubicí, vstupem pro vzorek a sondami pro kyslík a pH. K roztoku bylo přidáno 200 μΐ MAZU (BASF) proti pěnění, aby se zvládalo nadbytečné pěnění, do baňky byl vháněn stlačený vzduch, teplota byla nastavena na 28 °C, a míchadlo bylo zapnuto na otáčky 1200 ot/min až do té doby, kdy kyslíková sonda ukázala přes 60 % nasycení. Potom bylo přidáno 16 g krystalické glukózy a 4 g krystalického glukonátu sodného do finální koncentrace 10 g/1 glukonátu a 40 g/1 glukózy. Směs se nechala míchat dokud všechen glukonát nebyl konvertován na DKG. Hladina glukózy byla udržována nad 20 g/1. Díky permeabilizaci buněk vstoupila do neproduktivního buněčného metabolismu minimální množství glukózy. pH bylo udržováno při 7 kontrolovaným přidáváním 50 % NaOH od začátku do konce.

- 12CZ 298605 B6

Přidávání rozpustných enzymů a kofaktoru

Jakmile byl glukonát konvertován na DKG, bylo spolu s 400 μΜ NADP+ přidáno 2000 jednotek každé, na kofaktoru závislé, GDH a DKG reduktázy (pro DKGR se jedna jednotka rovná jedné změně OD absorbance za minutu, když se měří při 340 nm). Reaktor byl míchán, plněn vzduchem a udržován při 28 °C jako nahoře. Periodické přidávání glukózy se dělo od začátku do konce průběhu, aby byla zajištěna konstantní dodávka substrátu pro oba na kofaktoru závislé systémy.

ío Výsledky

Experiment v bioreaktoru byl prováděn s nerafinovanou reduktázou A:F22Y/A272G patent US 5 795 761) ve formě surového extraktu z E. coli. GDH T. acidophilum a NADP+ byly nakoupeny v rafinované formě od fy Sigma. Rychlosti GA kDKG byly větší než 10 g/l/h. Počáteční rychlosti tvorby 2KLG byly větší než 10 g/l/h. Integrovaná rychlost po prvních šesti hodinách byla přes 5 g/l/h. Kofaktor se jevil jako stabilní po prvních šest hodin a převážně v redukované formě. Celkový počet přeměn byl 537 (215 mM 2KLG/0,4 mM NADP+). Během prvních šesti hodin nešly nikdy intermediáty GA a DKG na 4 g/1. Průběh byl zastaven 6,5 hodiny po první náplni buněk a přes noc při 22 °C běžela doběhová fáze při mírném míchání. Konečný titr KLG byl kolem 42 g/1.

Během průběhu inkubace bioreaktoru byly odebírány alikvotní podíly. Tyto alikvoty byly nejprve točeny na mikroodstředivce, aby se buňky sbalily. Pro analýzu zbývající aktivity reduktázy, bylo přidáno 25 mikrolitrů supematantu vzorku k roztoku 910 μΐ pufru (50 ml bis-Tris, pH 7), 20 μΐ

DKG (70 mg/ml) a 250 μΜ NADPH. Aktivita reduktázy byla měřena monitorováním ztráty absorbance při 340 nm za 1 min. GDH aktivita byla měřena monitorováním ztráty absorbance při 340 nm za 1 min. GDH aktivita byla měřena přidáním 25 μΐ vzorku k roztoku obsahujícímu 520 μΐ pufru, 150 μΐ NaCl (1 M), 200 μΐ močoviny (8 M), 50 μΐ glc (1 M) a 60 μΐ NADP+ (5 mM) a monitorováním vzrůstu absorbance při 340 nm za 1 min. Obě, jak reduktáza tak GDH vykázaly úplnou reaktivitu v celém průběhu experimentu v bioreaktoru.

Příklad IV

Tento příklad ilustruje produkci KDG v bioreaktoru in vitro.

Buňky obsahující membránou vázané aktivity dehydrogenázy glukózy a dehydrogenázy D-glukonové kyseliny, avšak nikoliv aktivitu dehydrogenázy 2-keto-D-glukonátu, se vypěstují a seberou. Jedním příkladem takové buňky je Pantoea citrea, u níž je mutace v enzymu dehydrogenázy

2-keto-D-glukonátu aje vypěstována a zpracována jako v příkladu III. Buňky se permeabilizují jak je popsáno v příkladu III. Po alikvotních podílech nebo kontinuálně se přidává glukóza (krystalická nebo v roztoku). pH je udržováno kontrolovaným přidáváním koncentrovaného roztoku NaOH. Glukóza je konvertována na D-glukonovou kyselinu a potom KDG. Tvorba produktu se monitoruje analýzou alikvotů ve vhodném HPLC systému. Produkt se získá odstraněním buněk centrifugováním a koncentrováním nebo odstraněním zbylé kapaliny.

Příklad V

Tento příklad ukazuje, že přídavek organického rozpouštědla zvyšuje aktivitu reduktázy.

Do kyvefy se vloží 1 až 2 mg DKG, 250 pm NADPH, F22Y/A272G reduktáza A a dostatkem 50 mM bis—Tris pufru o pH 7 se doplní na konečný objem 1 ml. Aktivita reduktázy se měří monitorováním snižování absorbance při 340 nm. Množství přidané reduktázy při teplotě míst-13 CZ 298605 B6 nosti nebo 30 °C typicky vyvolává změnu absorbance o 0,1 až 0,2 OD/min. Za stejných podmínek, byly k roztoku přidávány alikvotní podíly methanolu nebo ethanolu a byla měřena aktivita reduktázy. Aktivita reduktázy v přítomnosti různých množství methanolu při 30 °C je uvedena na Obrázku 3 a aktivita v přítomnosti ethanolu při 22 °C, je uvedena na Obrázku 4.

Jak je na obrázcích ukázáno, aktivita reduktázy vzrůstá v přítomnosti určitých množství methanolu nebo ethanolu. Optimální koncentrace se pohybují mezi 10 a 25 % organického rozpouštědla.

ío GDH z T. acidophilum má malé snížení aktivity, když se inkubuje s 10 % methanolu (podmínky eseje jsou 50 mM Tris, pH 7, 12,5 mM D-glukózy, 250 μΜ NADP+, v 1 ml. Aktivita se monitoruje zvýšením absorbance při 340 nm). Permeabilizované buňky byly inkubovány s 15 % methanolu a glukonovou kyselinou. Aktivity dehydrogenázy D-glukonové kyseliny a dehydrogenázy kyseliny 2-keto-D-glukonové nebyly přidáním methanolu výrazně ovlivněny, jak bylo monito15 rováno tvorbou produktu (analýza HPLC).

Přídavek methanolu nebo ethanolu ke kompletní reakci v bioreaktoru bude zvyšovat aktivitu reduktázy. Ztráty aktivity GDH nebo jiných komponent mohou být překonány větším přídavkem GDH nebo buněk.

Příklad VI

Příklad VI ukazuje aktivitu reduktázy je-li přítomen Gafquat a PEG80000.

Reduktáza byla inkubována s 250 μΜ NADPH, 1 až 2 mg/ml DKG a 0 %, 0,7 % a 2,8 Gafquatu (ISP Technologies lne.) nebo 0,5 % PEG8000 v 1 ml pufru (50 mM bis-Tris pufr, pH 7) při 30 °C. Aktivita reduktázy byla měřena jako v příkladu V. Jak je v Tabulce 1 ukázáno, přídavek Gafquatu zvyšuje aktivitu o 80 % ve srovnání s aktivitou bez Gafquatu. PEG80000 zvyšuje akti30 vitu reduktázy přibližně o 15 %.

Tabulka 1

Zvýšení aktivity reduktázy v přítomnosti Hafquatu nebo PEG8000

Polymer	Přidaná % k finálnímu roztoku	% aktivity bez přídavku
Gafquat	07-2,8	180
PEG8000	0,5	115

Příklad VII

Příklad VII ukazuje aktivitu reduktázy v přítomnosti soli.

Aktivita reduktázy F22Y/A272G byla měřena v přítomnosti různých množství rozdílných solí. 45 Esej tvořilo přidávání reduktázy do roztoku (konečný objem 1 ml), který obsahoval 250 μΜ

NADPH, DKG (1 až 1,5 mg/ml), 50 mM bis-Tris pufru, pH 7,0 a různá množství fosforečnanu draselného, NaCl, KC1, K₂SO₄ a CaCl₂. Všechny reakce byly prováděny při 30 °C. Výsledky jsou uvedeny na Obrázku 5.

Jak je na Obrázku 5 ukázáno, aktivita reduktázy je stejná nebo mírně vzrůstá, když je společně inkubována s až do 100 mM NaCl nebo KC1. Potom aktivita opadá až koncentrace vzrostou na

- 14CZ 298605 B6

250 mM. Aktivita reduktázy opadá, když koncentrace CaCl₂ nebo fosforečnanu draselného jsou 20 mM nebo více.

Vazebná konstanta reduktázy (Km) pro NADPH v přítomnosti 200 mM NaCl byla stanovena za 5 použití standardních biochemických technik [Fersht A.: Enzyme Structure and Mechanism (1977), W. H. Freeman and Company], Reakce byla prováděna v bis-Tris pufru pH7 obsahujícím přibližně 1,5 mg/ml GKG při 30 °C a proměnná množství NADPH. Bylo nalezeno, že Km pro NADPH v přítomnosti 200 mM NaCl 10 až 40ti násobně vzrůstá proti Km stanovené bez NaCl. Maximální rychlost (Vmax) se solí byla podobná nebo mírně vzrostla nad Vmax bez soli. Jedna ío cesta ke snížení účinku soli na aktivitu reduktázy je zvýšit koncentraci NADPH, dokud ten je při oněch podmínkách při nebo nad Km. Jinak by mohly být odstraněny species s nábojem, včetně

KLG.

Příklad VIII

Příklad VIII ukazuje stabilitu A F22Y/A272G reduktázy v přítomnosti poměru soli/produkt.

Tepelná stálost reduktázy v přítomnosti solí velice vzrostla. Reduktáza byla testována jednou 20 z následujících cest. V prvním případě byla reduktáza přidána k pufru (50 mM bis-Tris, pH 7) v přítomnosti a nepřítomnosti různých množství 2-KLG (0 až 500 mM). Tyto roztoky byly potom alikvotně rozděleny (40 μΐ) do l,5ml zkumavek eppendorf. Zkumavky byly potom umístěny do vodní lázně 45 °C a vyjímány ve stanovených intervalech. Pak byla reduktáza pomocí standardních esejů pro aktivitu reduktázy, analyzována na zbývající aktivitu. Výsledky jsou uve25 děny na Obrázku 6.

Jak je na Obrázku 6 ukázáno, v přítomnosti 500 mM 2-KGL, reduktáza za těchto podmínek žádnou aktivitu výrazně neztrácí. Avšak pouze s pufrem inkubovaná reduktáza ztrácí přibližně polovinu své aktivity v 10 min. Koncentrace intermediátů 2-KLG poskytují částečnou stabilizaci.

Reduktáza byla inkubována 10 min v přítomnosti pufru (50 mM bis-Tris, pH 7 nebo 25 mM MOPS, pH 7), 0,5 M NaCl, 0,5 KC1, 0,5 M NH»C1, 0,5 M K₂SO₄ a 0,1 M NaCl při pH 7 a 45 °C. Jak je uvedeno v Tabulce 2 níže, v přítomnosti těchto sloučenin se ztrácí málo aktivity, zatímco reduktáza pouze s pufrem ztrácí téměř polovinu své aktivity. Tyto sloučeniny jasně reduktázu stabilizují. Nižší a vyšší hladiny těchto sloučenin by měly rovněž reduktázu stabilizovat.

Tabulka 2

Aktivita reduktázy po 10 min inkubaci při teplotě místnosti nebo 45 °C.

Aktivita byla stanovována pomocí standardního eseje.

Vzorek reduktázy	Zbylá aktivita po 12 min inkubací %	Zbylá aktivita po 10 min inkubaci %
Pufr		20-40
0,5 M NaCl		100
0,5 M KCI		100
0,5 M NH₄CI		100
0,5 M K2SO4		100
0,1 MNal	80-85
100mM NADPH		80-90
200 mM K2PO4		65-78
100 mM K₂SO₄		90-100

- 15CZ 298605 B6

Bylo provedeno srovnání mezi stabilizací 2-KLG a NaCl. Inkubace byla provedena v 25 mM MOPS, pH 7 při teplotě 45,4 °C. Byla použita koncentrace 20 mM 2-KLG nebo 20 mM NaCl. Analyzováno bylo v čase 0,5 a 10 min. Výsledky jsou shrnuty níž v Tabulce 3. Jak je ukázáno, stejné množství NaCl stabilizuje tak reduktázu více než 2-KLG.

Tabulka 3

Podmínky	Aktivita, 0 min, %	Aktivita, 5 min, %	Aktivita, 10 min, %

20 mM NaCl	100	72	59
20 mM 2-KLG	100	51	29

Všechna % v Tabulce 3 jsou ± 10 %.

Při 46,6 až 46,9 °C byly stanoveny v přítomnosti 0 až 400 mM NaKLG pro reduktázu poločasy životnosti. Tato teplota byla volena, aby se poločasy stanovovaly při stejné teplotě. Pufr je

25 mM MOPS, pH 7. Odebraly se alikvotní podíly a analyzovaly se na zbylou aktivitu. Měření termostability poločasů životnosti byla prováděna následovně: vzorek 450 μΐ obsahující pufr, reduktázu a 2-KLG (kde byl použit) byl umístěn do eppendorf-zkumavek a zahříván ve vodní lázni. Během doby průběhu, která se měnila od 10 do 30 minut bylo odebráno osm nebo devět alikvotních podílů. Každý alikvotní podíl byl nalit na led a dvojmo analyzován na konci experi20 mentu. Aktivity byly graficky vynášeny jako čas proti zbývající aktivitě. K_f bylo stanoveno úpravou linky využívající program počítačové grafiky pro řešení exponenciálního rozkladu. Tato hodnota byla potom použita k vypočítání poločasu životnosti [Fersht A., „Enzyme Structure and Mechanism“ (1977), W. H. Freeman and Co.]. Výsledky jsou uvedeny níže v Tabulce 4.

Tabulka 4

NaKLG koncentrace	0 mM	100 mM	200 mM	300 mM	400 mM
Poločas životnosti (min)	3,510,5	5,5 ±1	7,5 ±1,5	10±3	18,5 ±3

Jak ukazují výsledky v Tabulce 4, NaKLG zřetelně stabilizuje reduktázu a tato stabilizace je závislá na koncentraci.

Tato data ukazují, že zvyšující se množství soli mohou reduktázu stabilizovat. Vhodné soli, které mohou být použity v bioreaktoru představují síran amonný, octan sodný, octan amonný, chlorid amonný, síran sodný, fosforečnan draselný, fosforečnan sodný, chlorid sodný, KC1, NH4CI, K2SO4 a Nal. Zkušený odborník uzná, že optimální rozmezí soli bude závislé na teplotě. Proto, aby se dosáhla žádoucí stabilita reduktázy, může být v bioreaktoru modifikována buď teplota, nebo koncentrace soli anebo oboje. Při nižších teplotách, při kterých by byl typický reaktor provozován, by se muselo použít méně soli, aby se zajistil stejný stupeň stabilizace jak je udáno v Tabulce 4.

Příklad IX

Příklad IX ilustruje metodu měření poměru NADPH / NaDP+ a rovnováhy reakce.

-16CZ 298605 B6

Redukovaný kofaktor (NaDPH) má silnou absorbanci při 340 nm, zatímco oxidovaný kofaktor (NADP+) při takové vlnové délce neabsorbuje. Jsou-li tudíž spolu smíseny oba kofaktory, může být množství přítomného NADPH stanoveno absorbanci při 340 nm. Je-li také známo množství původně přidaného NaDP+, může být pak snadno stanoven poměr těchto dvou kofaktorů. Tato metoda může být použita pro stanovení, jak přidání různých komponent do reakce, jako na příklad reakce recyklace kofaktoru, ovlivňuje reakční rovnováhu.

ml reakční směsi byl při teplotě místnosti vložen do kyvety. Reakční směs tvořil pufr (50 mM bis-Tris, pH 7), 5 mg glukózy, 5 mg 2,5-DKG, 100 μΜ NADPH, 100 μΜ NADP+, reduktáza a ío dehydrogenáza glukózy (GDH). Pro nastartování reakce byly naposled přidány enzymy a hladiny kofaktoru byly monitorovány při 340 nm. Po dosažení rovnováhy (Obrázek 7) byl přidán další alikvotní podíl GDH. Rovnováha se velmi rychle posunula ve prospěch větší přítomnosti

NADHP. Přidávání více GDH poskytovalo stejnou odezvu.

Jako nahoře byl připraven další 1 ml inkubační směsi. Po dosažení rovnováhy bylo do ní přidáno 29 mg NaCl tak, aby se získala finální koncentrace 0,5 M NaCl. To, jak je ukázáno na Obrázku 8, dramaticky posunulo rovnováhu ve prospěch přítomnosti NADPH.

Příklad X

Příklad X ilustruje recyklační reakce kofaktoru.

Recyklační reakce kofaktoru byly uskutečňovány přidáváním reduktázy, glukózy, 2,5-DKG a

NADP+ do reakční nádoby. Aby se vyhodnotila reakce v přítomnosti produktu, byla k některým reakcím dodatečně přidávána rafinovaná 2-KLG. Tyto reakce byly udržovány, aby produkovaly glukonovou kyselinu a 2-KLG. Kofaktor byl recyklován mezi NADP+ a NADPH působením obou enzymů. Periodicky byly odebírány alikvotní podíly a pomocí HPLC analyzovány na přítomnosti substrátů a produktů. Reakce byla udržována nejméně 20 hodin při teplotě místnosti.

Byly prováděny reakce už jen se 3 ml. Reduktáza, GDH, 10 mg/ml glukózy a 10 mg/1 lyofilizované 2,5-DKG byly při reakci přidány do 50 mM bis-Tris pufru. K některým inkubacím byla v koncentraci 75 mg/1 přidána 2-KLG. Dodáním NADP+ (400 μΜ) byla při teplotě místnosti reakce nastartována. pH roztoku bylo přidáváním malého množství NaOH udržováno mezi pH 6 až 7,5. Periodicky byly přidávány alikvotní podíly glukózy a 2,5 DKG. Na konci dne byla reakce přes noc uložena při 4 °C. Následujícího rána byla ohřátá na teplotu místnosti, bylo upraveno pH a reakce pokračovala. Byly odebírány malé alikvotní podíly a injikovány do HPLC. Množství vytvořeného glukonátu a 2-KLG mohla být vypočtena srovnáním se standardem. Při typické reakci nejméně 60 % glukózy konvertovalo na glukonát a nejméně 60 % 2,5-DKG konvertovalo na 2-KLG.

Příklad XI

Příklad XI ilustruje kinetiku NaCl.

Když byl ke standardnímu eseji reduktázy, obsahujícímu 250 μΜ NADPH a 10 až 20 mM DKG, přidán NaCl (100 mM nebo více), snížil se podíl reduktázy. Provedením kinetické analýzy bylo zjištěno, že chlorid sodný zvyšuje Km reduktázy pro kofaktor NADPH. Jak je NaCl přidáno více, vzrůstá Km. Je-li použito množství NADPH pod nasycením, projevuje reduktáza inhibici vlivem NaCl. Aby se tento efekt paralyzoval, bylo do reakce přidáno více NADPH, takže to je několikanásobně nad Km. Způsob inhibice ukazuje, že je kompetitivní.

-17CZ 298605 B6

Km pro DKG v přítomnosti NaCl bylo stanoveno pomocí standardních technik. Koncentrace NADPH pro každé měření byla upravena nejméně trojnásobně nad její Km pro každou koncentraci NaCl.

[NaCl], mM	Km pro NADPH (mM)	Km pro DKG (mM)
0	4-9	6-14
100	30-100	6-14
200	130-230	6-14
400	260-360	6-14

Příklad XII

Příklad XII ukazuje kinetiku 2-KLG.

Km pro DKG v přítomnosti 2-KLG bylo stanovováno pomocí standardních biochemických technik. Množství 2-KLG bylo měřeno od 0 do 150 mM v pufru při pH 7. Km při DKG za podmínek pH 7 bylo 10 až 2 mM. Jak koncentrace 2-KLG vzrůstá, Km pro 2,5-DKG se snižuje. Na příklad

Km pro DKG při 150 mM 2-KLG je 2 až 4 mM. Reakční rychlost se také snižuje a dozná 2 až 4 násobné snížení, když koncentrace KLG vzroste z 0 na 150 ml. Toto chování je konsistentní s nekompetitivní inhibicí.

Bylo zjištěno, že Km pro NADPH v přítomnosti 100 mM 2-KLG je 4 až 9 mM. To bylo prove20 děno pomocí standardních biochemických technik při pH 7, s koncentrací 2,5-DKG větší než 14 mM a koncentracemi NADPH vymezujícími Km hodnotu.

S přítomností vzrůstajících množství KLG v prostředí bioreaktoru by se tudíž mělo očekávat, že sníží aktivitu reduktázy a zpomalí celkovou rychlost reakce. Dvěma cestami k překonání tohoto fenoménu by bylo získání KLG např. elektrodialýzou nebo alternativně přidáním více reduktázy do bioreaktoru.

Příklad XIII

Příklad XIII ilustruje syntézu 2,5-DKG.

Buňky P. citrea byly inkubovány s 150 mM glukonátu sodného ve vhodném pufru: použilo se 25 mM bis-Tris nebo 25 mM MOPS při pH 6. 25 ml buněk, pufr a substrát bylo vloženo do 125 ml erlenmeyerovy baňky s přepážkou a inkubováno při 28 °C za třepání přibližně 250 ot/min. Po 16 až 24 hodinách se baňka monitoruje na tvorbu 2,5-DKG pomocí HPLC analýzy a eseje aktivity. Buňky se odstředěním usadí, a supematant se odstraní. Materiál se za sterilních podmínek zfiltruje a může být uchován při 4 °C nebo zmražen. Jinak může být materiál lyofilizován na tuhou látku.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob nefermentativní produkce 2-keto-L-gulonové kyseliny z uhlíkového zdroje, vyznačující se tím, že zahrnuje v jakémkoliv pořadí kroky enzymatické oxidace uhlíkového zdroje nejméně jednou oxidativní enzymatickou aktivitou na oxidační produkt a enzymatické redukce tohoto oxidačního produktu nejméně jednou redukční enzymatickou aktivitou na to 2-keto-L-gulonovou kyselinu, kde uvedená oxidativní enzymatická aktivita vyžaduje oxidovanou formu enzymatického kofaktoru a uvedená redukční enzymatická aktivita vyžaduje redukovanou formu uvedeného enzymatického kofaktoru a kde se tato oxidovaná forma kofaktoru i redukovaná forma kofaktoru recykluje mezi alespoň jedním oxidačním stupněm a alespoň jedním redukčním stupněm.

2.5- diketo-D-gl ukonát.

2.5- diketo-D-glukonátu.

20

2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že uhlíkovým zdrojem je KDG.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje dále uvedené kroky v jakémkoli pořadí:

4. Způsob podle nároku 3, v y z n a č u j í c í se tím, že první oxidační enzymatická aktivita vyžaduje oxidovanou formu enzymatického kofaktoru.

5 kofaktoru je NADP+ a redukovaná forma enzymatického kofaktoru je NADPH.

30. Způsob podle nároku 3, vy z n a č uj í c í se tím, že oxidovaná forma enzymatického kofaktoru je NAD a redukovaná forma je NADH.

ío

31. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačuj ící se tím, že je kontinuální.

32. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, v y z n a č u j í c í se tím, že je vsázkový.

33. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že probíhá v prostředí obsahujícím organická rozpouštědla.

34. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, v y z n a č u j í c í se tím, že pro20 bíhá v prostředí obsahujícím dlouhé polymery.

35. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok získání Laskorbové kyseliny z uvedené 2-keto-L-gulonové kyseliny.

5. Způsob podle nároku 3, vy z n a č uj í c í se tím, že uhlíkovým zdrojem je glukóza a první enzymatickou aktivitou je aktivita dehydrogenázy glukózy.

6. Způsob podle nároku 5, v y z n a č u j í c í se t í m , že aktivita dehydrogenázy glukózy je získatelná z bakteriálního, kvasinkového nebo fungálního zdroje.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že aktivita dehydrogenázy glukózy je

45 získatelná ze zdroje zahrnujícího T. acidophilum, Cryptococcus uniguttalatus a druhy Bacillus.

8. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že každým z prvního, druhého a třetího enzymu je aktivita dehydrogenázy.

50

9. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že enzymy mající nejméně jednu z první, druhé, třetí a čtvrté enzymatické aktivity jsou imobilizovány.

10. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že enzymy mající nejméně jednu z první, druhé, třetí a čtvrté enzymatické aktivity jsou v roztoku.

-19CZ 298605 B6

11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že druhou enzymatickou aktivitou je aktivita dehydrogenázy glukonové kyseliny.

5

12. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že třetí enzymatickou aktivitou je aktivita reduktázy 2-keto-D-glukonátu.

13. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že čtvrtou enzymatickou aktivitou je aktivita reduktázy.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že aktivita reduktázy je získatelná z bakteriálního, kvasinkového nebo fungálního zdroje.

15. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že uvedený zdroj zahrnuje 15 Coiynebacterium a Erwinia.

16. Způsob podle nároku 15,vyznačuj ící se tím, že aktivitou reduktázy je reduktáza

17. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že prvním oxidačním produktem je glukonát, druhým oxidačním produktem je 2-keto-D-glukonát a třetím oxidačním produktem je

18. Způsob podle nároku 3, v y z n a č u j í c í se t í m , že probíhá v prostředí obsahujícím 25 rekombinantní hostitelské buňky.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že hostitelská buňka je životaschopná.

30

20. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že hostitelská buňka je neživotaschopná.

20 a. enzymatickou oxidaci uhlíkového zdroje první oxidační enzymatickou aktivitou na první oxidační produkt;

c. enzymatickou oxidaci druhého oxidačního produktu třetí oxidační enzymatickou aktivitou na

25 třetí oxidační produkt a

d. enzymatickou redukci třetího oxidačního produktu redukční enzymatickou aktivitou na 2keto-L-gulonovou kyselinu, kde alespoň jedna z uvedené první, druhé a třetí oxidativní enzymatické aktivity vyžaduje oxido30 vanou formu enzymatického kofaktoru a uvedená redukční enzymatická aktivita vyžaduje redukovanou formu uvedeného enzymatického kofaktoru a kde se tato oxidovaná forma kofaktoru i redukovaná forma kofaktoru recykluje mezi alespoň jedním oxidačním stupněm a redukčním stupněm.

35

21. Způsob podle nároku 18, vy zn a č u j í c í se t í m , že rekombinantní hostitelské buňky zahrnují členy Enterobacteriaceae.

22. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že probíhá v prostředí obsahujícím membrány rekombinantních hostitelských buněk a v němž enzymy mající alespoň jednu z uvedené první, druhé a třetí enzymatické aktivity jsou vázány na tyto membrány hostitelských buněk.

23. Způsob podle nároku 21, v y z n a č u j í c í se tím, že rekombinantní hostitelskou buňkou je druh Pantoea.

24. Způsob podle nároku 23, vy z n a č uj í c í se t í m , že rekombinantní hostitelskou buň45 kou je Pantoea citrea.

25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že rekombinantní hostitelská buňka má inaktivující mutaci nejméně jedné přirozeně se vyskytující aktivity dehydrogenázy.

50

26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že mutace je v membránou vázané aktivitě dehydrogenázy glukózy.

27. Způsob podle nároku 25, vy zn ač u j í cí se tí m , že hostitelská buňka obsahuje dále nukleovou kyselinu kódující heterologickou aktivitu dehydrogenázy glukózy.

-20CZ 298605 B6

28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že heterologická aktivita dehydrogenázy glukózy je získatelná z T. acidophilum, Cryptococcus uniguttalatus nebo druhu Bacillus.

29. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že oxidovaná forma enzymatického

25 36. Hostitelská buňka, zahrnující nukleovou kyselinu mající inaktivující mutaci v genu kódujícím aktivitu dehydrogenázy glukózy, nukleovou kyselinu kódující heterologickou aktivitu dehydrogenázy glukózy a nukleovou kyselinu kódující heterologickou aktivitu reduktázy tak, že heterologická aktivita dehydrogenázy glukózy vyžaduje oxidovanou formu kofaktoru a reduktáza vyžaduje reduktovanou formu kofaktoru.