CZ298428B6

CZ298428B6 - Farmaceutický a/nebo dietní prípravek pro optimalizaci viskozity sliznicního hlenu

Info

Publication number: CZ298428B6
Application number: CZ0318598A
Authority: CZ
Inventors: Hooreman@Michel
Priority date: 1996-04-05
Filing date: 1997-04-04
Publication date: 2007-10-03
Also published as: AP9801357A0; PL329161A1; HUP9902421A2; HUP9902421A3; OA10894A; EP0891189A1; PL188157B1; FR2747045B1; BR9708506A; NO324877B1; WO1997037681A1; FR2747045A1; AP1018A; RU2198673C2; JP2000509025A; CN1168499C; NZ332107A; CA2251009A1; TR199801976T2; NO984632L

Abstract

Farmaceutický a/nebo dietní prípravek, obsahujícíjako aktivní složku exocelulární proteinázu s prevažujícím proteolytickým úcinkem produkovanou kulturou Streptomyces fradiae, která má specifickou úcinnost nad 100 000 A.U./mg, molekulovou hmotnost vrozmezí od 30 000 do 36 000 a izoelektrický bod približne 7,0 a která je schopná selektivne znicit podjednotku A cholerového toxinu, aniž by došlo keznicení podjednotky B, a to ve forme smesi nebo vkombinaci s inertním, netoxickým, fyziologicky prijatelným excipientem nebo vehikulem.

Description

Vynález se týká oblasti biologie a zvláště pak terapeutické chemie. Vynález se týká farmaceutických a/nebo dietních přípravků na bázi enzymu nebo enzymového komplexu, jenž obsahuje takový enzym, který může přispět k prevenci a/nebo léčení různých onemocnění.

Dosavadní stav techniky

WO 87/07905 popisuje způsob přípravy proteolytického komplexu extrahovaného z kultury

S. fradiae, jenž zahrnuje v podstatě 3 proteázy (typ II, III a IV) o molekulové hmotnosti 18 000, 14 000, respektive 16 000 a s izometrickým bodem přibližně 9,0 (viz nárok 1 a str. 5). Proteáza typu II vykazuje dominantní proteolytický účinek (viz str. 4, poslední odstavec). Tento komplex při použití jako dietní přípravek stimuluje exokrinní aktivitu pankreatu. Uvedený komplex se podává orálně živočichům v dávkách 40 až 160 A.U. na gram potravy, a to ve formě prášku, který může také obsahovat další inertní složky (viz str. 8 a 9, ř. 10 až 13).

Předmět nároku 1 této přihlášky vynálezu tak v prvé řadě lze pokládat za první terapeutickou indikaci této proteázy a dále za dietní přípravek.

Výše citovaná publikace, jejíž předmět je považován za nejbližší stav techniky, popisuje použití dietních kompozic, jak jsou definovány v nároku I nebo 2, jakož dietního přípravku stimulujícího exokrinní aktivitu pankreatu. Avšak v tomto dokumentu není popsáno ani naznačeno, že by takový přípravek mohl být účinný při léčení pankreatických poruch nebo jiných poruch, jak jsou uvedeny v nárocích 3 až 7 této přihlášky vynálezu. V důsledku toho předmět těchto nároků splňuje kritérium vynálezecké činnosti.

Podstata vynálezu

Vynález se konkrétněji týká farmaceutických přípravků na bázi enzymu nebo enzymového komplexu, který obsahuje takový enzym, jenž stimuluje funkci střev a tím přispívá k prevenci a/nebo léčbě degenerativních onemocnění spojených se stárnutím.

Konkrétně se vynález týká farmaceutických přípravků obsahujících jako účinnou složku jeden či více enzymů extrahovaných z nebo obsažených v enzymovém komplexu získaném kultivací Streptomyces fradiae za podmínek uvedených ve francouzském patentu FR 2 600 340, jehož majitelem je přihlašovatel tohoto vynálezu.

Výše uvedený patentový spis popisuje přípravu nového proteolytického enzymu, který se získává z vláknité bakterie, Streptomyces fradiae, a jeho použití v zootechnologii; v dalším textuje tento komplex označován současným obchodním názvem PANSTIMASE®.

Uvedená vláknitá bakterie může simultánně produkovat nejméně 5 proteináz a 2 pantidázy; těchto 7 enzymů popisuje publikace K. Morihara a spol., Biochem. Biophys, Acta, 1967, 139, 382. Pokud se tyto enzymy společně přidají do potravin konzumovaných živočichy, pak těchto 7 enzymů způsobí nadměrné snížení viskozity střevního hlenu a mohou následně způsobit vznik vředů na střední stěně. Těchto 7 enzymů, pokud se používají dohromady, má tedy v zoologii nežádoucí účinek.

Za podmínek popsaných ve výše uvedeném patentu se získá komplex PANSTIMASE®, který tvoří pouze 3 exocelulámí proteinázy s velkým přebytkem jedné z nich a s vyloučením endocelulámích proteináz a peptidáz. Pokud se přidá do potravy konzumované živočichy, způsobí komplex PANSTIMASE® mírné snížení viskozity střevního hlenu, přičemž současně ní schopen napadat střední stěnu.

-1 CZ 298428 B6

Současně má komplex PANSTIMASE®, díky relativně mírnému účinku na proteiny střevního hlenu, větší účinek na proteiny surového materiálu, který se používá v krmných přípravcích, což vylepšuje jeho stravitelnost.

Kromě tohoto bezprostředního účinku na střeva má komplex PANSTIMASE® nepřímé účinky na různé orgány, zvláště pak na pankreas; jak to již bylo uvedeno v dřívějším patentu, bylo zjištěno, že způsobuje zvýšení koncentrace enzymů nebo proenzymů v tomto orgánu o 50 až 80 %.

Kvůli těmto příznivým účinkům se komplex PANSTIMASE® nyní používá jako nutriční doplněk přidávaný do potravy pro zvířata, a to za účelem zlepšení jejich růstu nebo produktivity. Bylo rovněž zjištěno, že tento komplex zvyšuje odolnost zvířat proti infekcím, bakteriálním či virovým onemocněním a že redukuje některé nepříjemné účinky ve spojitosti se stárnutím.

Tato zjištění vedla k vyslovení názoru, že komplex PANSTIMASE® nebo aktivní složky, ze kterých je složený, to znamená exocelulámí proteinázu s převažujícím proteolytickým účinkem, která je produkována kulturou Streptomyces frandiae, nebo směs této exocelulámí proteinázy s převažujícím proteolytickým účinkem s alespoň jednou nebo se dvěma exocelulámími proteinázami produkovanými kulturou Streptomyces frandiae, lze použít k léčivech určených jak pro zvířata, tak pro lidi.

Aktivní složky farmaceutických přípravků vyžadují v porovnání s produktem, jenž se používá u zvířat, další čistění. Za podmínek popsaných v dřívějším patentu se získá nepřečištěný komplex PANSTIMASE®, jehož titr je přinejmenším rovný 2000 A.U./mg.

Ansonova jednotka (Anson Unit, zkráceno A.U.) je zde definována jako množství enzymu, jež při inkubaci po dobu 10 minut při teplotě 25 °C a hodnotě pH 7,5 v přítomnosti denaturovaného hemoglobinu uvolňuje z tohoto substrátu ekvivalent 1 mcg tyrosinu, a to podle stanovení spektrofotometrické absorpce při 280 nm filtrátu, který nelze srážet kyselinou trichloroctovou.

Různé úpravy podmínek popsaných v uvedeném starším patentu umožňují získat polopřečištěný komplex PANSTIMASE®, jehož titr odpovídá nejméně 4000 A.U./mg. Běžné postupy trakčního srážení nebo průchodu kolonou umožňují izolování každého ze 3 proteinů, ze kterých se komplex PANSTIMASE® skládá. Specifická aktivita exocelulámí proteinázy s převažujícím proteolytickým účinkem je vyšší než 100 000 A.U./mg a je podstatně vyšší ve srovnání s hodnotami pro další dvě proteinázy; její molekulová hmotnost je přibližně 32 000 a její izoelektrický bod je přibližně 7,0.

Samotná tato proteináza s převažujícím proteolytickým účinkem vysvětluje hlavní fyziologické vlastnosti komplexu PANSTIMASE®, a to zvláště se zřetelem na skutečnost, že samotná tato proteáza má charakteristický účinek na dva důležité proteiny: cholerový toxin a kolagen.

Cholerový toxin je homolog LT-toxinu produkovaného některými patogenními bacily coli; skládá se z podjednotky A, jež je agresivní, a podjednotky B, jež je imunostimulační. Při nízkých koncentracích ve srovnání s koncentracemi dosahovanými ve střevech zvířat přijímajících potravu doplněnou o komplex PANSTIMASE® uvedená proteináza s převažujícím proteolytickým účinkem selektivně ničí podjednotku A, aniž by ničily podjednotku B, která si tak udržuje svoji schopnost stimulovat imunitní systém.

Kolagen je nejrozšířenější protein v živočišné říši; u savců představují různé typy kolagenu asi třetinu z celkového množství proteinů. Je známo, že rozpustnost muskulámího kolagenu v horké vodě je vysoká, pokud tento kolagen pochází z mladých zvířat a nízká, pokud tento kolagen pochází ze starších jedinců.

-2CZ 298428 B6

Pokud se na kolagen ze starších zvířat působí uvedenou proteinázou s převažujícím proteolytickým účinkem, pak se jeho rozpustnost v horké vodě zvýší a je srovnatelná s rozpustností kolagenu z mladých zvířat. Lze tedy konstatovat, že tato proteináza způsobu určité „omlazení“ kolagenu.

Většina výsledků získaných na zvířatech odpovídá testům, které byly provedeny s nepřečištěným nebo polopřečištěným komplexem PANSTIMASE®. Pro lidi je možno použít buď polopřečistěný komplex PANSTIMASE® nebo přečištěnou proteinázu či přečištěné proteinázy, ze kterých je tento komplex složený, to znamená exocelulámí proteinázu s převažujícím proteolytickým účinkem nebo směs této exocelulámí proteinázy s převažujícím proteolytickým účinkem s nejméně jednou z uvedených dalších dvou exocelulámích proteináz nebo s proteinázou či proteinázami, jejichž aminokyselinová sekvence je alespoň ze 60 % homologní s aminokyselinovou sekvencí uvedené extracelulámí proteinázy s převažujícím proteolytickým účinkem nebo se sekvencí aminokyselin směsi proteináz, jak byly definovány výše.

Vynález se rovněž týká farmaceutických a/nebo dietních přípravků obsahujících jako účinnou složku exocelulámí proteinázu s převažujícím proteolytickým účinkem produkovanou kulturou Streptomyces fradiae, která má specifickou účinnost nad 100 000 A.U./mg, jejíž molekulová hmotnost je v rozmezí od 30 000 do 36 000, s výhodou pak přibližně 32 000, jejíž izoelektrický bod odpovídá přibližně 7,0 s tím, že tato proteináza je schopná selektivně zničit podjednotku A cholerového toxinu, aniž by došlo ke snížení podjednotky B, a to ve formě směsi nebo v kombinaci s inertním, netoxickým, fyziologicky přijatelným excipientem nebo vehikulem.

Vynález se rovněž týká farmaceutických a/nebo dietních přípravků, obsahujících jako účinnou složku exocelulámích proteinázu s převažujícím proteolytickým účinkem, jak byla definována výše, nebo směs této exocelulámí proteinázy s převažujícím proteolytickým účinkem s nejméně jednou ze dvou dalších exocelulámích proteináz produkovaných kulturou Streptomyces fradiae, nebo proteinázu či proteinázy s aminokyselinovou sekvencí, která je alespoň ze 60 % homologní s aminokyselinovou sekvencí uvedené exocelulámí proteinázy s převažujícím proteolytickým účinkem nebo se sekvencemi aminokyselin směsi proteináz, jak byla výše popsána, a to ve formě směsi nebo v kombinaci s inertním, netoxickým, fyziologicky přijatelným excipientem nebo vehikulem. Homologními proteinázami mohou být extrakty z kultur různých mikroorganismů, zvláště pak z kultur Streptomyces fradiae nebo Streptomyces griseus.

Účinná látka se podává orálně, pulmonámě nebo genitálně v dávkách mezi 5000 až 100 000 A.U. Za tímto účelem se účinná složka ve formě směsi či kombinace s běžnými excipienty upraví do formy farmaceutického přípravku, jenž je vhodný pro tyto typy podávání.

Účinná látka je konkrétně přítomná v jedné z forem běžných v oblasti farmakotechnologie, jako jsou tablety, potažené tablety, želatinové kapsle, kapsle, prášky, roztoky nebo suspenze, suché aerosoly, bobule a vaginální tablety.

Přípravek podle tohoto vynálezu se podává jednou až třikrát denně, a to v závislosti na terapeutických požadavcích.

Zdá se, že všechny výsledky získané při testech na zvířatech mají stejný původ: základní účinek komplexu PANSTIMASE® na střevo; tento účinek má různé aspekty, které budou dále postupně diskutovány.

Farmakologická studie farmaceutických přípravků dle tohoto vynálezu. Působení komplexu PANSTIMASE® ve střevech.

-3CZ 298428 B6

1. Klky

U poměrně mladých potkanů(starých asi 2 měsíce) je patrné ze zkoumání pod fotonovým mikroskopem, že v případě klků dochází k normálnímu vývoji, a to jak u potkanů kontrolních, tak ošetřovaných.

U poměrně starých potkanů (starých asi 7 měsíců) vede stejné zkoumání k závěru, že u kontrolních potkanů dochází k atrofíi klků, zatímco u potkanů léčených od okamžiku jejich odstavení ve 4 týdnech jsou klky vyvinuty úplně stejně jako u potkanů starých 2 měsíce. Bylo tedy zjištěno, že komplex PANSTIMASE® způsobuje určité „omlazení“ střeva, jehož klky si dále udržují svoji počáteční schopnost vývoje a rychlé regenerace.

Střevo je nejen fyziologicky neaktivní filtr, ale je to také největší z endokrinních žláz (viz B. Leblanc a spol., Rec. Med. Vet. 1981, 157, 629; K. Uvnas-Moberg, Science, září 1989, 24). Střevo, jež je tvořeno malými buňkami, které se během celého svého života rychle regenerují, je orgán, který je nejbohatší na nukleové kyseliny: DNA + RNA (viz G. Durand a spol., Ann. Biol. Anim. Bioch. Biophys. 1966, 6 389). Proto má nejvyšší latentní schopnost syntézy proteinů.

Ze zkoumání histologických řezů střeva vyplývá, že komplex PANSTIMASE® umožňuje lepší projevení této latentní schopnosti a v důsledku toho vyšší produkci několika fyziologicky aktivních látek: trávicích enzymů, hormonů (působících na pankreas, játra, mozek), imunoglobulin, cytokinů, neuropřenašečů (např. VIP = vazoaktivní intestinální peptid), faktorů růstu (nebo přežití) buněk atd. Tímto se tedy vysvětluje, proč komplex PANSTIMASE®, jehož působení se projevuje ve střevě přímo, může nepřímo působit na jiné orgány a fyziologické symptomy ovlivněné výše uvedenými látkami. Uvedené skutečnosti tak vysvětlují zejména pozoruhodné působení tohoto komplexu pankreas (viz A. Estival a spol., Sdělení na konferenci o metabolismu, Nancy, 25-26. ledna 1979, University of Nancy I).

Střevo je rovněž orgán nejbohatší na imunitní buňky, které obíhají v krevních a lymfatických cévách, nebo orgán, ve kterém se shromažďují a množí PEYERovy pláty. Tyto imunitní buňky jsou složkou tkáně MALT (mucosae associated lymphoid tissue), která je rozdělena na tkáň GALT (situovanou ve střevě) a tkáň BALT (situovanou v průduškách), a má analogické vlastnosti s tkání SALT, situovanou v kůži. GALT a BALT jsou nezávislé a účinkují synergicky za účelem zajištění imunitní obrany sliznice a tím pádem za účelem přispění k obraně organismu jako celku.

Zkoumání histologických řezů střeva ukazuje, že komplex PANSTIMASE® přímo stimuluje tkáň GALT, čímž tedy může nepřímo stimulovat celkovou imunitní ochranu. Toto by vysvětlovalo skutečnost, že komplex PANSTIMASE^(R) zvyšuje odolnost zvířat proti infekčním chorobám.

2. Mikroklky

V případě potkanů, mladých i starých, zkoumání pod elektronovým mikroskopem ukazuje, že mikroklky kontrolních potkanů jsou pokryty hyperviskózním hlenem a stopami zbytků potravy; na druhé straně se mikroklky u potkanů ošetřovaných komplexem PANSTIMASE® zdají být čistší, větší a četnější. Komplex PANSTIMASE® tedy může zvyšovat celkový vyvinutý povrch mikroklků, čili jejich absorpční schopnost.

„In vitro“ bylo při ošetření fragmentů střeva odebraných od kontrolních potkanů komplexem

PANSTIMASE® zjištěno, aniž by došlo k poškození mikroklků, že bylo možné odstranit hyperviskózní hlen, který je pokrýval. K tomuto mírnému detergentnímu účinku může dojít během několika minut.

-4CZ 298428 B6 „In vivo“ umožňuje toto čistění střevní sliznice vytvoření těsnějšího kontaktu mezi choroboplodnými zárodky a uvedenou sliznicí, což může ve střevě vyvolat množení imunitních buněk, jež jsou schopné likvidovat uvedené choroboplodné zárodky.

3. Sekreční buňky a exokrinní žlázky

Ve střevě jsou distribuovány různé sekreční buňky (buňky produkující hlen, lysozym atd.) a četné exokrinní žlázky, a tyto buňky a žlázky vyměšují do střeva významná množství sekretů (u lidí asi 2000 ml za den). Tok těchto sekretů může být omezen nebo i zastaven přítomností mikročástic v hlenu.

Zkoumání histologických řezů střeva ukazuje, že komplex PANSTIMASE® deagreguje tyto mikročástice, obnoví normální tok uvedených sekretů a způsobí i reaktivní zvýšení jejich produkce.

Je známo, sekretované sliny obsahující faktor růstu buněk: faktor růstu epitelu (EGF); dále pak střevní sekrety mohou obsahovat růstové faktory, které jsou schopné působit na enterocyty, lymfocyty atd. Zvýšení produkce takovýchto faktorů působením komplexu PANSTIMASE® může vysvětlovat lepší vývoj klků a tkáně GALT, který byl zjištěn při histologii řezů střeva potkanů.

4. PEYERovy pláty

PEYERovy pláty, což jsou agregáty imunitních buněk distribuované ve střevě, se ve větším počtu vyskytují u ošetřovaných potkanů. U těchto potkanů se objevují v oblasti od dvanáctemíku, avšak u kontrolních potkanů se objevují pouze v oblasti od lačníku; rovněž jejich hustota je větší: jejich lymfocyty jsou menší, kompaktnější a zdá se, že jsou aktivnější (jsou intenzivněji zbarvené působením reakčních činidel, která se používají při histologii).

5. Prodloužená neadheze infekčních zárodků.

Komplex PANSTIMASE® může působit proti prodloužené adhezi infekčních zárodků ke sliznici, zvláště pak ke střevní sliznici.

Tato prodloužená adheze je důsledkem tvorby chemických vazeb mezi adheziny připojenými k těmto zárodkům a jejich receptory, které jsou připojeny ke sliznici. Adheziny a receptory jsou komplexní (glyko-lipo)proteiny.

Při testech „in vitro“ se ukázalo, že komplex PANSTIMASE®, jenž se vyznačuje určitou afinitou ke komplexním proteinům, může odříznout adhezní místa nebo oddělit receptory od sliznice, ke které jsou připojeny. Častým důsledkem tohoto účinku je rozrušení adheze, ke kterému může dojít během několika desítek minut.

Dále komplex PANSTIMASE® může stimulovat regeneraci střevních klků, tj. eliminovat staré buňky, které jsou abnormální nebo poznamenané adhezi infekčních zárodků. Tato eliminace je usnadňována zesilováním toku střevních sekretů, jejichž produkce je zvyšována působením komplexu PANSTIMASE®.

Je tedy patrné, že i když komplex PANSTIMASE® může nejprve umožnit bližší kontakt mezi infekčními zárodky a střevní sliznicí (a tím vyvolat množení imunitních buněk ve střevě s tím, že tyto buňky jsou schopné likvidovat uvedené zárodky), může rovněž působit proti prodloužené adhezi těchto zárodků ke sliznici a jejich proniknutí do tkáně ležící pod uvedenou sliznicí.

-5 CZ 298428 B6

6. Destrukce proteinových enterotoxinů

Při koncentracích mezi 10 až 100 A.U./ml a při zahřívání na 37 °C po několik desítek minut ničí komplex PANSTIMASE® několik proteinových toxinů a může tak přispět k prevenci a/nebo léčení průjmových onemocnění. Z toxinů ničených působením komplexu PANSTIMASE® lze uvést butolotoxin, cholerový toxin a LT-toxin produkovaný patogenními colibacily, nekrotizující cytotoxický faktor, který je rovněž produkován uvedenými colibacily.

Za stejných podmínek endogenní proteinázy (trypsin, chymotripsin atd.) tyto toxiny neničí, tak že nemohou nijak přispět k prevencí a/nebo léčbě uvedených průjmových onemocnění.

V případě LT-toxinu ničí komplex PANSTIMASE® podjednotku A, jež je agresivní, aniž by došlo ke zničení podjednotky B, jež je imunostimulační.

7. Závěr

Komplex PANSTIMASE® má zásadní účinek na celé střevo, který stimuluje globální funkci tohoto klíčového orgánu a v důsledku celého organismu. Z toho vyplývají četné příklady terapeutického využití tohoto komplexu.

Terapeutická využití farmaceutických přípravků podle tohoto vynálezu.

Zásadní účinek komplexu PANSTIMASE® ve střevě umožňuje jeho použití nebo použití aktivních látek, ze kterých je složen, tj. exocelulámí proteinázy s převažujícím proteolytickým účinkem nebo směsí této exocelulámím proteinázy s převažujícím proteolytickým účinkem s alespoň jednou ze dvou dalších exocelulámích proteináz k přispění k prevenci nebo léčbě onemocní, kterému je třeba čelit.

Příklady provedení

1. Cystická fibróza a respirační onemocnění

Cystická fibróza je charakterizována nadměrnou sekrecí příliš viskózního hlenu v oblasti střeva i v oblasti průdušek. Veškerý hlen má z chemického hlediska stejnou biochemickou strukturu a v důsledku toho komplex PANSTIMASE® může optimalizovat viskozitu střevního hlenu, bronchiálního hlenu nebo genitálního hlenu.

Pro přípravu léčiva určeného pro optimalizaci viskozity střevního, bronchiálního a/nebo genitálního hlenu se může použít exocelulámí proteináza nebo proteinázy podle tohoto vynálezu, nebo proteináza či proteinázy, jejichž aminokyselinové sekvence jsou alespoň ze 60 % homologní s aminokyselinovou sekvencí exocelulámí proteinázy nebo proteáz podle tohoto vynálezu.

Exocelulámí proteináza nebo proteinázy podle tohoto vynálezu nebo proteináza či proteinázy, jejichž aminokyselinové sekvence jsou alespoň ze 60 % homologní s aminokyselinovou sekvencí exocelulámí proteinázy nebo proteináz podle tohoto vynálezu, se mohou použít pro přípravu léčiva určeného pro léčení cystické fíbrózy a onemocnění ve spojitosti s nadměrnou sekrecí střevního, bronchiálního a/nebo genitálního hlenu, zvláště pak, je-li tento hlen příliš viskózní.

2. Zlepšení absorpce a krevního oběhu

Svým mírným detergentním účinkem na střevní stěnu přispívá komplex PANSTIMASE® ke zlepšení absorpce.

-6CZ 298428 B6

Toto zlepšení absorpce lze potvrdit analýzou léků podávaných orální cestou do krve zvířete. Tak například bylo 50 mg tetracyklinu bez komplexu PANSTIMASE® (kontrolní skupina) nebo v kombinaci s 3 mg komplexu PANSTIMASE® s titrem 400 A.U./mg (léčená skupina) podáno kuřatům pomocí žaludeční sondy. Po uplynutí 2 hodin od podání byl odebrán vzorek krve o objemu 2,5 ml a bylo zjištěno, že střední koncentrace tetracyklinu v séru činí l,35mcg/ml pro kontrolní skupinu a 1,90 mcg/ml pro léčenou skupinu.

Uvedené zlepšení absorpce lze analyzovat přesněji studováním zachycování léčiv v různých orgánech. Tak například potrava obsahující 4 g/kg oxytetracyklinu bez komplexu PANSTIMASE® jakožto potravinového doplňku (kontrolní skupina) nebo s přídavkem 300 mg/kg komplexu PANSTIMASE® o titru 400 A.U. (léčená skupina) byla 2 dny podávána pstruhům. Následně byly ryby usmrceny a obsah antibiotika byl analyticky stanoven v játrech, ve stavech a v ledvinách. Bylo zjištěno, že komplex PANSTIMASE® umožňuje podstatný vzestup koncentrace antibiotika ve tkáni, přičemž tato koncentrace se mění v širokém rozmezí podle daného orgánu.

+ 100 % v játrech, tj. 5,75 mcg/g pro léčenou skupinu oproti 2,5 mcg/g pro kontrolní skupinu, + 400 % ve svalech, tj. 1,75 mcg/g pro léčenou skupinu oproti 0,3 mcg/g pro kontrolní skupinu, + 1000 % v ledvinách, tj. 5,75 mcg/g pro léčenou skupinu oproti 0,5 mcg/g pro kontrolní skupinu.

Zdá se tedy, že komplex PANSTIMASE® způsobuje lepší absorpci oxytetracyklinu a lepší distribuci tohoto antibiotika v celém organismu, což zřejmě způsobuje zlepšení krevního oběhu.

Exocelulámí proteináza nebo proteinázy podle tohoto vynálezu nebo proteináza či proteinázy, jejichž aminokyselinové sekvence jsou alespoň ze 60 % homologní s aminokyselinovou sekvencí exocelulámí proteinázy nebo proteináz podle tohoto vynálezu, se mohou použít pro přípravu léčiva určeného pro léčení špatné absorpce léků či nutrientů a pro léčení poruch krevního oběhu. Uvedené léčivo je určeno zejména pro léčení hubnutí pozorovaného u starých osob nebo u pacientů, kteří užívají léky, jež mají sekundární účinky ovlivňující správnou funkci střeva.

3. Žaludeční vředy a enterotoxemie

Původcem žaludečních vředů je adheze bakterií (Helicobacter pylori) k žaludeční stěně a některé enterotoxemie mají svůj původ v adhezi různých infekčních zárodků ke sliznici a ničí četné enterotoxiny. Může tak tedy přispívat ke stimulaci regenerace střev a může sloužit k prevenci a/nebo léčbě žaludečních vředů a enterotoxemií.

U průmyslových chovů bylo zjištěno, že komplex PANSTIMASE® je schopen zredukovat počet prasat postižených žaludečními vředy a snížit úmrtnost v důsledku enterotoxemií.

Exocelulámí proteináza nebo proteinázy podle tohoto vynálezu nebo proteináza či proteinázy, jejichž aminokyselinové sekvence jsou alespoň ze 60 % homologní s aminokyselinovou sekvencí exocelulámí proteinázy nebo proteináz podle tohoto vynálezu, se mohou použít pro přípravu léčiva určeného k prevenci a/nebo léčení dlouhodobé adheze infekčních zárodků ke sliznici, k usnadnění regenerace atrofovaných nebo zničených klků střevní sliznice a k prevenci a/nebo léčení žaludečních vředů a enterotoxemií.

4. Diabetes, selhání jater a poruchy průchodnosti střeva

V uvedeném starším patentu již bylo popsáno, že komplex PANSTIMASE® stimulovat exokrinní funkci pankreatu. Skutečně bylo v pankreatu zjištěno podstatné zvýšení koncentrace všech analyzovaných enzymů a proenzymů, a to o 50 % v případě amylázy, o 70 % v případě

-7CZ 298428 B6 trypsinogenu a chymotrypsinogenu, o 80 % v případě lipázy (A. Estival a spol., Sdělení na koncentraci o metabolismu, Nancy, 25. - 26. ledna 1979, University ofNancy I).

Zkoumání histologických řezů pankreatu poté ukázalo, že u léčených potkanů je počet Langerhansových ostrůvků větší a že tyto ostrůvky mají lepší vzhled. Na základě těchto zkoumání byla vystavena hypotéza, že komplex PANSTIMASE® nejprve stimuluje endokrinní funkci pankreatu s následným obecným zlepšením anabolismu proteinu, které vede k následné stimulaci exokrinní funkce pankreatu.

Stimulace, která se projevuje v pankreatu, se projevuje rovněž v játrech, důsledkem čehož je zlepšení průchodnosti střeva. Ve velkých chovech prasat je často pozorována zácpa u březích samic. Bylo zjištěno, že dodávání komplexu PANSTIMASE® do jejich krmivá umožňuje vyhnout se těmto škodlivým poruchám průchodnosti střeva.

Exocelulámí proteináza nebo proteinázy podle tohoto vynálezu nebo proteináza či proteinázy, jejichž aminokyselinové sekvence jsou alespoň ze 60 % homologní s aminokyselinovou sekvencí exocelulámí proteinázy nebo proteináz podle tohoto vynálezu, se mohou použít pro přípravu léčiva určeného k prevenci a/nebo léčení diabetů, selhání jater a poruch průchodnosti střev.

5. Infekční nemoci, poruchy imunity a vakcinace

Jak již bylo uvedeno, komplex PANSTIMASE® se vyznačuje příznivým účinkem na GALT a v důsledku toho na celý imunitní systém. V důsledku tohoto účinku dochází ke zlepšení ve třech různých oblastech.

A. Infekční nemoci

Některá pozorování u velkých chovů ukázala, že komplex PANSTIMASE® často zlepšil zdravotní stav zvířat, což bylo původně spojováno se skutečností, že tento komplex usnadňuje absorpci antibiotik, která jsou přidávána do většiny průmyslových krmiv. Avšak později bylo zjištěno, že toto zlepšení bylo zvlášť významné v případě infekcí různými viry, ačkoli tyto jsou obecně imunní proti účinku antibiotik. Tato zjištění se týkala chřipky a Aujeszkyho nemoci u prasat, Gumborovy nemoci u kuřat a ecthymy u koz.

V posledně uvedeném případě byla virová infekce zjištěná v experimentální stanici předmětem uzavřených studií na celkem 120 kozách. Podíl zvířat nepostižených onemocněním byl 34 % u kontrolní skupiny a 70 % v případě léčené skupiny. Podíl těžce postižených zvířat byl 28 % u kontrolní skupiny, zatímco v případě léčené skupiny se nevyskytlo žádné těžce postižené zvíře.

Tento antivirový účinek lze vysvětlit skutečností, že komplex PANSTIMASE® zvyšuje počet a hustotu PEYERových plátů, což jsou agregáty imunitních buněk distribuované ve střevě.

B. Poruchy imunity

Další pozorování prováděná na selatech v průmyslových chovech ukázala, že komplex PANSTIMASE® zkracoval dobu trvání artritidy, což je zánětlivá reakce v důsledku poranění kloubů, ke kterému dochází u zvířat žijících v kovových klecích. Po zajizvení uvedených poranění se tyto zánětlivé reakce mohou progresivně zmírňovat vlivem působení tzv. supresivních imunitních buněk, které jsou v hojném množství přítomny ve střevě a mohou migrovat do zánětlivých zón. Je možné, že komplex PANSTIMASE® stimuluje množení těchto buněk ve střevě a že usnadňuje jejich migraci, což by vysvětlovalo skutečnost, že tento komplex zkracuje dobu trvání artritidy přibližně o 50 %.

-8CZ 298428 B6

C. Vakcinace

Zlepšení zdravotního stavu zjištěné u průmyslových chovů lze vysvětlit lepší odezvu zvířat, která dostávají krmivo doplněné komplexem PANSTIMASE®, na vakcinace. Předběžné testy na laboratorních myších potvrdily, že komplex PANSTIMASE® může zvyšovat účinnost vakcinací, 5 zvláště pokud se provádějí orální cestou.

Exocelulámí proteináza nebo proteinázy podle tohoto vynálezu nebo proteináza či proteinázy, jejichž aminokyselinové sekvence jsou alespoň ze 60 % homologní s aminokyselinovou sekvencí exocelulámí proteinázy nebo proteináz podle tohoto vynálezu, se mohou použít pro přípravu 10 léčiva určeného k prevenci a/nebo léčbě infekčních onemocnění a poruch imunity a pro zvýšení účinnosti vakcinací.

6. Hormonální insufícience a degenerace onemocnění související se stárnutím

Bylo zjištěno, že u starých reprodukčních prasat způsobuje komplex PANSTIMASE® zkrácení 15 intervalu odstavení-oplodnění (které mají u prasnic sklon k prodlužování) a stimuluje sexuální žádostivost (která má u kanců klesající tendenci). Zdá se tedy, že komplex PANSTIMASE® umožňuje nápravu hormonální insufícience a pravděpodobně i dalších nepříznivých efektů způsobených stárnutím.

Bylo zjištěno, že komplex PANSTIMASE® způsobuje „omlazení“ starých reprodukčních potkaních samic a redukci nepříznivých efektů stárnutí u starých reprodukčních prasnic a slepic.

A. Prvního oplodnění potkaních samic se obvykle dosahuje ve věku přibližně 70 dní; a pokud se provede ve věku přibližně 140 dní, pak je reprodukční výkonnost kontrolní skupiny velmi 25 špatná, přičemž tato výkonnost je lepší u léčené skupiny (která dostává stejnou potravu s doplňkem 300 mg/kg komplexu PANSTIMASE® s titrem 400 A.U./mg).

	Kontrolní skupina	Léčená skupina
oplodnění ve věku 70 dní 140 dni	oplodnění ve věku 140 dní
Úroveň oplod- něni	62 %	29 %	45 %
Perinatální mortalita potkanů	18%	35 %	18 %
Počet potkanů odstavených na každý litr	9	6,6	8,1

Bylo zjištěno, že u kontrolní skupiny potkaních samic vykázalo oplodnění ve věku 140 dnů velmi špatné výsledky, avšak u léčených potkaních samic oplodněných rovněž ve věku 140 dnů byly 30 zjištěny takové výsledky, jež se blížily normálním výsledkům získaných pro kontrolní skupinu potkaních samic oplodněných ve věku 70 dnů, přičemž bylo dosaženo dokonce stejného podílu perinatální mortality. Lze tedy říci, že komplex PANSTIMASE® způsobuje „omlazení“ potkaních samic starých 140 dní.

B. Reprodukční prasnice se vyřazují pokud se zdá, že jsou „ve velmi špatném stavu“, například když chovatel je toho názoru, že již nejsou schopny trvale stát, ani si jemně lehat (místo toho si

-9CZ 298428 B6 lehají ztěžka, čímž se riskuje, že by mohly zalehnout nově narozená selata). Ve stádu 80 prasnic byly prasnice před použitím komplexu PANSTIMASE® vyřazovány v průměru po 4,4 reprodukčního cyklu. Za 6 měsíců po zahájení používání uvedeného komplexu bylo zjištěno, že prasnice bylo možné vyřadit v průměru po 5,8 reprodukčního cyklu. Lze tedy mít za prokázané, že komplex PANSTIMASE® umožnil prodloužit produkční období prasnic asi o 30 %, a to bez jakýchkoli nepřijatelných změn jejich „dobrého stavu“ a jejich výkonnosti.

V průběhu stárnutí mají nosnice sklon ke snášení vajec, která mají křehčí skořápku, takže procentní podíl prasklých vajec může na konci produkčního období nosnice stoupnout nad 10 %. Komplex PANSTIMASE® umožnil snížení tohoto procentního podílu na polovinu, z čehož vyplývá, že také stimuluje fosfokalciový metabolismus.

Exocelulámí proteináza nebo proteinázy podle tohoto vynálezu nebo proteináza či proteinázy, jejich aminokyselinové sekvence jsou alespoň ze 60 % homologní s aminokyselinovou sekvencí exocelulámí proteinázy nebo proteináz podle tohoto vynálezu, se mohou použít pro přípravu léčiva určené k prevenci a/nebo léčbě hormonální insuficience a degenerativních onemocnění v souvislosti se stárnutím, jako je například artritida, artróza a osteoporóza.

Předběžná vyhodnocení tolerance farmaceutických přípravků dle tohoto vynálezu

Toxikologické studie prokázaly, že komplex PANSTIMASE® nemá toxické účinky na selata podává-li se jeden měsíc v dávce 20krát vyšší než činí v současné době doporučená dávka, která je 40 000 A.U. na 1 kg potravy; a žádné toxické účinky na potkany, kterým je podáván 3 měsíce v dávce 200krát vyšší, než činí uvedená používaná dávka.

Proto bylo možné provést předběžný test tolerance u lidí s použitím dávky, jež je relativně vyšší vhledem k současně používaným dávkám. Ve skutečnosti byly použity želatinové kapsle s obsahem 750 000 A.U. přečištěného komplexu PANSTIMASE® (tj. 50 mg vsázky stitrem 15 000 A.U./mg), přičemž tyto kapsle byly podávány pacientům v množství 2 až 3 kapsle denně po dobu 2 až 3 týdnů.

Bylo vybráno 24 pacientů (12 mužů a 12 žen) v průměrném věku 44 let s extrémy v rozsahu od 25 do 70 let; 17 z těchto pacientů trpělo dyspepsií v nejširším slova smyslu, aniž by u nich byla paraklinickými vyšetřeními (laboratorními testy, RDG, v některých případech pomocí endoskopie) detekovatelná jakákoli organická léze; 7 z těchto pacientů trpělo organickými lézemi: 3 pankreatickými, 2 žaludečními (1 pacient měl vřed, 1 pacient měl nádor), u 2 pacientů byla provedena koloktomie (jednoho z důvodu ulcerohemoragické rektolitidy, druhému kvůli nádoru). Průměr symptomatologie a změn hmotnosti, pokud na začátku léčby pacient trpěl podváhou (způsobenou nebo nezpůsobenou hubnutím), byl studován u všech 24 pacientů. Několik jedinců uvádělo zlepšení týkající se regulace průchodnosti střeva v případě zácpy nebo naopak průjmu a zvýšení hmotnosti v případech pacientů postižených hubnutím.

Byly provedeny také předběžné pokusy týkající se cystické fibrózy u pacienta ve věku 18 let, který užíval 2 želatinové kapsle denně po dobu 3 týdnů, přičemž každá z těchto kapslí obsahovala 10 000 A.U. komplexu PANSTIMASE®. Bylo zjištěno zlepšení symptomů v oblasti střev (stolice byla méně vydatná a méně lepivá), jakož i v bronchiální oblasti (snazší a méně časté odkašlávání).

Na závěr lze říci, že komplex PANSTIMASE® byl dobře tolerován a zdá se, že je zvlášť účinný v případech hubnutí.

Exocelulámí proteináza nebo proteinázy podle tohoto vynálezu nebo proteináza či proteinázy, jejichž aminokyselinové sekvence jsou alespoň ze 60 % homologní s aminokyselinovou sekvencí exocelulámí proteinázy nebo proteináz podle tohoto vynálezu, se mohou použít při přípravě dietního přípravku pro výživu slabých nebo vyhublých jedinců.

- 10CZ 298428 B6

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický a/nebo dietní přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku exocelulámí proteinázu s převažujícím proteolytickým účinkem produkovanou kulturou Streptomyces fradiae, která má specifickou účinnost nad 100 000 A.U./mg, molekulovou hmotnost v rozmezí od 30 000 do 36 000 a izoelektrický bod přibližně 7,0 a která je schopná selektivně zničit podjednotku A cholerového toxinu, aniž by došlo ke zničení podjednotky B, a to ve formě směsi nebo v kombinaci s inertním, netoxickým, fyziologicky přijatelným excipientem nebo vehikulem.
2. Farmaceutický a/nebo dietní přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku exocelulámí proteinázu s převažujícím proteolytickým účinkem definovanou v nároku 1, nebo směs této exocelulámí proteinázy s převažujícím proteolytickým účinkem s alespoň jednou z dalších exocelulámích proteináz produkovaných Streptomyces fradiae, nebo proteinázu či proteinázy se sekvencí aminokyselin, která je alespoň ze 60 % homologní se sekvencí aminokyselin uvedené exocelulámí proteinázy s převažujícím proteolytickým účinkem nebo se sekvencí aminokyselin uvedené směsi proteináz, a to ve formě směsi nebo v kombinaci s inertním, netoxickým, fyziologicky přijatelným excipientem nebo vehikulem.
3. Farmaceutický a/nebo dietní přípravek podle jednoho z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se účinná složka podává perorálně, pulmonámě a nebo prostřednictvím genitálií v dávkách mezi 5000 a 100 000 A.U.
4. Použití proteinázy nebo proteináz definovaných v kterémkoli z nároků 1 nebo 2 pro přípravu léčiva pro optimalizaci viskozity střevního, bronchiálního a/nebo genitálního hlenu.
5. Použití proteinázy nebo proteináz definovaných v kterémkoli z nároků 1 nebo 2 pro přípravu léčiva pro léčení onemocnění souvisejícího s nadměrnou sekrecí střevního, bronchiálního a/nebo genitálního hlenu, zvláště tehdy, je-li tento příliš viskózní.
6. Použití proteinázy nebo proteináz definovaných v kterémkoli z nároků 1 nebo 2 pro přípravu léčiva pro úpravu špatné absorpce léčiv nebo živin a pro léčbu poruch krevního oběhu.
7. Použití proteinázy nebo proteináz definovaných v kterémkoli z nároků 1 nebo 2 pro přípravu léčiva pro prevenci a/nebo léčbu prodloužených adhezí infekčních zárodků na sliznici, pro usnadnění regenerace atrofovaných nebo zničených klků na střevní sliznici a pro prevenci a/nebo léčbu vředů v zažívacím traktu a enterotoxemií.
8. Použití proteinázy nebo proteináz definovaných v kterémkoli z nároků 1 nebo 2 pro přípravu léčiva pro prevenci a/nebo léčbu diabetů, selhání jater a poruch střevní průchodnosti.
9. Použití proteinázy nebo proteináz definovaných v kterémkoli z nároků 1 nebo 2 pro přípravu léčiva pro prevenci a/nebo léčení infekčních nemocí a imunitních dysfunkcí, nebo pro zlepšení účinnosti vakcinace.
10. Použití proteinázy nebo proteináz definovaných v kterémkoli z nároků 1 nebo 2 pro přípravu léčiva pro prevenci a/nebo léčbu hormonální insuficience a degenerativních onemocnění ve spojitosti se stárnutím.
11. Použití proteinázy nebo proteináz definovaných v kterémkoli z nároků 1 nebo 2 pro dietní kompozice pro výživu zesláblých a vyhublých jedinců.