CZ289357B6

CZ289357B6 - Monoklonální anti-idiotypická protilátka Ab2, způsob její přípravy a farmaceutický prostředek, který ji obsahuje

Info

Publication number: CZ289357B6
Application number: CZ19961525A
Authority: CZ
Inventors: Ana Carceller; Elisabet Dr. Rosell; Alicia Gomez; Jaume Adan; Jaume Dr. Piulats
Original assignee: MERCK Patent Gesellschaft mit beschränkter Haftung
Priority date: 1995-05-26
Filing date: 1996-05-27
Publication date: 2002-01-16
Also published as: AU710159B2; AU5242296A; US5969107A; KR960040375A; NO962125L; JPH08325299A; SK67496A3; HU9601392D0; ZA964207B; NO962125D0; CZ152596A3; MX9601930A; PL314414A1; HUP9601392A3; DE69616651D1; CA2177328A1; HUP9601392A2; ATE208403T1; CN1142505A

Abstract

Monoklon ln anti-idiotypick protil tka Ab2 napodobuj c vnit°n obraz EGFR antigenu rozezn van ho odpov daj c my , humanizovanou nebo chim rn monoklon ln Ab1 idiotypickou protil tkou, p°i em idiotypickou protil tkou je my mAb 425 nebo protil tka od n odvozen , produkovan bun nou lini ulo enou pod slem ATCC HB 9629, je · innou proti n dor m, zp sob jej p° pravy a farmaceutick² prost°edek, kter² ji obsahuje.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká anti-idiotypických protilátek, jež vyvolávají imunitní odezvu proti nádorům, které nesou jako antigen receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR). Vynález se týká především anti-idiotypických protilátek, majících interní obraz antigenu a schopných simulovat externí oblast lidského EGFR. Jako výhodné podle vynálezu se odvozují uvedené protilátky z myšího mAb425 nebo z jeho humanizovaných chimémích verzí. Protilátek podle vynálezu je možno použít v nádorové imunoterapii a imunoprofylaxi.

Dosavadní stav techniky

V popisu se vyskytují četné zkratky a technické pojmy, které mají následující význam:

„FRs“ (Framework regions = úseky základní struktury) znamená čtyři podoblasti variabilních oblastí s lehkým nebo těžkým řetězcem, které nesou tři CDR.

„CDRs“ (complementarity determining regions = doplňující určující oblasti) znamená tři podoblasti variabilních oblastí s lehkým nebo těžkým řetězcem, které mají hypervariabilní sekvence a vytvářejí smyčkové struktury, které jsou primárně zodpovědné za vytváření přímého kontaktu s antigenem.

„EGF“ a „EGFR“ znamená epidermální růstový faktor a jeho receptor.

„PCR“ znamená polymerázovou řetězovou reakci.

„scFv“ znamená Fv s jedním řetězcem, což je protilátkový fragment.

„Vl“ znamená variabilní oblast s lehkým řetězcem.

„Vk“ znamená kapa variabilní oblast s lehkým řetězcem.

„V_H“ znamená variabilní oblast s těžkým řetězcem.

„Chimérické“ nebo částečně humanizované protilátky jsou protilátky mající konstantní oblasti odvozené z lidských zdrojů a variabilní oblasti (včetně CDRs) pocházející z nelidských zdrojů, například z myší.

„Humanizované“ nebo plně humanizované protilátky jsou protilátky mající konstantní oblasti a FRs odvozené z lidských zdrojů, zatímco CRDs pocházejí z nelidských zdrojů.

„Abl“ znamená první nebo mateřskou protilátku, která navozuje kaskádu následných protilátek imunizací.

„Ab2“ znamená typickou anti-idiotypickou protilátku („=anti-id“), jež je zaměřena na idiotypy Abl.

„Ab3“ znamená anti-idiotypickou protilátku, jež je zaměřena na idiotypy Ab2 a je tudíž porovnatelný s Ab 1.

PBS znamená fosfátem pufrovanou solanku.

FCS znamená telecí zárodečné sérum.

HBSS znamená Hanksův vyvážený solný roztok.

FITC znamená fluoresceinizothiokyanát.

MTC znamená směsnou buněčnou kulturu.

KLH znamená Keyhole Limpet hemocyanin.

-1 CZ 289357 B6

CFA znamená úplné Freundovy adjuvanty.

HRPO znamená lidskou rekombinantní peroxidázu.

Anti-idiotypické protilátky (anti-idiotypy nebo „anti-idy“) jsou protilátky zaměřené proti epitopům (nazývaným idiotypy), umístěným vantigenové vazební oblasti nebo ve variabilní oblasti jiné protilátkové molekuly. Interakce mezi idiotypy (Abl) a anti-idiotypy (Ab2) hrají významnou úlohu v uchování imunitní homeostázy. Síťoví idiotypů a anti-idiotypů mělo vysvětlit imunoregulaci (Jerme, F. G., Ann. Immunol. 125C, str. 373, 1974). „Interní obraz“ antiidiotypických protilátek simuluje trojrozměrnou strukturu antigenu rozeznanou Abl. Podávání Ab2 může vyvolat produkci protilátek Ab3 proti původnímu antigenu. U některých přenosných nemocí a při léčení rakoviny byly aplikovány s úspěchem idiotypové vakcíny. (Například: Uytdehaag, F. G. a C. Μ. H. Osterhaus, J. Immunol. 134, str. 1225, 1986; Kennedy, R. C. a kol., Science 232, str. 220, 1986; Hiemaux, J. R., 56, str. 1407, 1988; Stein, K. E. a T. Soderstrom J. Exp. Med. 160, str. 1001, 1984). V nádorové imunologii bylo použito idiotypické vakcinace k modulování růstu nádorů v experimentálních systémech in vivo a in vitro. (Smorodinsky, N. I. a kol., Eur. J. Immunol. 18, str. 1713, 1988 a Viale, G. a kol. J. Immunol. 139, str. 4250, 1987). Herlyn a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76, str. 1438,1987) uvádí slibné výsledky v klinických pokusech na pacientech s pokročilou kolorektální rakovinou, zastavení metastáz a částečná klinická remise byla pozorována u pacientů ošetřovaných pouze anti-idy. Anti-idiotypické protilátky a jejich použití v nádorové terapii jsou také známy například z patentových spisů číslo US 4 918 164aEP0 141 783.

Epidermální růstový faktor (EGF) je polypeptidový hormon, který je mitogenický pro epidermální a epiteliální buňky. Dojde-li k interakci EGF s citlivými buňkami, váže se na membránové receptory (EGFR). EGFR je transmembránový glykoprotein přibližné molekulové hmotnosti a je genovým produktem c-erb-B proto-onkogenu.

MAb 425 je myší monoklonální protilátka zaměřená proti dobře známé linii lidských karcinomních buněk A431 (ATCC CRL 1555), váže se na polypeptidový epitop externí oblasti lidského EGFR a inhibuje vazbu EGF. Zjistilo se, že MAb 425 (ATCC HB9629) zprostředkovává nádorovou cytotoxicitu in vitro a potlačuje in vitro růst nádorových buněk epidermoidních a buněčných řad odvozených od kolorektálního karcinomu (Rodeck a kol., Cancer Res. 47, str. 3692, 1987). O humanizovaných a chimérických verzích MAb 425 se pojednává v patentovém spise číslo WO 92/15683.

Vazba EGF na receptor aktivuje četné biochemické procesy vedoucí k replikaci DNA a dělení buněk (Carpenter, G. Annu. Rev. Biochem. 56, str. 881, 1987). Systém EGFR byl nedávno implikován v onkogenické transformaci buněk (DiFiore, P. P. a kol. Cell 51, str. 1063.10,1987). Autokrinní stimulovaná proliferace buněk byla navrhována u několika nádorů, které expresují EGFR a sekretují EGF nebo TGFa (Ennis, B. W. a kol., Mol. Endo. 3, str. 1830, 1989), vyšší exprese EGFR v povrchu buněk byla zjištěna v nádorech různého tkáňového původu jako plic, močového měchýře, v karcinomu, v melanomu a v neneuronálních mozkových nádorech (Neal, D. E. a kol., Lancet, 1., str. 366, 1985; Libermann, T. A. a kol., Cancer Res. 44 str. 753, 1984; Herlyn, M. a kol., J. Clin. Immunol. 2 str. 135, 1982). EGFR je terapeutickým terčem, jelikož je přímo implikován v buněčné proliferaci četných tumorů. Ukázalo se, že jeho nadexprese má špatnou prognostickou hodnotu, neboť koreluje se zvýšeným invazivním potenciálem (Sainsbury, J. R. a kol., Lancet 1. str. 364, 1985).

Pasivní nebo aktivní imunizace proti EGFR u pacientů s rakovinou vede k cirkulaci specifických protilátek, které působí jako antagonity EGF a TGFa, neboť blokují jejich přístup k receptoru a inhibují růst nádoru. EGFR je dobrým kandidátem pro idiotypovou vakcínu, jelikož byl vyčištěn z nádorových buněk, není však dostupný v dostatečném množství pro terapeutické účely.

-2CZ 289357 B6

Četné skupiny vědců zkoumaly anti-idiotypické protilátky a jejich strukturální porovnání s jejich antigeny a interními obrazci (například Tsjisaki, M. a kol. J. Immunol. 150, str. 508, 1993; Raychaudhuri a kol., J. Immunol. 145, str. 760, 1990; Bruck, C. a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, str. 6578, 1986).

V evropském patentovém spise číslo EP 0586002 se popisuje monoklonální protilátka rozpoznávající EGFR. Inhibicí EGF vázání na receptor je tato protilátka schopná inhibovat růst nádorových buněk, závisejících na EGF. Přídavně má protilátka cytotoxické působení a/nebo je schopná produkovat synergický jev při inhibici proliferace nádorových buněk, pokud je kombinována s gangliosidem nebo s monoklonální protilátkou proti EGF. Jsou popisovány deriváty a fragmenty této protilátky a farmaceutické prostředky, které ji obsahují.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je monoklonální anti-idiotypická protilátka Ab2 napodobující vnitřní obraz EGFR antigenu rozeznávanému odpovídající myší, humanizovanou nebo chimémí monoklonální Abl idiotypickou protilátkou, přičemž idiotypickou protilátkou je myší mAb 425 nebo protilátka od ní odvozená, produkovaná buněčnou linií uloženou pod číslem ATCC HB 9629.

Především se vynález týká nových anti-idiotypických protilátek (anti-idů), které vyvolávají imunitní odezvu vůči epidermálnímu receptoru růstového faktoru. Vynález poskytuje obzvláště nejméně dva takové Anti-idy (označené 5A6 a 3B6), které simulují antigenové místo na povrchu lidského epidermálního receptoru růstového faktoru. Tudíž protilátek podle vynálezu, obzvláště schopných simulovat EGFR, se může použít k vyvolání a narůstání imunitní odezvy vůči všem druhům lidských nádorů, které expresují epidermální receptor růstového faktoru na svém povrchu, včetně melanomů, gliomů a karcinomů. Uvedených protilátek lze použít také k diagnostickým účelům, kde jde o lokalizaci a posouzení uvedených nádorů in vitro nebo in vivo.

Podstatou vynálezu je tak zajištění nové protilátky, kterou je monoklonální anti-idiotypická protilátka (Ab2), vyvolávající imunitní odezvu proti epidermálnímu receptoru růstového faktoru (EGFR).

V detailu se vynález týká monoklonální anti-idiotypické protilátky simulující interní obraz antigenu EGFR rozpoznávaného odpovídající myší, humanizovanou nebo chimérickou monoklonální idiotypickou protilátkou (Abl). Tato protilátka Abl může být nelidskou, obzvláště myší, humanizovanou nebo chimérickou monoklonální protilátkou, jak shora uvedeno. Jelikož je možno si představit, že jako takových je několik protilátek Abl zaměřených proti epitopu AGFR, týká se vynález také anti-idiotypických protilátek, které mohou rozeznat tuto skupinu Abl protilátek anti-EGFR.

Vynález se dále týká monoklonálních anti-idiotypických protilátek anti-EGFR, které lze získat z odpovídající protilátky Abl anti-EGFR, například imunizací.

Proto je podstatou vynálezu monoklonální anti-idiotypická protilátka, kterou lze získat imunizací zvířete s odpovídající myší, humanizovanou nebo chimérickou monoklonální idiotypickou protilátkou (Abl).

Anti-idiotypické protilátky podle vynálezu se s výhodou získají imunizací monoklonální antiEGFR protilátkou 425 nebo jejími humanizovanými a chimérickými verzemi. MAb 425 se vyrábí známou buněčnou řadou deponovanou pod označením ATCC HB 9629.

Podstatou vynálezu tudíž je monoklonální protilátka, jež se vyznačuje tím, že idiotypickou protilátkou (Abl) je MAb 425 (ATCC HB 9629) nebo je od ní odvozena humanizací nebo

-3CZ 289357 B6 chimérizací o sobě známými způsoby, například popsanými v patentovém spise číslo WO 92/15683.

Vynález se také týká specifických anti-idiotypických protilátek, jež mají dobře definované 5 aminokyselinové sekvence v hypervariabilní (CDR) a variabilní (FR) oblasti protilátek a jež jsou vyznačeny na obr. 5A až F.

Vynález se tedy také týká anti-idiotypické monoklonální protilátky, přičemž oblasti CDR a FR uvedené protilátky zahrnují aminokyselinové sekvence podle obr. 5A až F. Kromě toho je 10 podstatou vynálezu podle výhodného provedení anti-idiotypická protilátka mající aminokyselinovou nebo nukleotidovou sekvenci podle obr. 5 A až F.

Sekvence podle vynálezu zahrnují také varianty a obměny pocházející z přesně definovaných sekvencí podle obr. 5 spontánních nebo chemicky vyvolaných nebo fyzikálně způsobených 15 mutací, inzercí, vypuštěním a náhradou jednotlivých aminokyselinových nebo nukleotidových zbytků, za předpokladu, že se biologická aktivita a vlastnosti konečných protilátek podstatně nezměnily.

Pojem anti-idiotypická protilátka také zahrnuje fragmenty takových protilátek, jako jsou 20 například molekuly Fv s jedním řetězcem nebo molekuly F(ab)^ř2 a Fab', jež jsou v oboru dobře známy (Skerra a Pliickthun, Science 240, str. 1038, 1988; Better a kol. Science 240, str. 1041, 1988). Popsány byly také Fv sjedním řetězcem (kde V_L a V_H řetězce jsou spolu vázány) (například Bird a kol., Science 242, str. 423, 1988; Houston a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, str. 5879, 1988).

Způsob přípravy monoklonální anti-idiotypické protilátky, navozující imunitní odezvu receptoru epidermálního růstového faktoru, spočívá podle vynálezu vtom, že se zvíře imunizuje odpovídající idiotypickou protilátkou (Abl), která se váže na idiotypický antigen přímo svými CDR oblastmi, syntetizovaná antiidiotypická protilátka, která se váže na idiotypy mateřské 30 protilátky Abl, se oddělí a čistí se o sobě známými způsoby.

Vynález se také týká farmaceutického prostředku obsahujícího jako účinnou látku monoklonální anti-idiotypickou, shora definovanou protilátku a popřípadě farmaceuticky přijatelný nosič.

Konečně se vynález týká použití uvedené anti-idiotypické protilátky pro výrobu léčiv zaměřených proti nádorům.

Vynález popisuje získání tří monoklonálních anti-idiotypických protilátek (5A6, 3B6 a 15H6), které rozeznají idiotypy překrývající se s antigenovým vázajícím místem (paratopem) mAb 425. 40 Sérologické a imunologické studie ukazují, že 5A6 a 3B6 nesou interní obrazec epitopu rozeznaného mAb 425 vyvolávajícím humorální odezvu v syngenetickém (Balb/c myším) a v allogenickém (B6D2F1 myším) systému. Pravý interní obrazec Anti-idů bude působit jako náhražky antigenu ve zvířatech jiných druhů, avšak tyto Anti-idy byly neúčinné ve vyvolání odezvy podobné Abl v případě králíků a krys. Klonování a sekvencování jejich V-oblastí 45 ukázalo existenci aminokyselinových homologií mezi CDR s lehkými i těžkými řetězci a některé zbytky EGFR umístěné v ligandové vazebné oblasti, což naznačuje antigenové napodobení. Studie antigenicity homologických oblastí naznačuje možné vysvětlení nedostatku biologického působení v heterogenním systému a podporuje potenciální účinnost v lidské terapii.

-4CZ 289357 B6

Popis obrázků a tabulek

Obr. 1: Inhibiční vazby 425 na EGFR prostřednictvím 5A6, 3B6 a 15H8 nebo neodvozených mAb. Procento inhibice vypočteno jak popsáno v materiálu a způsobech používajících hodnot OD z ELISA.

Obr. 2: Křivky inhibiční vazby myší (A) a humanizované verze (B) 425 na EGFR expresující buňky A431 prostřednictvím 5A6 (tečka), 3B6 (kolečko), 15H8 (prázdný trojúhelník) a myší IgGl (Sigma - plný trojúhelník). Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr OD duplicitních vzorků, osa x: přírůstek (pg/ml), osa y: OD.

Obr. 3: Konkurenční ELISA pro vazbu Ab3—Ab2. Řadové ředění krysího séra Ab3 je testováno na vazbu pevnou fází povlečené Ab2 nebo neodvozené mabl5 inkubované předem 5A6 (tečka), 3B6 (plný čtverec), 15H8 (plný trojúhelník). Jako kontrol použito mAb 15 (prázdný trojúhelník) a normálního myšího séra (plný kosočtverec). A: krysí Ab3 séra anti-5A6; B: krysí Ab3 séra anti-3B6; krysí Ab3 séra anti-15H8; D: krysí kontrolní anti-mAbl5; osa y: OD, osa x: zředění sér xlO^-3.

Obr. 4: ELISA pevné fáze: Inhibiční vazba Balb/c a B6D2F1 Ab3 od 5A6 a 2B6 imunizovaných myší na čištěný EGFR Anti-idy.

Obr. 5: Úplná sekvence variabilní oblasti (včetně vůdčí sekvence) myších monoklonálních protilátek 15H8, 5A6 a 3B6 s těžkým a lehkým řetězcem. Znázorněny jsou nukleotidové a aminokyselinové sekvence. Vůdčí sekvence, pokud jsou zaznamenány, jsou vytištěny tučně, sekvence CDR jsou vytištěny kurzivou a sekvence primerů, použitých k zesílení variabilních oblastí, jsou podtrženy. Těžký řetězec 15H8, 5A6 a 3B6 má charakteristickou strukturu skupiny IIID. Lehký řetězec 15H8 a 5A6 mají charakteristickou strukturu kapa-skupiny V a 3B6 má strukturu kapa-skupiny III, vše podle Kabatovy klasifikace.

A:	15H8	těžký řetězec
C:	3B6	těžký řetězec
E:	5A6	těžký řetězec

B: 15H8 lehký řetězec

D: 3B6 lehký řetězec

F: 5A6 lehký řetězec

Obr. 6 Porovnané sekvence CDR2H, CDR3H a CDR2L externí oblasti Ab2 a EGFR. Identické aminokyseliny jsou znázorněny v uzavřených rámečkách. Otevřené rámečky znamenají podobné aminokyseliny. Potenciální antigenové oblasti jsou ve šrafovaných polích.

Tabulka I. Konstanty afinity 5A6, 3B6 a 15H8 vůči 425. Disociační konstanty jsou vypočteny z náčrtků vazby Ab2 na 425 z hodnot OD získaných ELISA provedené popsaným způsobem.

Tabulka II. Inhibiční vazba Abl-Ab2 prostřednictvím Ab3 a detekce vzájemně reagujících idiotypů Ab2. Dvojnásobné zředění séra Ab3 od myší (A), králíků (B) a krys (C) imunizovaných Anti-idy nebo neodvozenými mAb jsou testovány na inhibici vazby jejich imunizujících Ab2, ostatní Anti-idy a myší izotyp a allotyp souhlasí s mAb. Uvedeny jsou sérové titry vykazující 100% inhibici.

Tabulka III. Odezva anti-EGFR v Balb/c myších stanovená nepřímou imunofluorescencí vůči EGFR pozitivním (A431) nebo negativním nefixovaným buňkám (C33A), ELISA proti úplným buňkám nebo vyčištěné externí oblasti.

^a) Detekce FITC králičí Anti-myší IgM+IgG ^b) Detekce FITC králičí Anti-myší IgG ^c) Pozitivní zvířata/imunizovaná zvířata

-5CZ 289357 B6

Vynález blíže objasňuje následující podrobný popis.

Biologický materiál a obecné metody

Mikroorganismy, buněčné linie, plazmidy, fagemidy, promotory, rezistanční markéry, replikační počátky nebo jiné fragmenty vektorů jež jsou zde zmiňovány jsou obchodně nebo jinak všeobecně dostupné. Pokud není v přihlášce uvedeno jinak, jsou použity pouze jako příklady a nejsou nezbytné podle vynálezu a mohou být nahraženy jinými vhodnými nástroji a biologickými materiály.

Techniky, potřebné podle vynálezu, jsou zde podrobně popsány. Ostatní podrobně nepopsané techniky jsou známy jako standardní způsoby známé pracovníkům v oboru, nebojsou podrobně popsány v citovaných odkazech, v patentové literatuře a ve standardní literatuře (například Harlow, E. a D. Lané, Antibodies, a laboratory manual 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.).

K. pokusům in vivo je použito myši Balb/c (IFFA CREDO), hybridního kmene B6D2F1 od myší C57BL/6J a DBA/2J (IFFA CREDO), krys Wistar (Interfauna Ibérica) a novozélandských bílých králíků (Biocentre).

A431 je epidermoidní karcinom (ATCC CRL1555) expresující EG-FR. C33A (ATCC HTB31), mozkový karcinom je receptomegativní. Jako fúzního partnera k získání hybridoma je použito HLl-Friendly Myeloma-653 (Ventrex, Bioventures group). Všechny linie se kultivují v médiu RPMI 1640 doplněném 10 % zárodečného telecího séra a 2mM glutaminu.

Anti-EGFR mAb (Abl) je generován podle Rodecka a kol. Jako kontrol je použito několika myších mAb neodvozených specifit v různých zkouškách: mab 15 (IgGl,k), anti-gp85/45 karcinomu malých plicních buněk; R24, (IgG3,k), anti-GD3; 14F9 (IgG3,k), anti-GD3 a Me361(IgG2a), anti-GD2 byly popsány (Kamma H. a kol., Cancer Res. 49(8), str. 5118, 1989; Dippold, W. G. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 77, str. 6144, 1980; Massó O. a kol., Immunologia 10 str. 36, 1991 a Thurin J. a kol., Cancer Res. 46, str. 1229, 1987).

Fill (IgGl,k) získán PEG vyvolanou fúzí mezi splenocyty zRNasou imunizovaných myší Balb/c a Friendly-Mylenoma jak dále popsáno.

Získání Anti-425 idiotypu mAb

Pomocí splenocytů z myší Balb/c imunizovaných mAb 425 se generují myší hybridomy a fúzují se s buňkami 653 Friendly-Myelomu. Supematanty se testují sendvičovou ELISA proti mAb 425. Hybridomy 5A6, 3B6 a 15H8 se získají ze dvou fůzí jež dají 2,8 % a 10,5 % specifické účinnosti. Po trojnásobném klonování způsobem omezeného ředění zjištěno, že jde o IgGl,k.

Charakterizace 5A6, 3B6 a 15H8

K. charakterizování Ab2 se použije surových supematantů nebo čištěných vzorků proteinu A. Anti-idová povaha se potvrdí jejich specifickou vazbou na mAb 425 při testování oproti panelu neodvozených mAb různými antigenickými specifítami (111, 361 15 a 14F9).

K definici lokalizace idiotypů 425 poznaných anti-idy se testuje na inhibiční vazbu 425-EGFR použitím ELISA oproti sEGFR. Všechny inhibují zcela svou reaktivitu (obr. 1), což značí, že rozeznávají idiotypy ve vazebných místech antigenu.

K definování 5A6, 3B6 a 15H8 Anti-idy jako Ab2b se zjišťuje, zda koincidují idiotypy rozeznané na mAb s CDR nebo s vazebným místem antigenu. Pro tyto analýzy se sestaví křivky porovnávací inhibiční vazby s myší (obr. 2A) a humanizovanou (obr. 2B) verzí 425 mAb

-6CZ 289357 B6 nepřímou zkouškou ELIS A pomocí buněk A431. Všechny tři Anti-idy mohou inhibovat vazbu obou verzí 425, každý Ab2 má podobnou křivku inhibiční vazby, což ukazuje, že idiotypy 425 rozeznané, 5A6, 3B6 a 15H8 jsou přímo implikovány k rozeznávání antigenu. 15H8 je 10-krát účinnější při inhibování vazby buněk 425-A431 než 5A6 a 3B6. Ke stanovení stupně souhlasu Ab2 k paratopu 425 se vypočte disociační konstanta (KD) Anti-idů; konstanta KD každé Ab2 je udána v tabulce I, 15H8 má vyšší afinitu k 425 což souhlasí s vyšší schopností inhibovat vazbu EGFR-425. Tyto výsledky také naznačují, že nejméně dva různé idiotypy na mAb426 jsou rozeznány Anti-idy.

Tabulka I

Ab2 KD ~5A6 1,002.10^-9 M

3B6 1,250.1O^-9 M

15H8 0,300.10^-1° M

Synergická (Balb/c), allogeneická (B6D2F1) a xenogeneická (krysy, králíci) indukce AB3

Užitečnost těchto Ab2 jakožto vakcín Id se vyhodnocuje analýzou jejich imunogenecity. Skutečný interní obrazec Ab2 by měl být schopen vyvolat Ab3 se specifitou podobnou Abl překročením bariéry druhů. Ab3 se generuje v myších, v krysách a v králících podle shora popsaných imunizačních protokolů. Protilátky proti anti-Idům jsou zjistitelné dva týdny po první dávce a dosahují maximální úrovně 6 až 8 týdnů po podání první dávky. Specifická odezva proti imunizaci Ab2 se udržuje až do 12 měsíců u krys a králíků, zatímco je přechodná u myší, kde klesá titr Ab3 v následujících měsících. Všichni králíci generují anti-myší Igy; titr séra Ab3 proti imunizaci Ab2 je 5 až 10 -krát vyšší než proti izotypu a allotypu srovnatelných Ig, což naznačuje, že imunitní odezva proti konstantní oblasti Ab2 nenarušuje imunitní odezvu vůči oblasti V.

Ke stanovení účinné imunizace vůči těm determinantům Ab2, jež způsobují kontakt s paratopem mAb 425 (kde by měly být umístěny anigen-simulující idiotypy), se provádí zkouška inhibiční vazby, kde se měří vazba 5A6, 3B6 nebo 15H8 Ab2 na mAb 425 v přítomnosti sériových zředění séra Ab3 ze zvířat imunizovaných Ab2 nebo neodvozených myších mAb. V tabulce II jsou udána zředění séra Ab3, která vytvářejí 100% inhibici vazby Ab2-Abl, z myší Balb/c (A), králíků (B) a krys (C). Jak patrno z tabulky II A, B a C, všechna séra anti-5A6 Ab3 vzrostou ve 3 druzích inhibovaných 5A6 a 3B6 mab-426 vazbou se stejnou účinností, séra anti-3B6 vykazují podobný inhibiční obrazec, což naznačuje, že oba Anti-idy mají stejné idiotopy. Kromě toho se zjišťuje, že některá Anti-15H8 séra krys a myší inhibují vazbu 5A6 a 3B6 na 425, což naznačuje parciální idiotypickou identitu. Takové reaktivity se nenacházejí v králičím séru Anti-15H8, což značí, že odezva Ab3 v králících může být zaměřena hlavně proti jiným více imunodominantním idiotopům, přičemž je tato možnost také podporována nálezem vyšších inhibičních titrů v králičím séru Ab3 než nalezeném u myší a krys.

Antigenová totožnost mezi 5A6 a 3B6 se studuje konkurenční zkouškou ELISA, testují se sériová zředění (10~³ až 10^-5) králičích a krysích sér Ab3 na vazbu k Ab2 v přítomnosti stejného objemu (1 mg/ml) Ab2 nebo kontrolních mAb. Na obr. 3 jsou křivky inhibice vazby odpovídající krysímu séru Ab3. 5A6 a 3B6 vytvářejí identický repertoár v krysách a králících: séra Anti-5A6 reagují stejně dobře s 5A6 nebo 3B6 Ab2 povlacích na destičkách ELISA a jsou stejně inhibována oběma Ab2. Králičí sérum Ab3 má podobný obrazec inhibice jako pro krysí séra znázorněná na obr. 3.

Tabulka IIA

Balb/c Ab3	Ab2-mAB 425 inhibice vázání
5A6	3B6	15H8
5A6	1/600	1/600	—
	1/1200	1/1200	1/150
	1/300	1/300	—
	1/4800	1/2400	1/75
	1/4800	1/4800	1/150
3B6	1/6400	1/6400
	1/2400	1/2400	—
	1/4800	1/4800	—
	1/800	1/800	—
	1/4800	1/4800	-
15H8	—	_	1/9600
	-	—	1/9600
	-	—	1/9600
	-	-	1/9600
	1/2400	1/2400	1/9600
Fill	-	-	-
KLH	-	-	-
Preinmunní	—	—	—
séra	-	-	-

-8CZ 289357 B6

Tabulka IIB

Rabbit Ab3	Ab2-mAb 425 inhibice vázání
5A6	3B6	15H8
5A6	1/3200	1/3200	—
	1/12800	1/12800	—
	1/6400	1/12800	—
	1/12800	1/6400	—
	1/12800	1/12800	-
3B6	1/6400	1/6400
	1/3200	1/6400	—
	1/12800	1/12800	—
	1/12800	1/12800	—
	1/12800	1/12800	-
15H8	—	_	1/12800
	-	-	1/12800
	-	—	1/1600
	-	-	1/3200
mAbl5	-	-	ND
Fill	-	-	-
mAb425	-	-	-
KLH	-	-	-
Preinmunní	—	_
séra	-	-	-

-9CZ 289357 B6

Tabulka IIC

Rat Ab3	Ab2-mAB 425 inhibice vázání
5A6	3B6	15H8
5A6	1/2400	1/4800	-
	1/2400	1/2400	-
3B6	1/2560	1/2560	_
	1/1280	1/2560	-
15H8	1/160	1/320	1/2560
	-	-	1/1280
Fill	—	—	—
	—	—	-
MAB 15	-	-	-
	—	—
KLH	-	-	-
	-	-	-
	—	—	—
Preinmunní	-	-	-
séra	-	-	-

Identifikace protilátek Anti-EGFR Ab3

Antireceptorové protilátky se detekují v séru Ab3 přímou imunofluorescencí proti buňkám A431 a C33A a výsledky jsou uvedeny v tabulce III.

Tabulka III

Ab3^c	Imunofluorescence	ELISA
A431	C33A^a	A431	sEGFr”
Anti-5A6	7/14	0/14	6/14	5/15
Anti-3B6	10/13	0/13	6/13	5/16
Anti-15H8	4/12	0/12	0/12	0/11
Anti-mAbl5	0/2	0/2	0/2	0/4
Anti-R24	0/3	0/3	0/3	0/3
KLH	0/5	0/5	0/5	0/4
preimunní	0/20	0/20	0/20	NT

Vakcinace Anti-Id v myším systému indukuje vytváření protilátek Anti-EGFR, v Ab3 z krys 15 a z králíků však nemohly být zjištěny žádné protilátky Anti-EGFR. Vývoj protilátek Anti-EGFR v myších B6D2F1 potvrzuje, že vakcinace Ab2 není geneticky omezena na myší kmen Balb/c. Specifické protilátky dosahují titrů 1/50 až 1/1600 při testování sEGFR zkouškou ELISA.

Inhibiční vazba Ab3-EGFR prostřednictvím 5A6,3B6 a 15H8

Tyto zkoušky se provádějí k testování, zda Anti-idové simulace v trojrozměrném uspořádání EGFR. Různá zředění Anti-EGFR séra Ab3 z myší Balb/c a B6D2F1 se smísí sAnti-idy a nechají se reagovat 4 hodiny při teplotě místnosti, pak se testují na antireceptorové protilátky destičkami povlečenými sEGFR a procento inhibice se vypočte z hodnot OD znázorněných na

-10CZ 289357 B6 obr. 4. 5A6 a 3B6 dává 100% inhibici, což naznačuje, že souhlasí trojrozměrná struktura původního antigenu. 15H8 dává 15 až 35% inhibici Anti-EGFR Ab3 od 5A6 nebo 3B6.

Bylo tvrzeno, že interní obrazec Anti-idů může nahradit imunologické vlastnosti antigenu a vyvolat specifickou odezvu v různých druzích, není tomu tak v případě 5A6 a 3B6, které selhávají ve vyvolání Anti-EGFR u krys a králíků; provedené sérologické testy však naznačují, že anti-receptorové protilátky detekované v myších jsou vyvolány idiotypovými determinanty AB6 a B36 podobnými EGFR.

Primární struktury Ab2 a porovnání aminokyselinových sekvencí s EGFR.

Bylo provedeno sekvencování DNA za účelem analyzování strukturní báze jejich imunologických vlastností. Sekvence VH a VL 5A6, 3B6 a 15H8 jsou vypsány na obr. 5. Aminokyselinové sekvence oblasti VH se klasifikují do podskupin IIID podle Kabata. Oblasti VL 5A6 a 15H8 patří do skupiny kV a 3B6 do kffl podle Kabata. Sekvence CDRjsou porovnány s aminokyselinovými sekvencemi lidského EGFR (CQHUE z databanky SPIRS), (obr. 6), v uzavřených rámečcích jsou uvedeny zjištěné identické zbytky a v otevřených rámečcích jsou ekvivalenty zbytků. Maximální homologie je nalezena mezi zbytky 77-84 z CDR2H a zbytky 125-129 zCDR3H a 70-76 z 5A6 a 74-80 CDR2L, nejvyšších homologických oblastí EGFR, aminokyseliny 437-452 a 492-502 sCDR3H jsou umístěny v hypotetických ligandověvazebných oblastech receptorového proteinu, který popsal A. Ullrich a kol. (30). 15H8 má identické sekvence CDR2H ale má odlišné sekvence CDR3H a CDR2L. K analyzování, jakou úlohu hraje každá homologická CDR ve vytváření interního obrazce EGFR, se porovnaly sekvence 5A6 a 3B6 se známými oblastmi VH a VL podle Kabata. Zjistilo se, že některé řetězce VH podle vynálezu jsou vysoce homologické s 5A6 a s 3B6, vykazují podobné CDR1H a CDR2H, což naznačuje, že sekvence CDR3H hraje hlavní úlohu v rozeznání paratopu 425 a mimikrů EGFR. Zjistilo se, že existuje 63 Igů (hlavně myšího a lidského původu) s oblastmi CDR3H částečně homologickými (50-87%) sCDR3H z 5A6 a 3B6. Homologická aminokyselina se hromadí, jak se zdá, na zbytcích 100H-102, zatímco méně homologická kyselina se nachází spolu se segmentem GYVG kde byla nalezena maximální homologie s EGFR. Bylo zjištěno, že žádná protilátka myšího nebo lidského původu nemá zbytek V v poloze 100D, který je výlučně 4A6, 3B6. VL 5A6 a 3B6 vykazují homologie s myšími kapa-řetězci, zcela odlišné VL řetězcové sekvence mají stejnou specifičnost. Úloha CDR2L není přímo odvozena, jak se zdá, z identity aminokyselin. 5A6 a 3B6 mají různé sekvence konstruující identickou interní strukturu obrazce EGFR, avšak homologie aminokyselin s EGFR se jeví jako akumulované v této oblasti.

K vyhodnocení jejich imunologického účinku jako vakcín Id, se analyzovaly postupně dostupnost a antigenové vlastnosti oblastí CDR2H, CDR3H a CDR2L. Antigenický index (míra antigenické pravděpodobnosti) se vypočítá z ANTIGENICkého programu, sekundární struktura se definuje programem DSSP ke stanovení dostupnosti nalezených homologických sekvencí.

Analýzy primární a sekundární struktury ukazují, že homologické zbytky jsou dostupné a také koincidují s oblastmi vykazujícími pozitivní antigenický index, mohou být proto přímo implikovány do odezvy anti-intemího obrazce. Řetězce VL5A6 a VL3B6 vykazují 7 neidentických antigenických oblastí a 11024 a 11603 angstromů dostupného proteinového povrchu, schopného vytvářet antigenické idiotypy, avšak obě protilátky generují identické odezvy Ab3 u myší, králíků a krys. Tyto výsledky naznačují, že Anti-Anti-idová odezva, zjištěná v tomto systému, je výlučně zaměřena na Id definovaný řetězec VH 5A6 a 3B6.

Jelikož imunologická a strukturální analýza ukazuje, že Anti-idy 5A6 a 3B6 jsou interním obrazem externí oblasti EGFR, analyzuje se, proč selhává ve vyvolání odezvy v jiném druhu. Pozitivní oblast GYVGYAIDY CDR3H nesoucí ekvivalentní segmenty GYVGY EGFR se porovnávají se sekvencemi CDR3H z myších, krysích a králičích protilátek. Velká skupina myších protilátek má sekvenci YAIDY, takže mezi předpověděnou antigenickou oblastí CDR3H

-11 CZ 289357 B6 se očekává, že zbytky GYVG definují privátní imunologický idiotyp v myších. Nezjistilo se, že by králičí Ig měly sekvenci YAIDY, čímž je možné, že králičí Anti-Anti-Idová odezva je zaměřena na jiné idiotypy definované většími antigenickými oblastmi, kazící anti-intemí obrazovou odezvu.

V souhrnu se vynález týká následujícího:

V aktivní imunoterapii rakoviny bylo použito různých přístupů. Anti-idiotypické protilátky simulující imunologický účinek nádorových markérů byly aplikovány u rakovinou postižených pacientů k získání specifické protinádorové odezvy řízené interakcemi Id-Anti-Id.

K vyvinutí specifických vakcín pro EGFR byly získány Anti-idy mAbs zaměřené proti mAb 425. Vybrány byly tři protilátky (5A6, 3B6 a 15H8) rozeznávající kombinační místo asociovaných idiotypů na mAb425, definované svými sekvencemi CDR, jak předvedeno inhibicí vazby humanizované verze 425 mAb na EGFR.

Imunologické a sérologické zkoušky ukázaly, že 5A6 a 3B6 působí jako interní obrazce vyvolávající specifickou humorální odezvu v myších. Protilátky podobné Abl2 ze séra Ab3 se vážou na membránově vázaný EGFR na buňkách A431 a reagují proti sEGFR. Reakce je úplně inhibovaná jak 5A6, tak 36B Ab2 (nezávisle na Anti-idu použitém pro imunizaci), což naznačuje, že 5A6 a 3B6 nesou stejný interní obrazec EGFR. Imunologické údaje naznačují částečný idiotypický souhlas s idiotypem interního obrazce 5A6 a 3B6 a 425 paratopně odvozený Id z 15H8, sérologické zkoušky ukázaly částečné inhibiční vázání Anti-5A6 a Anti-3B6 myšího Ab3 na Ab2 nebo EGFR v přítomnosti 15H8. Imunologické studie ukázaly chybějící biologický efekt: byly indukovány protilátky IgM (reagující s buňkami A431 avšak selhávající v rozeznání sEGFR), nejsou však inhibovány 15H8. Tyto výsledky naznačují, že v průběhu imunizačních protokolů byly aktivovány nespecifické klony.

K poznání, jaké struktury Anti-idů jsou implikovány v generování odezvy Anti-EGFR byl proveden výzkum strukturní korelace mezi Id a antigenem.

Po sekvencování 5A6, 3B6 a 15H8 a po porovnání aminokyselinových homologů s EGFR byla nalezena sada homologických a ekvivalentních aminokyselin v antigenických a v dostupných oblastech CDR2H, CDR3H a CDR2L. Tyto údaje souhlasí s četnými zprávami ukazujícími přítomnost homologických sekvencí v CDR, (nebo v přilehlých oblastech) z řetězců VL a VH, které participují na strukturálním vytváření interního obrazce nesoucího idiotypy (31 až 33). Poznatek, že různé sekvence v 5A6 a 3B6 konstruují dvě protilátky s identickým imunologickým účinkem, umožnil analyzovat úlohu CDR a rámcových oblastí v indukci odezvy Ab3 a v konformaci interního obrazce EGFR.

CDR2L, CDR2H a CDR3H z 5A6 a 3B6 se pravděpodobně podílejí na konstrukci interního obrazce, jelikož maximální homologie a ekvivalentní aminokyselina byla nalezena s externí doménou EGFR v těchto oblastech. Trojrozměrní mimikry hrají, jak se zdá, hlavní úlohu jak je dovoženo následujícími poznatky.

a) CDR21L z 5A6 a 3B6 jsou rozdílné, avšak dávají vznik stejné odezvě Anti-EGFR.

b) V neodvozených protilátkách byly nalezeny homologické zbytky z CDR2H, takže jejich účast v interní struktuře obrazce nezávisí na výlučně lineární identitě.

c) Afinity zjištěné mezi CDR a zbytky 148-154, 437-452 a 492-502 z EGFR se zakládají hlavně na ekvivalentní aminokyselině.

d) Ekvivalentní aminokyselina se hromadí v těch CDR, avšak nikoli v jiných oblastech.

-12CZ 289357 B6

Idiotypická analýza několika rodin protilátek (Anti-PC, Anti-dextran, Anti-glaktan, Anti-NIP) provedena Daviem a kol., (34) ukázala, že v systému hnaném antigenem, zahrnuje výraz Id minimum aminokyselin zCDR2H, CDR3H a párování se specifickými řetězci L. Uvedené imunologické a sekvenční údaje naznačují, že podle vynálezu byla generována Idovou kaskádu Abl-Ab2-Ab3, omezená na soubor idiotypických oblastí definovaných paratopem 425 a paratopem Ab2. Nejvýznamnější okolností bylo získat dvě Ab2, 5A6 a 3B6 vykazující identické imunologické vlastnosti (a tudíž idiotypické determinanty) pocházející z identických řetězců VH spárovaných s různými řetězci VL.

Biologická účinnost Anti-idových protilátek koreluje s jejich afinitou s idiotypickým repertoárem v receptorovém druhu. Analýza zbytků implikovaných ve vytváření 5A6 a 3B6 struktury interního obrazce ukázala, že jsou začleněny do větší antigenové oblasti (zbytky 100F-101 v H-řetězci) zjištěné jako homologické s ostatními myšími protilátkami (z databáze proteinů NBFR) ale ne v králících. Proto interní struktura obrazce determinuje idiotyp „viděný“ myším imunitním systémem ale maskovaný větší idiotypickou oblastí při podávání králíkům. Tato domněnka je také podpořena imunologickými výsledky: Titry sér Anti-5A6 a Anti-3B6 paratopicky odvozené Ab3 jsou vyšší u králíků než u myší. Zjistilo se také, že homologické zbytky 100F-101 jsou přítomny v lidských protilátkách (z databáze NBFR), což poskytuje teoretický základ pro účinnost interního obrazce 5A6 a 3B6 v lidském systému.

Účinnost interního obrazce antiidiotypických protilátek jako vakcín byla demonstrována v různých zvířecích modelech a v klinických pokusech. Získání anti-idů rozeznávajících protilátky Anti-EGF popsal nedávno Suarez (Suarez, E. a kol., Immunologia 12, str. 122, 1993), který získal 4 neintemí obrazce mAbs.

5A6 a 3B6 jsou prvními interními obrazci Anti-id mAb napodobujícími externí oblast lidského EGFR. Biologické charakteristiky mAb 425 určují, že 5A6 a 3B6 simulují ligandově vazebné místo EGFR.

Sérologické studie, biologický účinek na zvířecích modelech a strukturní analýza naznačují jejich potenciální hodnotu pro vakcinaci lidí.

Terapeutické a diagnostické užití

Protilátky podle vynálezu mohou být podávány lidským pacientům pro terapii. Vynález se proto také týká farmaceutického prostředku, který jako účinnou složku obsahuje nejméně jednu protilátku nebo protilátkový fragment podle vynálezu spolu s jedním nebo s několika farmaceuticky přijatelnými látkami ze souboru zahrnujícího nosič, excipient nebo ředidlo.

Protilátky podle vynálezu se zpravidla podávají intravenózně nebo parenterálně. Obecně dávka pro podávání protilátkových fragmentů je dostatečně velká k vytvoření žádoucího potlačení nádoru a účinku lyže nádoru. Dávka závisí na věku, stavu, pohlaví a rozsahu onemocnění pacienta a může být 0,1 až 200 mg/kg, s výhodou 0,1 až 100 mg/kg denně, po dobu jednoho až několika dní.

Prostředky pro parenterální podání zahrnují sterilní vodné nebo nevodné roztoky, suspenze a emulze. Příklady nevodných rozpouštědel jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje, jako olivové oleje, vstřikovatelné organické estery jako je ethylenoleát a jiná rozpouštědla známá v oboru, vhodná pro tyto účely. Protilátky podle vynálezu mohou být používány v prostředcích obsahujících fyziologicky přijatelný nosič. Příklady takových vhodných nosičů jsou solanka, PBS, Ringerův roztok, nebo laktátovaný Ringerův roztok. Ve farmaceutických prostředcích mohou být i ochranné látky a jiné přísady, jako antibiotika, antioxidanty a chelatační činidla.

-13CZ 289357 B6

Protilátka (nebo případně protilátkový fragment) může být konjugována známými způsoby s cytokiny, jako je IL-2 k podpoře jejich cytotoxicity.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se hodí k ošetřování nádorů všeho druhu, včetně melanomů, gliomů a karcinomů, stejně jako nádorů oběhového systému a pevných nádorů. K diagnostickým účelům může být protilátka konjugována, například s radio-opakním barvivém nebo může být radiologicky značená. Výhodným způsobem značení je metoda jodogenní. S výhodou se protilátka podává jako fragment F(ab)'₂ nebo scFv pro diagnostické účely. To poskytuje vynikající výsledky, takže substrakce pozadí není nutná.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Humanizovaný mAb 425

Byla popsána humanizace mAB 425 (Kettleborough, C. A. a kol. Protein Eng. 4, str. 773, 1991). 20 Přebudovaná forma mAb425 obsahuje myší CDR roubovaný na lidské variabilní oblasti zahrnující strukturu místa antigenové vazby. Použito je ho k přesnějšímu definování umístění idiotypů 425 rozeznaných Ab2.

Příklad 2

Příprava Anti-idiotypických mAb na Anti-EGFR 425 mAb

Myši Balb/c se senzibilují injekcí i.p. 75 mg vyčištěného 425 mAb spojeného s KLH (Sigma), 30 polymerovaného s glutaraldehydem a smíšeného sCFA (Difco). Zvířatům se podá 7., 14., 21.,

28. a 38. den stejný imunogen emulgovaný IFA. Fúze se provede 3 dny po poslední dávce. Slezinné buňky imunizovaných myší se fúzují s HLl-Friendly Myeloma-653 pomocí 1450 polyethylenglykolu (Boehringer Mannheim) podle popsaného protokolu (Carceller, A. Sangre 33 (3), str. 220, 1988). Fúzované buňky se pěstují v prostředí obsahujícím 39 % RPMI 1640, 39 % 35 Hybridoma Medium (Gibco), 20 % zárodečného telecího séra a 2 % HAT. Pozitivní hybridy se klonují třikrát limitovaným ředěním.

Příklad 3

Detekce a analýza aktivity Ab2

Anti-idiotypické protilátky se detekují sendvičovou zkouškou ELISA s polystyrénovými mikrotitrovými destičkami (Nunc, Maxisorb), povlečenými 1 mg/ml čištěného 425 mAb. 45 Destičky se blokují 2% BSA-PBS a surové supematanty nebo zředěná séra v 0,2% BSA-PBS se inkubují přes noc při teplotě 4 °C. Po promytí PBS-0,05% Tween 20 se přidá biotinylovaný mAb 425, připravený způsobem, který popsal Harlow a Lané (jak shora uvedeno) v průběhu jedné hodiny při teplotě 37 °C, destičky se omyjí třikrát a přidá se HRPO-streptavidin (Dako), zředěný 1/1000 ve 2% BSA-PBS. Jako substrátu se použije roztoku 3,3,5,5-tetramethyl50 benzidinu (Sigma). OD se měří při 450 nm.

-14CZ 289357 B6

Příklad 4

Disociační konstanta (KD) Ab2 mAb 5A6, 3B6 a 15H8

Toto stanovení se provede způsobem Friguetovým (Friguet, B. a kol., J. Immunol. Methods 77, str. 306, 1985), stručně; sériová zředění mAb425 (2.10’⁸M až 2.10^_llM) se inkubují s pevnými koncentracemi Ab2 až do dosažení rovnováhy. Koncentrace volné Ab2 se měří nepřímou zkouškou ELISA pomocí mikrotitrových destiček povlečených 1 mg/ml mAb 425 a HRPOkráličího Anti-myšího IgGl (Zymed).

Příklad 5

Externí doména (sEGFR) vyčištěného lidského EGFR

Čištění externí domény lidské EGFR a imunoafinitní chromatografie z EGFR sekretovaného buňkami A431 je popsána (Weber W. a kol., J. Biol. Chem. 259 (23), str. 14631, 1984). Použije se pro potvrzení specifity Ab3 nepřímými nebo konkurenčními zkouškami.

Příklad 6

Zkoušky lokalizace idiotypů rozeznaných 425 mAb

K lokalizování 425 idiotypů definovaných 5A6, 3B6 a 15H8 se zkoušejí se zřetelem na schopnost inhibovat vazbu 425-EGFR. Tato analýza se napřed provede s čištěným sEGFR. Surové supematanty a 50 mg/ml čištěné Ab2 se smísí se 125 mg mAb 425. Po čtyřhodinové inkubaci při teplotě 37 °C se zkouší aktivita 425 zkouškou ELISA za pomocí mikrotitrových destiček povlečených 2,5 mg/ml sEGFR. Destičky se omyjí třikrát PBS-1%BSA a přidá se AP-rabbit antimouse Ig (Dako). Jako substrátu se použije roztoku 3,3,5,5-tetramethylbenzidinu. OD se měří při 450 nm v zařízení Tritertek Multiscan plate reader.

Tyto analýzy se doplní porovnáním jejich inhibičních vazebních křivek myší a přetvařované 425: 100 ng/ml myší nebo přetvařované 425 se smísí se stejnými objemy s rostoucí koncentrací (2,10^-2až 2.10'¹) čištěné Ab2 5A6, 3B6, 15H8 nebo neodvozené myší protilátky IgGl. Zbývající aktivita se měří zkouškou Cell-ELISA proti buňkám A431 předem fixovaným v mikrotitrové destičce (5,10⁵/důlek) s 0,1% glutaraldehydu. Po 60-minutové inkubaci při teplotě 37 °C se buňky promyjí třikrát PBS-l%BSA-0.05% Tween20. HRPO-Goat-Anti murine IgG2a (Dianova) a HRPO-Goat Anti-human IgG se použije k detekci vazby Abl, jako substrátu se použije orthofenyldiaminu (Sigma).

Příklad 7

Generace Ab3 v syngeneickém (Balb/c myši), allogeneickém (F6D2F1 myši) a xenogeneickém (krysy Wistar a NZW králíci) systému a detekce Ab3

Vyčištěné Ab2 se spojí s KLH (Calbiochem) glutaraldehydem (Sigma) a emulgují se s CFA nebo IFA. Zvířatům se podává ve dnech 0, 15, 30 a 60. U některých zkoušek se přídavné injekce provedou o 8 až 12 měsíců později ke studování stálosti odezvy Ab3. Při každé dávce dostanou zvířata 75 mg (myši), 150 mg (krysy) a 300 mg (králíci) celkového Ig intraperitoneální inokulací (myši) nebo subkutánně v různých místech (krysy a králíci). Kontrolní skupiny dostanou stejné dávky irelevantní na KLH-kopulované Ig nebo KLH samotného. Vzorky krve se shromáždí v den 0 a 1 týden po každé dávce. Sériová zředění séra (v PBS-0,15 % suchého mléka) se dají na

-15CZ 289357 B6 mikrotitrovou destičku předem povlečenou 1 mg/ml Ab2 nebo jinou myší Ig. Vázané anti-antiidy se detekují biotinylovanou Ab2 (v myším séru Ab3), HRPO-Rabit-Anti Ratlg (Dako) deprivované na vzájemnou reaktivitu proti myším igům a HRPO Swine Anti-Rabbit Ig (Dako). Anti-izotypické a allotypické protilátky vyvinuté v krysách a v králících se eliminují extenzivní adsorpcí 1/50—1/100 vzorků zředěných sér s myší IgGl po inkubaci přes noc při teplotě 4 °C.

Příklad 8

Inhibice vazby Ab2-Ab-1 séry Ab3

Tato zkouška se provádí k detekci protilátek reagujících s místy Ab2, jež vytvářejí kontakt s mAb 425-paratopem. V podstatě 8 až 16ng/ml vyčištěné 5A6, 3B6, 15H8 a Fill se smísí se sériovými zředěními obsahujícími séra Ab3, po noční inkubaci při teplotě 4 °C, zbývající aktivita Ab2 se detekuje přímou zkouškou ELISA proti 1 mg/ml 425 povlečených na polystyrénových destičkách. Vazba Ab2 se detekuje PA-Rabit Anti-mouse IgGl (Zymed).

Příklad 9

Stanovení idiotypické identity Ab2 vzájemnou konkurencí na vazbu Ab3

Ke stanovení idiotypické identity mezi každou anti-idovou protilátkou se zkouší Ab2 na inhibici vazby séra Ab3 na destičky povlečené Ab2. Sériová zředění krysího séra Ab3 (10^-3 až 10^-5) se zkoušejí na vazbu Ab2 v přítomnosti stejného objemu (1 mg/ml) Ab2 nebo kontrolních mAb předem inkubovaných přes noc při teplotě 4 °C.

Příklad 10

Detekce protilátek Anti-EGFR s odezvou Ab3

Zkoušejí se séra Ab3 myší, krys a králíků na aktivitu podobnou Abl pomocí CellELISA proti buňkám A431, jak prve popsáno, nebo zkouškou ELISA se sEGFR (2,5 mg/ml). Jako druhé protilátky se použije HRPO Rabbit Anti-mouse Ig (Dako), Rabbit Anti-Rat Ig (Dako) a Swine Anti-Rabbit Ig (Dako). Antireceptorové protilátky se testují také přímo zkouškou immunofluorescenční za použití nefixovaných živých buněk A431, pěstovaných v Terasaki destičkách.

Přikladli

Inhibice vazby EGFR-Ab3 prostřednictvím Anti-idů 5A6,3B6 a 15H8

Konkurenční zkouškou se zkoušejí determinanty mezi receptorem a anti-idy. Přes noc se inkubuje při teplotě 4 °C 120 až 240 mg/ml 5A6, 3B6, 15H8 nebo neodvozeného IgGl se zředěními 1/25 až 1/150 Ab3 sér Anti-EGFR a zkoušejí se na Anti-receptorovou aktivitu zkouškami ELISA, CellELISA a zkouškou přímé imunofluorescence. Procento inhibice se vypočte následovně:

OD s Ab2 - OD pozadí %inhibice = 1 - (--------------------)-100

OD bez Ab2 - Od pozadí

-16CZ 289357 B6

Příklad 12

Příprava RNA a cDNA

Z hybridomních buněčných linií 5A6, 3B6 a 15H8 se izoluje celková RNA. Buňky vyprané v PBS se suspendují v roztoku guanidiumthiokyanátu a RNA se izoluje způsobem ultraodstředění gradientu chloridu cezia podle Chirgwina (Chirgwin a kol., Biochemistry 18, str. 5294, 1979). Soupravou Pharmacia se syntetizuje prvně-řetězcová cDNA. Syntéza se provede v 15 μΙ s 5 pg RNA, během jedné hodiny při teplotě 37 °C. První řetězec cDNA se použije přímo ze zesílení bez předběžného klonování.

Příklad 13

Zesílení PCR

K zesílení kopií myších variabilních oblastí s lehkým řetězcem se použije souboru PDR primerů. Primery 5'jsou určeny k hybridizaci vůdčí sekvence. Primery jsou směsi 61 oligonukleotidů pro variabilní oblast s těžkým řetězcem a 405 oligonukleotidů pro variabilní oblast s řetězcem kapa. Primery 3' jsou určeny k převedení do konstantní oblasti. Použije se specifických IgGl kapa myších primerů.

K zesílení s termostabilní polymerázou DNA se 25 μΐ reakční směsi obsahující 1 μΐ hybridu cDNA-RNA, 250 nM příslušné směsi primerů 5' a 3', 200 mM každé dNTP, 1 mM MgCl₂ (pro lehký řetězec), 2 mM MgCl₂ (pro těžký řetězec) a 1 jednotka polymerázy Taq (Cetus) překryje minerálním olejem a podrobí se působení teploty s počátkem 60 °C do 55 °C. Jedna desetina reakce PCR proběhne na 1% agarosové TAE gelové elektroforéze a zabarví se ethidiumbromidem ke zviditelnění výsledných produktů PCR.

Příklad 14

Molekulární klonování a sekvencování μΐ každého produktu PCR se váže do vektoru TA (Invitrogen, San Diego). Vazební reakce DNA do oblastí řetězce VH a VL každé Ab2 se transformují tepelným šokem do kompetentních buněk TG1 E. coli. To vytváří šest knihoven DNA, jednu z lehce variabilní oblasti a ostatní z těžké variabilní oblasti každé mAb. Kolonie se selektují na destičkách LB s 100μg/ml kabenicilinu a jiné se uchovají pro další analýzy. Pozitivní kolonie se detekují skrínováním PCR nebo pomocí plazmidové digesce, jak to popsal Gíissow (Giissow, D. Clackson, T. T. Nucleic Acids Res. 17, str. 4000, 1989). Připraví se dvouřetězcové plazmidické DNA (Wizard preps, Promega Corp.) pro sekvencování z transformantů. Pomocí Taq polymerázy se provede ukončení dideoxy-nukleotidového řetězce způsobem, který popsal Sanger (Sanger, F. a kol., Proč. Nat. Acad. Sci. (JSA 74, str. 5463, 1977). Použité primery v sekvenčních reakcích se převedou do vektoru TA.

Příklad 15

Počítačová analýza a porovnání sekvencí

K vypočtení sekundární struktury Ab2 a jejích příslušných zbytků se použije softwarový program DSSP (Sybil). K předpovědění antigenových oblastí se použije metody Kolaskara a Tongaonkara (Kolaskar, A. S. a kol., FEBS-Lett. 276(1-2) str. 172,1990). Homologie Ab2 a EGFR se definují

- 17CZ 289357 B6 programem BESTFIT pomocí Gencorova disku pro porovnávací tabulku symbolů. Porovnatelná lidská sekvence EGFR byla publikována dříve (Ullrich a kol., Nátuře 309: str. 418, 1984). Ab2 se porovná s jinými známými Igy pomocí databanky proteinového identifikačního zdroje (PIR) kompilované National Biomedical Research Fundation (NBRF) a programem PROSIS.

Průmyslová využitelnost

Monoklonální anti-idiotypická protilátka navozující imunní odezvu proti nádorům nesoucí antigen receptoru epidermálního růstového faktoru (EGFR) schopná napodobovat tento antigen. Podle výhodného provedení je protilátka odvozena od mAb 425 (ATCC HB 9629) nebo od jeho humanizovaného nebo chimérického derivátu. Protilátka je vhodná pro výrobu farmaceutického prostředku proti nádorům.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Monoklonální anti-idiotypická protilátka Ab2 napodobující vnitřní obraz EGFR antigenu rozeznávaného odpovídající myší, humanizovanou nebo chimémí monoklonální Abl idiotypickou protilátkou, přičemž idiotypickou protilátkou je myší mAb 425 nebo protilátka od ní odvozená, produkované buněčnou linií uloženou pod číslem ATCC HB 9629.
2. Monoklonální anti-idiotypická protilátka podle nároku 1 získatelná imunizací zvířete odpovídající myší, humanizovanou nebo chimémí idiotypickou protilátkou.
3. Monoklonální anti-idiotypická protilátka podle nároku 1 nebo 2, jejíž CDR oblasti a FR oblasti zahrnují aminokyselinovou sekvenci podle obr. 5A až F.
4. Monoklonální anti-idiotypická protilátka podle nároku 1 nebo 2, obsahující nukleotidovou sekvenci podle obr. 5A až F kódující CDR a FR oblasti protilátky.
5. Způsob přípravy monoklonální anti-idiotypické protilátky podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se zvíře imunizuje odpovídající idiotypickou protilátkou, která se váže na idiotypický antigen přímo svými CDR oblastmi, syntetizovaná anti-idiotypická protilátka, která se váže na idiotypy mateřské protilátky, se oddělí a čistí se.
6. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje monoklonální anti-idiotypickou protilátku podle nároků 1 až 3 a popřípadě farmaceuticky vhodný nosič.
7. Použití monoklonální anti-idiotypické protilátky podle nároků 1 až 3 pro výrobu léčiva proti nádorům.