CZ2017415A3

CZ2017415A3 - Kmen bakterie Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii CCM 8774 a využití jeho antifungálně účinných metabolitů ve výrobě potravin a krmiv

Info

Publication number: CZ2017415A3
Application number: CZ2017-415A
Authority: CZ
Inventors: Vladimír Dráb; Miloslava Kavková; Dita Havelková; Jan Karas
Original assignee: Výzkumný ústav mlékárenský s.r.o.
Priority date: 2017-07-18
Filing date: 2017-07-18
Publication date: 2018-05-16
Also published as: CZ307297B6

Abstract

Kmen bakterie Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii, uložený v České sbírce mikroorganismů Přírodovědecké fakulty Masarykovy university, Kamenice 5, Brno pod sbírkovým číslem CCM 8774. Tento kmen je využitelný pro výrobu kyseliny propionové a fermentu obsahujícího antifungálně účinné metabolity využitelné v potravinářském a krmivářském průmyslu.

Description

Oblast techniky

Řešení se týká průmyslového mikrobiálního kmene Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii CCM 8774, který je využitelný pro produkci kyseliny propionové a dalších antifungálně účinných metabolitů ze substrátů obsahujících kyselinu mléčnou, a to v průmyslových podmínkách za kontinuálních či diskontinuálních podmínek.

Dosavadní stav techniky

Většina potravin a krmiv je citlivá na kontaminaci vláknitými houbami v různých etapách výroby, zpracování, přepravy a skladování. Klimatické podmínky a podmínky během výroby, přepravy a skladování mohou podpořit růst hub a syntézu mykotoxinů vedoucí ke kažení potraviny nebo její zdravotní závadnosti. Trendem posledních let při výrobě potravin vyvolaným požadavky spotřebitelů je snížení množství či úplná eliminace chemických sloučenin používaných pro konzervaci a ochranu potravin a krmiv a jejich nahrazení přírodními antimikrobiálními látkami. Úkolem vynálezců bylo nalézt možnosti ochrany potravin před kažením způsobeným vláknitými houbami, použitím bakterií produkujících antifungálně působící metabolity.

Podstata vynálezu

Uvedené nedostatky odstraňuje nový průmyslový mikrobiální kmen bakterie Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii CCM 8774 produkující kyselinu propionovou a octovou v potravinářské kvalitě zároveň s produkcí dalších blíže nespecifikovaných antifungálně účinných metabolitů, při kultivaci v substrátech obsahujících kyselinu mléčnou.

Izolace kmene podle vynálezu

Při izolaci kmene se smíchalo 10 g sýra s 90 ml 2(% roztoku citrátu sodného a po vytvoření •y homogenní emulze stomacherem se připravila desítková ředění ve fyziologickém roztoku a

9 naočkovala na YEL agar (yeast extract lactate). Kultivace probíhala anaerobně při teplotě 30 °C po dobu 6 dní.

Charakterizace kmene podle vynálezu

Po přečištění získaných kolonií byly získané izoláty charakterizovány pomocí morfologie a fyziologických znaků. Grampozitivní a katalázapozitivní nesporulující tyčinky produkující kyselinu octovou a propionovou z laktátu byly dále charakterizovány pomocí rodově specifické PCR, rep-PCR s primerem GTG5 a sekvenací 16 S rRNA podle Rossi a kol. v publikaci Syst. Appl. Microbiol. 21,419-28 z roku 1999. Rodově specifická PCR prokázala příslušnost kmene podle vynálezu krodu Propionibakterium. Sekvenační analýzou byla

-'Ά v databázi BLAST zjištěna 100 % shoda se sekvencí typového kmene Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii. Shluková analýza fingerprintu z repetitivní PCR rovněž prokázala příslušnost k druhu Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii.

Původní kmen podle vynálezu je uložen ve Sbírce mlékárenských mikroorganismů Laktoflora pod číslem CCDM 1067 a v lyofilizovaném stavu na mezinárodním ukládacím místě podle Budapeštské smlouvy v České sbírce mikroorganismů Přírodovědecké fakulty Masarykovy university, Kamenice 5, Brno pod sbírkovým číslem CCM 8774.

Stanovení antifungálních vlastností kmene podle vynálezu

Příprava extraktů

Kmeny bakterií propionového kvašení dlouhodobě uchovávané v zamraženém stavu byly obnoveny v YEL bujónu (yeast extrakt lactate) při 30 °C do nárůstu a následně očkovány (2 % inokula, v/v) do syrovátkového média (retentát kyselé syrovátky zahuštěný reverzní osmózou, výchozí pH 4,4 až 4,5, obsah kyseliny mléčné ~ 2 % m/v), jehož pH před sterilací (110 °C, 30 minut) bylo upraveno na 7,0 pomocí NaOH. Pro udržení konstantního pH během fermentace a jako neutralizační činidlo bylo přidáno 5 % (m/v) CaCO3 a 0,5 % (m/v) trimagnesium fosfátu (obě složky předem sterilovány při 121 °C po dobu 60 minut). Po kultivaci při 30 °C byla část fermentovaného média sterilně převedena do zkumavek a uchovávána při -20 °C do doby použití (komplet). Zbývající část byla odstředěna při 9000 g po dobu 10 minut a získaný supematant membránově filtrován (0,2 pm) a rovněž uchováván při -20 °C (bb supematant).

ϊ * * · « ·

9 • *

Příprava živných půd a suspenzí vláknitých hub

Používané kmeny vláknitých hub byly kultivovány na ječných kroupách při optimální teplotě a po sporulaci byly spory extrahovány fyziologickým roztokem s přídavkem 0,05 % (m/v) Tween 80. Koncentrace spor v extraktu byla zjištěna pomocí plotnové metody na Malt agaru (HiMedia Laboratories, Mumbai, Indie). Spory vláknitých hub byly vmíchány do rozvařených živných půd temperovaných na 50 °C na výslednou koncentraci 20 až 50 spór/ml média a rozlity na plotny. Pro testování byla použita tato živná média:

Malt agar M253 (HiMedia), pH 5,5 ±0,2

A v'

Czapek Malt agar M732 (HiMedia), pH 6,8 ±0,2 i

Λ

JM3 agar: smícháno 40 ml zahuštěné syrovátky RO pH 6,5 se 150 ml deionizované vody a 10 g ječné mouky, směs rozvařena na homogenní směs, ochlazena na 25 až 28 °C, pH znovu upraveno 40 % (m/v) NaOH na 6,5, sterilace 110 °C, 20 minut, sterilní směs smíchána 12:5 s rozvařeným 3\% agarem.

Testování antifungálních vlastností

V případě testování účinnosti bb supematantů byly spory plísní v živných médiích nality na Petriho misky o průměru 18 cm a po zatuhnutí byly v agaru vykrojeny jamky o průměru 8 mm. Do jamek bylo pipetováno 200 μΐ příslušného bb supematantu a po 4 hodinách skladování při 4 až 6 °C byly misky kultivovány při 25 °C po dobu 5 dní. V případě testování živých buněk (komplet) bylo na misku pipetováno nejprve 1.5 ml kompletu následně zalitého 15 ml suspenze spor v živné půdě. Kontrolní misky obsahovaly přídavek sterilní kyselé syrovátky pH 4,4 až 4,5 a neutralizované syrovátky s pH upraveným NaOH na 7,0. Vzhled misek byl hodnocen vizuálně po 5 dnech porovnáním růstu hub na plotnách s testovaným kmenem a kontrolních obsahujících kyselou nebo neutralizovanou syrovátku (1 úplná inhibice, 2 výrazná inhibice, 3 mírná inhibice, 4 bez inhibice) a zároveň byla pořizována fotografická dokumentace.

V případě bezbuněčných supematantů byla pozorována jen mírná inhibice růstu Penicillium nalgiovensis CCDM 329 na Malt i Czapek Malt agaru kmenem Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii CCM 8774. Stejný kmen způsobil výraznou inhibici růstu testované kultury Penicillium camemberti CCDM 767 a 769 na Malt agaru, zatímco na Czapek Malt agaru nebyla pozorována žádná inhibice. Naopak v případě

O * » >

* 4

Pen. roqueforti PA1 byla u tohoto kmene pozorována výrazná inhibice růstu na Czapek Malt agaru, zatímco na Malt agaru byl neúčinný. V případě přídavku živých buněk bakterií propionového kvašení jsou výsledky uvedeny v tab. 1.

Tabulka 1 Antifungální aktivita živých buněk různých kmenů propionibakterii vůči vláknitým houbám z rodu Penicillium

Indikátorové kultury	\| Penicillium roqueforti PA 1 \|	Penicillium nalgiovensis CCDM 329 \|	Penicillium camemberti CCDM 797+799
Testované kmeny	Czapek Malt.	Malt	JM3	Czapek Malt.	Malt	JM3 !	Czapek Malt.	Malt	JM3 I
CCM 8774	4	4			^Z		-----?-----		4

Legenda: 1 úplná inhibice, 2 výrazná inhibice, 3 mírná inhibice, 4 bez inhibice

Podobné výsledky byly získány Gwiazdowska a kol. v publikaci Pol. J. Microbiol. 2008,57, 205 až 212, pro houby zrodů Fusarium a Alternaria, kde byly živé buňky také účinnější než bezbuněčné supematanty.

Pro výrobu kyseliny propionové a fermentu se tento kmen použije samostatně nebo ve směsi s jinými kmeny, s výhodou pak např. s kmenem bakterií Lactobacillus rhamnosus VT1 a/nebo kvasinkou Kluyveromyces marxianus CCDM 269 v libovolném poměru.

Následné příklady provedení kmen podle vynálezu pouze dokládají, ale neomezují.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Startovací propionová kultura uchovávaná v lyofilizováném stavu se obnoví v 16 % (m/v) b

odstředěném mléce s 0,5 % (m/v) kvasničného extraktu a kultivována při 30 °C do sražení mléka. Získaná kultura je použita k inokulaci sterilní syrovátky (kyselá syrovátka o sušině 16 až 18 % neutralizovaná NaOH na pH 6,5 až 7,0 před sterilací) s přídavkem 2 % sterilního uhličitanu vápenatého. Po 48 až 72 h statické kultivace při 30 °C je touto kulturou zaočkován 25 1 fermentor obsahující 20 kg kyselé mikrofíltrované syrovátky o sušině 16 až 18 % (m/v) obsahující cca 2 % (m/v) kyseliny mléčné v množství 5 až 10 % inokula. Syrovátka během fermentace se kontinuálně neutralizuje na pH 6.5 až 7,0 hydroxidem sodným a je míchána (50 ot./min). Po dvou dnech fermentace při 30 °C je zahájeno kontinuální odebírání fermentu a je přidávána mikrofiltrovaná syrovátka o sušině 14 až 18 % a obsahem 4 až 10 % (m/v) mléčnanu sodného, vápenatého, amonného či jejich směsi ve stejném objemu jako odebíraný ferment. V průběhu fermentace jsou průběžně odebírány vzorky a sledován obsah antifungálně účinných látek. Fermentace je ukončena po dosažení minimálního obsahu 3 % kyseliny propionové (m/v).

. t « tki*···* , ; i i < í · t .£«·«·«* 4 « « « · · · · ♦ · »

Příklad 2

Ferment se připraví stejně jako v příkladu 1, s tím rozdílem, že místo přídavku mikrofiltrované syrovátky o sušině 14 až 18 % (m/v) a obsahu 4 až 10 % (m/v) mléčnanu sodného, vápenatého, amonného či jejich směsi je ferment po 24 až 48 h fermentace zaočkován 0,01 % (v/v) bakteriální kultury Laktobacillus rhamnosus VT1 schopné produkce kyseliny mléčné z laktózy obsažené v syrovátce a ferment není kontinuálně odebírán.

Příklad 3

Ferment se připraví stejný postupem jako v příkladu 2, s tím rozdílem, že zároveň s propionovou kulturou je zaočkován kvasinkou Kluyveromyces marxianus CCDM 269 v dávce 1 až 5 % (v/v).

Příklad 4

Ferment se připraví postupem podle příkladu 2 a 3, s tím rozdílem, že kontinuální neutralizace je nahrazena jednorázovým přídavkem max. 5 % (m/v) uhličitanu vápenatého nebo směsi max. 5 % (m/v) uhličitanu vápenatého a max. 0,5 % (m/v) trimagnesium fosfátu.

Příklad 5

Ferment získaný postupem podle příkladu 1 až 4 se smíchá s fermentovanou syrovátkou obsahující 6 až 10 % (m/v) kyseliny mléčné v takovém poměru, aby obsah kyseliny propionové ve výsledné směsi byl vyšší než 3 % (m/v) a zároveň pH fermentu se pohybovalo v hodnotách pod 5,5.

Příklad 6

Z fermentu získaného podle příkladu 4 se odstraní mikrobiální buňky procesem mikrofiltrace s využitím membrán o porozitě 0,8 až 1,4 pm při teplotě 25 až 50 °C.

Příklad 7

Ferment získaný podle příkladů 1 až 6 se zahustí na vakuové odparce při teplotě 60 až 70 °C na sušinu 20 až 50 % hm.

• ♦

Příklad 8

Ferment získaný podle příkladů 1 až 6 se usuší na sprej ové sušárně nebo procesem lyofilizace za těchto podmínek mražení -40 °C, sušení 0,4 mbar, dosoušení 30 °C, 0,02 mbarma sušinu

A minimálně 98 % hm.

Příklad 9

Ferment získaný podle příkladů 5 až 8 je použit jako náhrada používaných konzervantů do receptury na přípravu toastového chleba. Dávka fermentu se vypočte tak, aby po upečení obsah propionátu v chlebu nepřesáhl 3 g/ikg. Výsledkem použití fermentu bylo prodloužení trvanlivosti toastového chleba o 4 až 6 dnů oproti komerčně používanému propionátu vápenatému (tabulka 2).

Tabulka 2: Porovnání trvanlivosti toastového chleba při použití různých receptur (1)

	Obsah PA (%)	m* (g)	Voda do těsta (g)	Droždí čerstvé (g)	Teplota těsta (°C)	pH těsta	Kynutí (min.)	Dny do výskytu plísně	0
kontrola	0	0	810	41	30,7	5,84	60	5	6	6	6	5,75
propionát vápenatý	100	6,3	810	50	31,0	5,86	60	12	13	13	14	13
Ferment MF 4 A	5,31	118	692	50	31,8	5,80	75	14	15	>21	>21	17,75
Odparka (pokusí)	7,69	82	728	50	31,1	5,88	75	15	>21	>21	>21	19,5

*m(g)=navážka konzervantů do těsta

Příklad 10

Ferment získaný podle příkladu 5 až 8 se použije ve formě aerosolu pro nástřik na povrch chleba za horka po vyndání z pece nebo po vychladnutí.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Průmyslový kmen bakterie Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii, uložený v České sbírce mikroorganismů Přírodovědecké fakulty Masarykovy university, Kamenice 5, Brno pod číslem 8774, který produkuje kyselinu propionovou a další antifungálně účinné metabolity během kultivace v syrovátce.
2. Použití kmene podle nároku \f k výrobě fermentu, při kterém se fermentuje neutralizovaná kyselá syrovátka.
3. Použití kmene podle nároku 1/k výrobě fermentu, při kterém se fermentuje neutralizovaná kyselá syrovátka, a fermentace probíhá směsí alespoň dvou kmenů mikroorganismů.
4. Způsob úpravy fermentu získaného podle nároku 2 nebo 3, spočívající v koncentraci účinných látek zahuštěním na vakuové odparce nebo sušením.

y
5. £působ použití fermentu získaného podle nároku 2 až 4jako náhrady konzervantů do těsta pro přípravu toastového chleba.
6. Způsob použití fermentu získaného podle nároku 2 až 4jako náhrady konzervantů nástřikem na povrch pekárenských výrobků.