CZ20032697A3 - Protilátka proti osteopontinu a farmaceutický prostředek - Google Patents
Protilátka proti osteopontinu a farmaceutický prostředek Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20032697A3 CZ20032697A3 CZ20032697A CZ20032697A CZ20032697A3 CZ 20032697 A3 CZ20032697 A3 CZ 20032697A3 CZ 20032697 A CZ20032697 A CZ 20032697A CZ 20032697 A CZ20032697 A CZ 20032697A CZ 20032697 A3 CZ20032697 A3 CZ 20032697A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- antibody
- opn
- osteopontin
- integrin
- fragment
- Prior art date
Links
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 title claims description 18
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 title claims description 18
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 1
- 101000613820 Homo sapiens Osteopontin Proteins 0.000 claims abstract description 220
- 102100040557 Osteopontin Human genes 0.000 claims abstract description 215
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 37
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 claims abstract description 26
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 57
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 53
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 48
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 26
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 21
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 108010031258 SVVYGLR peptide Proteins 0.000 claims description 20
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 19
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 19
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 14
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 11
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 claims description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 claims 4
- 108010041012 Integrin alpha4 Proteins 0.000 claims 1
- 208000023004 optic perineuritis Diseases 0.000 description 282
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 39
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 38
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 28
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 28
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 25
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 25
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 23
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 23
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 12
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 12
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 11
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 11
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 11
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 11
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 10
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 101100518500 Homo sapiens SPP1 gene Proteins 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- VLARLSIGSPVYHX-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C(=O)C=CC1=O VLARLSIGSPVYHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 7
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 7
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 6
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 6
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 6
- 108010053299 glycyl-arginyl-glycyl-aspartyl-seryl-proline Proteins 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 238000001061 Dunnett's test Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 230000003286 arthritogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 5
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 5
- 208000010729 leg swelling Diseases 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 5
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 4
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 4
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 4
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 4
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 238000003436 Schotten-Baumann reaction Methods 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 230000023578 negative regulation of cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 210000000707 wrist Anatomy 0.000 description 3
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NFDXQGNDWIPXQL-UHFFFAOYSA-N 1-cyclooctyldiazocane Chemical compound C1CCCCCCC1N1NCCCCCC1 NFDXQGNDWIPXQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QDFXRVAOBHEBGJ-UHFFFAOYSA-N 3-(cyclononen-1-yl)-4,5,6,7,8,9-hexahydro-1h-diazonine Chemical compound C1CCCCCCC=C1C1=NNCCCCCC1 QDFXRVAOBHEBGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WADSJYLPJPTMLN-UHFFFAOYSA-N 3-(cycloundecen-1-yl)-1,2-diazacycloundec-2-ene Chemical compound C1CCCCCCCCC=C1C1=NNCCCCCCCC1 WADSJYLPJPTMLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 208000009137 Behcet syndrome Diseases 0.000 description 2
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 101100462201 Mus musculus Opn4 gene Proteins 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001104043 Syringa Species 0.000 description 2
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 208000018359 Systemic autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000012973 diazabicyclooctane Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- -1 fluorescein isocyanate Chemical class 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 2
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NTEDOEBWPRVVSG-FQUUOJAGSA-N (2s)-1-[(2r)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O NTEDOEBWPRVVSG-FQUUOJAGSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 1,1-Dichloroethane Chemical compound CC(Cl)Cl SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl carbonochloridate Chemical compound CC(C)COC(Cl)=O YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N Dimethoxyethane Chemical compound COCCOC XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001135770 Homo sapiens Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 101001135995 Homo sapiens Probable peptidyl-tRNA hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 101000703512 Homo sapiens Sphingosine-1-phosphate phosphatase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010041341 Integrin alpha1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008607 Integrin beta3 Human genes 0.000 description 1
- 108010020950 Integrin beta3 Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000720288 Macroschisma Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101000648740 Mus musculus Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- JLTDJTHDQAWBAV-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylaniline Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=C1 JLTDJTHDQAWBAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100032842 Oryza sativa subsp. japonica RA16 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100193637 Oryza sativa subsp. japonica RAG2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108700011066 PreScission Protease Proteins 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 1
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101100020289 Xenopus laevis koza gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid trimethyl ester Natural products COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002905 effect on arthritis Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- XCPXPFNKTCFWTA-UHFFFAOYSA-N ethyl carbonobromidate Chemical compound CCOC(Br)=O XCPXPFNKTCFWTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RIFGWPKJUGCATF-UHFFFAOYSA-N ethyl chloroformate Chemical compound CCOC(Cl)=O RIFGWPKJUGCATF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N hexamethylphosphoric triamide Chemical compound CN(C)P(=O)(N(C)C)N(C)C GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 102000058004 human PTH Human genes 0.000 description 1
- 102000051312 human SPP1 Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 108010024069 integrin alpha9 Proteins 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000012332 laboratory investigation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- QQHNGZNHRRLNKI-UHFFFAOYSA-N methyl carbonobromidate Chemical compound COC(Br)=O QQHNGZNHRRLNKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMJHPCRAQCTCFT-UHFFFAOYSA-N methyl chloroformate Chemical compound COC(Cl)=O XMJHPCRAQCTCFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002464 muscle smooth vascular Anatomy 0.000 description 1
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000004526 pharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011181 potassium carbonates Nutrition 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 201000008171 proliferative glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
- C07K16/2842—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
- C07K16/2848—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Protilátka proti osteopontinu a farmaceutický prostředek • · • · • · • · ·
I · · * /Α
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká protilátky proti lidskému osteopontinu a způsobu léčení autoimunitních onemocnění, revmatismu a revmatoidní artritidy s použitím protilátky.
Dosavadní stav techniky
Osteopontin (dále označovaný jako „OPN“) je kyselý, vápník vázající glykoprotein, který je ve velkém množství přítomen v kostech.
Je známo, že alternativním sestřihem se přirozeně vytvářejí tři typy isoforem lidského OPN, totiž osteopontin-a (dále označovaný jako „OPN-a“), osteopontin-b (dále označovaný jako „OPN-b“) a osteopontin-c (dále označovaný jako „OPN-c“) (Y. Saitoh a další, (1995): Laboratory Investigation, 72, 55 - 63). Předpokládá se, že v rámci těchto látek má prekurzor OPN-a aminokyselinovou sekvenci ukázanou jako SEQ ID No. 1 dále ve výpisu sekvencí, kde se při sekreci odštěpuje signální peptid, takže se získá zralá forma OPN-a v rozmezí aminokyselin I17-N314. Navíc se zralý OPN štěpí na Ckonci na 168. zbytku argininu thrombinem z živého organismu na dva fragmenty, N-koncový a C-koncový.
Výše popisovaný OPN má různé fyziologické, patologicky významné funkce, např. adhezi buněk, migraci buněk, tumorogenezi, imunitní odpověď a inhibici cytolýzy zprostředkované komplementem. Tyto různé funkce zprostředkují různé typy receptorů na povrchu buněk. OPN v sobě obsahuje sekvenci RGD (např. OPN-a má tuto sekvenci od zbytku v poloze 159 do zbytku v poloze 161). Hlavními receptory OPN jsou druhy integrinů rozpoznávající sekvenci RGD, jako jsou otV(33, otVpi a αΛ/βδ; Konkrétně typy integrinů aVp3, aVpi a aVp5 • · · · ·
- 2 • · zprostředkují adhezi buněk na buňky hladkého svalstva cév. α\/β3 se dále účastní migrace makrofágů, lymfocytů, endoteliálních buněk, buněk hladkého svalstva apod.
Dalšími výzkumy bylo zjištěno, že OPN se také váže prostřednictvím sekvence SWYGLR na typy integrinů α9β1, α4β1 a α4β7, a že je také rozdíl ve způsobu vazby, takže α4β1 se váže na oba OPN ještě nerozštěpené thrombinem (non-cleavage-typ OPN) a N-koncový fragment OPN rozštěpeného thrombinem (cleavage-type OPN), zatímco α9β1 se váže pouze na OPN rozštěpená thrombinem (Y. Yokosaki a další, (1999): The Journal of Biological Chemistry 274, 36328 - 36334/P. M. Green a další, (2001): FEBS Letters 503, 75 79/S. T. Barry a další, (2000): Experimental Cell Research 258, 342 351). Tyto integrinové podjednotky a9 a cc4 nebo integrinové podjednotky β1 a β7 mají vysokou podobnost co se týče aminokyselinové sekvence. Druhy integrinů α4β1 a α4β7 se dále nacházejí hlavně v lymfocytech a monocytech, zatímco v neutrofilech se tyto druhy integrinů exprimují velmi málo. Alternativně se α9β1 silně exprimuje selektivně v neutrofilech a má funkce nezbytné pro migraci neutrofilů přes VCAM-1 a Tenascin-C. Tento integrin je dále různě exprimován ve svalových buňkách, epiteliálních buňkách a jaterních buňkách. Jak bylo popsáno výše, cytoplasmatické domény integrinových podjednotek a4 a cc9 společně podporují migraci leukocytů do míst zánětu a agregaci v těchto místech prostřednictvím individuálních biochemických cest přenosu signálů mezi buňkami, které se od sebe nepatrně liší, pro zesílení jejich infiltračních aktivit. Tímto způsobem se integrinové podjednotky účastní různých zánětlivých reakcí.
Jak bylo popsáno výše, různé typy integrinů podporují migraci leukocytů a účastní se tedy zánětlivých reakcí. Proto mohou být farmaceutické látky s inhibičními účinky na tyto aktivity integrinů potenciálně využity jako protizánětlivá léčiva. Například integrin α\/β3 ··· · · · · ·· · ····· · · ·· · • · · · · · · « · ·
Λ ··· · · ···· ·· ··» ··· ··· «· ·· se exprimuje v osteoklastech, cévních endoteliálních buňkách, buňkách hladkého svalstva apod. Nyní se vyvíjí protilátka proti αΛ/β3, která bude inhibovat vazbu mezi integrinem α\/β3 a jeho různými vazebnými ligandy, což může potenciálně vést např. k potlačení poškození kloubů.
Protože receptory ze skupiny integrinů se běžně vyskytují v různých tkáních a zajišťují nezbytné funkce pro řízení vitálních aktivit, použití protilátek proti integrinů pro léčení revmatoidní artritidy a osteoartritidy může vyvolávat stejnou inhibici i na jiných místech a může tedy způsobovat nežádoucí účinky.
WO 01/71358 dále popisuje způsob screeningu na látku inhibující vazbu mezi a4 integrinem a osteopontinem a způsob léčení zánětlivých onemocnění s použitím látky získané tímto screeningem.
Byly nalezeny různé faktory, které se účastní patogeneze revmatoidní artritidy. Tyto objevy jsou popisovány v četných publikacích. Tato zjištění však nejsou spolehlivá. Dosud známé způsoby léčení založené na těchto poznatcích mají vedlejší účinky a nejsou v podstatě uspokojivé.
Proto je nezbytné s konečnou platností objasnit patogenezi revmatoidní artritidy a poskytnout lepší způsoby léčení tohoto onemocnění. Řešení těchto problémů je cílem předkládaného vynálezu.
Revmatoidní artritidy se obtížně odlišuje od osteoartritiy. Dalším účelem vynálezu je tedy poskytnutí diagnostické metody.
Podstata vynálezu
Autoři vynálezu zjistili, že se vyskytují vyšší koncentrace OPN v tekutinách kloubních dutin pacientů s revmatismem a pacientů s osteoartritidou. Dále autoři vynálezu nalezli poprvé zvýšený poměr
N-koncového fragmentu thrombinem rozštěpeného typu v celkovém OPN u pacientů s revmatismem. Autoři tedy uvažují, že OPN by mohl mít velký význam při nástupu těchto onemocnění. Jak je popsáno v následujícím referenčním příkladu, autoři vynálezu dále ověřili tato zjištění pomocí experimentu na myších s nefunkčním OPN.
Autoři vynálezu dále připravili protilátky, které individuálně rozpoznávají N-koncový fragment a C-koncový fragment OPN rozštěpeného thrombinem. Experimenty s těmito protilátkami bylo prokázáno, že N-koncový fragment OPN rozštěpeného thrombinem se vyskytoval ve vyšší koncentraci zvláště v tekutinách kloubních dutin pacientů s revmatoidní artritidou.
Autoři vynálezu zaměřili svou pozornost na společnou přítomnost sekvence RGD a sekvence SVVYGLR, obě rozpoznávané integrinem lidského typu, v N-koncovém fragmentu v takto vysokých koncentracích, jak bylo pozorováno u pacientů s revmatoidní artritidou. Autoři předpokládali, že protilátka současně blokující obě tyto sekvence by široce inhibovala vazbu mezi OPN a integrinem, takže taková protilátka by mohla být účinná pro léčení revmatoidní artritidy a osteoartritidy.
OPN se dále vyskytuje v ledvinách, placentě, vaječnících, mozku, kůži apod., ale exprimuje se hlavně v kostní tkáni. Autoři předpokládají, že pro léčení revmatoidní artritidy by byla vazba mezi OPN a integrinem s výhodou blokována způsobem specifičtějším pro místo OPN. Protože zánětu se společně účastní různé typy integrinů, mohlo by být účinné širší blokování vazby těchto různých typů integrinů.
Autoři vynálezu proto připravili protilátku inhibující vazbu mezi sekvencí RGD lidského OPN a integrinem a vazbu mezi sekvencí SVVYGLR lidského OPN a integrinem a potom ověřili její účinky při experimentech s adhezí buněk, migrací buněk apod. Autoři vynálezu dále izolovali protilátku proti syntetickým peptidům odpovídajícím
- 5 • · těmto vnitřním sekvencím myšího OPN pro testování účinnosti této protilátky jako léčiva s použitím myšího modelu artritidy.
Protože myší OPN má sekvence RGD a SLAYGLR rozpoznávané myším integrinem na polohách homologních s lidským OPN z hlediska aminokyselinové sekvence, byla izolována protilátka M5 současně blokující tyto sekvence. Bylo ověřeno, že vazba protilátky M5 s myším OPN a produkty jeho štěpení thrombinem byla inhibována peptidem GRGDSP včetně místa sekvence RGD, a že protilátka M5 inhibovala migraci monocytů aktivovaných TNF-a odvozených z myší sleziny. Bylo také pozorováno, že protilátka M5 potlačuje poškození kostí při testování v systému orgánové kultivace lebeční části calvarium myší. Dále bylo potvrzeno, že tato protilátka má zřejmé léčebné účinky při podávání v modelu kolagenem vyvolané myší artritidy.
Výše uvedené výsledky ukazují, že protilátka současně blokující vazbu s lidským integrinem na sekvencích RGD a SVVYGLR inhibuje vazbu mezi OPN a integrinem, a je proto účinná pro léčení revmatoidní artritidy, a že tato protilátka bude účinkovat pravděpodobně nejen na revmatismus jako je juvenilní kloubní revmatismus a chronický revmatismus, ale také na psoriatickou artritidu a lupénku. Chronické odmítání po transplantacích orgánů charakteristicky zahrnuje vaskulární a bronchiální okluzivní poruchy. Jejich histologická vyšetření ukazují, že z důvodů spouštění tvorby cytokinů a růstových faktorů a poškození cévních endoteliálních buněk prostřednictvím aktivace T-buněk a makrofágů, a z důvodů vyvolání fibrinogeneze a dalších jevů prostřednictvím prolíferace buněk hladkého svalstva cév, dochází pravděpodobně k uzavření cév (P. Freese a další, (2001): Nephrol Dial Transplant, 16, 2401 - 2406/J. R. Waller a další, (2001): British Journal of Surgery, 88, 1429 - 1441/S. R. Lehtonen a další, (2001): Transplantation, 72, 1138 - 1144). Uvádí se, že OPN funguje jako protein nezbytný pro aktivaci makrofágů a fibrinogenezi buněk hladkého svalstva cév (A. O’Regan a další, (2000): Int. J. Exp. Pathol., • · · ·
81, 373 - 390). Protilátka inhibující OPN podle vynálezu potlačující migraci monocytů a neutrofilů tedy bude pravděpodobně inhibovat průběh této fibrinogeneze. Tato protilátka bude tedy potlačovat chronické odmítání po transplantaci orgánů, což v důsledku povede k adhezi orgánů. Dále bude mít tato protilátka účinky při léčení autoimunitních onemocnění včetně systémových autoimunitních onemocnění, erythematodes, zánětu spojivek, Behcetovy nemoci, mnohočetné myositidy, proliferativní glomerulonefritidy, sarkoidózy apod.
Jinými slovy, vynález poskytuje protilátku proti osteopontinu inhibující vazbu mezi integrinem rozpoznávající sekvenci RGD a OPN nebo její fragment a také široce inhibující vazbu mezi integrinem rozpoznávajícím sekvenci SVVYGLR nebo odpovídající sekvenci a osteopontinem nebo jeho fragmentem.
Vynález dále poskytuje léčivo pro léčení autoimunitních onemocnění, revmatismu a revmatoidní artritidy, přičemž tato léčiva jako účinné složky obsahují protilátku proti osteopontinu.
Vynález dále poskytuje způsob léčení autoimunitních onemocnění, revmatismu a revmatoidní artritidy, který zahrnuje podávání protilátky proti osteopontinu pacientům s revmatismem a revmatoidní artritidou, pro inhibici vazby mezi sekvencí RGD osteopontinu a integrinem a/nebo pro inhibici vazby mezi sekvencí SVVYGLR a integrinem.
Vynález ještě dále poskytuje diagnostický prostředek pro zjištění revmatismu a způsob diagnostiky revmatismu využívající protilátku proti osteopontinu.
Podrobný popis vynálezu
Protilátka proti osteopontinu (označovaná jako „protilátka inhibující OPN“) inhibující vazbu mezi integrinem rozpoznávající
- 7 ·· ···· · · ·· ···· • · · ·· · · ·· · • · · · · · · · · ·
sekvenci RGD a OPN nebo její fragment a také inhibující vazbu mezi integrinem rozpoznávajícím sekvenci SVVYGLR nebo odpovídající sekvenci a OPN nebo jeho fragmentem může být jakákoli z protilátek inhibující vazbu integrinů rozpoznávajícího sekvenci RGD, například ανβ1, ανβ3, a ανβ5, s OPN-a, OPN-b, OPN-c nebo jejich N-koncovým fragmentem, a také inhibující vazbu integrinů rozpoznávajícího sekvenci SVVYGLR, např. α9β1, α4β1 a α4β7 s OPN-a, OPN-b, OPNc nebo jeho N-koncovým fragmentem. Sekvence SVVYGLR nebo odpovídající sekvence mají následující významy: sekvence SVVYGLR znamená sekvenci od šeřinu v poloze 162 do argininu v poloze 168 lidského OPN, přičemž odpovídající sekvence znamená sekvenci odpovídající SVVYGLR u typů OPN jiných savců, jako je například vepřová sekvence SVVYGLR identická s lidskou sekvencí, SVAYGLR osla, SLAYGLR myši a krysy, SVAYGLK vepře a SVAYRLK králíka. Protilátka inhibující OPN podle vynálezu může být jakákoli z protilátek, která si zachová tyto vlastnosti, přičemž způsob přípravy protilátky není konkrétně vymezen. Protilátka inhibující OPN může být připravena použitím například OPN-a, OPN-b, OPN-c, nebo jejich Nkoncového fragmentu, nebo peptidu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci RGDSVVYGLR nebo její odpovídající sekvenci (dále označováno jako „peptid příbuzný OPN“) jako antigenu. Zde uváděný fragment OPN zahrnuje fragmenty OPN vytvořené štěpením OPN proteínázami apod., a jde např. o fragment získaný štěpením thrombinem.
Protilátka inhibující OPN se s výhodou připravuje s použitím peptidu obsahujícího sekvenci RGDSVVYGLR jako antigenu. Výhodněji se protilátka inhibující OPN připravuje např. použitím peptidu (VDTYDGRGDSVVYGLRS) jako antigenu obsahujícího obě tyto sekvence následující za sebou, přičemž sekvence začíná od valinu v poloze 153 a končí na šeřinu v poloze 169 v případě OPN-a, a následným zpracováním peptidu obecnými metodami. Pro zvýšení
- 8 antigenicity se s výhodou používá peptid příbuzný OPN navázaný na biopolymerní sloučeninu.
Při výzkumech onemocnění souvisejících s OPN s použitím myši jako experimentálního zvířete se s výhodou používá protilátka inhibující OPN proti myšímu OPN. Tato protilátka se s výhodou připravuje použitím peptidů obsahujícího sekvenci RGDSLAYGLR jako antigenů.
Příklady biopolymerní sloučeniny pro navázání na peptid příbuzný OPN zahrnují například látky Macroschisma hemocyanin (dále označovaný jako „KLH“), ovalbumin (dále označovaný jako „OVA“), bovinní sérový albumin (dále označovaný jako „BSA“), králičí sérový albumin (dále označovaný jako „RSA“) a thyroglobulin. Mezi těmito látkami jsou výhodnější KLH a thyroglobulin.
Peptid příbuzný s OPN a biopolymerní sloučenina jsou svázány známými způsoby, například potupem využívajícím směsného anhydridu kyseliny (například B. F. Erlanger a další, (1954): J. Biol. Chem. 234, 1090 - 1094) nebo postupu využívajícího aktivovaný ester (A. E. Karu a další, (1994): J. Agric. Food Chem. 42, 301 - 309).
Směsný anhydrid používaný v postupu využívajícím směsného anhydridu může být získán vystavením peptidů příbuzného OPN obecné Schotten-Baumannově reakci a potom reakcí s biopolymerní sloučeninou pro přípravu systému peptid - polymerní sloučenina. Jako haloformátový ester používaný při způsobu využívajícím směsný anhydrid kyselin se může použít např. methylchloroformát, methylbromoformát, ethylchloroformát, ethylbromoformát, isobutylchloroformát apod. Poměr peptidů, haloformátového esteru a polymerní sloučeniny pro použití podle předkládaného vynálezu se s výhodou volí v širokém rozmezí.
Schotten-Baumannova reakce se zde provádí v přítomnosti bazické sloučeniny. Bazická sloučenina pro použití při reakci zahrnuje sloučeniny běžně používané při Schotten-Baumannově reakci, např.
- 9 organické báze jako triethylamin, trimethylamin, pyridin, dimethylanilin,
N-methylmorfolin, diazabicyklononen (DBN), diazabicykloundecen (DBU), diazabicyklooktan (DABCO) apod., a anorganické báze jako je uhličitan draselný, uhličitan sodný, hydrogenuhličitan draselný, hydrogenuhličitan sodný apod.
Reakce se dále provádí při teplotách -20 °C až 100 °C, s výhodou 0 °C až 50 °C. Doba reakce je přibližně 5 min až 10 h, s výhodou 5 min až 2 h.
Reakce mezi získaným směsným anhydridem kyselin a biopolymerní sloučeninou se obecně provádí při -20 °C až 150 °C, s výhodou 0 °C až 100 °C, po dobu přibližně 5 min až 10 h, s výhodou 5 min až 5 h. Metoda směsného anhydridu kyselin se obecně provádí v rozpouštědle. Jako rozpouštědlo může být použito např. kterékoli rozpouštědlo běžně používané při metodě směsného anhydridu kyselin, např. halogenované uhlovodíky jako je dichlormethan, chloroform a dichlorethan; aromatické uhlovodíky jako je benzen, toluen a xylen; ethery jako je diethylether, dioxan, tetrahydrofuran a dimethoxyethan; estery jako je methylacetát a ethylacetát; neprotonová polární rozpouštědla jako je N,N-dimethylformamid, dimethylsulfoxid a hexamethylfosfotriamid; apod.
Proces aktivace esteru se obecně provádí následujícím způsobem. Nejprve se rozpustí peptid příbuzný s OPN v organickém rozpouštědle pro reakci s N-hydroxysukcinimidem v přítomnosti vazebného činidla, za získání esteru aktivovaného Nhydroxysukcinimidem.
Jako vazebné činidlo se používají obecná vazebná činidla pro rutinní použití při kondenzačních reakcích, jako je například dicyklohexylkarbodiimid, karbonyldiimidazol a ve vodě rozpustný karbodiimid. Jako organické rozpouštědlo se může použít např. N,Ndimethylformamid (DMF), dimethylsulfoxid a dioxan. Molární poměr peptidů a vazebného činidla jako je N-hydroxysukcinimid pro použití
- 10 při reakci je s výhodou 1 : 10 až 10:1, nejvýhodněji 1:1. Reakční teplota je 0 °C až 50 °C, s výhodou 22 °C až 27 °C, přičemž reakční doba je 5 min až 24 h, s výhodou 1 h až 2 h. Vhodná reakční teplota je vyšší než teploty tání jednotlivých složek a nižší než teploty varu jednotlivých složek.
Po provedení vazebné reakce se reakční roztok přidá k roztoku s rozpuštěnou biopolymerní sloučeninou pro uskutečnění reakce. V případě, že biopolymerní sloučenina obsahuje volnou aminovou skupinu, se například vytvoří amidová vazba mezi aminoskupinou a karboxylovou skupinou peptidu. Reakční teplota je 0 °C až 60 °C, s výhodou 5 °C až 40 °C, ještě výhodněji 22 °C až 27 °C, a doba reakce je 5 min až 24 h, s výhodou 1 h až 16 h, ještě výhodněji 1 h až 2 h.
Reakční produkt mezi peptidem příbuzným s OPN a biopolymerní sloučeninou vytvořený tímto způsobem se čistí dialýzou nebo použitím odsolovací kolony apod., pro získání produktu, kterým je peptid příbuzný s OPN navázaný na biopolymerní sloučeninu (jednoduše dále označovaný jako „navázaný produkt“).
Nyní bude popsán způsob přípravy protilátky s použitím navázaného produktu získaného výše popsaným způsobem jako antigenu a imunologický test s využitím této protilátky. Pro přípravu protilátky mohou být použity známé metody, které se popisují např. v Žoku Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimental Lecture Series) a Meneki Seikagaku Kenkyu Ho (Immuno-Biochemistry Research Method) (Nihon Seikagaku Gakkai hen (Japan Biochemical Association, ed.)).
Pro přípravu polyklonální protilátky použitím navázaného produktu podle vynálezu se zvíře imunizuje navázaným produktem a potom se odebírá protilátka.
Konkrétněji se např. navázaný produkt, jako je navázaný produkt peptid příbuzný s OPN-thyroglobulin nejprve rozpustí v pufru s fosforečnanem sodným (dále označovaný jako „PBS“), který se ·· ···· · · · · · · · · • · · ·· · · ·· * ····· · · ·· · ·· ·· · . · · · ·
.. ·· · · · ·.·. - 11 - ...............
potom smísí s Freundovým kompletním adjuvans nebo Freundovým nekompletním adjuvans, nebo pomocnou látkou jako je hydroxid hlinitý. Získaná směs se použije jako imunogen pro imunizaci savce.
Pro imunizaci může být použito jakékoli zvíře běžně používané v oboru, jako je např. myš, krysa, králík, koza a kůň. Podání imunogenu pro imunizaci se může uskutečnit např. subkutánní injekcí, intraperitoneální injekcí, intravenózní injekcí a intramuskulární injekcí. Výhodná je subkutánní injekce nebo intraperitoneální injekce. Imunizace se může provést jednou nebo vícekrát ve vhodných intervalech, s výhodou v intervalu 1 týden až 5 týdnů.
Obecně se potom imunizovanému zvířeti odebere krev, ze které se oddělí sérum. Čištěním frakce polyklonální protilátky se může izolovat protilátka inhibující OPN.
Obecně se dále může fúzovat imunitní buňka získaná imunizací zvířete navázaným produktem s myelomovou buňkou za vytvoření hybridomu. Odebíráním protilátky z kultury hybridomu se může izolovat protilátka inhibující OPN jako monoklonální protilátka.
Jestliže se protilátka podle vynálezu má používat při léčení zvířat včetně lidí, dává se přednost použití chimérní protilátky (viz zveřejněná evropská patentová přihláška EP 0125023) připravené takovou modifikací genetického inženýrství, aby získaná protilátka inhibující OPN měla stejnou konstantní oblast jako tato protilátka pro léčeného člověka nebo zvíře, nebo se používá animalizované protilátky (viz zveřejněná evropská patentová přihláška EP 0239400 nebo EP 045126). Dále se s výhodou používá monoklonální protilátka (protilátka živočišného typu pro jednotlivé druhy zvířat) (viz zveřejněná evropská patentová přihláška EP 0546073 nebo WO 97/07671) připravená použitím transgenního zvířete s uměle zavedeným genem, který se účastní tvorby protilátky u léčeného člověka nebo zvířete.
V případě, že léčeným pacientem je člověk, a zvířetem vytvářejícím protilátku inhibující OPN je myš, se s výhodou použije • · · · . 12 - .............
lidských/myších chimérních protilátek nebo humanizovaných protilátek. Výhodněji se do transgenního zvířete jako je myš zavede lidský gen, který se účastní tvorby protilátky, a zvíře se použije pro přípravu monoklonální protilátky lidského typu pro následné použití. Dále se pro tvorbu protilátky může s výhodou použít metoda exprese na povrchu fága (phage display).
Takto získaná protilátka inhibující OPN může být použita ve formě Fv, Fab nebo F(abj2 s rozpoznávacím místem antigenu vystřiženým z protilátky inhibující OPN proteázou apod.
Takto získaná protilátka inhibující OPN se dále v případě potřeby čistí a dále se formuluje známým způsobem do dávkových forem použitelných při léčení revmatoidní artritidy, revmatismu jako je juvenilní kloubní revmatismus a chronický revmatismus, psoriatická artritida a lupénka; potlačení chronického odmítání po transplantaci orgánů; a léčení autoímunitních onemocnění jako jsou systémová autoimunitní onemocnění, erythematodes, zánět spojivek, Behcetova nemoc, mnohočetná myositida, proliferativní nefritida vřeténkového (provazcového) typu a sarkoidóza.
Protilátka inhibující OPN podle vynálezu se s výhodou může používat jako léčivo pro léčení revmatismu nebo revmatoidní artritidy. Příklady dávkových forem obsahujících tato léčiva pro léčení revmatismu apod., zahrnují parenterální formy jako jsou injekce a infuze, které se s výhodou podávají intravenózní injekcí a subkutánní injekcí (pro použití jako terapeutický prostředek pro léčení autoimunitních onemocnění se používá např. výše uvedených příkladů). Pro formulaci mohou být dále použity farmaceuticky přijatelné nosiče a aditiva ve farmaceuticky přijatelném rozsahu v závislosti na dávkové formě.
Množství protilátky inhibující OPN přidávané do formulací se bude lišit v závislosti na vážnosti příznaků a věku pacienta, používané dávkové formě formulace nebo vazebném titru protilátky inhibující • ·
- 13 • · · ·
OPN apod. Vhodně se například používá množství přibližně 0,1 mg/kg až 100 mg/kg.
Protože protilátka inhibující OPN se jako účinná složka takto získaného terapeutického prostředku podle vynálezu silně váže na sekvence RGD a SVVYGLR v OPN, protilátka inhibující OPN bude pravděpodobně inhibovat vazbu mezi těmito oblastmi OPN a integrinem, čímž potlačí vypuknutí příznaků revmatismu, revmatoidní artritidy a dalších autoimunitních onemocnění.
Protože protilátka inhibující OPN podle vynálezu se specificky váže na místo OPN, nikoli na místo na integrinu, protilátka nebude pravděpodobně inhibovat jiné významné funkce integrinu, takže se očekává, že je možno předejít nepříznivým vedlejším účinkům.
Protilátka inhibující OPN podle vynálezu se také může používat pro účely screeningu na terapeutický prostředek proti autoimunitním onemocněním. Jak bylo popsáno výše, sloučenina inhibující vazbu mezi sekvencí RGD OPN a integrinem a inhibující vazbu mezi sekvencí SVVYGLR a integrinem, může sloužit jako léčivo autoimunitních onemocnění. Použitelnost látky hledané při screeningu (testovaná látka) jako terapeutického prostředku autoimunitních onemocnění tedy může být vyhodnocována v reakčním systému připraveném přidáním testované látky a protilátky inhibující OPN kompetitivním způsobem do testovacího systému v přítomnosti daných množství OPN a integrinu pro testování míry inhibice vazby mezi OPN a integrinem vztažené na množství použité protilátky inhibující OPN.
Podobně sloučenina inhibující vazbu mezi sekvencí RGD OPN a integrinem a sekvencí SVVYGLR a integrinem bude pravděpodobně sloužit jako léčivo pro revmatismus a revmatoidní artritidu. Jestliže se protilátka inhibující OPN používá pro sestavení stejného reakčního systému jako bylo popsáno výše, může se tento reakční systém použít také pro screening na revmatismus a revmatoidní artritidu.
• · · · • ·
- 14 Protilátka inhibující OPN podle vynálezu se dále může použít jako diagnostický prostředek revmatismu. Jak bylo popsáno výše, je prokázáno, že při artróze pacientů s revmatoidní artritidou se nacházejí vysoké koncentrace N-koncového fragmentu OPN rozštěpeného thrombinem. Při tomto testu může tedy sloužit OPN nebo jeho N-koncový fragment ve vzorku s použitím protilátky inhibující OPN pro diagnostiku revmatismu. Pro testy se používají následující obecné metody imunochemických testů [Hybridoma Method and Monoclonal Antibody, vydáno R&D Planning KK., str. 30 53, 5. března 1982], použitelné jsou radioimunologická metoda (RIA), ELISA (E. Engvall a další, (1980): Methods in Enzymol., 70, 419 439), metoda fluorescenčně značených protilátek, plaková metoda, tečkovací metoda, agregační metoda, Ouchterlonyho test apod.
Použitá metoda se může vhodně zvolit na základě různých hledisek. Z hlediska citlivosti, jednoduchosti apod. je výhodná metoda ELISA. Tato metoda výhodně zahrnuje imobilizaci protilátky inhibující OPN podle vynálezu na nosič a označení protilátky rozpoznávající místo na OPN odlišné od místa pro protilátku inhibující OPN podle vynálezu, pro detekci OPN nebo jeho N-koncového fragmentu. Tato metoda detekce tedy může být použita pro diagnostický prostředek revmatoidní artritidy.
Látka použitá pro značení protilátky může zahrnovat enzymy jako je křenová peroxidáza (dále označována jako „HRP“), alkalická fosfatáza (dále označovaná jako „AP“) apod., fluorescenční látky jako je fluoresceinisokyanát a rhodamin apod., radioaktivní látky jako je
I25
P, I apod., chemiluminiscenční látky apod. Dále se popisuje sendvičová metoda jako jedna ze specifičtějších detekčních metod jednotlivých isoforem OPN. Tento postup zahrnuje v prvním kroku (a) imobilizaci protilátky proti isoformě OPN podle vynálezu na nosiči, ve druhém kroku (b) blokování povrchu nosiče bez imobilizované protilátky materiálem, který nesouvisí s antigenem, např. proteinem.
• » ····· · · · · • · · · · · · · · • · · · · ···
-15- ..... ······ ..
Postup dále zahrnuje krok (c) přidání vzorku s obsahem různých koncentrací isoformy OPN k získané směsi pro vytvoření komplexu isoforma OPN - protilátka a krok (d) následného přidání značené protilátky proti isoformě OPN a ponechání protilátky navázat se na imobilizovaný komplex antigen - protilátka, a konečný krok (e) zjišťování množství značky navázané na nosič pro zjištění množství isoformy OPN přítomné ve volném stavu ve vzorku na základě předem připravené kalibrační křivky.
Nosič použitý v kroku (a) pro imobilizaci protilátky zahrnuje bez omezení jakékoli nosiče rutinně používané při metodách imunochemických testů. Nosič může být například polystyrénová 96jamková mikrotitrační destička nebo mikrotitrační destička s navázanými aminovými skupinami. Pro další imobilizaci protilátky se může například používat pufr obsahující protilátku přidaný k nosiči spolu s vhodnou dobou inkubace. Jako pufr se mohou používat známé pufry jako je např. 10 mM PBS. Koncentrace protilátky v pufru se může volit v širokém rozmezí, ale obecně je vhodná koncentrace přibližně 0,01 až 100 pg/ml a s výhodou 0,1 až 20 pg/ml. Množství pufru je 300 μΙ/jamku nebo méně, a s výhodou přibližně 20 až 150 μΙ/jamku, jestliže se jako nosič používá 96-jamková mikrotitrační destička. Inkubace se může provádět bez omezení například jako inkubace přes noc při teplotě 4 °C, která je obecně nejvhodnější.
Při kroku (b) blokování se nosič blokuje pro zabránění nespecifické adsorpce na nosič, protože na OPN přidávaném v následujícím kroku se může vyskytovat část potenciálně adsorbovatelná na nosič bez ohledu na reakci antigen - protilátka. Jako blokovací látka se používá například bovinní sérový albumin (BSA) a roztok odstředěného mléka. Mohou se také používat komerčně dostupné blokovací prostředky jako je Block-Ace (vyráběný firmou Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.; Code No. UK-25B). Konkrétně se bez omezení blokování provádí přidáním např. vhodného objemu činidla Block-Ace k části, která má na sobě imobilizovaný • · . 16 . ..... ........
antigen, provede se inkubace přes noc při přibližně 4 °C a získaná část se opláchne pufrem. Jako pufr se může použít např. pufr se složením 10 mM PBS, pH 7,2, 0,8 % (hmotn./obj.) NaCl, 0,02 % (hmotn./obj.) KCI a 0,02 % (obj./obj.) Tween 20.
V dalším kroku (c) se potom přivede do styku vzorek obsahující isoformu OPN s imobilizovanou protilátkou, aby se mohla isoforma OPN zachytit na imobilizované protilátce za získání komplexu imobilizovaná protilátka - isoforma OPN. Reakce se bez omezení provádí při teplotě přibližně 37 °C po dobu 1 h. Po ukončení reakce se nosič opláchne pufrem pro odstranění nereaktivních proteinů apod. Výhodný pufr použitelný při této reakci má složení 10 mM PBS, pH 7,2 a 0,05 % (obj./obj.) Tween 20.
V kroku (d) se dále vytvoří komplex imobilizovaná protilátka isoforma OPN - značená protilátka přidáním značené protilátky rozpoznávající jiný epitop na isoformě OPN zachycené na imobilizované protilátce. Po ukončení reakce se nosič s výhodou opláchne pufrem pro odstranění nereaktivních proteinů apod. Jako pufr pro tuto reakci se používá pufr popsaný v kroku (c).
Značená protilátka používaná v kroku (d) je nutná pro rozpoznání epitopu odlišného od epitopu rozpoznávaného imobilizovanou protilátkou v kroku (a). Jestliže se jako imobilizovaná protilátka používá polyklonální protilátka rozpoznávající první poloviční doménu isoformy OPN, jako protilátka značená navázaným enzymem (např. HRP nebo AP apod.) se používá např. polyklonální protilátka rozpoznávající druhou poloviční doménu isoformy OPN. Použití těchto protilátek rozpoznávajících různá místa jak bylo popsáno výše, umožňuje vysoce citlivý specifický test na isoformu OPN vytvořenou alternativním sestřihem.
Množství značené protilátky používané v kroku (d) je s výhodou přibližně 5000 až 10 000násobek množství imobilizované protilátky navázané na nosič. Je vhodné, jestliže se pro reakci používá značená
- 17 • · · protilátka zředěná na konečnou maximální adsorbanci 1,5 až 2,0 při konečném testu. Pro toto ředění se mohou používat pufry a reakce se s výhodou provádí při teplotě přibližně 37 °C po dobu přibližně 30 min a potom po ukončení reakce následuje oplach pufry. Reakce však není na uvedené podmínky omezena. Výše popsané reakce umožňují vazbu komplexu protilátka - isoforma OPN - značená protilátka na nosič.
V kroku (e) se nakonec přidá roztok chromogenního substrátu reagující se značenou látkou v komplexu imobilizovaná protilátka isoforma OPN - značená protilátka, aby bylo možno změřit absorbanci a vypočítat množství OPN na základě kalibrační křivky.
Jestliže se jako látka použitá pro značení protilátky použije enzym peroxidáza, může se použít jako chromogenní substrát roztok obsahující peroxid vodíku a 3,3’,5,5’-tetramethylbenzin (TMB) nebo ofenylendiamin (OPD). Bez omezení se chromogenní reakce provádí přidáním roztoku chromogenního substrátu k reakci při přibližně 25 °C po dobu přibližně 20 min, a potom se pro ukončení enzymatické reakce přidá 1N kyselina sírová. V případě použití TMB se průběh chromogenní reakce zjišťuje na základě absorbance při 450 nm. V případě, že se jako látka pro značení použije enzym AP, použije se například chromogenní reakce využívající kyseliny pnítrofenylfosforečné (pNPP) jako substrátu, přidání 2N NaOH pro ukončení enzymatické reakce a měření absorbance při 415 nm.
Použitím kalibrační křivky předem připravené na základě absorbance reakčního roztoku s přidanými známými koncentracemi isoformy OPN se může vypočítat koncentrace isoformy OPN ve vzorku.
Způsob detekce isoformy OPN podle vynálezu se používá pro objasnění funkcí OPN a pro diagnózu a léčení onemocnění, za která je OPN odpovědný. Jeden příklad takového použití zahrnuje detekční kit zánětlivých abnormalit, kterým je možno například odlišit revmatismus
- 18 • · ‘ • · * · · • · * • · · • · ·· · a revmatoidní artritidu, kde tento kit je založen na oddělené detekci Nkoncového fragmentu thrombinem rozštěpeného OPN a OPN nerozštěpeného typu, takže se detekuje přítomnost nebo nepřítomnost zánětlivých abnormalit.
Jak bylo popsáno výše, N-koncový fragment thrombinem rozštěpeného OPN se pravděpodobně pozoruje s vysokými koncentracemi v kloubních dutinách zvláště pacientů s revmatoidní artritidou. U pacientů s osteoartritidou je však tato koncentrace nízká. Jak bylo popsáno výše, poměr N-koncového fragmentu OPN v kloubní dutině se u jednotlivých pacientů liší. Pro diagnostické odlišení revmatismu a osteoartritidy se proto může uspokojivě použít měření poměru N-koncového fragmentu k celkovému OPN.
Jako konkrétnější příklad je možno získat protilátky proti jednotlivým peptidům s následujícími třemi sekvencemi společnými všem třem isoformám OPN, tedy OPN-a, OPN-b a OPN-c.
CVDTYDGRGDSVVYGLRS (C+V153 až S169) (1)
KSKKFRRPDIQYPDATDEC (K170 až E187+C) (2)
IPVKQADSGSSEEKQC (117 až Q31+C) (3)
Mezi těmito sekvencemi je sekvence (1) přítomná na N-konci thrombinem rozštěpeného místa, a je přítomná společně v úplném OPN jako typ nerozštěpený thrombinem a N-koncový fragment.
- 19 Alternativně je sekvence (2) přítomná na C-konci místa rozštěpeného thrombinem a je přítomná v úplném OPN typu nerozštěpeného thrombinem, ale nikdy není obsažena v N-koncovém fragmentu. Sekvence (3) odpovídá aminokyselinovým zbytkům v polohách 17 až 31 N-koncového místa OPN a je přítomna v úplném OPN jako typ nerozštěpený thrombinem a N-koncový frgment. Diagnostický kit pro rozlišení mezi pacienty s revmatismem a pacienty s osteoartritidou může být složen ze dvou typů imunodetekčních činidel využívajících protilátky odpovídající těmto třem typům sekvencí. Jinak řečeno, první imunodetekční činidlo používající dva typy protilátek proti peptidům reprezentovaným sekvencemi (3) a (2) provádí test thrombinem nerozštěpeného typu OPN běžně rozpoznávaného oběma protilátkami ve vzorku. Potom se může provádět detekce stejným způsobem jako je sendvičová metoda, která zahrnuje imobilizaci například protilátky proti peptidů sekvence (3) na nosiči, což umožňuje reakci protilátky se vzorkem z pacienta, nosič se opláchne a potom se přidá protilátka proti peptidů sekvence (2) jako značící protilátka. V případě druhého imunodetekčního činidla se navíc používají dvě protilátky proti peptidům sekvencí (1) a (3) pro zjištění celkového množství thrombinem nerozštěpeného typu OPN a N-koncového fragmentu vytvořeného štěpením thrombinem ve vzorku, které jsou běžně rozpoznávány oběma protilátkami. V takovém případě se detekce může provádět stejně jako při sendvičové metodě, která zahrnuje imobilizaci například protilátky proti peptidů sekvence (1) na nosiči, ponechání protilátky reagovat se vzorkem z pacienta, opláchnutí nosiče a následné přidání protilátky proti peptidů sekvence (3) jako značící protilátky. Potom se vzájemně porovnají výsledků testů vzorku stejného pacienta s použitím těchto dvou typů imunodetekčních činidel, čímž se zjistí poměr thrombinem rozštěpeného vytvořeného Nkoncového fragmentu v celkovém OPN pacienta, který umožní rozlišení mezi revmatismem a osteoartritidou.
- 20 Přehled obrázků na výkresech
| Obr. 1 | ukazuje grafy znázorňující inhibicí RGD-dependentní adheze buněk na OPN. |
| Obr. 2 | ukazuje grafy znázorňující inhibicí RGD-dependentní a |
| 5 | RGD-indepententní adheze buněk mezi nOPN a buňkami SW480 transformovanými a9 protilátkou 2K1. |
| Obr. 3a | ukazuje grafy znázorňující migraci buněk indukovanou OPN. |
| Obr. 3b | ukazuje grafy znázorňující potlačení migrace buněk |
| 10 | indukované OPN působením protilátek. |
| Obr. 4 | ukazuje grafy znázorňující časový průběh změny hodnocení artritidy při podávání směsi artritogenní protilátky/LPS individuálně myším s defektním genem OPN a normálním myším. |
| 15 Obr. 5 | ukazuje grafy znázorňující srovnání otoku zápěstí při podávání směsi artritogenní protilátky/LPS myším s defektním genem OPN a normálním myším. |
| Obr. 6 | ukazuje grafy znázorňující adhezi mezi myším OPN a NIH3T3 v závislosti na koncentraci. |
| 20 Obr. 7 | ukazuje grafy znázorňující inhibicí adheze mezi myším OPN a NIH3T3 působením peptidů GRGDSP. |
| Obr. 8 | ukazuje grafy znázorňující inhibicí adheze mezi myším OPN a NIH3T3 působením protilátky M5. |
Příklady provedení vynálezu
Vynález bude nyní podrobněji popsán na následujících příkladech a referenčním příkladu. Vynález však není na tyto příklady omezen.
- 21 Příklad 1
Klonování, konstrukce, čištění a činidla pro fúzní protein GST-OPN
Klonování a čištění proteinu se provádělo v podstatě způsobem popsaným v dokumentu (S. Kon a další, (2000): J. Cell. Biochem. 77: 487 - 498).
cDNA lidských isoforem OPN, tj. OPN-a a OPN-b, byly izolovány následujícím způsobem: použitím RNA připravené z buněk NRC-12 buněčné linie lidského karcinomu ledviny jako templátu byla synteticky připravena cDNA; s použitím této cDNA jako templátu byla provedena PCR s použitím následujících primerů OPN-5 a OPN-3 pro izolaci cDNA kódujících úplný lidský OPN-a a OPN-b, individuálně obsahující příslušné oblasti signálních peptidů.
Způsobem popsaným v odkazu byly potom takto klonované cDNA pro OPN-a a OPN-b vloženy do vektoru pGEX4T (Amersham Pharmacia Biotech, Tokio, Japonsko) tak, že cDNA mohly být ve stejném čtecím rámci jako gen GST (glutathion S-transferáza; EC2.5.1.18), pro expresi ve formě fúzního proteinu s GST s použitím Escherichia coli JM109 (takto získané fúzní proteiny GST-OPN se dále označují jako „GST-OPN-a“ a „GST-OPN-b“).
OPN-5:
5’-CGGGATCCACTACCATGAGAATTGCAGTGATTTGC-3’
OPN-3:
5’-CCGCTCGAGTTAATTGACCTCAGAAGATGCACTATC-3’
- 22 cDNA kódující lidskou isoformu OPN-c byla připravena dvoustupňovou PCR s použitím OPN-a cDNA jako templátu. V prvním kroku byla individuálně provedena PCR s použitím OPN-5 a následujícího OPNct-3 primerů nebo následujícího OPNct-5 a OPN-3 primerů; získané dva produkty PCR byly smíseny, tepelně zpracovány a postupně ochlazeny pro hybridizaci a potom byl přidán enzym pro prodloužení. Ve druhém kroku byla potom provedena PCR s použitím primerů OPN-5 a OPN-3 pro získání cDNA kódující úplný lidský OPN-c včetně oblasti signálního peptidu. cDNA isoformy c byla integrována do vektoru pGEX4T stejným způsobem jako u isoforem a a b, pro přípravu fúzního proteinu s GST (označovaný zde dále jako „GSTOPN-c“).
OPNct-3:
5’-ACACAGCATTCTTTTCCACAGAACTTCCAGAATCAGC-3’
OPNct-5:
5’-TGAGGAAAAGAATGCTGTGTCCTCTGAAGAAAACC-3’ cDNA kódující poloviční část na aminovém konci (MI-R168) z thrombinem rozštěpeného místa OPN-a byla izolována PCR s použitím OPN-a cDNA jako templátu a OPN-5 s následujícím OPNnh-3 primerem popsaným níže. Stejným způsobem jako pro isoformy a a b byla získaná cDNA integrována do vektoru pGEX4T pro přípravu proteinu GST (označovaný dále jako „GST-Nhalf“).
OPNnh-3:
5’-GCCTCGAGTTACCTCAGTCCATAAACCACACT-3’
- 23 • · ·
Protein osteopontinu (hOPN C half) na karboxylovém místě z thrombinem rozštěpeného místa OPN-a byl připraven dvoustupňovou PCR s použitím OPN-a cDNA jako templátu. V prvním kroku byla provedena PCR jednotlivě s použitím OPN-5, následujícího OPNch-3 primeru, následujícího OPNch-5 a OPN-3 primeru. Ve druhém stupni byla provedena PCR s použitím primerů OPN-5 a OPN-3 pro přípravu proteinu OPN na karboxylovém místě. Stejným způsobem jako pro isoformy a a b umožnila rekombinace do vektoru pGEX4T přípravu proteinu GST (označovaný dále jako „GST-Chalf“).
OPNch-3:
5’-TCTTAGATTTGGCACAGGTGATGCCTAGGAG-3’
OPNch-5:
5’-CACCTGTGCCAAATCTAAGAAGTTTCGCAGA-3’
Obecnou metodou byly připraveny různé rekombinantní fúzní proteiny GST-OPN v Escherichia coli, které potom byly čištěny s použitím kolony glutathion-Sepharose podle popisu v odkazu. Protein GST-Nhalf byl rozštěpen na vazebném místě proteázou prescission (PreScission; Amersham Pharmacia Biotech, Tokio, Japonsko), pro odstranění části proteinu GST a tím oddělení proteinu (dále označovaný jako „nOPN“) složeného z aminokoncové poloviční části (I17-R168) samotného OPN.
Alernativně byla cDNA kódující úplný OPN-a (M1-N314) dále vložena do vektoru pcDNA3.1 (+) (Invitrogen Corporation), pro transfekci do buněk CHO-K1 (vyráběné firmou Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) (dále označované jako „buňka CHO/OPN• ·
- 24 ·· ··· ··· a“). OPN-a typu s navázaným cukerným řetězcem (dále označovaný jako „CHO/OPN-a“) izolovaný z buněk byl čištěn následujícím způsobem. Supernatant z kultivace buněk CHO/OPN-a byl zpracován chromatografií na iontoměničové koloně s použitím kolony DEAE5 Sepharose CL-6B column (Amersham Pharmacia Biotech, Tokio, Japonsko) a chromatografií gelovou filtrací na koloně Ultrogel AcA44 column (vyráběná firmou BioSepra SA) a čištění pokračovalo kolonovou chromatografií s reverzními fázemi na koloně RESOURCE RPC column (Amersham Pharmacia Biotech, Tokio, Japonsko). Takto bylo čištění ukončeno. Pro výzkumné práce na imunitní senzitizaci a vazbě byly používány různé peptidy získané od firmy Sigma Genosís Japan; tyto peptidy byly jinak získány chemickou syntézou metodou Fmoc (N-(9-fluorenyl)methoxykarbonyl) na syntezátoru peptidů (model 432 A; vyráběný firmou PerkinElmer Life Science, lne.) a čištěním chromatografií na koloně C18 s reverzními fázemi.
Příklad 2
Produkce monoklonální protilátky
Syntetické peptidy odpovídající vnitřním sekvencím lidského
2o OPN byly připraveny způsobem ukázaným výše a tyto peptidy byly potom použity pro imunizaci.
Peptid 1:
CVDTYDGRGDSVVYGLRS (C+V153 až S169)
Peptid 2:
CIDSQELSKVSREFHSH (C+1261 až H276) • · ·
- 25 • · • · · ·
Peptid 1 má konkrétně sekvence RGD a SVVYGLR rozpoznávající integrinové receptory θνβ3, popřípadě α9β1.
Tyto peptidy byly navázány na thyroglobulin a potom byly použity pro imunizaci myší běžně používaným způsobem. Z imunizovaných myší byly potom izolovány splenocyty, se kterými byla provedena buněčná fúze s buňkami myšího myelomu P3-X63Ag8-653 s použitím polyethylenglykolu. Způsobem popsaným v odkazu (M. Kinebuchi a další, (1991): J. Immunol., 146, 3721 - 3728) byl vybrán hybridom reagující s každým z peptidu použitých pro imunizaci.
Z myší imunizovaných peptidy 1 a 2 byly izolovány monoklonální protilátky označené 2K1 a 4G1. Hybridom tvořící monoklonální protilátku 2K1 byl uložen pod depozitním číslem FERM BP-7883 ve sbírce Patent Organism Depository Center, the National Institute of Advanced Industrial Science a Technology (AIST Tsukuba Central 6,
1-1-1, Higashi, Tsukubashi, Ibaraki 305 - 8566, Japonsko), 20. června 2001. Dále byla izolována monoklonální protilátka 53 (mAb53) imunizací úplným rekombinantním lidským OPN (D. S. Bautista a další, (1994): J. Biol. Chem., 269, 23280 - 23285).
Příklad 3
Reaktivita OPN a jeho thrombinovými štěpnými produkty s monoklonálními protilátkami
Vazebné vlastnosti monoklonálních protilátek 2K1 a 4C1 izolovaných v příkladu 2 proti OPN a jeho thrombinovým štěpným produktům byly testovány metodou westernového přenosu. Bylo zjištěno, že protilátka 2K1 reagovala s GST-OPN-a, GST-OPN-b, GSTOPN-c a GST-Nhalf. Protilátka 4C1 reagovala s GST-OPN-a, GSTOPN-b, GST-OPN-c a GST-Chalf. Tyto monoklonální látky se nevázaly pouze na rekombinantní OPN nenavázané na cukerné řetězce vytvářené v Escherichia coli, ale reagovaly také s proteinem
CHO/OPN-a s navázanými cukernými řetězci a jejich thrombinovými štěpnými produkty (dále označované jako „thrombinem rozštěpený OPN“).
Příklad 4
Inhibice adheze buněk na OPN monoklonálními protilátkami
Následující metodou bylo zjišťováno, zda monoklonální protilátky inhibovaly adhezi buněk na OPN. Nejprve byla 96-jamková destička potažena různými koncentracemi CHO/OPN-a při 4 °C přes noc a potom byla ponechána inkubovat s 0,5 % BSA v PBS za podmínek 37 °C 10 min, pro blokování nespecifické adheze. Buňky lidských fibroblastů TIG-7 nebo SW480 transformované cDNA integrinové podjednotky a9 (dále označované jako „a9-transformované buňky SW480“) byly suspendovány v médiu D-MEM obsahujícím 0,25 %
BSA; 200 pl získané buněčné suspenze (s koncentrací buněk 5x10 buněk/jamku) bylo pipetováno na 96-jamkovou destičku předem potaženou CHO/OPN-a nebo nOPN, v přítomnosti nebo nepřítomnosti různých koncentrací monoklonálních protilátek nebo syntetických peptidů a destička byla inkubována 37 °C 1 h.
Kultivační médium bylo slito a všechny jamky byly dvakrát propláchnuty médiem D-MEM obsahujícím 0,25% BSA. Adherentní buňky byly fixovány a barveny 0,5% krystalovou violetí ve 20% methanolu 30 min.
Všechny jamky byly třikrát opláchnuty vodou a adherentní buňky byly potom solubilizovány do 20% kyseliny octové. Získaný supernatant z každé jamky byl analyzován čtecím zařízením pro imunologii pro měření absorbance při 590 nm pro zjištění relativního počtu buněk přichycených k jamce. Všechny tyto testy byly prováděny v triplikátech a byly prováděny alespoň tři nezávislé experimenty. Ukázané hodnoty představují průměr ze tří nezávislých experimentů.
0····· · · · • 00 ·· · · ·
00·0· · * *
00 · 000
0 0 0 0 » . 27 - .............
Bylo zjištěno, že buňky TIG-7 mají vysokou adherenci k OPN, ale jak je ukázáno na obr. 1A, adheze je zřejmě inhibována peptidem GRGDSP (100 pg/ml), ale není inhibována kontrolním peptidem (Ckoncová oblast K296-N314 OPN) (100 pg/ml). Adheze je tedy závislá na RGD. Jak je ukázáno na obr. 1B, protilátka 2K1 v koncentraci 200 pg/ml dále zřejmě inhibovala adhezi buněk na OPN. Jak je dále ukázáno na obr. 1C, vliv 2K1 na inhibici buněčné adheze je srovnatelný s vlivem protilátky mAb53, a je závislý na koncentraci. Ještě dále, 2K1 a mAb53 nikdy neinhibují adhezi buněk TIG-7 na io vitronektin (VN) nebo fibronektin (FN).
Obr. 2 ukazuje inhibici monoklonálních protilátek adheze nOPN a vitronektinu na a9-transformované buňky SW480. Jak je ukázáno na obr. 2A, adheze mezi 1 pg/ml vitronektinu a a9-transformovanými buňkami SW480 byla inhibována 200 pM peptidem GRGDSP (peptid
RGD), takže adheze je závislá na RGD. Adheze cc9-transformovaných buněk SW480 na 3 pg/ml nOPN byla inhibována kombinací 200 pM GRGDSP a monoklonální protilátky proti α9β1 Y9A2 (A. Wang a další, (1996): Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 15, 664 - 672), takže adheze je RGD-dependentní a RGD-independentní. Obr. 2B dále ukazuje vliv
2o 2K1 na adhezi a9-transformovaných buněk SW480 na nOPN a vitronektin. Adheze mezi a9-transformovanými buňkami SW480 a vitronektinem nebyla inhibována v žádném případě 2K1, ale adheze mezi buňkami SW480 a nOPN byla působením 2K1 inhibována. To ukazuje, že 2K1 si zachovává schopnost inhibovat RGD dependentní adhezi.
- 28 Příklad 5
Inhibice migrace monocytů indukované OPN pomocí monoklonálních protilátek
Test migrace buněk s použitím buněk U937 byl prováděn na systému ChemoTx101-8 (Neuro Probe lne.). Koncentrace buněk byla nastavena na 2 x10 buněk/ml pufrem D-MEM obsahujícím 0,1% BSA a suspenze byla pak nanesena do horní vrstvy na filtr (s velikostí pórů 8 pm), zatímco protein OPN byl přidán do dolní vrstvy.
Destička ChemoTx byla ponechána stát v přítomnosti 5 % CO2 io při 37 °C 4 h. Po stání byl filtr fixován methanolem a potom obarven hematoxylinem a eosinem (H-E). Počet buněk migrujících do zadní plochy filtru byl zjišťován mikroskopem (zvětšení 400 x). Test byl prováděn v triplikátech a výsledky jsou vypočteny jako střední hodnota. Výsledky jsou uvedeny v obr. 3.
Obr. 3a ukazuje migraci buněk U937 směrem k CHO/OPN-a, thrombinem rozštěpenému OPN a GST-Nhalf v ukázané koncentraci. Obr. 3b dále ukazuje inhibiční testy použitím jednotlivých OPN při koncentraci 10 pg/ml v přítomnosti neo nepřítomnosti 50 pg/ml 2K1, mAb53 nebo kontrolního myšího IgG po antigenně specifickém čištění.
Jak je ukázáno na obr. 3a a 3b, CHO/OPN-a, thrombinem rozštěpený OPN a GST-Nhalf indukují migraci lidských monocytů U937 v závislosti na koncentraci (A). Protilátka 2K1 zjevně inhibuje migraci monocytů indukovanou CHO/OPN-a, thrombinem rozštěpeným OPN a GST-Nhalf. Naopak protilátka mAb53 inhibuje pouze migraci monocytů indukovanou úplným OPN (B).
·«···· · · « · · · * · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · • · ··· · · · · · ·
- 29 Referenční příklad 1
OPN a indukce artritidy
Pro objasnění funkce OPN při artritidě byla uměle připravena myš s defektním genem OPN (S. R. Rittling a další, (1998): J. Bone a
Mminer. Res., 13 (7), 1101 - 1111) známým způsobem pro komparativní experimenty s normální myší.
Komerčně dostupný koktejl vyvolávající artritidu na bázi monoklonálních protilátek (dodávaný pod obchodním názvem Arthrogen-CIA® mAb, Arthritogenic mAb coctaíl; vyráběný firmou Iwai io Chemical Pharmaceutical Co., Ltd.) byl podáván myším s defektním genem OPN (OPN'/_) a normální myši (OPN+/+), individuálně podle instrukční příručky připojené k produktu, s cílem indukovat artritidu. Potom byla sledována vážnost vyvolaného stavu. Jako kontroly byly použity tyto dva typy myší, kterým byl podáván fyziologický roztok.
Srovnání vážnosti artritických příznaků bylo prováděno na základě hodnocení artritidy standardním testem otoku zápěstí 10. den po podání. Výsledky jsou uvedeny na obr. 4 a 5.
Jak je zřejmé z obr. 4, u normálních myší, kterým se podává artritogenní koktejl protilátka/lipopolysacharid (dále označovaný jako „LPS“) dochází ke zvýšení výsledků hodnocení artritidy v den 4 a v dalších dnech, až do dne 10, kdy hodnocení dosáhne maxima (12 nebo více). Alternativně se hodnocení artritidy myší s defektním genem OPN zvyšovalo v den 5 a v dalších dnech, ale skoré dosáhlo maxima pouze 4 nebo méně. U žádné skupiny, které byl podáván fyziologický roztok, ke zvýšení hodnocení artritidy nedošlo.
Jak je ukázáno na obr. 5, u myší s defektním genem OPN je otok zápěstí poměrně slabý ve srovnání s normálními myšmi, u kterých se jasně ukazuje úloha OPN při artritidě.
• · « · · ·
- 30 Příklad 6
Inhibiční aktivita protilátky 2K1 na migraci lidských periferních leukocytů
Následující metodou byla zjišťována inhibiční aktivita protilátky 2K1 na migraci lidských periferních leukocytů aktivovanou cytokiny. Tabulka 1 ukazuje výsledky inhibiční aktivity na migraci neutrofílů, zatímco tabulka 2 ukazuje výsledky inhibiční aktivity na migraci monocytů.
Experimentální metoda
Při dělení pomocí Ficollu byla z normální lidské periferní krve separována frakce monocytů a frakce neutrofílů (Ρ. M. Daftarian a další, (1996): Journal of Immunology, 157, 12 - 20). Mezilehlá vrstva mezi Ficollem a sérem byla oddělena a kultivována v baňce při 37 °C 1 hodinu. Získané přichycené buňky byly použity jako monocyty. K vrstvě erythrocytů zbylých po oddělení frakce monocytů byl přidán pětinásobný objem 3% dextranu-PBS pro agregaci erythrocytů a potom se prováděla centrifugace při 150 x g a 4 °C 5 min.
Agregované erythrocyty byly vysráženy, přičemž výsledný supernatant obsahoval neutrofily v suspendovaném stavu. Potom byla frakce centrifugována při 500 x g při laboratorní teplotě 20 min pro oddělení neutrofílů. Monocyty a neutrofily získané tímto způsobem byly přes noc kultivovány s lidským TNF-a (20 ng/ml) pro aktivaci. Potom byly získané aktivované monocyty a neutrofily použity pro experimenty s migrací.
Experimenty s migrací byly prováděny s použitím 48-jamkové mikrokomůrky pro chemotaxi (vyráběná firmou Neuro Probe lne.). Po přidání různých koncentrací protilátky 2K1 k OPN štěpenému thrombinem a stání při 37 °C 15 min byly směsi přidávány do dolní komůrky (konečná koncentrace lidského OPN 10 pg/ml). Na komůrku
- 31 byl potom položen polykarbonátový filtr (velikost pórů 5 pm) a do horní komůrky bylo přidáno 50 pl suspenze buněk (2 x 106 buněk/ml).
Po kultivaci v přítomnosti 5 % CO2 při 37 °C 2 h byl polykarbonátový filtr odstraněn pro odstranění buněk na horním povrchu filtru; potom byly buňky, které pronikly do zadní části filtru, barveny systémem Diff-Quick (vyráběný firmou Baxter, International lne.). Obarvené buňky byly počítány při zvětšení 40 x. Výsledky jsou ukázány jako střední počty buněk (buněk/mm3) ± SD v 6 jamkách.
io Výsledky experimentů
Protilátka 2K1 inhibovala migraci lidských periferních neutrofilů a monocytů aktivovaných TNF-α směrem k OPN rozštěpenému thrombinem.
Inhibice migrace neutrofilů
Tabulka 1
| Koncentrace thrombinem rozštěpeného OPN (pg/ml) | Koncentrace 2K1 (pg/ml) | Střední počet migrujících buněk na 1 mm3 |
| 0 | 0 | 400,0 + 67,8** |
| 10 | 0 | 581,7 ± 67,1 |
| 10 | 0,4 | 566,7 ± 60,2 |
| 10 | 2 | 550,0 ± 49,0 |
| 10 | 10 | 450,0 ± 90,8** |
| 10 | 50 | 426,7 + 30,8** |
** P<0,01 (jednosměrný ANOVA, Dunnettův test) • · · · · «
- 32 Inhibice migrace monocytů
Tabulka 2
| Koncentrace thrombinem rozštěpeného OPN (pg/ml) | Koncentrace 2K1 (pg/ml) | Střední počet migrujících buněk na 1 mm3 |
| 0 | 0 | 58,3 ± 50,8** |
| 10 | 0 | 285,0 ± 49,3 |
| 10 | 0,4 | 258,0 ± 71,9 |
| 10 | 2 | 256,7 ± 66,5 |
| 10 | 10 | 160,0 ± 56,9** |
| 10 | 50 | 75,0 ± 55,4** |
** P<0,01 (jednosměrný ANOVA, Dunnettův test)
Příklad 7
Příprava protilátky M5
Pro použití při imunizaci byl připraven následující syntetický peptid odpovídající vnitřní sekvenci (C+V138 až R153) myšího OPN.
io Peptid M5:
CVDVPNGRGDSLAYGLR
Peptid byl navázán na thyroglobulin pro následné použití pro imunizaci králíka známým způsobem. Z imunizovaného králíka bylo odebíráno antisérum pro přípravu protilátky M5 použitím kolony naplněné peptidem M5 navázaným přes N-koncový cystein prostřednictvím disulfidické vazby na kuličky thiol Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, Tokio, Japonsko).
• · · ·
- 33 Příklad 8
Reaktivita protilátky M5 s OPN a produkty jeho štěpení thrombinem
Vazebná schopnost protilátky M5 získané v příkladu 7 s OPN a produkty jeho štěpení thrombinem byla testována metodou westernového přenosu. Jako OPN byl použit rekombinantní myší OPN z glykosylované formy vytvářené v buňkách CHO. Protilátka M5 reagovala s OPN a jeho štěpnými produkty.
Příklad 9 io Inhibice adheze buněk na OPN prostřednictvím protilátky M5
Způsobem popsaným v dokumentu (S. Kon a další, (2002): J. Cell. Biochem., 84 (2), 420 - 432) bylo zjišťováno, zda by mohla protilátka M5 inhibovat adhezi buněk na OPN. Jako OPN byl použit úplný myší OPN, ze kterého byla předem odstraněna část GST proteázou PreScission protease (Amersham Pharmacia Biotech, Tokio, Japonsko) (dále označovaný jako „mOPN/de-GST“). Jako buňky byly použity myší buňky NIH3T3.
Jak je ukázáno na obr. 6, buňky NIH3T3 se přichytávají na mOPN/de-GST v závislosti na koncentraci. Jak je ukázáno na obr. 7, adheze je zjevně inhibována peptidem GRGDSP (100 pg/ml), takže adheze závisí na RGD. Jak je ukázáno na obr. 8, protilátka M5 v koncentraci 200 pg/ml zjevně inhibovala adhezi buněk na OPN.
Příklad 10
Inhibični aktivita protilátky M5 vůči migraci myších slezinných monocytů
Inhibični aktivita protilátky M5 na migraci myších monocytů odvozených ze sleziny aktivovanou cytokiny byla testována následujícím způsobem. Výsledky jsou ukázány v tabulce 3.
- 34 Experimentální metoda
Splenocyty myší CS7BL/6 byly rozdrceny krycím sklem na jednotlivé buňky, které byly potom kultivovány v baňce při 37 °C 1 h. Získané adherentní buňky byly použity jako monocyty. Monocyty byly kultivovány přes noc a aktivovány lidským TNF-a (20 ng/ml). Výsledné aktivované monocyty byly použity při experimentu s migrací. Experiment s migraci byl prováděn stejným způsobem jako v případě lidského vzorku v příkladu 6 výše.
Výsledky experimentů
Protilátka M5 inhibovala migraci monocytů aktivovaných TNF-a odvozených z myší sleziny směrem k myšímu OPN štěpenému thrombinem získaného štěpením úplného myšího OPN (vyráběného firmou Genzyme Corporation) hovězím thrombinem (vyráběný firmou Sigma).
Tabulka 3
| Koncentrace thrombinem rozštěpeného myšího OPN (pg/ml) | Koncentrace M5 (pg/ml) | Střední počet migrujících buněk na 1 mm3 |
| 0 | 0 | 428,3 ± 52,7** |
| 10 | 0 | 556,7 ± 46,3 |
| 10 | 0,8 | 570,0 ± 75,6 |
| 10 | 4 | 536,7 ± 60,6 |
| 10 | 20 | 461,7 ± 104,4 |
| 10 | 100 | 468,3 ± 67,9 |
** P<0,05(jednosměrný ANOVA, Dunnettův test) • ·
Příklad 11
Účinek protilátky M5 na potlačení poškození kostí
Následujícím způsobem byl vyšetřován účinek protilátky M5 na potlačení poškození kostí v systému orgánové kultury části lebky calvarium myší. Výsledky jsou ukázány v tabulce 4.
Experimentální metoda
Z novorozené myši jeden den po narození byla vyjmuta lebeční kost; po úpravě velikosti byla její polovina vložena do každé jamky 24jamkové destičky. Do každé jamky byl potom přidán lidský parathyroidní hormon (PTH) (1 - 34) s koncentrací upravenou přidáním kultivačního média D-MEM (s 10% bovinním sérem) na konečnou hodnotu 10 nM pro dosažení indukce poškození kosti. Protilátka M5 byla přidána na konečnou koncentraci 200 pg/ml. Po kultivaci 1 týden při 37 °C bylo testováno množství vápníku uvolněného z kosti do kultivačního média testem Calcium E Test WAKO (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Výsledky experimentů
Bez přidání PTH byla koncentrace vápníku 7,02 mg/ml. S přidáním PTH však byla koncentrace vápníku 9,11 mg/ml. Bylo tedy ukázáno, že dojde k podpoře uvolňování vápníku z kostí. Když byla přidána protilátka M5 v koncentraci 200 pg/ml, bylo ověřeno, že absorpce kosti byla inhibována o přibližně 70 %.
• · · ·
- 36 Tabulka 4 tt · · * · 9 « r • « · · · • · »tt
| Množství uvolněného vápníku (mg/dl) | |
| Médium | 7,02 ± 0,18** |
| Kontrola PTH | 9,11 ± 0,17 |
| M5 | 7,65 ± 025** |
** P<0,01 (jednosměrný ANOVA, Dunnettův test)
Příklad 12
Vliv protilátky M5 na model myší kolagenní artritidy indukované
Následující metodou byl zjišťován vliv protilátky M5 na model myší myší kolagenní artritidy. Tabulka 5 ukazuje výsledky hodnocení artritidy; tabulka 6 ukazuje výsledky hodnocení otoku nohy; tabulka 7 ukazuje změnu tělesné hmotnosti; a tabulka 8 ukazuje výsledky io hodnocení změny v přijímání potravy.
Experimentální metoda
Pro indukci artritidy byl použit koktejl artritogenní protilátky (s obchodním názvem koktejlu pro vyvolání artritidy Arthrogen-CIA® mAb, Arthritogenic mAb coctail; vyráběný firmou Iwai Chemical Pharmaceutical Co., Ltd.) rozpoznávající čtyři epitopy specifické pro kolagen. Myším byl intravenózně podán artritogenní koktejl; o 3 dny později byl intraperitoneálně podán LPS (100 pg) pro vyvolání artritidy. Artritida byla pozorována v den 3 po podání LPS a dosáhla maxima v den 6.
Bezprostředně před podáním LPS a o tři dny později byla intravenózně podána protilátka M5 v dávce 40 pg, 150 pg nebo 400 pg. Jako kontrolní skupina byla použita skupina, které byl podán králičí IgG (v dávce 400 pg). Dále byla intravenózně podána protilátka proti myšímu TNF-α v dávce 200 pg/myš bezprostředně před podáním r ·
- 37 LPS a o tři dny později. Jako kontrolní skupina byly použity myši, kterým byl podán krysí IgG (v dávce 200 pg). Dále byl orálně podáván MTX (v dávce 3,2 mg/kg) jednou denně v den podání LPS a později. Byl používán MTX rozpuštěný v 5 ml 0,5% methylcelulózy. V případě kontrolní skupiny bylo podáváno 5 ml 0,5% roztoku methylcelulózy.
Hodnocení se provádělo pro skupiny pěti zvířat, přičemž se provádělo hodnocení artritidy, otoku nohy, změna tělesné hmotnosti a změna příjmu potravy.
Výsledky experimentů
Jak je ukázáno v tabulkách 5 až 8, protilátka M5 měla určitý potlačující účinek na zlepšení hodnocení artritidy, opoždění nástupu artritidy a zlepšení stavu u otoku nohy v modelu myší artritidy (terapeutický účinek). Nástup artritidy byl potlačován v závislosti na koncentraci tak, že efekt převyšoval účinek podané protilátky proti myšímu TNF-α (v dávce 200 pg/myš). Naopak MTX neměl téměř žádný farmaceutický účinek.
V normální skupině v rámci modelu byl navíc pozorován určitý úbytek tělesné hmotnosti o přibližně 3 g tři dny po podání LPS; tento sklon pokračoval v den 3 až den 6, ačkoli pokles hmotnosti byl více nebo méně omezen. Ve skupinách, kterým byla podána protilátka M5 (150 pg, 400 pg) a skupinám, kterým byla podána protilátka proti myšímu TNF-α, bylo pozorováno zjevné zlepšení hodnocení úbytku hmotnosti. Co se týče příjmu potravy, pro všechny farmaceutické látky byl pozorován rychlý pokles tělesné hmotnosti až do dne 3 po podání LPS; v den 3 až den 6 však došlo ke zmenšení poklesu ve všech skupinách, kterým byla podána protilátka M5, i ve skupině ošetřené protilátkou proti myšímu TNF-α. Tabulka 5 ukazuje účinek na hodnocení artritidy; tabulka 6 ukazuje potlačení otoku nohy; a tabulky 7 a 8 ukazují vliv na změnu tělesné hmotnosti, popřípadě příjem potravy.
- 38 Tabulka 5
| Dny | Skupina, které byl podán králičí IgG (dávka 400 pg/myš) | Skupina, které byla podána protilátka M5 (dávka pg/myš) | ||
| 40 | 150 | 400 | ||
| 3 | 1,2±1,1 | 2,4±1,7 | 1,0+1,2 | 0,0±0,0 |
| 4 | 1,8+1,3 | 3,4±1,1 | 1,4+0,5 | 02+0,4* |
| 5 | 5,0±1,6 | 6,0±2,0 | 3,0±1,2* | 1,8±0,4** |
| 6 | 5,4±1,3 | 7,2±1,3 | 4,6±1,5 | 3,0±1,0* |
** P<0,01, *P<0,05 (neparametrický test Mann-Whitney)
| Dny | Skupina, které byl podán krysí IgG (dávka 200 pg/myš) | Skupina, které byla podána protilátka proti myšímu TNF-a (dávka 200 pg/myš) |
| 3 | 0,8±0,4 | 1,0±0,6 |
| 4 | 2,4±0,2 | 1,0±0,5 |
| 5 | 5,8±0,4 | 3,2±0,5* |
| 6 | 6,6±0,4 | 5,8±0,5 |
* P<0,05 (neparametrický test Mann-Whitney)
| Dny | Kontrolní skupina | Skupina, které byl podán MTX (dávka 3,2 mg/kg) |
| 3 | 1,0±0,3 | 0,8+0,4 |
| 4 | 1,8±0,6 | 1,8±0,7 |
| 5 | 4,0±0,9 | 6,0±0,6 |
| 6 | 5,2±0,9 | 6,0±0,6 |
• · · · • · ·
- 39 Tabulka 6
| Místo | Objem otoku nohy (ml) | ||||
| Normální skupina | Skupina, které byl podán králičí IgG (dávka 400 pg/myš) | Skupina, které byl podán M5 (dávka pg/myš) | |||
| 40 | 150 | 400 | |||
| Přední noha | 0,041 ±0,003** | 0,051 ±0,004 | 0,055±0,004 | 0,041 ±0,004** | 0,038±0,001 ** |
| Zadní noha | 0,117±0,004** | 0,138±0,005 | 0,140±0,010 | 0,127±0,006 | 0,121±0,009** |
** P<0,01, * P<0,05 (jednosměrný ANOVA, Dunnettův test)
| Místo | Objem otoku nohy (ml) | ||
| Normální skupina | Skupina, které byl podán krysí IgG (dávka 200 pg/myš) | Skupina, které byla podána protilátka proti myšímu TNF-a (dávka 200 pg/myš) | |
| Přední noha | 0,041 ±0,003** | 0,044±0,003 | 0,041±0,002 |
| Zadní noha | 0,117±0,004** | 0,127±0,004 | 0,130±0,006 |
| Místo | Objem otoku nohy (ml) | ||
| Normální skupina | Kontrolní skupina | Skupina, které byl podán MTX (dávka 3,2 mg/kg) | |
| Přední noha | 0,041 ±0,003** | 0,044±0,002 | 0,047±0,003 |
| Zadní noha | 0,117±0,004** | 0,129±0,005 | 0,132±0,003 |
• ·
- 40 Tabulka 7
| Změna tělesné hmotnosti (g) | |||||
| Normální skupina | Skupina, které byl podán králičí IgG (dávka 400 pg/myš) | Skupina, které byl podán M5 (dávka pg/myš) | |||
| 40 | 150 | 400 | |||
| Den 0 až den 3 po podání | 0,1 | -2,8 | -2,4 | -1,6 | -1,5 |
| Den 3 až den 6 po podání | 0,5 | 1,8 | 1,0 | 0,8 | 1,5 |
| Změna tělesné hmotnosti (g) | |||
| Normální skupina | Skupina, které byl podán krysí IgG (dávka 200 pg/myš) | Skupina, které byla podána protilátka proti myšímu TNF-a (dávka 200 pg/myš | |
| Den 0 až den 3 po podání | 0,1 | -2,9 | -1,7 |
| Den 3 až den 6 po podání | 0,5 | -1,7 | -0,1 |
| Změna tělesné hmotnosti (g) | |||
| Normální skupina | Kontrolní skupina | Skupina, které byl podán MTX (dávka 3,2 mg/kg) | |
| Den 0 až den 3 po podání Den 3 až den 6 po podání | 0,1 0,5 | -2,9 -2,7 | -1,5 -1,8 |
• · · ·
- 41 Tabulka 8 • · · · · • · · · • · · · « • · · · · • · · · · · ·
| Množství přijaté potravy (g/myš/den) | |||||
| Normální skupina | Skupina, které byl podán králičí IgG (dávka 400 pg/myš) | Skupina, které byl podán M5 (dávka pg/myš) | |||
| 40 | 150 | 400 | |||
| Den 0 až den 3 po podání | 2,7 | 1,0 | 0,9 | 1,4 | 1,1 |
| Den 3 až den 6 po podání | 2,9 | 2,4 | 2,3 | 2,4 | 2,8 |
| Množství přijaté potravy (g/myš/den) | |||
| Normální skupina | Skupina, které byl podán krysí IgG (dávka 200 pg/myš) | Skupina, které byla podána protilátka proti myšímu TNF-a (dávka 200 pg/myš) | |
| Den 0 až den 3 po podání | 2,7 | 1,0 | 1,3 |
| Den 3 až den 6 po podání | 2,9 | 2,5 | 2,8 |
| Množství přijaté potravy (g/myš/den) | |||
| Normální skupina | Kontrolní skupina | Skupina, které byl podán MTX (dávka 3,2 mg/kg) | |
| Den 0 až den 3 po podání | 2,7 | 0,9 | 0,8 |
| Den 3 až den 6 po podání | 2,9 | 2,4 | 2,1 |
• · · · · I
- 42 Příklad 13
Dostupnost peptidovych fragmentů příbuzných OPN
Fragmenty peptidů příbuzných s OPN ve stavu vyčištěném chromatografií HPLC byly zakoupeny od firmy Auspep lne., Parkiville,
Austrálie. Jejich aminokyselinové sekvence jsou ukázány jako (1) až (3).
hOPN5:
CVDTYDGRGDSVVYGLRS (C+V153 až S169) (1) hOPN3:
KSKKFRRPDIQYPDATDEC (K170 až E187+C) (2) hOPN1:
IPVKQADSGSSEEKQC (117 až Q31+C) (3)
Příklad 14
Příprava antigenů pro imunizaci
Fragmenty peptidů příbuzných s OPN navázané na thyroglobulin 20 byly připraveny procesem EMCS (N-(6-maleimidokaproyloxy)sukcinimid) následujícím způsobem. Pro přípravu těchto produktů byl použit molární poměr thyroglobulinu, peptidového fragmentu příbuzného s OPN a EMCS 1 : 300 : 400.
Čtyři miligramy každého peptidového fragmentu příbuzného 25 s OPN z příkladu 13 byly rozpuštěny v destilované vodě 1 ml. Alternativně bylo smíseno 5 mg thyroglobulinu rozpuštěného v 1 ml 0,01 M fosfátového pufru, pH 7,0 a EMCS rozpuštěný v koncentraci 80 pg/μΙ v dimethylformamidu, jednotlivě v množstvích odpovídajících
- 43 molárním poměrům, pro přípravu roztoku komplexu thyroglobulinEMCS. Roztok komplexu byl rozdělen na tři části. Ke každé části byl přidán roztok fragmentu peptidu příbuzného s OPN v množství odpovídajícím molárním poměrům za získání roztoku produktu zesítěného EMCS peptidového fragmentu příbuzného s OPN navázaného na thyroglobulin.
Roztok takto navázaného produktu byl dialyzován s použitím PBS pro upravení koncentrace produktu na 10 pg/μΙ. Navázaný produkt peptidového fragmentu příbuzného s OPN a thyroglobulinu byl použit jako antigen pro imunizaci.
Příklad 15
Příprava antigenů pro screening
Proteiny OPN pro screening, tedy fúzní proteiny mezi GST a isoformami lidského OPN, jmenovitě GST-OPN-a, GST-OPN-b a GSTOPN-c, a fúzní proteiny mezi GST a fragmentem OPN na straně aminoskupiny (GST-Nhalf) z místa štěpeného thrombinem a fragmentem OPN na straně karboxylové skupiny (GST-Chalf) ze stejného místa štěpeného thrombinem byly připraveny metodou popsanou v příkladu 1, pro použití v testu reaktivity antiséra s OPN.
Příklad 16
Imunitní senzitizace
Králík byl imunizován s použitím navázaných produktů peptidových fragmentů příbuzných s OPN a thyroglobulinu připravených v příkladu 14 jako antigenů pro imunizaci. Imunizace byla prováděna použitím posilovači dávky 100 pl (100 pg) roztoku navázaného produktu každý týden nebo každé dva týdny. Antigeny byly smíseny s Freundovým kompletním adjuvans pro první imunizaci a potom byly smíseny s Freundovým nekompletním adjuvans pro • · · · · ·
I · · ► · · · ·
- 44 druhou a následující imunizaci. Po osminásobné imunizaci bylo ze vzorku krve odděleno sérum, které potom bylo použito jako antisérum.
Příklad 17
Reaktivita antiséra s OPN
Peptidové fragmenty příbuzné s OPN připravené v příkladu 13 byly zředěny 0,1M karbonátovým pufrem, pH 9,5, na koncentraci 10 pg/ml, a roztoky byly potom imobilizovány v množství 50 pl/jamku na 96-jamkové destičce. Po opláchnutí PBS a blokování roztokem io 0,1% BSA/PBS/0,05% NaN3, byla v množství 50 μΙ/jamku vložena dvojnásobná sériová ředění stonásobného ředění antiséra získaného v příkladu 16 a reakce byla ponechána probíhat při 37 °C 30 min.
Po ukončení reakce byla jamka čtyřikrát propláchnuta 0,05% Tween 20-PBS. Potom bylo do každé jamky přidáno vždy 50 μΙ HRP15 značené protilátky proti králičímu IgG (vyráběná firmou IBL Co., Ltd.) a reakce byla ponechána probíhat při 37 °C 30 min. Po ukončení reakce bylo do každé jamky přidáno 100 μΙ vždy 0,05M citrátového pufru, pH
4,5 s obsahem 0,4 mg/ml orthofenylendiaminu (OPD) a vodného 0,03% peroxidu vodíku. Potom byla destička ponechána stát v temnu při laboratorní teplotě 15 min, přičemž probíhala chromogenní reakce. Po ukončení chromogenní reakce bylo do každé jamky přidáno 100 μΙ 1N kyseliny sírové pro ukončení reakce a byla měřena absorbance při 492 nm.
Použitím proteinů OPN připravených v příkladu 15 byla alternativně testována reaktivita antiséra metodou westernového přenosu, antiséra proti peptidovým fragmentům příbuzným s OPN, hOPN1 a hOPN5 reagovala s GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c a GST-Nhalf, ale nikdy nereagovala GST-Chalf. Alternativně reagovala antiséra proti peptidovému fragmentu příbuznému s OPN, hOPN3, • · · · · ·
- 45 s GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c a GST-Chalf, ale nikdy nereagovala s GST-Nhalf.
Příklad 18
Příprava produktů protilátek proti peptidovým fragmentům příbuzným s
OPN s navázanou HRP
Produkty protilátek proti peptidovým fragmentům příbuzným s OPN s navázanou HRP, hOPN3 a hOPN1, byly připraveny následujícím způsobem. 20 mg každé protilátky proti peptidovému fragmentu příbuznému s OPN bylo štěpeno pepsinem a potom byla provedena gelová filtrace pro vyčištění fragmentu F(ab’)2 protilátky proti peptidovému fragmentu příbuznému s OPN. Potom byl fragment F(ab’)2 převeden na fragment Fab’ použitím 2-merkaptoethanolu. HRP byla ponechána reagovat s EMCS při 37 °C 60 min a potom byla provedena gelová filtrace pro přípravu navázaného produktu HRPEMCS, který dále reagoval s fragmentem Fab’ protilátky proti peptidovému fragmentu příbuznému s OPN při 4 °C přes noc a potom byla provedena gelová filtrace pro přípravu produktu protilátky proti peptidovému fragmentu příbuznému s OPN s navázanou HRP zesítěnou EMCS.
Příklad 19
Konstrukce sendvičových systémů ELISA
Z kombinací sendvičové destičky ELISA a značených protilátek byly připraveny dva typy systémů, totiž 1 - 3 a 5 - 1. Systém 1 - 3 byl připraven následovně. 10 pg/ml protilátky proti peptidovému fragmentu hOPN1 příbuznému s OPN bylo přidáno množství 100 pl do každé jamky 96-jamkové destičky ELISA. Po reakci přes noc při 4 °C bylo provedeno blokování roztokem 10% BSA/PBS/NaN3. Získaná destička v tomto stavu byla použita jako destička pro sendvičovou ELISA. Jako
- 46 značená protilátka byl definován produkt protilátky proti peptidovému fragmentu hOPN3 příbuznému s OPN s navázanou HRP získaný v příkladu 18. Jak bylo popsáno výše, kombinace mezi imobilizační destičkou s použitím protilátky proti hOPN1 a značenou protilátkou s použitím protilátky proti hOPN3 byla definována jako systém 1-3.
Stejným způsobem byla zkonstruována kombinace imobilizační destičky s použitím protilátky proti hOPN5 a značené protilátky s použitím protilátky proti hOPN1 jako systém 5-1.
Příklad 20
Test na osteopontin v systémech sendvičové ELISA
Protein OPN byl zjišťován následujícím způsobem. 100 pl roztoku obsahujícího vzorek plasmy nebo tekutiny z kloubní dutiny testovaného subjektu bylo přidáno na destičky pro sendvičovou ELISA systémů 1 - 3 a 5 - 1 a byla ponechána probíhat reakce při 37 °C 1 h. Po reakci byly destičky 4 x opláchnuty 0,05% Tween 20-PBS a potom bylo přidáno 100 μΙ každé ze značených protilátek specifických pro jednotlivé systémy pro reakci při 4 °C 30 min. po ukončení reakce byly destičky 6 x opláchnuty pufrem 0,05 % Tween 20-PBS a potom bylo přidáno 100 μΙ roztoku TMB (tetramethylbenzidin). Potom byly získané destičky ponechány stát v temnu při laboratorní teplotě 30 min. Pro ukončení reakce byla použita 1N kyselina sírová a absorbance byla měřena při 450 nm.
Tabulka 9 ukazuje hodnoty množství OPN v tekutinách kloubních dutin pacientů (13 případů) s revmatismem s použitím této metody měření a tabulka 10 ukazuje hodnoty množství OPN v tekutinách kloubní dutiny u pacientů (12 případů s osteoartritidou). Dále ukazuje tabulka 11 hodnoty množství OPN v plasmě pacientů s revmatismem (16 případů); tabulka 12 ukazuje hodnoty OPN v • · « · • · • · · ·
- 47 plasmě pacientů s osteoartritidou (7 případů); a tabulka 13 ukazuje hodnoty OPN v plasmě normálních pacientů (6 případů).
Z těchto výsledků je jasně vidět, že srovnání systému 1 - 3 z hlediska hodnoty OPN v plasmě mezi pacienty s revmatoidní artritidou, pacienty s osteoartritidou a normálními pacienty neukazuje žádný významný rozdíl.
Srovnání provedené s pomocí systému 5 - 1 z hlediska hodnot OPN v plasmě mezi pacienty s revmatoidní artritidou, pacienty s osteoartritidou a normálními pacienty však ukázalo podstatně vyšší hodnoty OPN v plasmě u pacientů s revmatoidní artritidou a pacientů s osteoartritidou než je hodnota OPN u normálních osob. Hladina významnosti byla vyšší u pacientů s revmatoidní artritidou. To ukazuje, že celkové množství OPN zjišťované v případě systému 5 - 1, je vhodné pro diagnostiku obecné kategorie artritidy.
Hodnoty OPN v tekutinách kloubní dutiny pacientů s revmatoidní artritidou a pacientů s osteoartritidou jsou vyšší než hodnoty OPN v jejich plasmě, což ukazuje na lokální tvorbu OPN.
Porovnání se systémy 1 - 3 a 5 - 1 z hlediska hodnoty OPN v kapalině kloubní dutiny u pacientů s revmatoidní artritidou a pacientů s osteoartritodou ukázalo, že hodnota OPN u pacientů s revmatoidní artritidou byla významně vyšší než hodnota OPN u pacientů s osteoartritidou, jestliže bylo použito kteréhokoli systému 1 - 3 a 5 - 1.
Jako nový indikátor byl vyšetřován poměr hodnot OPN u těchto systémů 1 - 3 a 5 - 1. Tento indikátor může být použit pro srovnání poměru thrombinem rozštěpeného OPN. Hodnoty OPN v plasmě tekutin kloubní dutiny pacientů s revmatoidní artritidou byly 1 nebo nižší, a hodnoty OPN u pacientů s osteoartritidou byly 2 nebo vyšší, takže byl pozorován významný rozdíl. Tyto hodnoty OPN u systému 1 3/5 - 1 mohou být použity pro diagnostické rozlišení pacientů s revmatismem od pacientů s osteoartritidou v časném stadiu.
- 48 ······ « · · · · • re * · »· « · ····· · · β · • · · · » · ·· ··· ··· ··· ?·
Tabulka 9
| Vzorek | Systém 1 - 3 (ng/ml) | Systém 5 - 1 (ng/ml) | Systém 1 - 3/ systém 5 - 1 |
| RA 1 | 8498 | 2932 | 2,898 |
| RA 2 | 22715 | 26223 | 0,866 |
| RA 3 | 2659 | 1905 | 1,396 |
| RA 4 | 20186 | 94430 | 0,214 |
| RA 5 | 1520 | 2002 | 0,759 |
| RA 6 | 5870 | 2238 | 2,623 |
| RA 7 | 7303 | 56753 | 0,129 |
| RA 8 | 2200 | 6268 | 0,351 |
| RA 9 | 18344 | 59873 | 0,306 |
| RA10 | 2133 | 2002 | 1,065 |
| RA11 | 26804 | 33036 | 0,811 |
| RA12 | 18868 | 32824 | 0,575 |
| RA13 | 3633 | 6067 | 0,599 |
| Střední hodnota | 10825,6 | 25119,5 | 0,969 |
• · · · · « » · « » · · · · • · · · · 1
- 49 Tabulka 10
| Vzorek | Systém 1 - 3 (ng/ml) | Systém 5 - 1 (ng/ml) | Systém 1-3/ systém 5 - 1 |
| OA 1 | 1520 | 3471 | 0,438 |
| OA 2 | 9957 | 14374 | 0,693 |
| OA 3 | 6595 | 2932 | 2,249 |
| OA 4 | 3523 | 237 | 14,865 |
| OA 5 | 8619 | 28483 | 0,303 |
| OA 6 | 1926 | 896 | 2,150 |
| OA 7 | 653 | 850 | 0,768 |
| OA 8 | 6490 | 7814 | 0,831 |
| OA 9 | 4750 | 1987 | 2,391 |
| OA10 | 6830 | 2932 | 2,329 |
| OA11 | 386 | 181 | 2,133 |
| OA12 | 1621 | 356 | 4,553 |
| Střední hodnota | 4405,8 | 5376,1 | 2,808 |
» · · · · , • · • · · ·
- 50 Tabulka 11
| Vzorek | Systém 1 - 3 (ng/ml) | Systém 5 - 1 (ng/ml) | Systém 1 - 3/ systém 5 - 1 |
| RA 1 | 1621 | 1379 | 1,175 |
| RA 2 | 532 | 845 | 0,630 |
| RA 3 | 132 | 617 | 0,214 |
| RA 4 | 142 | 1758 | 0,081 |
| RA 5 | 624 | 2089 | 0,299 |
| RA 6 | 341 | 1990 | 0,171 |
| RA 7 | 152 | 845 | 0,180 |
| RA 8 | 671 | 224 | 2,996 |
| RA 9 | 543 | 557 | 0,975 |
| RA10 | 947 | 431 | 2,197 |
| RA11 | 935 | 1794 | 0,521 |
| RA12 | 1008 | 1650 | 0,611 |
| RA13 | 636 | 678 | 0,938 |
| RA14 | 464 | 545 | 0,851 |
| RA15 | 683 | 488 | 1,400 |
| RA16 | 1057 | 597 | 1,771 |
| Střední hodnota | 6555 | 1030,4 | 0,938 |
- 51 Tabulka 12
| Vzorek | Systém 1 - 3 (ng/ml) | Systém 5 - 1 (ng/ml) | Systém 1 - 3/ systém 5 - 1 |
| OA 1 | 695 | 302 | 2,301 |
| OA 2 | 1094 | 412 | 2,655 |
| OA 3 | 1070 | 557 | 1,921 |
| OA 4 | 75 | 1129 | 0,066 |
| OA 5 | 814 | 356 | 2,286 |
| OA 6 | 959 | 276 | 3,475 |
| OA 7 | 983 | 311 | 3,161 |
| Střední hodnota | 812,9 | 477,6 | 2,267 |
Tabulka 13
| Vzorek | Systém 1 - 3 (ng/ml) | Systém 5 - 1 (ng/ml) | Systém 1 - 3/ systém 5 - 1 |
| Normální 1 | 475 | 199 | 2,387 |
| Normální 2 | 578 | 249 | 2,321 |
| Normální 3 | 802 | 232 | 3,457 |
| Normální 4 | 983 | 384 | 2,560 |
| Normální 5 | 520 | 284 | 1,831 |
| Normální 6 | 624 | 215 | 2,902 |
| Střední hodnota | 663,7 | 260,5 | 2,576 |
Zastupuje:
Claims (5)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Protilátka proti osteopontinu která může inhibovat vazbu mezi5 integrinem rozpoznávajícím místo aminokyselinové sekvenceRGD a osteopontinem nebo jeho fragmentem, a která může také inhibovat vazbu mezi integrinem rozpoznávajícím místo aminokyselinové sekvence SVVYGLR nebo odpovídající ekvivalentní sekvencí a osteopontinem nebo jeho fragmentem.
- 2. Protilátka proti osteopontinu která může inhibovat vazbu mezi integrinem rozpoznávajícím místo aminokyselinové sekvence RGD a osteopontinem nebo jeho fragmentem, a která může také inhibovat vazbu mezi α9β1 integrinem a osteopontinem nebo15 jeho fragmentem.
- 3. Protilátka proti osteopontinu která může inhibovat vazbu mezi integrinem rozpoznávajícím místo aminokyselinovoé sekvence RGD a osteopontiem nebo jeho fragmentem, a která může také20 inhibovat vazbu mezi a4 integrinem a osteopontinem nebo jeho fragmentem.
- 4. Protilátka proti osteopontinu která může inhibovat vazbu mezi integrinem rozpoznávajícím místo aminokyselinové sekvence25 RGD a osteopontinem nebo jeho fragmentem, a která může také inhibovat vazbu mezi α9β1 integrinem a osteopontinem nebo jeho fragmentem, a vazbu mezi cc4 integrinem a osteopontinem nebo jeho fragmentem.• · · · · · • · · • · · · ·- 53 5.Protilátka proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 4, kde tímto fragmentem je N-koncový fragment osteopontinu.Protilátka proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 5, kde tato protilátka je vytvořena proti peptidu obsahujícímu částečnou aminokyselinovou sekvenci RGDSVVYGLR jako antigenu.ίο 7.15 8Protilátka proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 6, kde tato protilátka je vytvořena proti peptidu obsahujícímu částečnou aminokyselinovou sekvenci RGDSVVYGLRS jako antigenu.Protilátka proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 7, kde tato protilátka je vytvořena proti peptidu VDTYDGRGDSVVYGLRS jako antigenu.Protilátka proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 5, kde tato protilátka je vytvořena proti peptidu obsahujícímu částečnou aminokyselinovou sekvenci RGDSLAYGLR jako antigenu.Protilátka proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 5, kde tato protilátka je vytvořena proti peptidu CVDVPNGRGDSLAYGLR jako antigenu.- 54 11. Protilátka proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 10, kde tato protilátka je monoklonální protilátka.12. Protilátka proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 8,
- 5 kde tato protilátka je humanizovaná protilátka.13. Protilátka proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 8, kde tato protilátka je protilátka lidského typu.w 14. Farmaceutický prostředek pro léčení autoimunitních onemocnění, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje protilátku proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 13.15 15. Farmaceutický prostředek pro léčení revmatismu, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje protilátku proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 13.20 16. Farmaceutický prostředek pro léčení revmatoidní artritidy, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje protilátku proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 13.25 17. Farmaceutický prostředek pro léčení osteoartritidy, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje protilátku proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 13.• · · 4 • ♦ • · · ·- 55 18. Způsob léčení autoimunitních onemocnění, který zahrnuje podávání protilátky proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 13 pacientovi s autoimunitními onemocněními.19. Způsob léčení revmatismu, který zahrnuje podávání protilátky proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 13 pacientovi s revmatismem.io 20. Způsob léčení revmatoidní artritidy, který zahrnuje podávání protilátky proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 13 pacientovi s revmatoidní artritidou.21. Způsob léčení osteoartritidy, který zahrnuje podávání protilátky15 proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 13 pacientovi s osteoartritidou.22. Způsob screeningu na léčivo pro léčení autoimunitních onemocnění, vyznačující se tím, že zahrnuje20 vyhodnocení testované sloučeniny z hlediska stupně inhibice vazby mezi místem sekvence RGD osteopontinu a integrinem a/nebo vazby mezi místem sekvence SVVYGLR a integrinem.23. Způsob screeningu na léčivo pro léčení revmatismu,25 vyznačující se tím, že zahrnuje vyhodnocení testované sloučeniny z hlediska stupně inhibice vazby mezi místem sekvence RGD osteopontinu a integrinem a/nebo vazby mezi místem sekvence SVVYGLR a integrinem.- 56 * ·24. Způsob screeningu na léčivo pro léčení revmatoidní artritidy, vyznačující se tím, že zahrnuje vyhodnocení testované sloučeniny z hlediska stupně inhibice vazby mezi místem sekvence RGD osteopontinu a integrinem a/nebo místem sekvence SVVYGLR a integrinem.25. Způsob screeningu na léčivo pro léčení osteoartritidy, vyznačující se tím, že zahrnuje vyhodnocení testované sloučeniny z hlediska stupně inhibice vazby mezi místem sekvence RGD osteopontinu a integrinem a/nebo místem sekvence SVVYGLR a integrinem.26. Protilátka proti isoformě OPN, která je připravena ponecháním peptidového fragmentu odpovídajícího isoformě OPN navázat se na biopolymerní sloučeninu, imunizací zvířete získaným navázaným produktem a izolací protilátky ze zvířete.27. Protilátka proti isoformě OPN podle nároku 26, kde uvedeným peptidovým fragmentem odpovídajícím isoformě OPN je peptid následujícího vzorce (1), (2) nebo (3):CVDTYDGRGDSVVYGLRS (1)KSKKFRRPDIQYPDATDEC (2)IPVKQADSGSSEEKQC (3).28. Diagnostická metoda pro rozlišení zánětlivých abnormalit mezi revmatoidní artritidou a osteoartritidou, která zahrnuje detekci N-koncového fragmentu OPN, a detekční kit pro provádění této metody.29. Metoda rozlišení zánětlivých abnormalit podle nároku 28, kde tato metoda zahrnuje použití tekutiny z kloubní dutiny nebo plasmy, a detekční kit pro provádění této metody.30. Detekční kit pro zjišťování zánětlivých abnormalit, vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci prvního imunodetekčního činidla využívajícího sady dvou ze tří typů uvedených protilátek proti isoformě OPN podle nároku 27 io s druhým imunodetekčním činidlem využívajícím další sady dvou ze tří typů uvedených protilátek.31. Detekční kit pro zjišťování zánětlivých abnormalit podle nároku 29, vyznačující se tím, že uvedené dva typy15 protilátek pro použití v prvním imunodetekčním činidle jsou protilátky proti peptidům individuálně reprezentovaným následujícími vzorci (3) a (2):IPVKQADSGSSEEKQC (3)KSKKFRRPDIQYPDATDEC (2); a20 uvedené dva typy protilátek pro použití v druhém imunodetekčním činidle jsou protilátky proti peptidům individuálně reprezentovaným následujícími vzorci (1) a (3): CVDTYDGRGDSVVYGLRS (1)IPVKQADSGSSEEKQC (3).32. Použití protilátky proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 13 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení autoimunitních onemocnění.- 58 33. Použití protilátky proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 13 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení revmatismu.34. Použití protilátky proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 13 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení revmatoidní artritidy.io 35. Použití protilátky proti osteopontinu podle některého z nároků 1 až 13 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení osteoarthritidy.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001107578 | 2001-04-05 | ||
| JP2001290700 | 2001-09-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20032697A3 true CZ20032697A3 (cs) | 2004-01-14 |
Family
ID=26613159
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20032697A CZ20032697A3 (cs) | 2001-04-05 | 2002-04-04 | Protilátka proti osteopontinu a farmaceutický prostředek |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20040234524A1 (cs) |
| EP (2) | EP1754719A3 (cs) |
| JP (1) | JP4230776B2 (cs) |
| KR (1) | KR100881900B1 (cs) |
| CN (1) | CN100469793C (cs) |
| AR (1) | AR033121A1 (cs) |
| AT (1) | ATE412013T1 (cs) |
| AU (1) | AU2002244968B2 (cs) |
| BR (1) | BR0208809A (cs) |
| CA (1) | CA2443330A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20032697A3 (cs) |
| DE (1) | DE60229509D1 (cs) |
| ES (1) | ES2314040T3 (cs) |
| HU (1) | HUP0401561A2 (cs) |
| MX (1) | MXPA03009052A (cs) |
| NO (1) | NO20034405L (cs) |
| NZ (1) | NZ528483A (cs) |
| PL (1) | PL366469A1 (cs) |
| RU (1) | RU2299888C2 (cs) |
| WO (1) | WO2002081522A1 (cs) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7202044B2 (en) | 2001-05-09 | 2007-04-10 | Biovision Ag | Method for detecting a progressive, chronic dementia disease, and corresponding peptides and detection agents |
| NZ573740A (en) | 2001-09-18 | 2010-07-30 | Genentech Inc | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor, particularly kidney tumor - TAT184 |
| US7241873B2 (en) * | 2001-09-25 | 2007-07-10 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Recombinant anti-osteopontin antibody and use thereof |
| AU2003258127A1 (en) * | 2002-08-06 | 2004-02-23 | Diadexus, Inc. | Compositions and methods relating to ovarian specific genes and proteins |
| WO2004103403A1 (ja) * | 2003-05-23 | 2004-12-02 | Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. | 免疫担当細胞活性化阻害剤およびその用途 |
| US20050042214A1 (en) * | 2003-07-15 | 2005-02-24 | Gershwin M. Eric | Discovery of the microorganism that causes the human autoimmune disease, primary biliary cirrhosis |
| EP1805220A1 (en) * | 2004-10-13 | 2007-07-11 | Genentech, Inc. | Method for treating tumors using anti-osteopontin antibodies |
| KR101316990B1 (ko) | 2005-01-13 | 2013-10-11 | 가부시키가이샤 진 테크노 사이언스 | 항-α9 인테그린 항체와 그 용도 |
| RU2429016C2 (ru) | 2006-05-31 | 2011-09-20 | Астеллас Фарма Инк. | Гуманизированное антитело против остеопонтина человека |
| DK2047863T3 (da) | 2006-06-08 | 2013-09-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Middel til forebyggelse eller behandling af inflammatoriske sygdomme |
| WO2007149948A2 (en) | 2006-06-20 | 2007-12-27 | The Gov. Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Compositions and methods for diagnosis and treatment of tumors |
| KR101429783B1 (ko) | 2006-07-12 | 2014-08-18 | 가부시키가이샤 진 테크노 사이언스 | 항 인간 α９ 인테그린 항체와 그 용도 |
| US7981672B2 (en) | 2006-09-11 | 2011-07-19 | Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. | Monoclonal antibody and use thereof |
| CA2667263C (en) * | 2006-10-26 | 2016-11-08 | Gene Techno Science Co., Ltd. | Antibody against rgd in amino acid sequence of extracellular matrix protein and production method and use of the same |
| CN101293916A (zh) * | 2007-04-24 | 2008-10-29 | 上海国健生物技术研究院 | 骨桥蛋白的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及用途 |
| CN101293924A (zh) * | 2007-04-24 | 2008-10-29 | 上海国健生物技术研究院 | 骨桥蛋白的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及其在制备抗肿瘤转移药物中的用途 |
| KR100894265B1 (ko) * | 2007-06-05 | 2009-04-21 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 골형성 촉진 펩타이드를 함유하는 주입형 골재생재 |
| JP2011501112A (ja) | 2007-10-10 | 2011-01-06 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 心筋梗塞のモニタリング及びその治療のための手段及び方法 |
| MY177564A (en) | 2007-12-05 | 2020-09-20 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-nr10 antibody and use thereof |
| CA2711882C (en) | 2008-01-11 | 2016-07-19 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Improved humanized anti-human .alpha.9-integrin antibody |
| JP2011509650A (ja) | 2008-01-11 | 2011-03-31 | 株式会社ジーンテクノサイエンス | ヒト化抗−α９インテグリン抗体及びその使用 |
| US8614296B2 (en) | 2008-04-24 | 2013-12-24 | Gene Techno Science Co., Ltd. | Humanized antibodies specific for amino acid sequence RGD of an extracellular matrix protein and the uses thereof |
| WO2010095270A1 (ja) | 2009-02-23 | 2010-08-26 | 株式会社ジーンテクノサイエンス | 抗ヒトα９インテグリン抗体とその用途 |
| KR101667227B1 (ko) | 2009-03-10 | 2016-10-18 | 가부시키가이샤 진 테크노 사이언스 | 인간화된 ｋ33ｎ 단일 클론 항체의 제조, 발현 및 해석 |
| JP2012526983A (ja) * | 2009-05-12 | 2012-11-01 | イノファーマスクリーン、インコーポレイテッド | オステオポンチン抑制剤のスクリーニング方法及びそれによる抑制剤 |
| US8617829B2 (en) | 2009-09-24 | 2013-12-31 | Gene Techno Science Co., Ltd. | Humanized antibodies specific for amino acid sequence RGD of an extracellular matrix protein and the uses thereof |
| MX2013009859A (es) | 2011-03-01 | 2014-02-28 | Novo Nordisk As | Ligandos dr3 antagonicos. |
| GB2493540A (en) * | 2011-08-10 | 2013-02-13 | Follicum Ab | Agents for stimulating hair growth in mammals |
| TW201623329A (zh) * | 2014-06-30 | 2016-07-01 | 亞佛瑞司股份有限公司 | 針對骨調素截斷變異體的疫苗及單株抗體暨其用途 |
| EP3284480A4 (en) | 2015-04-14 | 2018-12-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of atopic dermatitis containing il-31 antagonist as active ingredient |
| US20220324956A1 (en) * | 2019-08-09 | 2022-10-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Therapeutic Antibodies Against Osteopontin |
| WO2021100794A1 (ja) | 2019-11-20 | 2021-05-27 | 中外製薬株式会社 | 抗体含有製剤 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US171358A (en) * | 1875-12-21 | Improvement in machines for trimming and punching roofing-slates | ||
| US63247A (en) * | 1867-03-26 | hbtdeick | ||
| US63241A (en) * | 1867-03-26 | Jacob green | ||
| US705842A (en) * | 1901-10-25 | 1902-07-29 | Daniel M Moroney | Machine for assembling links in making chain belts. |
| US5459060A (en) * | 1989-08-24 | 1995-10-17 | Bioclonetics Incorporated | Human monoclonal antibodies directed against the transmembrane glycoprotein (gp41) of human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| GB9122820D0 (en) * | 1991-10-28 | 1991-12-11 | Wellcome Found | Stabilised antibodies |
| DE69433422T2 (de) * | 1993-03-11 | 2004-09-16 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Monoklonaler anti-hiv antikörper |
| EP0705842A2 (en) * | 1994-10-06 | 1996-04-10 | Hoechst Aktiengesellschaft | Regulated genes by stimulation of chondrocytes with 1L-1beta |
| US6414219B1 (en) * | 1998-06-30 | 2002-07-02 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Osteopontin knock-out mouse and methods of use thereof |
| AU777432B2 (en) * | 1999-04-15 | 2004-10-14 | Children's Medical Center Corporation | Osteopontin-derived chemotactic and inhibitory agents and uses therefor |
| EP1269196B1 (en) * | 2000-03-23 | 2007-11-21 | Glaxo Group Limited | Method of screening for inhibitors of osteopontin |
| US7241873B2 (en) * | 2001-09-25 | 2007-07-10 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Recombinant anti-osteopontin antibody and use thereof |
-
2002
- 2002-04-04 AT AT02713293T patent/ATE412013T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-04-04 AU AU2002244968A patent/AU2002244968B2/en not_active Ceased
- 2002-04-04 CA CA002443330A patent/CA2443330A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-04 JP JP2002579907A patent/JP4230776B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-04 NZ NZ528483A patent/NZ528483A/en unknown
- 2002-04-04 PL PL02366469A patent/PL366469A1/xx unknown
- 2002-04-04 CN CNB028110862A patent/CN100469793C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-04 ES ES02713293T patent/ES2314040T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-04 RU RU2003132446/13A patent/RU2299888C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-04-04 CZ CZ20032697A patent/CZ20032697A3/cs unknown
- 2002-04-04 US US10/473,134 patent/US20040234524A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-04 KR KR1020037012488A patent/KR100881900B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-04-04 MX MXPA03009052A patent/MXPA03009052A/es active IP Right Grant
- 2002-04-04 BR BR0208809-6A patent/BR0208809A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-04-04 WO PCT/JP2002/003382 patent/WO2002081522A1/ja active IP Right Grant
- 2002-04-04 EP EP06120039A patent/EP1754719A3/en not_active Withdrawn
- 2002-04-04 DE DE60229509T patent/DE60229509D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-04 EP EP02713293A patent/EP1375518B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-04 HU HU0401561A patent/HUP0401561A2/hu unknown
- 2002-04-05 AR ARP020101262A patent/AR033121A1/es not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-10-02 NO NO20034405A patent/NO20034405L/no not_active Application Discontinuation
-
2007
- 2007-08-08 US US11/836,078 patent/US20080069815A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO20034405L (no) | 2003-12-05 |
| HUP0401561A2 (hu) | 2004-11-29 |
| EP1375518B1 (en) | 2008-10-22 |
| AR033121A1 (es) | 2003-12-03 |
| DE60229509D1 (de) | 2008-12-04 |
| CN100469793C (zh) | 2009-03-18 |
| PL366469A1 (en) | 2005-02-07 |
| ATE412013T1 (de) | 2008-11-15 |
| NZ528483A (en) | 2008-03-28 |
| KR20030092022A (ko) | 2003-12-03 |
| AU2002244968B2 (en) | 2007-07-26 |
| JP4230776B2 (ja) | 2009-02-25 |
| KR100881900B1 (ko) | 2009-02-04 |
| US20080069815A1 (en) | 2008-03-20 |
| ES2314040T3 (es) | 2009-03-16 |
| RU2003132446A (ru) | 2005-04-27 |
| WO2002081522A1 (fr) | 2002-10-17 |
| RU2299888C2 (ru) | 2007-05-27 |
| BR0208809A (pt) | 2004-03-09 |
| CN1513000A (zh) | 2004-07-14 |
| EP1375518A1 (en) | 2004-01-02 |
| EP1754719A2 (en) | 2007-02-21 |
| EP1375518A4 (en) | 2004-12-08 |
| US20040234524A1 (en) | 2004-11-25 |
| JPWO2002081522A1 (ja) | 2004-07-29 |
| NO20034405D0 (no) | 2003-10-02 |
| EP1754719A3 (en) | 2007-05-16 |
| MXPA03009052A (es) | 2004-10-15 |
| CA2443330A1 (en) | 2002-10-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2002244968B2 (en) | Anti-osteopontin antibody and use thereof | |
| US7241873B2 (en) | Recombinant anti-osteopontin antibody and use thereof | |
| US8338379B2 (en) | Monoclonal antibody and use thereof | |
| WO2008007804A1 (fr) | ANTICORPS ANTI-INTÉGRINE α-9 HUMAINE ET UTILISATION DE CELUI-CI | |
| RU2287580C2 (ru) | Рекомбинантный рецептор коллагена на тромбоцитах гликопротеин vi и его применение в фармацевтике | |
| US7981672B2 (en) | Monoclonal antibody and use thereof | |
| EP2727937A1 (en) | Soluble integrin 4 mutant | |
| CN104768970A (zh) | 模拟肽 | |
| JP5399710B2 (ja) | 細胞外マトリックスタンパク質のアミノ酸配列ｒｇｄに対する抗体およびその製法と用途 | |
| KR20070042994A (ko) | 항시노비올린 항체 | |
| JP2007106767A (ja) | 抗オステオポンチン抗体およびその用途 | |
| JP3663243B2 (ja) | Ｆａｓ抗原の免疫学的測定法及び測定用キット | |
| JP2004155745A (ja) | ペプチドおよびその利用 | |
| JP4020467B2 (ja) | 細胞接着活性ペプチド | |
| JPWO2003052417A1 (ja) | 細胞外グラニュライシンの検出方法 |