CZ20032014A3 - 2H-1-benzopyranové deriváty a farmaceutický prostředek - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká 2H-l-benzopyranových derivátů a farmaceutického prostředku, který tyto látky obsahuje. Popsány jsou také způsoby výroby uvedených sloučenin.

Dosavadní stav techniky

V dokumentu WO 94/20098 (Zymogenetics) se popisují 3,4-diaryl-2H-l-benzopyrany pro použití k zábraně ztráty kostní tkáně, zvláště v případě osteoporózy.

Zvláště, výhodnou sloučeninou, popsanou v tomto dokumentu, je 1-enanciomer centchromanu, který byl později dodáván . (Novo Nordisk) jako levormeloxifen pro léčení osteoporózy.

Levormeloxifen bude'dále použit jako srovnávací sloučenina.

Substituované benzopyranové a thiobenzopyranové deriváty se silným antiestrogenním účinkem byly později popsány v dokumentech WO 98/25916 a WO 99/65893 (C&C Research Laboratories).

Sloučeniny podle vynálezu se svou chemickou strukturou od známých benzopyranů liší

- přítomností dvojné vazby mezi atomy v poloze 3-4 nebo 4-4a, tato vazba může být endo- nebo exocyklická,

- substitucí na atomu uhlíku v poloze 4 benzopyranového kruhu, substituentem je terč.aminoalkyloxybenzyl nebo benzylidenyl,

- přítomností hydroxyskupiny v poloze 5 v případě, že substituentem na atomu uhlíku v poloze 4 je terč.aminoalkyloxyfenyl.

Tyto rozdíly ve struktuře benzopyranu a zvláště přítomnost methylenového nebo methylidenového můstku mezi atomem uhlíku v poloze 4 benzopyranového kruhu a atomem uhlíku fenylové skupiny má patrně základní důležitost pro farmakologickou účinnnost sloučenin podle vynálezu.

Nesteroidní benzothiofenový derivát raloxifen, popsaný v publikaci Jones CD a další, J. Med. Chem. 27, 1057-159, 1984 je účinný jako agonista i antagonista estrogenu ve specifických tkáních a začíná být klinicky využíván v.USA a v. některých evropských státech.

Také s touto látkou je možno sloučeniny podle vynálezu výhodně srovnávat.

Jako látky s účinností ŠERM byly popsány ještě další syntetické sloučeniny s uvedeným spektrem účinnosti, včetně trifenylethylenu a dihydronaftalenu. Ukázalo se, že používání těchto látek je problematické vzhledem k příliš velké stimulaci děložní tkáně.

Nové látky typu ŠERM podle vynálezu mají prokazatelné příznivé účinky na kostní tkáň a na koncentraci lipidů v krevním séru a také antagonistické účinky, které jsou spojeny s nízkým stupněm estrogenního účinku na reproduktivní tkáně.

»·'

Vzhledem ke specifickým agonistickým a antagonistickým účinkům typu estrogenu je možno sloučeniny podle vynálezu využívat k léčebným účelům, zvláště k prevenci a léčení postmenopauzálních patologických stavů, jako jsou osteoporóza, koronární srdeční onemocnění a zhoubné nádory, závislé na estrogenech.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří 2H-i-benzopyranové deriváty obecného vzorce I

R1

kde Rx a R₂ nezávisle znamenají atom vodíku, alkyl, halogenalkyl, alkenyl nebo halogenalkenyl nebo tvoří tyto skupiny spolu s atomem dusíku, na nějž jsou vázány, 4- až 8-členný heterocyklický kruh,

X znamená atom vodíku, alkyl, aryl, nitroskupinu, atom halogenu, 0-R₃, kde R₃ znamená atom vodíku, alkyl, aryl, alkanoyl nebo aryloyl,

X! znamená atom vodíku, alkyl nebo alkoxyskupinu a v případě, že X a X_x znamenají alkylové zbytky, mohou tyto skupiny spolu s atomem uhlíku, na nějž jsou vázány tvořit kondenzovaný aromatický kruh za vzniku α-naftalenylové skupiny,

Y znamená atom vodíku, alkyl, alkanoyl, aryloyl, (i alkyl aminokarbonyl, alkyloxykarbonyl,

Z znamená atom vodíku, 0-R₄, kde R₄ znamená atom vodíku, alkyl, alkanoyl nebo aryloyl, m znamená 1 nebo 2, n znamená. 0 nebo 1, p znamená 2 až 6

-j—znamená jednoduchou nebo dvojnou vazbu mezi atomy v polohách 3-4 nebo 4-4a, přičemž v případě, že n = 1, může být dvojná vazba exocyklická nebo endocyklická za vzniku 4-benzylidenchromanu v případě, že m = 1 nebo

4-benzylchrom-3-enu v případě, že m = 2 a v případě, že n =0, může být endocyklická vazba 3-4 jednoduchá nebo dvojná vazba a v případě, že n = 0 a endocyklická vazba 3-4 je jednoduchá vazba, má Z odlišný význam od atomu vodíku.

Sloučeniny podle vynálezu mohou existovat ve formě solí .

*

Sloučeniny s bazickými skupinami mohou vytvářet adiční soli s organickými nebo anorganickými kyselinami.

Sloučeniny, které obsahují kyselé skupiny, mohou existovat ve formě solí s alkalickými kovy nebo s kovy alkalických zemin nebo ve formě solí s aminy.

·· ·· ·· ·· ···· '· · · · · · · '·

V případě, že ve sloučeninách obecného vzorce I je vazba mezi polohami 3 a 4 benzopyranového kruhu jednoduchá vazba, mohou být atomy uhlíku v poloze 3 a 4 asymetrické a pak mohou sloučeniny existovat jako čisté enanciomery, směsi diastereoisomerů nebo racemáty.

Alkylovým zbytkem je s výhodou Cl-C4alkyl, jako methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl nebo terč.butyl.

Halogenalkyl je s výhodou Cl-C4alkyl, substituovaný 1 až 5 atomy fluoru nebo chloru, jde tedy například o trifluormethyl.

Alkenyl je s výhodou C2-C4alkenyl, například ethenyl. nebo allyl. Halogenalkenyl je s výhodou C2-C4alkenyl, substituovaný 1 až 3 atomy halogenu.

Aryl je s výhodou fenyl nebo naftyl, popřípadě substituovaný 1 až 3 substituenty, které mohou být stejné nebo odlišné a volí se ze skupiny atom halogenu, alkyl, alkoxyskupina, nitroskupina, kyanoskupina, trifluormethyl, aminoskupina nebo hydroxyskupina.

Alkenoyl je s výhodou Cl-C4alkanoyl, například formyl, acetyl nebo propionyl.

Aryloyl je s výhodou benzoyl, popřípadě substituovaný 1 až 3 substituenty, které jsou stejné nebo odlišné a volí se ze skupiny atom halogenu, alkyl, alkoxyskupina, nitroskupina, kyanoskupina, trifluormethyl, aminoskupina nebo hydroxyskupina.

• · • · · ·4 « ·« • · 4 · · 4 4

4 4 4 4 4 ·

444 4 444 444 ·

4 · · · · · · · • 44 44 44 44 44

Výhodnými sloučeninami obecného vzorce I jsou ty látky, v nichž R_x a R₂ společně s atomem dusíku piperidinový nebo pyrrolidinový kruh a Y znamená atom vodíku nebo alkenoyl,

Z znamená atom vodíku, hydroxyskupinu nebo alkoxyskupinu, n = 0 nebo 1, p = 2, X a Xi znamená atom vodíku nebo znamená jeden z těchto symbolů atom vodíku a druhý atom helogenu nebo skupnu 0R₃, kde R₃ má svrchu uvedený význam, s. výhodou v poloze para.

Ve výhodném provedení se vynález týká 2H-l-benzopyranových derivátů obecného vzorce IA

kde X znamená atom vodíku, Cl-C4alkoxyskupinu a Y znamená atom vodíku Cl-C4alkyl, Cl-C5alkanoyl nebo aryloyl.

Aryloyl je s výhodou benzoyl, popřípadě substituovaný 1 až 3 substituenty, které jsou stejné nebo odlišné a volí se ze skupiny atom halogenu, alkyl, alkoxyskupina, nitroskupina, kyanoskupina, trifluormethyl, aminoskupina nebo hydroxyskupina.

4* ·· 9· 4444 • · 4 4 4 4 · · · • · · 4 · ··· 4 4 4 φ

4 4 4 4 4444 · · 4 4 4 · · 4 ·

Sloučeniny tvoří soli, například adiční soli s organickými nebo anorganickými kyselinami nebo soli s alkalickými kovy, kovy alkalických zemin nebo organickými aminy.

Sloučeniny obecného vzorce I náleží do skupiny selektivních modulátorů receptoru estrogenu ŠERM, které jsou schopné se vázat na receptor estrogenu a dostávat se s ním do interakce, avšak v některých tkáních, jako je kostní tkáň, působí jako látky s agonistickým účinkem estrogenu a v dalších tkáních, například v mléčné žláze a děloze jako látky, antagonizujicí účinek estrogenu.

Uvedené látky si uchovávají své příznivé účinky typu estrogenu bez některých jeho nežádoucích vedlejších účinků.

Vynález se také týká způsobu výroby sloučenin obecného vzorce I

Ri

·· ···· « ·· ♦· ·* ··«· ·.·· · * · ··· ····*·<

• · · · · · ··· · · · · ··· · · · ·*·· ··· ·« ·· ·» ·· ·· kde Ri a R₂ nezávisle znamenají atom vodíku, alkyl, halogenalkyl, alkenyl nebo halogenalkenyl nebo tvoří tyto skupiny spolu s atomem dusíku, na nějž jsou vázány, 4- až 8-členný heterocyklický kruh,

X znamená atom vodíku, alkyl, aryl, nitroskupinu, atom halogenu, 0-R₃, kde R₃ znamená atom vodíku, alkyl, aryl, alkanoyl nebo aryloyl,

Xi znamená atom vodíku, alkyl nebo alkoxyskupinu a v případě, že X a Xi znamenají alkylové zbytky, mohou tyto skupiny spolu s atomem uhlíku, na nějž jsou vázány tvořit kondenzovaný aromatický kruh za vzniku α-naftalenylové skupiny,

Y znamená atom vodíku, alkyl, alkanoyl, aryloyl, alkylaminokarbonyl, alkyloxykarbonyl,

Z znamená atom vodíku, 0-R₄, kde R₄ znamená atom vodíku, alkyl, alkanoyl nebo aryloyl, m znamená 1 nebo 2, n znamená 0 nebo 1, p znamená 2 až 6

----- znamená jednoduchou nebo dvojnou vazbu mezi atomy v .

polohách 3-4 nebo 4-4a, přičemž v případě, že n = 1, může být dvojná vazba exocyklická nebo endocyklická za vzniku 4-benzylidenchromanu v případě, že m = 1 nebo

4-benzylchrom-3-enu v případě, že m = 2 a v případě, že n = 0, může být endocyklická vazba 3-4 jednoduchá nebo dvojná vazba a v případě, že n = 0 a endocyklická vazba 3-4 je jednoduchá vazba, má Z odlišný význam od atomu vodíku.

V následujících schématech 1 a 2 je popsána příprava 2 -(N-piperidinyl)ethoxyderivátů obecného vzorce I. Schémata je také možno použít na jiné terč.aminoalkyloxyanalogy sloučenin obecného vzorce I.

V • ·

·· · • ·

Schéma 2

γ.

—O

(XXIV) (XXV) (XXVII) (xxvni) (+)enanciomer a (-)enanciomer

W)'., 'I':·'' • ·

Sloučeniny obecného vzorce I, v nichž Z = 0R₄ je možno připravit podle schématu 1 reakcí 1,3,5-trihydroxybenzenu se substituovaným fenylacetonitrilem v aprotickém rozpouštědle, nasyceném plynným HCI, vznikne ketimin vzorce II, který je možno hydrolyzovat ve vroucí vodě za vzniku odpovídajícího ketonu vzorce III, který je možno cyklizovat působením N,N-dimethylformamiddimethylacetalu a diethyletherátu trifluoridu boritého v dimethylformamidu DMF za vzniku sloučeniny vzorce IV.

Sloučeniny vzorce IV je možno chránit v poloze 7 například tvorbou vhodného anhydridu v rozpouštědle nebo bez.rozpouštědla při teplotě 0 °C až teplotě varu rozpouštědla'nebo čistého anhydridu, nebo je možno vytvořit halogenid v aprotickém rozpouštědle v přítomnosti baze, čímž se získá ester vzorce V, který musí být stálý v průběhu Grignardovy reakce.

Výsledné sloučeniny vzorce V je možno hydrogenovat v přítomnosti vhodného katalyzátoru za vzniku sloučenin vzorce VI.

Přidáním Grignardova reakčního činidla vzorce VII, získaného z 4 -(terč.aminoalkyloxy)-1-brombenzenu a hořčíku v aprotickém rozpouštědle ke ketonům vzorce VI pří teplotě -70 °C až teplotě varu rozpouštědla se získají alkoholy vzorce VIII, které je možno dehydratovat například v ethanolovém roztoku koncentrované kyseliny chlorovodíkové, čímž se získají sloučeniny vzorce IX.

Sloučeniny vzorce IX je možno alkylovat nebo acylovat působením alkylhalogenidu nebo acylhalogenidu ve vhodném rozpouštědle v přítomnosti baze nebo je možno je acylovat

• · • · · · • · • · působením anhydridu kyseliny při vyšších teplotách bez rozpouštědla za vzniku sloučenin vzorce X,'v nichž Y, které je odlišné od R₄, je ochrannou skupinou, která se voli tak, že je stálá při Grignardově reakci. Sloučeniny vzorce IX je možno zbavit ochranných skupin, například koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou nebo bromovodíkovou při vyšších teplotách nebo v případě, že Y znamená acyl působením uhličitanu draselného ve vodném methanolu pří teplotě místnosti za vzniku odpovídajících volných fenolů vzorce XI, které je možno dialkylovat, například působením alkylhalogenidu ve vhodném rozpouštědle v přítomnosti baze nebo je možno tyto látky diacylovat, například působením acylhalogenidu ve vhodném rozpouštědle a v přítomnosti baze nebo působením anhydridu kyseliny v rozpouštědle nebo bez “rozpouštědla za vzniku sloučenin vzorce X, kde Y má význam R₄, který je odlišný od atomů vodíku. Sloučeniny vzorce X je možno hydrogenovat ve vhodném rozpouštědle a v.

přítomnosti katalyzátoru za'vzniku odpovídajících sloučenin vzorce XII, kde Y znamená R₄ nebo má význam, odlišný od R₄ :a současně může mít Y význam, odlišný od ochranné skupiny v průběhu Grignardovy reakce.

fc

Sloučeniny vzorce IX je také možno hydrogenovat za vzniku sloučenin vzorce XIII.

Sloučeniny vzorce. I, v nichž Z znamená atom vodíku, je možno připravit podle schématu II.

• Sloučenina vzorce XIV se chrání na fenolové hydroxyskupině vhodnou ochrannou skupinou Y, která se volí ze skupin, popsaných v literatuře pro ochranu fenolů, jde například o souhrnnou publikaci T. W. Greene, P. G. Wuts, Protéctivegroups in organic synthesis, třetí vydání,, John • ·

Wiley & Sons, lne., 1999, s. 246-292, čímž se získají sloučeniny vzorce XV. Ochrannou skupinu je nutno volit tak, aby byla stálá v průběhu následujících stupňů. Sloučenina vzorce XV se pak selektivně hydrogenuje na olefinové dvojné vazbě tak, aby nedošlo k redukci ketonu na alkoholy, užije se katalytická hydrogenace za přítomnosti vhodného katalyzátoru s obsahem Pd, Pt, Rh, Ru nebo jiných přechodných kovů ve vhodném rozpouštědle, jako jsou alkoholy, THF, aceton, dioxan, ethylacetát, směs alkoholu a vody a podobně, nebo je možno uskutečnit chemickou redukci působením hydridu ve vhodném aprotickém rozpouštědle za vzniku sloučeniny vzorce XVI. Sloučeninu vzorce XVI je pak možno nechat reagovat se sloučeninou vzorce XVII (získanou reakcí chráněného 4-hydroxybenzylchloridu s hořčíkem ve vhodném rozpouštědle,, jako diethyletheru, THF nebo jiných rozpouštědlech typu etheru mezi teplotou místnosti a teplotou varu rozpouštědla) za vzniku sloučenin vzorce XVIII. Ochrannou skupinu Y' pro 4-hydroxybenzylchlorid je rovněž nutno volit podle svrchu uvedených kriterií, avšak užije se obvykle skupina, odlišná od skupiny Y ve sloučeninách vzorce XV. Selektivním odstraněním této druhé ochranné skupiny Y' vznikají sloučeniny vzorce XIX. Tyto látky je možno alkylovat působením halogenalkylaminu ve vhodném rozpouštědle a v přítomnosti baze za vzniku sloučenin obecného vzorce XX.

Sloučeniny vzorce XX je možnodehydratovat, například působením vodné kyseliny chlorovodíkové v acetonitrilu při teplotě místnosti za vzniku směsi sloučenin vzorce XXI a XXII nebo v případě'; že Y = acyl, je možno tuto skupinu odstranit za mírných podmínek, například uhličitanem draselným ve vodném methanolu při teplotě místnosti za vzniku sloučenin vzorce XXIII. Sloučeninu vzorce XXI je ·· · · · možno ze směsi izolovat krystalizací, kdežto sloučeninu vzorce XXII je možno čistit chromatograficky.

Čisté enanciomery sloučenin vzorce XXI je možno připravit chirální chromatografií za vzniku sloučenin vzorce XXV a XXVI.

Sloučeniny vzorce XXI a XXII je možno hydrogenovat za vzniku sloučenin vzorce XXVII.

Sloučeniny vzorce XXIII je možno dehydratovat, například působením vodné kyseliny chlorovodíkové v acetonitrilu za vzniku sloučenin vzorce XXIV, které je možno acylovat nebo alkylovat například působením acylchloridu nebo alkylchloridu ve vhodném rozpouštědle a v přítomnosti baze, za vzniku sloučenin vzorce XXII, v nichž

Y může být odlišné od ochranné skupiny, použité pro

Grignardovu reakci.

Při vhodné volbě skupiny ve významu Y je možno získat sloučeniny vzorce XXIV přímo ze sloučenin vzorce XX odstraněním ochranné skupiny Y v kyselém prostředí za současné hydrolýzy terciárního alkoholu.

Sloučeniny vzorce XXI, v nichž Y = acyl, je možno hydrolyzovat například uhličitanem draselným ve vodném methanolu za vzniku odpovídajících fenolů vzorce XXVIII, které je pak možno alkylovat nebo acylovat alkylačním nebo acylačním činidlem za vzniku sloučenin vzorce XXI,'v nichž

Y může být odlišné ód ochranné skupiny pro Grignardovu reakci. Výhodnou ochrannou skupinou je pivaloyl(2,2 -dimethylpropanoyl).

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava 2,4,6-trihydroxyf enylbenzylketiminhydrochloridu

Roztok 60 g floroglucinolu ve 400 ml diethyletheru se zchladí na 5 °C a přidá se k roztoku 50,1 g f enylacetoni trilu a 4,7. ml di ethyl ethe.rátu trifluoridu boritého v 800 ml HCl/ETOAc přibližně 5M, rozpouštědlo bylo připraveno probubláváním plynného chlorovodíku zchlazeným ethylacetátem.

Roztok se uloží na 3 dny při teplotě 5 °C. Krystalická žlutá sraženina se odfiltruje, promyje se 50 ml diethyletheru a pak se použije v následující reakci bez dalšího čištění.

Tímto způsobem bylo ve výtěžku 80 % získáno 95 g produktu.

TLC: chloroform/methanol = 90/10, Rf = 0,7

Příklad 2

Příprava 2,4,6, -trihydroxyf enylbenzylketonu

g 2,4,6 -trihydroxyfenylbenzylketiminhydrochloridu se uvede do suspenze v přibližně 2000 ml vody a směs se zahřeje za míchání, na 1. hodinu na 90 °C.

Po zchlazení se získá krystalický produkt. Pevný podíl se.odfiltruje, promyje se 200 ml vody a suší ve. vakuu při teplotě 60 °C.

Ve výtěžku 85 % se získá 7 0 g produktu.

TLC: chloroform/methanol - 90/10, Rf - 0,8

Příklad 3

Příprava 5,7-dihydroxyisoflavonu

Roztok 228 ml diethyletherátu trifluoridu boritého a 84 g N, N-dimethylf ormamiddimethylacetalu v 715 ml

N,N-dimethylformamidu se přidá k roztoku. 55 g sloučeniny z příkladu 2 v 1400 ml Ν,Ν-dimethylformamidu, zahřátého na 50 °C. Směs se pak zahřívá 60. minut na 95 °C.

Tmavě oranžový roztok se zchladí na teplotu místnosti, vlije se do 10 litrů chladné vody a nechá se stát přes noc bez míchání.

Růžový pevný podíl se odfiltruje, promyje se 1 litrem vody a suší ve vakuu při 70 °C.

Ve výtěžku 70,4 % se získá 40,3 g produktu.

TLC: hexan/ethylacetát =70/30, Rf =0,55

Příklad 4

Příprava 7-pivaloyloxy-5-hydroxyisoflavonu ,

g sloučeniny z příkladu 3 a 50 ml anhydridu kyseliny pivalové se zahřeje na 12 0 °C za míchání magnetickým míchadlem v uzavřené nádobě na 4 hodiny. Tmavě červený roztok se pak nechá stát přes noc při teplotě místnosti bez míchání.

Vzniklá sraženina se odfiltruje, promyje se petroletherem a suší ve vakuu při teplotě 45 °C.

Ve výtěžku 65 % se získá 8,9 g růžové pevné látky. TLC: methylenchlorid/methanol = 95/5, Rf = 0,8

Příklad 5

Příprava 3 - f enyl - 5-hydroxy- 7 - píval oyloxychr oman - 4 - onu

Roztok 8,7 g sloučeniny z příkladu 4 ve 300 ml acetonu se přidá k 9 g 5% Pd/C s obsahem vody přibližně 50 % a směs se hydrogenuje 2,5 hodin v Parrově přístroji při tlaku vodíku 0,28 MPa. Katalyzátor se odfiltruje přes vrstvu celitu a filtrát se odpaří do sucha. Olejovitý zbytek se rozpustí v diethyletheru, vysuší se síranem sodným a znovu odpaří. Ve výtěžku 90 % še získá 8.g oranžového oleje, který se použije bez dalšího čištění. ' .

TLC: petrolether/EtOAc = 95/5, Rf = 0,5

Příklad 6

Příprava 4- (2- (N-piperidinyl) ethoxy) -1-brombenzenu

Roztok 10 g bromfenolu ve 160 ml dimethylformamidu se přidá k 20,7 g uhličitanu draselného a směs se zahřeje za ·· ··

• ·' · • · *

mícháni na 10 minut na 10 0 °C. Pak se v průběhu 10 minut přidá 9,6 g N- (2-chlorethyl) píperidinhydrochloridu. Směs se 2 hodiny zahřívá za míchání, pak se zchladí na teplotu místnosti, vlije se do 300 ml vody a extrahuje 300 ml ethylacetátu. Organická fáze se extrahuje 2krát 200 ml 3% HC1. Po alkalizaci se vodná fáze extrahuje 3 00 ml ethylacetátu, odpařením rozpouštědla se získá 13 g produktu ve formě oranžového oleje.

TLC: methylenchlorid/methanol/kyselina octová = 70/20/10,

Rf = 0,7

Příklad 7

Příprava 4- (2- (N-piperidinyl) ethoxy) fenylmagnesiumbromidu

2,1 g hořčíku se vloží do baňky s objemem 50 0 ml se 4 hrdly, opatřené zpětným chladičem, kapací nálevkou a magnetickým míchadlem v atmosféře dusíku.

Přidá se 5 ml roztoku 11,8 g sloučeniny z příkladu 6 v 50 ml čerstvě destilovaného tetrahydrofuranu a pak se směs zahřeje na teplotu varu pod zpětným chladičem.

Zbývající roztok se po kapkách přidá do vroucí reakční směsi v průběhu 40 minut. Směs se nechá zteplat na teplotu místnosti a pak se zakalený šedý roztok použije v následujícím stupni.

Příklad 8

Příprava 3-fenyl-4- (4- (2- (N-piperidinyl) ethoxy) fenyl) -4,5- di hydr oxy - 7 - piva 1 oy 1 oxychromanhydrochl oř i du

Grignardův roztok, získaný v předchozím stupni, se rychle přidá k roztoku 2,6 g sloučeniny z příkladu 5 ve 20 ml bezvodého THF za míchání. Teplota stoupne na 40. °C. Směs se 1,5 hodiny míchá, pak se přidá 10 ml vody a směs se odpaří do sucha ve vakuu. Surový produkt se rozpustí ve 300 ml ethylacetátu a nerozpustný materiál se odfiltruje. Organický roztok se promyje 200 ml 0,25 N HCl (hydrochloridu produktu je rozpustnější v ethylacetátu než ve vodě) a odpaří se na malý objem, takže dojde ke srážení. Po zpracování ultrazvukem se pevná látka oddělí filtrací a suší na vzduchu.

Tímto způsobem se ve výtěžku 36 % získá 1,6 g produktu ve formě bílého prášku s teplotou tání 220 až 221 °C.

TLC: methylenchlorid/methanol = 90/10, Rf = 0,3 NMR je v souladu se strukturou sloučeniny.

Přiklaď 9

Příprava 3-fenyl-4-(4-(2-(N-piperidinyl)ethoxy)fenyl)-5-hydroxy-7-pivaloyloxychrom-3 -enhydrochloridu • · ··· · ···'·'· · · ·· · · · · · · · · ··· ·♦ ♦· ·· *· ♦·

0,71 g sloučeniny z příkladu 8 se rozpustí ve 40 ml vroucího ethylalkoholu. Roztok se zchladí na teplotu místnosti a přidá se 0,2 ml 37% HCl. Po 2 hodinách při teplotě místnosti se roztok odpaří do sucha a pevná pěna se nechákrystalizovat z acetonu. Získaná pevná látka se odfiltruje, promyje se acetonem a suší ve vakuu při teplotě 35 °C, čímž se ve výtěžku 80 % získá 550 mg produktu s teplotou tání 229 až 230 °C.

TLC: methylenchlorid/methanol/triethylamin = 95/5/1,

Rf = 0,3

NMR jev souladu se strukturou produktu.

Příklad 10

Příprava 3-fenyl-4- (4- (2- (N-piperidinyl)ethoxy)fenyl) -5- hydroxy-7-pivaloyloxychromanhýdrochloridu

• «

··· '· · .··

470 mg sloučeniny z příkladu 9 se uvede do suspenze v 50 ml acetonu. Přidají se 2 ml vody a zakalený roztok se hydrogenuje v Parrově přístroji při tlaku vodíku 0,28 MPa v přítomnosti 2 g 5% Pd/C s obsahem 50 % vody celkem 3 hodiny.

Po odfiltrování katalyzátoru se roztok odpaří a získaná bílá pevná pěna se rozpustí v malém množství methanolu a vysráží přidáním diethyletheru.

Tímto způsobem se získá 230 mg produktu s teplotou tání 260 až 270 ^QC za rozkladu.

TLC: methylenchlorid/methanol/triethylamin = 90/10/0,5 NMR je v souladu se strukturou produktu

Příklad 11

Příprava 3 -fenyl-4 -(4 -(2 -(N-piperidinyl)ethoxy)fenyl)-5,7-dihydroxychrom-3 -enhydrochloridu

HO

370 mg sloučeniny z příkladu 9 se rozpustí ve 20 ml horkého THF, přidá se 13 0 mg LiAlH₄ a směs se 3 0 minut míchá.

Pak se opatrně přidá 170 mg vody, šedá pevná látka se odfiltruje a roztok se okyselí HCl/EtOAc. Pak se směs

odpaří, odparek se rozpustí ve 2 ml ethanolu a zpracuje se působením ultrazvuku.

Vysráží se bílá pevná látka, která se odfiltruje, promyje diethyletherem a suší ve vakuu při 50 °C.

Tímto způsobem se získá 210 mg produktu s teplotou tání 248 až 251 °C za rozkladu.

TLC: methylenchlorid/methanol/triethylamin = 95/5/1 Rf = 0,25

NMR je v souladu se strukturou produktu

Příklad 12

Příprava 4' , 7-dipivaloyloxy-5-hydroxyisoflavonu

g genisteinu a 75 ml anhydridu kyseliny pivalové, běžně dodávaného nebo připraveného známým způsobem,, se 2 2 hodin zahřívá na 110 °C, pak se hnědý roztok zchladí a nechá se stát přes noc při teplotě místnosti.

Vytvoří se malé množství pevné látky. Ke směsi se přidá 150 ml lehkého petroletheru, velké množství vytvořené pevné látky se odfiltruje, promyje se lehkým petroletherem a suší ve vakuu při'teplotě 45 °C.

Získá se 11,6 g výsledného produktu.

TLC: lehký petrolether/EtOAc = 85/15, Rf = 0,5

• ·«	•	« 9*			99		9 99 9
• 9 9	• ·	• ·	•	9		•	9
• ·	• ,9 ·	9 9.9	•	,· 9		9	•
• ·	• 9	.·	9	9		9	• 9
	•	• 9«			9 9		.9 9

Příklad 13

Příprava 3- (4-pivaloyloxyfenyl) -5-hydroxy-7-pivaloyloxychroman-4-onu

g sloučeniny z příkladu 12 se rozpustí v 750 ml acetonu a hydrogenuje při tlaku 0,28 MPa při použití 10 g 5% Pd/C s obsahem 50 % vody jako katalyzátoru.

Po třech hodinách se katalyzátor odfiltruje a roztok se odpaří, čímž se získá olej, který se nechá krystalizovat ze 150 ml lehkého petroletheru.

Získá se 8,7 g výsledného produktu.

TLC: lehký petrolether/EtOAc = 8Ξ/Ί5, Rf = 0,5

Příklad 14

Příprava 3- (4-pivaloyloxyfenyl) -4- (4- (2- (N-piperidinyl) ethoxy) fenyl) -4,5-dihydroxy-7- p i va 1 oy 1 oxy c hr omanhydr o ch 1 o r i du t·

•			··				·««»·
«« <		•		• · ·	•	•	•
* ·		• .«	•	• · · · .·	•	•	•
• · • » ·	··	•	v·	• · .» ·	• • «	•	• · ··

Výsledný produkt se získá způsobem podle příkladu 8 při použití sloučeniny z příkladu 13 místo sloučeniny z příkladu 5.

TLC: chloroform/methanol/30% NH₄OH = 95/5/0,1, Rf = 0,35

Příklad 15

Příprava 3- (4-pivaloyloxyfenyl)-4-(4-(2-(N-piperidinyl) ethoxy) fenyl) -5-hydroxy-7-pivaloyloxychrom-3-enhydrochloridu

Výsledná látka byla získána způsobem podle příkladu 9 při použití.3-(4-pivaloyloxyfenyl)-4-(4-(2-(N-piperidinyl) ethoxy) fenyl) -4,5-dihydroxy-7-pivaloyloxychromanhydrochloridu místo sloučeniny z příkladu 8.

TLC: chloroform/methanol/3 0% NH₄OH = 95/5/0,1, Rf = 0,4 Teplota tání 243 až 245 °C za rozkladu.

Příklad 16

Příprava 3- (4-pivaloyloxyfenyl)-4-(4-(2-(N-píperidinyl) ethoxy) fenyl) -5-hydroxy-7pivaloyloxychromanhydrochloridu *« »♦«· • c« ·· f · · · » · · · ♦· « • ·· · · · » ft · * «· ««· ««···· · · • · · ·· t « · · c ·«· ·* ·♦ ·♦ ·* ··

Výsledný produkt se získá způsobem podle příkladu 10 s tím rozdílem, že se užije sloučenina z příkladu 15 místo sloučeniny z příkladu 9.

TLC: chloroform/methanol/30.% NH₄0H = 95/5/0,1, Rf = 0,45 Teplota tání 205 až 207 °C za rozkladu.

Příklad 17

Příprava 3 - (4-pivaloyloxyfenyl)-4-(4- (2-(N-piperidinyl) ethoxy) fenyl) -5-isopropoxy-7-pivaloyloxychrom-3-enhydrochlorídu

HCÍ

210 mg sloučeniny z příkladu 15 se rozpustí ve 4 ml DMF, pak se přidá 300 mg uhličitanu draselného a 200 mg 2-jodpropanu a směs’se míchá 2 hodiny při teplotě místnosti.

·« ··«· • ·* *» ·· * 9 ·«·· · · · • ·« ······· • 9 9 · · · <»·· · · · ·

*.·’··· ····· ⁷ 999 99 ·· ·· 99 >·

Pak se přidá 5 ml vody, vysrážený produkt se odfiltruje, promyje se vodou a čistí rychlou chromatografií na silikagelu, jako eluční činidlo se užije methylenchlorid a methanol 95/5, Rf = 0,7.

Získaný produkt se rozpustí ve 2 ml acetonu a k roztoku se přidá malý přebytek HCl v EtOAc, čímž se získá krystalický hydrochlorid.

Celkem se získá 7 mg produktu s teplotou tání 237 až 239 °C.

NMR jev souladu se strukturou produktu.

Příklad 18

Příprava 4' -methoxy-7-pivaloyloxy-5-hydroxyisof lavonu

0 g biochaninu A běžně dodávaného nebo připraveného známým způsobem se uvede do suspenze ve 10 0 ml anhydridu kyseliny pivalové a směs se 4 hodiny zahřívá za míchání na 120 °C.

Pak se hnědý roztok nechá stát přes noc při teplotě místnosti. Vysrážený produkt se odfiltruje, promyje se lehkým petroletherem a suší ve vakuu při 7 0 °C. Tímto způsobem se získá 19,6 g produktu.

TLC: methylenchlorid/methanol = 95/5, Rf = 0,8 i

Přiklad 19

Příprava 3- (4-methoxyfenyl) -5-hydroxy-7-pivaloyloxychroman-4-onu

Výsledná látka se získá způsobem podle příkladu 5 při použití 4 '-methoxy-7-pivaloyloxy-5-hydroxyisof lavonu místo sloučeniny z příkladu 4.

TLC: petrolether/EtOAc = 95/5, Rf = 0,5

Příklad 20

Příprava. 3 - (4 -methoxyfenyl) -4 - (4 - (2 - (N-piperidinyl) ethoxy) fenyl) -4,5-dihydroxy-7-pivaloyloxychromanhydrochloridu

Výsledný produkt se získá způsobem podle příkladu 8 při použití 3-(4-methoxyfenyl)-5-hydroxy-7pivaloyloxychroman-4-onu místo sloučeniny.z příkladu 5. TLC: chloroform/methanol/30% NH₄0H = 95/5/0,1, Rf = 0,3 •M'

Příklad 21

Příprava 3-(4-methoxyfenyl) -4-(4-(2-(N-piperídínyl)ethoxy) f enyl) - 5 -hydroxy- 7-pivaloyloxychrom-3 -enhydrochloridu

Výsledný produkt se získá způsobem podle příkladu 9 při použití 3-(4-methoxyfenyl) -4-(4-(2-(N-piperidinyl) ethoxy) fenyl) - 4,5-dihydroxy-7-pivaloyloxychromanhydrochloridu místo sloučeniny z příkladu 8.

TLC: chloroform/methanol/30% NPLOH = 95/5/0,1, Rf = 0,35 Teplota tání 214 až 216 °C za rozkladu.

NRM je v souladu se strukturou produktu

Příklad 22

Příprava 3- (4-methoxyfenyl) -4- (4- (2- (N-piperidinyl) ethoxy) fenyl) - 5,7-dihydroxychrom-3-enhydrochloridu

Výsledný produkt se získá způsobem podle příkladu 11 při použití sloučeniny z příkladu 21 místo sloučeniny z příkladu 9.

TLC: choroform/methanol/30% NH₄OH = 95/5/1, Rf = 0,3 Teplota tání 198 až 200 °C za rozkladu.

Příklad 23

Příprava 7-pivaloyloxyisoflavonu

K roztoku 7 g 7-hydroxyisoflavonu ve 190 ml N,N-dimethylformamidu se přidají 2 g 80% hydridu sodíku v parafinovém oleji. Směs se 10 minut míchá a pak se v průběhu 1 minuty za energického míchání po kapkách přidá

4,2 g pivaloylchloridu. Po 20 minutách stání při teplotě místnosti se směs vlije do 400 mi vody, sraženina se odfiltruje, promyje se 1000 ml vcdy a rozpustí v 800 ml chloroformu. Organický roztok se vysuší síranem sodným a odpaří do sucha. Tímto způsobem se získá 7,6 g produktu jako bílá pevná látka.

TLC: lehký petrolether/ethylacetán = 85/15, Rf = 0,6

Příklad 24

Příprava 3 - f enyl-7-pivaloyloxychroman-4-onu

Roztok 15,7 g sloučeniny z příkladu 23 v 770 ml .

1.4- dioxanu se přidá k 8 g vlhkého 5% paladia na aktivním uhlí a hydrogenuje v Parrovš přístroji při tlaku 0,2 8 MPa. Reakce se sleduje pomocí TLC tak, aby nedošlo k další redukci na 4-hydroxyderiváty. Po 2 hodinách se katalyzátor odfiltruje na vrstvě celitu a promyje se 200 ml

1.4- dioxanu.

Roztok se odpaří do sucha a 21,35 g oleje se nechá krystalizovat tak, že se olej rozpustí ve 115 ml ethylacetátu, přidá se 635 ml lehkého pet.roletheru a směs,,: se uloží přes noc při teplotě -20 °C. Tímto způsobem se získá 8,53 g produktu.

Krystalizaci z matečného louhu v ethylalkoholu se získá ještě druhý podíl 1,3 g čistého produktu’.

TLC: lehký petrolether/ethylacetát = 80/20, Rf = 0,85

Příklad 25

Příprava 3-fenyl-4- (4- (2- (N-piperidinyl) ethoxy) fenyl) -4-hydroxy- 7 -pivaloyloxychromanhydrochloridu

• · · · ····· · ·· · * ·· · ·

Produkt byl získán způsobem podle příkladu 8 při použití sloučeniny z příkladu 24 místo sloučeniny z příkladu 5 .

TLC: methylenchlorid/methanol = 90/l0_, Rf = 0,4

Příklad 26

Příprava 3-feny 1-4- (4- (2- (N-piperidinyl) ethoxy) feny 1) -4-hydroxy- 7 -pivaloyloxychrom- 3 -enhydrochloridu

Výsledný produkt byl získán způsobemp podle příkladu 9 při použití sloučeniny z příkladu 25 místo sloučeniny z příkladu 8.

TLC: methylenchlorid/methanol/30% NH₄OH = 95/5/1, Rf = 0,4 Teplota tání 233 až 235 °C za rozkladu

Příklad 27

Příprava 3 - f enyl - 5 -hydroxy- 7 -methoxychroman-4-onu

Výsledný produkt se získá způsobem podle příkladu 5 při použití 5-hydroxy-7-methoxyisoflavonu místo sloučeniny z příkladu 4 .

Příklad 28

Příprava 3-fenyl-4-(4-(2- (N-piperidinyl)ethoxy)fenyl)-4,5-dihydroxy- 7 -methoxychromanhydrochloridu

Výsledný produkt byl získán způsobem podle příkladu 8při. použití 3-fenyl-5-hydroxy-7-methoxychroman-4-onu místo sloučeniny' z příkladu 5.

TLC:. methylenchlorid/methanol = 50/10, Rf = 0,25

Příklad 29

Příprava 3-fenyl-4- (4 - (2- (N-piperidinyl) ethoxy) fenyl) - 5-hydroxy-7 -methoxychrom-3 -enhydrcchloridu

Výsledný produkt byl získán způsobem podle příkladu 9 při použití sloučeniny z příkladu 28 místo sloučeniny z příkladu 8 .

TLC: methylenchlorid/methanol/30% NH₄OH = 95/5/1, Rf = 0,3 Teplota tání: 253 až 256 °C za rozkladu NMR jev souladu se strukturou produktu

Příklad 30

Příprava 3-fenyl-4-(4-(2-(N-piperidinyl)ethoxy)fenyl)-5-methoxy-7-pivaloyloxychrom-3-enhydrochloridu

550 mg sloučeniny z příkladu 9 se rozpustí ve 30 ml DMF a pak se přidá roztok 400 mg uhličitanu draselného ve

3,5 ml vody a roztok 0,9 ml methyljodidu v 9,5 ml DMF a výsledná směs se míchá 5 hodin, pak se reakce zastaví přidáním 200 ml vody a směs se extrahuje 200 ml ethylacetátu. Organická fáze se promyje 2krát 200 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysuší se síranem sodným a odpaří ve vakuu. Žlutý olej se čistí rychlou chromatografií na silikagelu při použití

CH₂Cl₂/MeOH/NEt₃ = 95/5/0,1, Rf = 0,4. Získaný produkt se převede na hydrochlorid přidáním HCl/EtOAc k roztoku volné látky v EtOAc. Tímto způsobem se získá 195 mg bílé amorfní pevné látky.

TLC: methylenchlorid/methanol/NEt₃ = 95/5/0,1, Rf = 0,4 NMR je v souladu se strukturou produktu

Příklad 31

Příprava 3-fenyl-(4-fluorfenyl)-4-(4-(2- (N-piperidinyl)ethoxy) fenyl) -5-hydroxy-7-pivaloyloxychrom-3 -enhydrochloridu

Výsledný produkt byl získán způsobem podle příkladu 1 až 9, přičemž v příkladu 1 byl jako výchozí materiál použit 4-fluorfenylacetonitril místo fenylacetonitrilu.

.TLC: methylenchlorid/methanol/30% NH₄OH = 95/5/1, Rf = 0,3 Teplota tání 198 až 200 °C za rozkladu NMR jev souladu se strukturou produktu

Příklad 32

Příprava cis-3-fenyl-4- (4-benzyloxýbenzyl)-4-hydroxy-7-pivaloyloxychromanu

4,9 g hořčíku se pod dusíkem uloží do baňky s objemem 500 ml se 4 hrdly, opatřené zpětným chladičem, kapací nálevkou a magnetickým míchadlem.

14,7 g 4-bepzyloxybenzylchloridu se rozpustí ve 190 ml čerstvě destilovaného THF a roztok se uloží do kapací nálevky.

ml tohoto roztoku se po kapkách přidá k hořčíku při teplotě místnosti a směs se rychle zahřívá až do okamžiku, kdy je zřejmá efervescence na povrchu hořčíku. Pak se baňka okamžitě ponoří do olejové lázně s teplotou 75 °C a zbývající roztok se přidá v průběhu 40 minut. Pak se směs nechá zteplat na teplotu místnosti, načež se šedý zakalený roztok přenese do baňky s objemem 500 ml, opatřené teploměrem, přívodem chloridu vápenatého, magnetickým míchadlem a kapací nálevkou pod dusíkem. Grignardův roztok se okamžitě užije v následujícím stupni nebo se uloží do mrazicího zařízení. Výtěžek je 100 %, přepočítáno na nezreagovaný hořčík.

Roztok 10 g sloučeniny z příkladu 24 ve 100 ml čerstvě destilovaného THF se po kapkách přidá ke svrchu připravenému roztoku, zchlazenému přibližně na -20 °C v průběhu 30 minut.

Žlutooranžová směs se nechá zteplat na teplotu místnosti, míchá se 2 hodiny, zchladí se na 0 °C a za míchání se přidá 8 ml vody. Vytvořený pevný podíl se odloží, roztok se odpaří do sucha a odparek se rozetře s 2krát 300 ml ethylacetátu a lehkého petroletheru v poměru 15:85.

Po odfiltrování pevného podílu (soli hořčíku a jiné vedlejší produkty) se roztok odpaří a olej ovitý zbytek se nechá krystalizovat z 200 ml ethanolu.

Získá se 7,0 g bílé pevné látky. Druhý podíl 1,4 g čistého cis-3-fenyl-4- (4-benzyloxybenzyl) -4-hydroxy-7-pivaloyloxychromanu se získá rychlou chromatografií matečného louhu pří použití směsi ethylacetátu a lehkého petroletheru 15:85.

TLC: EtOAc/lehký petrolether = 15:85, Rf = 0,35

Příklad 33

Příprava cis-3-fenyl-4 - (4-hydroxybenzyl) -4-hydroxy-7 pivaloyloxychromanu

6,9 g sloučeniny z příkladu 32 se rozpustí v 800 ml methanolu a směs se hydrogenuje v Parrově přístroji v přítomnosti 14 g vlhkého 5% paladia na aktivním uhlí při tlaku 0,28 MPa celkem 45 minut.

Po odfiltrování katalyzátoru přes vrstvu celitu se roztok odpaří za sní.ženého tlaku a olejovitýzbytek se použije v následujícím stupni bez dalšího čištění.

TLC: EtOAc/lehký petrolether = 30/70, Rf = 0,5.

Κ5ΐ»'.38

'9 ··	• W	9»	9« ··♦,·
« · · ·	•	•	•	•	9 '< 9
• 99	•	•	•	•	9 9 9
• 9 9	• ·	•	··	•	• 9 9 . 9
		• ·	9·		9 9 9 9

Příklad 34

Příprava cis-3-.fenyl-4- (4- (2- (N-piperidínyl) ethoxy) benzyl) -4-hydroxy-7-pivaloyloxychromanu

K roztoku 5,3 g sloučniny z příkladu 33 ve 170 ml acetonu se přidá 2,48 g N-(2-chlcrethy) piperidin.hydrochloridu a 3,38 g uhličitanu .draselného a směs se^zá míchání vaří 16 hodin pod zpětným chladičem.

Pevný podíl se odfiltruje, roztok se odpaří a olejovitý zbytek se rozpustí v 500 ml vroucího hexanu.

Po odfiltrování nerozpustného materiálu se horký roztok zchladí na teplotu místnosti a zpracuje se ultrazvukem nebo se energicky míchá až do zahájení krystalizace. Po uložení při teplotě -20 °C se pevný podíl odfiltruje a suší ve vakuu při teplotě 50 °C. Tímto .způsobem se získá 3,2 g bílé pevné látky.

Matečný louh je mošno podrobit rychlé chromatografii při použití CH₂Cl₂/MeOH/NEt₃ = 35/5/0,1, čímž se získá ještě

1,2 g produktu.

TLC: methylenchlorid/methanol/NEt₃ = 95/5/0,1, Rf = 0,4

/4 4 »	4 4 ·'* »
* 4 4	• '4 · <4 «
<4 4 ·	•4 9 · »·» t, *
44 4 ’* ·	<· 4 4

*

Příklad 35

Příprava rac-3-fenyl-4-E- (4- (2- (N-piperidinyl) ethoxy) benzylíden-7-pivaloyloxychromanhydrochloridu

Roztok 4,2 g sloučeniny z příkladu 34 ve 300 ml methylkyanidu, zchlazený na -20 °C se přidá k roztoku 3 ml 3 7% HCl ve 3 00 ml methylkyanidu, rovněž zchlazenému na -20 °C a směs se nechá stát přes noc při téže teplotě.

Pak se nechá roztok zteplat na teplotu místnosti a <

průběh reakce se ověří pomocí HPLC.

Po úplném spotřebování sloučeniny z příkladu 34 se rozpouštědlo odpaří ve vakuu, odparek se rozpustí v acetonu a roztok se znovu odpaří, čímž se získá pevná bílá pěna, která .se rozpustí v ethylacetátu a nechá se krystalizovat působením ultrazvuku nebo za míchání..

TLC: EtOAc/n-ButOH/H₂0/CH₃COOH = 50/10/10/10, Rf = 0,3

Teplotá tání 214 až 216 °C

NMR je v souladu se.strukturou produktu

Příklad 36

Rozdělení enanciomerů sloučeniny z příkladu 35 '*•1 íí

Sloučenina z příkladu 35 se podrobí dělení pomocí preparativní HPLC.

Oddělení bylo uskutečněno za následujících podmínek: Sloupec: Chorisis 10 μτη, 7,8 x 300 mm

Eluční činidlo: acetonitril/0,5% kyselina octová = 27/75 Průtok 2 ml/min lambda: 254 nm náplň: 25 mg v 0,5 ml mobilní fáze.

Enanciomerní čistota obou enanciomerů byla stanovena pomocí analytické chirální chromatografie za následujících podmínek:

sloupec: Chiralcel OJ-R, 5 μτη, 4,6 x 150 mm eluční činidlo: acetonitril/0,01M NaH₂PO₄ = 1 ml HC1O₄, (pH 5,6) = 65/35 průtok: 0,5 ml/min lambda: 254 nm

Doba retence (+)isomeru: 5,6 min

Doba retence (-)isomeru: 6,2 min

Oba isomery byly získány jako volné látky a byly převedeny na hydrochlorid probubláváním plynného chlorovodíku etherovým roztokem volných látek.

[a] _D = +44,6 (c = 1, MeOH) [a]_D = -44,o (c =1, MeOH)

Příklad 37

Příprava rac-3-fenyl-4-E- (4- (2- (N-piperidinyl) ethoxy) benzyliden-7 -hydroxychromanhydrochloridu

• *

I ··

HCÍ

Roztok 440 mg uhličitanu draselného ve 2,5 ml vody se přidá k roztoku 440 mg sloučeniny z příkladu 35 v 50 ml methanolu a směs se míchá přes noc. Pak se přidá 6,3 ml IN HCl, načež se roztok částečně odpaří až do vzniku bílé emulze. Po zchlazení na 0 °C se vyloučí pevný podíl, který se odfiltruje, promyje se vodou a suší na vzduchu. Získá se 3 20 mg bílé amorfní pevné látky.

TLC: EtOAc/n-ButOH/H₂0/CH₃COOH = 50/10/.10/10 Rf = 0,2 NMR je v souladu se strukturou produktu

Příklad 38

Příprava cis-3 - fenyl - 4 - (4 - (2 - (N-piperidinyl) ethoxy) benzyl) -4,7-dihydroxychromanu

Směs 12,5 g sloučeniny z příkladu 34, 800 ml methanolu, 12,5 g uhličitanu draselného a 40 ml vody se

<· J hodiny míchá, pak se rozpouštědlo odpaří na 50 ml a za míchání magnetickým míchadlem se přidá 500 ml vody. Vyloučí se bílá pevná látka, která se odfiltruje, promyje se vodou a suší při 45 °C. Tímto způsobem se získá 9,2 g produktu. TLC: methylenchlorid/methanol/30% NH₄OH = 93/7/0,7,

Rf = 0,35

Teplota tání 95 až 103 °C

NMR je v souladu se strukturou produktu

Příklad 39

Příprava 3-fenyl-4-(4 -(2- (N-piperidinyl) ethoxy)benzyl)-7-hydroxychrom-3-enu

Roztok 3 ml 37% HCI ve 40 ml acetonitrilu se přidá k vroucímu roztoku 9 g sloučeniny z příkladu 38 ve 300 ml acetonitrilu. Po 20 minutách se roztok rychle zchladí na 0 °C, přidá se 9,0 g uhličitanu draselného, směs se 3 hodiny míchá a vysrážená volná látka se odfiltruje spolu s uhličitanem draselným, promyje se vodou a suší ve vakuu při 40 °C. Tímto způsobem se získá 7 g produktu.

Teplota tání 168 až 170 °C za rozkladu

TLC: methylenchlorid/methanol/30% NH₄OH = 93/7/0,7,

Rf = 0,4

NMR jev souladu se strukturou produktu

Ϊ.

Příklad 40

Příprava 3 -f enyl - 4 - (4 - (2 - (N-piperidinyl) ethoxy) benzyl) -7-pivaloyloxychrom-3 -enhydrochloridu

HCI

0,5 g pivaloylchloridu se přidá ke směsi 0,5 g sloučeniny z příkladu 39 a 0,5 g uhličitanu draselného ve 40 ml acetonitrilu. Směs se míchá 5 hodin, pak se soli odfiltrují., přidá se HCI v EtOAc v mírném přebytku a roztok se odpaří do sucha', čímž se získá pevná pěna, která se rozetře.s ethyletherem, zfiltruje a usuší při teplotě místnosti. Tímto způsobem se získá 400 mg produktu jako bílá amorfní pevná látka.

TLC: EtOAc/n-ButOH/H₂0/CH₃COOH = 50/10/10/10,. Rf = 0,4 NMR je v souladu se strukturou produktu

Příklad 41

Příprava 3-fenyl-4 - (4- (2- (N-piperidinyl)ethoxy)benzyl)-5,7-díacetyloxychrom- 3 -enhydrochloridu

210 mg sloučeniny z příkladu 11 se rozpustí ve 2 g anhydridu kyseliny octové při teplotě 13 0 °C a směs se 3 0 minut míchá. Pak se roztok zchladí na teplotu místnosti, přidají se 2 g ledu, směs se zředí 50 ml vody, přidá se vodný, roztok uhličitanu draselného a směs se extrahuje 50 ml ethylacetátu. Organická vrstva se vysuší síranem sodným, zfiltruje, okyselí mírným přebytkem HCl/EtOAc a odpaří do sucha. Výsledný žlutý olej se nechá krystalizovat ze směsi acetonu a diethyletheru, čímž se získá 100 mg produktu ve formě světle žlutého prášku.

TLC: methylenchlorid/methanol/NEt₃ = 95/5/0,1,

Rf = 0,55

Teplota tání 154 až 156 °G za rozkladu

NRM jev souladu se strukturou produktu

Příklad 42

Příprava 3-fenyl-4- (4- (2- (N-piperidinyl) ethoxy) benzyl) - 7 - isobutyroyloxychrom-3 -enhydrochlorídu

HCl

Produkt se získá způsobem podle příkladu 40 při použití isobutyroylchloridu místo pivaloylchloridu. TLC: EtOAc/n-ButOH/H₂O/CH₃COOH = 50/10/10/10, Rf = 0,4 Teplota tání 152 až 155 °C • '·· 9 · * 9 · · · 9

9 9 9 9 ··· ’·· ·· ·· ·· ··«· 9¹ 9 9' ·

9 9 '· (999/9 · · *

-9 9 · 9

199 99 '99

NRM jev souladu se strukturou produktu

Příklad 43

Příprava 3-fenyl-4-(4-(2-(Ň-piperidinyl)ethoxy)benzyl)-7-hydroxychrom-3-enmethansulfonátu (1:1), jde o rozpustnou sůl sloučeniny z příkladu 39

2,7 g sloučeniny z příkladu 39 se rozpustí ve 120 ml horkého acetonu, přidá se roztok 512 mg kyseliny methansulfonové ve 30 ml acetonu a roztok se míchá magnetickým míchadlem až do zahájení krystalizace.

Směs se nechá stát 2 hodiny pří teplotě -20 °C, pevný podíl se odfiltruje, promyje se diethyletherem a suší ve vakuu při 40 °C. Tímto způsobm se získá .2,9 g :b£lé pevné látky s teplotou tání 170 až 175 °C za rozkladu.

Rozpustnost této soli ve vodě při teplotě místnosti je vyšší než 1 mg/ml.

Příklad 44

Příprava 3-fenyl-4-E-(4-(2-(N-piperidinyl)ethoxy)-benzyl)7-hydroxychrom-3-enu isomerací sloučeniny z příkladu 37 ml 1% HCl v methylkyanidu se přidá k suspenzi 660 mg sloučeniny z příkladu 37 ve směsi 150 ml methylkyanidu a 5 ml vody, zahřáté na 80 °C. Reakce se sleduje pomocí HPLC (sloupec Select B RP Ci₈, eluční činidlo CH₃CN/MeOH = 80/20 70 %, pufr 30 %, průtok 0,8 ml/min, lambda 254 nm). Po zahřívání 15 minut na 80 °C je reakce ukončena. Vytvořilo se 85 % produktu (doba retence

4,8 min), 11 % výchozí látky zůstalo nezreagováno. Reakce již dále neprobíhá ani při zahřívání ani po přidání dalšího podílu kyseliny.

Reakční směs se zpracuje a produkt se izoluje stejně jako v příkladu 39. Ve výtěžku 75 % se tímto způsobem získá 500 mg produktu.

Příklad 45

Příprava 3-(4-methoxyfenyl)-4-oxo-4H-l-benzopyran-7-ylesteru kyseliny 2,2-dimethylpropanové

g, 335 mmol formononetinu se uvede do suspenze v acetonitrilu, přidá se uhličitan draselný a směs se míchá 20 minut při teplotě místnosti. Pak se do směsi po kapkách přidá 59,85 g, 496 mmol pivaloylchloridu, reakční směs se ještě 15 minut míchá a pak se reakce zastaví vlitím směsi do vody. Pevný podíl se odfiltruje, promyje se vodou a rozpustí v chloroformu. Roztok se vysuší a odpaří do sucha, čímž se získá výsledný produkt, který je možno nechat krystalizovat z horkého toluenu. Tímto způsobem se získá 102 g bílého krystalického prášku.

Teplota tání 159 až 161 °C

NMR, MS a IR jsou v souladu se strukturou produktu.

Příklad 46

Příprava 3,4-dihydro-3-(4-methoxyfenyl) -4-OXO-2H-1-benzopyran-7-ylesteru kyseliny 2,2-dimethylpropanové

4« 4 4 4 4 4 4 ^;4 44 4 '9 · '•, ·4 · 4 '4 4 .4

4 4-4 4. 4 4 ·4 '· · · ··♦ <4 4 4 4 • 4 44 4 4444 «· «4 '4« 44 '99

Sloučenina z příkladu 45 se rozpustí v dioxanu a roztok se hydrogenuje v Parrově přístroji při tlaku 0,25 MPa při použití 5% Pd/BaSO₄ jako katalyzátor.

Po 3 hodinách se katalyzátor odfiltruje, roztok se odpaří na malý objem v vlije se do vody, čímž vznikne sraženina, která se odfiltruje a rozpustí v horkém 95% ethanolu. Směs se nechá stát přes noc v lednici, vzniklý bílý produkt se odfiltruje a promyje se petroletherem, čímž se získá 66 g výsledného produktu.

Teplota tání 119 až 121 °C

NMR, MS a IR jsou v souladu se strukturou produktu

Příklad 47

Příprava 3,4-dihydro-4-hydroxy-3- (4-methoxyf enyl) -4- [ (4- (fenylmethoxy) fenyl] methyl] -2K-l-benzopyran-7-ylesteru kyseliny 2,2-dimethylpropanové

«« 99 9« ·9. 9999 • ' ',9 '9 '9 9: · '· · ·99 · ·.·.·· · · . · ,· · ·'··»'·· « · i··· λ«· i·· (·» *· ··

15,4 g, 63 5 mmol hořčíkových třísek se uloží do baňky s objemem 2 litry. 49,6 g, 211,6 mmol

4-benzyloxybenzylchloridu sé rozpustí v bezvodém THF a roztok se v průběhu 1 hodiny po kapkách přidá k hořčíkovým třískám v atmosféře inertního plynu za mírného varu pod zpětným chladičem.

Pak se směs zchladí na -20 °C a po kapkách v průběhu 15 minut se přidá roztok 60 g, 169,3 mmol sloučeniny z příkladu 4 6 ve 3 00 ml bezvodého THF. Směs se nechá zteplat na teplotu místnosti, přidá se 50 ml vody, pevný materiál se odfiltruje a roztok se odpaří do sucha. K výslednému oleji se přidá 200 ml ethylacetátu a směs se nechá 1 hodinu stát při teplotě -20 °C. Pevný podíl se odfiltruje a roztok se odpaří do sucha. Výsledný olej se nechá krystalizovat ze směsi 95% ethanolu a petroletheru 80:20, čímž se získá

60,8 g, 110 mmol produktu. Teplota tání 104 až 111 °C.

NMR, MS a IR jsou v souladu se strukturou produktu

Příklad 48

Příprava 3,4-dihydro-4-hydroxy-4-[(4-hydroxyfenyl)methyl] -3- (4-methoxyfenyl) -2K-l-benzopyran-7-ylesteru kyseliny 2,2-dimethylpropanové

• «« toto ·· toto·· ·« to · ·'· · ♦ * · '· w • «· .· · to « to · λ · ♦>·'· 'to ··· · · <to · to · -· * to · ·· · to i··· '99 (·· ··· ··

60,8 g, 110 mmol sloučeniny z příkladu 47 se rozpustí v ethylacetátu, přidá se 5% paladium na aktivním uhlí a směs se hydrogenuje.

Katalyzátor se odfiltruje a roztok se odpaří do sucha, čímž se získá 50,88 g, 110 mmol pevné pěny, která se užije bez dalšího čištění.

NMR, MS a IR jsou v souladu se strukturou produktu.

Příklad 49

Příprava 3,4-dihydro-4-hydroxy-3-(4-methoxyfenyl) -4- [ [4- [2- (1-piperidinyl) ethoxy] fenyl ] methyl] -2H-l-benzopyran-7-ylesteru kyseliny 2,2-dimethylpropanové

Směs 50 g, 108,1 mmol sloučeniny z příkladu 48, 20 g, 108,7 mmol N-(2-chlorethyl) piperidinhydrochloridu a K₂CO₃ v 860 ml vroucího acetonu se nechá reagovat.

Pevný podíl se odfiltruje a roztok se odpaří do sucha, čímž se získá 62 g, 108,1 mmol oleje, který se užije bez dalšího čištění.

NMR, MS a IR jsou v souladu se strukturou produktu.

4444 ·4 ·<

4. -·*· <· 4 4 4

4* 4 4 * '4 4 · >4 •444 4 444 4 4 4 4 • 4 4 4 · 4 · 4 ·

Příklad 50

Příprava 3,4-dihydro-4-hydroxy-3- (4-methoxyfenyl) -4- [ [4- [2- (1-piperidinyl) ethoxy] fenyl] methyl] -2H-1 -benzopyran-4,7-diolu

K roztoku 60 g, 104,6 mmol sloučeniny z příkladu 49 v methanolu se přidá uhličitan draselný, rozpuštěný ve vodě a .směs se nechá reagovat 3 hodiny při teplotě místnosti. Pak se rozpouštědlo odpaří na 300 ml a směs se vlije do vody a vzniklá směs se míchá přes noc. Pak se pevný podíl odfiltruje, promyje se vodou a suší ve vakuu při teplotě místnosti, čímž se získá 36 g surového produktu, který se nechá krystalizovat z vroucího acetonitrilu, čímž se získá 28 g produktu.

Teplota tání 107,5 až 108,5 °C

NMR, MS a IR jsou v souladu se strukturou produktu

Příklad 51

Příprava 3 - (4-methoxy) f enyl-4 - [ [4 - [2 - (1-piperidinyl) ethoxy] fenyl] methyl] -2H-1-benzopyran-7 -olhydrochloridu

• 4 4 4

4 4 4 • « 4

4« 4 4 • 44 4 · g, 49 mmol sloučeniny z příkladu 50 se rozpustí v 550 ml horkého acetonitrilu, přidá se 4,9 ml 37% HC1 a roztok se 45 minut míchá při teplotě varu pod zpětným chladičem. Roztok se nechá zteplat na teplotu místnosti, vykrystalizovaná pevná látka se odfiltruje a promyje se diethyletherem. Získá se 17,3 g, 34 mmol produktu.

Teplota tání 199 až 205 °C za rozkladu

NMR, MS a IR jsou v souladu se strukturou produktu

Sloučeniny podle vynálezu byly podrobeny zkouškám na svou farmakologickou účinnost.

V následujících příkladech jsou uvedeny výsledky, získané se sloučeninami 3-fenyl-4-(4-(2-(N-piperidinyl) ethoxy) benzyl)-7-hydroxychrom-3-enem ve volné formě nebo ve 'formě soli s kyselinou methansulfonovou a 3-(4-methoxy)fenyl-4- [ [4- [2-(1-piperidinyl)ethoxy]fenyl]methyl] -2H-l-benzopyran-7-olhydrochloridem. Dále bude sloučenina z příkladu 39 uváděna jako sloučenina I a sloučenina z příkladu 51 jako sloučenina II.

Zkouška in vitro: Lidské receptory estrogenu a a β (ER-α a ER-β)

Pokus byl prováděn způsobem podle publikace Obourn JD a další, Biochemistry 32, 6229, 1993.

Sloučenina I podle vynálezu se váže s vysokou afinitou na lidské receptory ER-α a ER-β. Odpovídající vazné konstanty Ki jsou 0,041 + 0,011 a 0,157 ± 0,028 nM.

Při srovnání se známou látkou typu ŠERM, raloxifenem je afinita ER-α pro tuto látku podobná,

9·

999 . 9 • 99 ·· 9 «

99

9 ·

9 9

9*9 9 9

9 9

9 9

9

9

9« 9···

9

9

9 9

9

Κι=0,071 + 0,008 nm, kdežto afinita pro ER-β je lOkrát vyšší, Kf = 1,62 ± 0,348 nm.

Sloučenina II podle vynálezu se váže s ještě vyšší afinitou na lidské receptory ER-α a ER-β. Vazná konstanta Ki je v tomto případě 0,017 + 0,002 a 0,099 ± 0,005 nM.

Ve srovnání s raloxifenem (Ki ER-β = 1,62 + 0,348, ER-α = 0,071 + 0,008 nm) je afinita pro ER-β 16krát vyšší, kdežto afinita pro ER-α je obdobná.

Zkoušky in vivo: Zkoušky na nezralých krysích samicích

Antiuterotrofní účinnost

Pokusy byly prováděny způsobem podle publikace Eppenberger U a další, Am J Clin Oncol 14, suppl. 2, S5S14, 1991.

U nezralých krysích samic dojde při podávání 17a-ethinyl estradiolu E2 v dávce 0,05 mg/kg perorálně po dobu 3 dnů k. významnému vzestupu vlhké hmotnosti dělohy o 170 až 220 % ve srovnání s kontrolami, jimž bylo podáváno pouze nosné prostředí.

Uvedená koncentrace E2 byla nej nižší koncentrace která vyvolávala téměř maximální účinek a byla proto zvolena na bázi předběžných pokusů na závislost odpovědi na dávce.

Sloučeniny I a II při perorálním podání vyvolávaly inhibici uterotrofního působení E2, přičemž účinek byl závislý na dávce. Úplný antagonismus bylo možno pozorovat • ·· ·· ·· ·· ···· ···· · ··· · · · ··· ······· • · · · · · ··· · · · 9 ··· ·· · · · · · • •r ·9 3· ·· ·· ·· pro sloučeninu I v dávce 1 až 10 mg/kg/den, EC₅₀ = 0,33 mg/kg/den, kdežto v případě srovnávacím látky levormeloxifenu došlo pouze k částečné antagonizaci stimulace dělohy E2, to znamená k 40 až 45% inhibici při dávce 1 mg/kg/den.

Pro sloučeninu II bylo možno pozorovat úplný antagonismus v dávce 0,1 až 1 mg/kg/den. Při srovnání antiestrogenní účinnosti (ED₅o je dávka, jíž je zapotřebí pro 50% snížení růstu, vyvolaného estradiolem) bylo prokázáno, že sloučenina II podle vynálezu je přibližně. 25krát účinnější než raloxifen (ED50 = 0,016 a 0,39 mg/kg/den).

Uterotrofní účinnost

Sloučenina vzorce I a raloxifen v dávce 0,1 mg/kg/den mírně zvyšovaly hmotnost dělohy ve srovnání s kontrolními krysami, jimž bylo podáváno pouze nosné prostředí (17 a 32 %, podstatně méně než 0,1 mg/kg/den E2) avšak hmotnost dělohy pro 0,01, 1 a 10 mg/kg/den sloučeniny I a raloxifenu nebyla statisticky významně odlišná od hmotnosti kontrolních krys.

Ani hmotnost děloh po podávání 0,01, 0,1, lalO mg/kg/den sloučeniny II a raloxigenu nebyla statisticky významně odlišná od hmotnosti kontrolních krys.

Podle údajů v publikaci M. Salman a další, J. Med. Chem. 1986, 29, 1801-1803 zvyšuje levormeloxifen v obdobných dávkách statisticky významně vlhkou hmotnost dělohy v závislosti na dávce a maximální agonistická • · · · účinnost 60 až 65 % účinnosti E2 byla zjevně prokazatelná pro dávku 1 mg/kg.

Je tedy možno uzavřít, že při pokusu na nezralých krysích samicích výhodné sloučeniny podle vynálezu účinně antagonizovaly stimulaci dělohy estrogenem až na úroveň kontrolních krys, jimž bylo podáváno pouze nosné prostředí.

Při antagonizaci stimulace dělohy estrogenem je sloučenina II účinnější než raloxifen.

Naopak levormeloxifen je částečným agonistou, přičemž v dávce 1 mg/kg/den má maximální agonistickou účinnost 60 až·65 % účinnosti E2.

Farmakologický profil uvedených látek na nezralých krysách je velmi odlišný ve srovnání se strukturně příbuznou sloučeninou levormeloxifenem, což prokazuje, že strukturní rozdíly mezi.sloučeninami podle vynálezu a známými látkami jsou podstatné pro snížení stimulačních účinků na dělohu.

Účinky na krysím modelu bez vaječníků (OVX)

Pokusy byly prováděny na krysách s vyoperovanými vaječníky způsobem podle publikace Kain DN, Bone Minerál 15, 175-192, 1991 a Grese TA a další, J Med Chem 40, 146-167, 1997.

Čtyřtýdenní pokus na krysách OVX

Účinky zkoumaných látek byly vyhodnoceny také na krysách OVX ve stáří 9 až 11 měsíců, sloučeniny byly

• S

podávány 4 týdny po provedeném chirurgickém zákroku a výsledky byly srovnávány s výsledky u krys OVX a s pozitivními kontrolami (Sham).

•Agonistické estrogenní účinky, specifické pro tkáně byly zkoumány zejména na děloze, byla stanovena hmotnost dělohy, bylo provedeno histologické vyšetření dělohy, stanovena účinnost peroxidázy děložních eosinofilů (EPO), hustota anorganické tkáně v kostech BMD a koncentrace cholesterolu v krevním séru.

Podávání sloučenin po dobu 4 týdnů nebylo spojeno s žádnými toxickými příznaky.

Účinek na hustotu anorganických látek v kostech MBD (bederní páteř, Ll-4)

Hodnoty byly měřeny pomocí zařízení DEXA (měření absorpce pomocí rtg-záření) při použití přístroje Hologic QDR-1000 plus opatřeného sofwarovým programem pro měření u malých zvířat. Byl použit postup s vysokou rozlišovací schopností (vzdálenost čar 0,0254 cm, rozlišení 0,0127 cm) při průměru kolimátoru 0,63 mm. Při tomto postupu je možno získat dobré informace o kompaktní i trabekulární kosti.

Měření in vivo pomocí zařízení DEXA bylo provedeno těsně před chirurgickým zákrokem k získání základní čáry a pak 4 týdny po chirurgickém zákroku. Zkoumanou anatomickou oblastí byla bederní páteř Ll-4.

Všechna zvířata byla před vyšetřením anestetizována směsí ketaminu a p-promazinu. Při každém vyšetření byla krysa uložena na záda s páteří, rovnoběžnou s dlouhou osou • ··· · « densitometrického stolu. Lumbární páteř byla vyšetřena při použití pánevních kostí pro označení polohy, analýza tohoto místa byla uskutečněna rozdělením obratlů a meziobratlových prostorů pomocí použitého programu, do výsledků byly' zahrnuty pouze cílové obratle v uvedené oblasti.

Ochrana v procentech byla vypočítána podle následující rovnice:

ochrana v % = [ (% změny BMD_zkOumaná látka - % změny BMD_kontroia ovx) / (% změny BMD_kontroia sham ^_ změny BMD_kqntroia ovx) 1 x 100

V prvním pokusu byly sledovány příznivé účinky sloučeniny I na kostní tkáň.

í, 4 týdny po chirurgickém zákroku bylo možno pozorovat podstatně nižší procentuální změnu BMD od základní čáry u krys OVX ve srovnání s krysami sham (-9,39 + 0,60 a -0,11 ± 0,75 %, P < 0,01).

Podle literárních údajů dochází při podání 0,1 mg/kg 17a-ethinylestradiolu É2 k částečné prevenci ztráty kostní tkáně, ochrana je přibližně 50 %.

0,1, 1 a 10 mg/kg denně sloučeniny I snižovalo statisticky významně ztrátu kostní tkáně, vyjádřenou v procentech změny BDM od základní čáry, hodnoty byly vyšší než pro krysy OVX (40, 46 a 4 7 % ochrany, P < 0,01) .

Ve druhém pokusu byly sledovány příznivé účinky sloučeniny II na ztrátě kostní tkáně.

• ·

999 týdny po chirurgickém zákroku byla ztráta krevní tkáně u krys OVX podstatně vyšší než u krys sham (% změny BMD bylo -5,16 % a 1,28 %, P < 0,01).

Jak je uvedeno v literatuře, 0,1 mg/kg 17a-ethinylestradiolu E2 brání ztrátě kostní tkáně, ochrana je přibližně 95 %.

Zkoumaná látka II v dávce 0,1 a 1 mg/kg/den snižovala ztrátu kostní tkáně v závislosti na dávce, přičemž procento změny BMD od základní čáry bylo podstatně vyšší ve srovnání s krysami OVX (ochrana 60 a 119 %, P < 0,01).

Účinek sloučeniny II na kostní tkáň byl srovnatelný s účinkem sloučeniny E2 v dávce 0,1 mg/kg/den, což znamená, že zkoumaná látka má plný agonistický estrogenní účinek rna kostní tkáň.

Se sloučeninou II byly srovnávány také účinky reloxifenu a levormeloxifenu. Jejich ochranný účinek byl významný (ochrana 50 až 60 % při dávce 1 a 10 mg/kg/den) , avšak statisticky významně nižší ve srovnání se sloučeninou podle vynálezu.

Účinek na koncentraci cholesterolu v séru

Sloučenina I snižovala v dávce 0,1 až 10 mg/kg/den v závislosti na dávce koncentraci cholesterolu v krevním séru u krys OVX při hodnotě ED₅₀ 0,12 mg/kg, maximální snížení koncentrace cholesterolu bylo možno pozorovat při dávce 10 mg/kg (67% inhibice vzhledem ke kontrole OVX).

• ·· ·

Sloučenina II v dávce 0,1 a 1 mg/kg/den snižovala koncentraci cholesterolu v krevním séru v závislosti na dávce u krys OVX (inhibice 75 a 81 %). Sloučenina II byla stejně účinná jako E2 při snižování koncentrace cholesterolu v krevním séru vzhledem ke kontrolám, kdežto reloxifen a levormeloxifen byly statisticky významně méně účinné.

Účinky na dělohu

U krys OVX, jimž byly podávány sloučeniny podle vynálezu v dávkách 0,1, 1 a 10 mg/kg/den byla hmotnost dělohy statisticky významně nižší než u kontrol sham i u krys OVX, jimž byla podávána sloučenina E2 .

Stupeň indukce tvorby peroxidázy eosinofilů v děloze může být vhodným značením pro růstovou odpověď na podávání estrogenu podle publikace Lyttle CR a DeSombre ER proč Nati Acad Sci USA 74, 3162-3166, 1977. Zkoumané látky neměly žádný významný účinek na účinnost peroxidázy eozinofilů ve srovnání s krysami OVX, kdežto v případě levormeloxifenu došlo ke statisticky významnému vzestupu této hodnoty.

Mimoto nedošlo při.podávání zkoumaných látek k významnější stimulaci děložního epithelu.

Estrogen a levormeloxifen vyvolaly vymizení atrofie epithelu, zachovaly jeho histologii na úrovni kontrol sham.

Sloučeniny I a’II podle vynálezu při podávání v dávkách 0,1, 1 a 10 mg/kg/den a 0,1 a 1 mg/kg/den po dobu 4 týdnů perorálně statisticky významně snižovaly ztrátu • · · * · · · · · kostní tkáně a současně snižovaly koncentraci cholesterolu v krevním séru.

Těchto ochranných účinků bylo dosaženo při minimální stimulaci děložní tkáně.

Je tedy možno uzavřít, že benzopyranové deriváty podle vynálezu mají velmi výhodnou účinnost typu ŠERM, to znamená selektivní modulaci receptorů estrogenu, příznivou selektivitu pro jednotlivé tkáně, zejména ve srovnání se strukturně příbuznými známými látkami.

Pokusy in vitro: Proliferace buněk MCF-7 <·’ Při těchto pokusech byla sloučenina I srovnávána s'.· .idvěma běžně dodávanými produkty, raloxifenem a tamoxifenem.

Nádorové buňky byly získány z American Typa Culture Collection (ATCC HTB-22)-. Živné prostředí bylo minimální (základní prostředí s 10 % fetálního séra skotu, prostředí «bylo ještě doplněno jedním procentem antibiotika a antimykotické;látky. Podíly po 100 μΐ buněčné suspenze (5 x 103/vyhloubení) byly uloženy na mikrotitrační plotnu s 96 vyhloubeními v atmosféře s 5 % oxidu uhličitého při teplotě 37 °C. Po 24 hodinách bylo do každého vyhloubení přidáno 100 μΐ živného prostředí, 2 μΐ roztoku zkoumané látky, mitomycin nebo nosné prostředí (DMSO, konečná koncentrace 0,4 %) a mikrotitrační plotny byly inkubovány na 72 hodin. Každý materiál byl použit ve dvojím provedení. Na konci inkubace bylo do každého vyhloubení přidáno 20 μΐ modři alamar (75%) a plotny byly inkubovány ještě 6 hodin a pak byla určena životaschopnost buněk pomocí intenzity fluorescence (excitace při 530 nm a emise při 590 nm).

• · * · · · · • · · · · · · ·

Sloučenina I a dvě srovnávací látky, tamoxifen a raloxifen vyvolávaly statisticky významnou inhibici růstu ve srovnání s kontrolní skupinou, jíž bylo podáváno pouze nosné prostředí. Účinné sloučeniny byly podávány v koncentracích 1 až 100 μΜ. Za podmínek prováděného pokusu byly tamoxifen a sloučenina I účinnější (Inhibiční koncentrace IC₅₀ = 6,0 a 6,5 μΜ) než raloxifen (IC₅₀ = 11 μΜ) .

Úplná inhibice růstu byla pozorována při koncentraci 11 μΜ pro tamoxifen a sloučeninu I a v koncentraci 18 μΜ pro raloxifen, kdežto 50% letální koncentrace byla LC₅₀ 22 pro tamoxifen, 20 pro sloučeninu I a 29 μΜ pro raloxifen.

Uvedené výsledky potvrzují, že sloučeniny podle vynálezu jsou účinnými a selektivními agonisty a antagonisty estrogenu, specifickými pro určité tkáně.

Zkoumané látky mají výhodnější farmak.o logický profil než strukturně příbuzné benzopyranové deriváty, například levormeloxifen a je možno je srovnávat s příznivým výsledkem také s raloxifenem, který je jednou z prvních látek s účinností ŠERM, vyvinutou pro klinické použití.

Vzhledem ke.svému možnému léčebnému použití je možno sloučeniny podle vynálezu mísit s obvyklými farmaceuticky přijatelnými pomocnými látkami a připravit tak farmaceutické prostředky pro parenterální, perorální, rektální, podkožní nebo transdermální podání nebo podání na nosní sliznici běžným způsobem.

Každý odborník může snadno zpracovat sloučeniny podle vynálezu příslušným způsobem, běžně v oboru prováděným,: a uvedeným například v souhrnné publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro ed. , Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990.

Zastupuj e:

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   TV iooz ~ÍO1)

   1. 2H-1-benzopyranové deriváty obecného vzorce I _ZR1 ' O—(CH₂)_p—H ' R2 // \\

   4a

   Z .. ^Λ • J ⁿ'm J n. 4 1

   kde Ri a R₂ nezávisle znamenají atom vodíku, alkyl, halogenalkyl, alkenyl nebo halogenalkenyl nebo tvoří tyto skupiny spolu s atomem dusíku, na nějž jsou vázány, 4- až 8-členný heterocyklický kruh,

   X znamená atom vodíku, alkyl, aryl, nitroskupinu, atom halogenu, 0-R₃, kde R₃ znamená atom vodíku, alkyl, aryl, alkanoyl nebo aryloyl,

   Xi znamená atom vodíku, alkyl nebo alkoxyskupinu a v případě, že X a X_x znamenají alkylové zbytky, mohou tyto skupiny spolu s atomem uhlíku, na nějž jsou vázány tvořit kondenzovaný aromatický kruh za vzniku ct-naf talenylové skupiny,

   Y 'znamená atom vodíku, alkyl, alkanoyl, aryloyl, alkylaminokarbonyl, alkyloxykarbonyl,

   Z znamená atom vodíku, 0-R₄, kde R₄ znamená atom vodíku, alkyl, alkanoyl nebo aryloyl, m znamená 1 nebo 2, n znamená 0 nebo 1,

   p znamená 2 až 6

   ----- znamená jednoduchou nebo dvojnou vazbu mezi atomy v polohách 3-4 nebo 4-4a, přičemž v případě, že n = 1, může být dvojná vazba exocyklická nebo endocyklická za vzniku 4-benzylidenchromanu v případě, že m = 1 nebo

   4-benzylchrom-3-enu v případě, že m = 2 a v případě, že n = 0, může být endocyklická vazba 3-4 jednoduchá nebo dvojná vazba a v případě, že n = 0 a endocyklická vazba 3-4 je jednoduchá vazba, má Z odlišný význam od atomu vodíku.
2. 2. 2H-l-benzopyranové deriváty obecného vzorce I podle nároku 1, kde

   R_x a R₂ znamenají alkylové zbytky a tvoří s atomem dusíku, na nějž jsou vázány, piperidinový kruh, ,-X znamená atom vodíku nebo Cl-C4alkoxyskupinu,

   Xi znamená atom vodíku,

   Y znamená atom vodíku, Cl-C5alkanoyl nebo aryloyl,

   Z znamená atom vodíku, m=2, η = 1, p = 2, vazba' mezi atomy v poloze 3-4 je dvojná vazba a vazba mezi atomy v poloze 4-4a je jednoduchá vazba.
3. 3. 2H-l-benzopyranový derivát obecného vzorce I podle nároku 1 a 2, kterým je 3-fenyl-4-(4-(2-(N-piperidinyl) ethoxy) benzyl) -7-hydroxychrom-3-en, jeho estery a jeho soli.
4. 4. 2H-l-benzopyranový derivát obecného vzorce I podle nároku 1 a 2, kterým je 3-(4-methoxy)fenyl-4-[[4-[2-(1-piperidinyl) ethoxy]' fenyl] methyl] - 2H-1 -benzopyran- 7 -ol, jeho estery a jeho soli.

   • ♦· ·· ·· ·» ···♦ ·· · · ···· · · · • ···*·· · · · • · · · · · ··· 9 9 9 ·

   9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

   9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
5. 5. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že jako svou účinnou složku obsahuje alespoň jeden 2H-1-benzopyranový derivát podle některého z nároků 1 až 4 spolu s farmaceuticky přijatelnými pomocnými látkami.
6. 6. Použití 2H-l-benzopyranových derivátů podle některého z nároků 1 až 4 pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci a léčení postmenopauzálních chorobných stavů, ΐ zvláště osteoporózy, koronárního srdečního onemocnění a lidských zhoubných nádorů, závislých na estrogenu.