CZ20013824A3 - Protilátka, farmaceutický prostředek a diagnostická sada - Google Patents

Protilátka, farmaceutický prostředek a diagnostická sada Download PDF

Info

Publication number
CZ20013824A3
CZ20013824A3 CZ20013824A CZ20013824A CZ20013824A3 CZ 20013824 A3 CZ20013824 A3 CZ 20013824A3 CZ 20013824 A CZ20013824 A CZ 20013824A CZ 20013824 A CZ20013824 A CZ 20013824A CZ 20013824 A3 CZ20013824 A3 CZ 20013824A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antibody
disease
patient
epitope
antibodies
Prior art date
Application number
CZ20013824A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ304876B6 (cs
Inventor
Dale B. Schenk
Frederique Bard
Nicki J. Vasquez
Ted Yednock
Original Assignee
Neuralab Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23254226&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ20013824(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Neuralab Limited filed Critical Neuralab Limited
Publication of CZ20013824A3 publication Critical patent/CZ20013824A3/cs
Publication of CZ304876B6 publication Critical patent/CZ304876B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/605—MHC molecules or ligands thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká použití protilátky, která se váže k Αβ pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení onemocnění spojeného s amyloidními depozity v mozku pacienta. Vynález spadá do oblasti imunologie a medicíny.
Dosavadní stav techniky
Alzheimerova nemoc je progresivní onemocnění, které vede k senilní demenci (v obecném případě se popisuje v publikaci Selkoe, TINS 16, 403-409 (1993), Hardy et al., WO 92/13 069, Selkoe, J., Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 438-447 (1994), Duff et al., Nátuře 373, 476-477 (1995), Games et al., Nátuře 373, 523 (1995)) . Obecně řečeno toto onemocnění spadá do dvou kategorií: vznik onemocnění v pozdějším věku (nad 65 let) a časný vnik onemocnění, ke kterému dochází před obdobím senility, to znamená mezi 35 a 60 lety. U obou typů onemocnění je patologie stejná, ale abnormality mají tendenci být závažnější v případech začínajících v ranném věku. Onemocnění se charakterizuje alespoň dvěma typy lézí v mozku, senilními plaky a neurofibrilárními uzly. Senilní plaky jsou oblasti desorganizovaných neurofilů, kdy jejich průměr dosahuje až 150 pm, s extrabuněčnými amyloidními deposity v centru, které jsou viditelné mikroskopickou analýzou sekcí mozkové tkáně. Neurofibrilární uzle jsou vnitrobuněčné depozity mikrotubule spojené s proteinem tau, jenž obsahuje dvě vlákna, které omotávají každý druhý v páru.
Základní část plaků je peptid nazvaný Αβ nebo β-amyloidní peptid. Peptid Αβ je vnitřní fragment aminokyselin 39-43 prekurzorového proteinu nazvaného amyloidní prekurzorový protein (APP). Několik mutací APP koreluje s přítomností
Alzheimerovy nemoci (popisuje se v publikaci Goate et al. , Nátuře 349, 704) (1991) (valin Αβ717 na izoleucin) , Chartier Harlan et al., Nátuře 353, 844 (1991)) (valin717 na glycin), Murrell et al., Science 254, 97 (1991) fenylalanin), Mullan et al., Nátuře Genet,
717 (dvojitá mutace měnící lyzin595-methionin596
Αβ (popisuje se Tato pozorování (valin na
1, 345 (1992) na asparagin leucin596) . Uvažuje se, že takové mutace způsobují Alzheimerovu nemoc zvýšeným nebo změněným zpracováním APP na Αβ, zvláště zpracování APP na zvýšené množství dlouhé formy Αβ (to znamená Αβ1-42 a Αβ1-43). Ukazuje se, že mutace v jiných genech, jako jsou geny prezenilinu PSI a PS2 nepřímo ovlivňují APP za vzniku zvýšeného množství dlouhé formy v publikaci Hardy, TINS20, 154 (1997)) ukazuje, že Αβ a zvláště jeho dlouhá forma je u Alzheimerovy nemoci kauzativní element.
M.C. Michael v dokumentu EP 526 511 popisuje aplikaci homeopatických dávek (které jsou rovné nebo nižší než hodnota 10-2 mg/den) Αβ pacientům s AD. U typického člověka, který má přibližně 5 litrů plazmy, se očekává, že horní limit této dávky vytvoří koncentraci ne vyšší než 2 pg/ml. Normální koncentrace Αβ v lidské plazmě je v typickém případě v rozmezí 50 až 200 pg/ml (popisuje se v publikaci Seubert et al., Nátuře 359, 325-327 (1992)). Protože v dokumentu EP 526 511 se popisuje dávka, která těžko změní množství endogenního cirkulujícího Αβ a protože v dokumentu EP 526 511 se nedoporučuje použití adjuvans, jako imunostimulantu a zdá se nepravděpodobné, že dojde k jakémukoliv terapeutickému účinku.
Naopak vynález popisuje léčbu Alzheimerovi nemoci a jiného amyloidogenního onemocnění aplikací fragmentů Αβ nebo protilátky k jistým epitopům Αβ v pacientovi za podmínek, které vyvolávají u pacienta pozitivní imunitní odezvu. Vynález dále popisuje dlouhotrvající potřebu terapeutických režimů pro ♦ « prevenci nebo zmírnění neuropatologie a u některých pacientů poruchy poznání spojené s Alzheimerovou nemocí.
Tento dokument se vztahuje k dokumentu WO 99/27 944, podaném 30. 11. 1998, US 60/067 740 podaném 2. 12. 1997, US 60/080 970, podaném 7.4.1998 a US 09/201 430 podaném 30.11.1998.
Podstata vynálezu
Vynález popisuje použití protilátky, která se váže na Αβ, pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení onemocněni spojeného s amyloidními depozity Αβ v mozku pacienta. Taková onemocnění zahrnují Alzheimerovu nemoc, Downův syndrom a poruchy poznávání. Později se mohou vyskytovat s nebo bez jiných charakteristik amyloidogenního onemocnění. Některé metody podle vynálezu zahrnují aplikaci účinné dávky protilátky, která se specifický váže na komponent amyloidního depozitu u pacienta. Takové metody jsou zvláště použitelné při prevenci nebo léčbě Alzheimerovi nemoci u lidských pacientů. Některé metody umožňují aplikaci účinné dávky protilátky, která se váže na Αβ. Některé metody zahrnují aplikaci účinné dávky protilátky, která se specificky váže na epitop ve zbytcích 1 až 10 Αβ. V některých metodách se protilátka specificky váže na epitop ve zbytcích 1 až 6 Αβ. V některých metodách se protilátka specificky váže na epitop ve zbytcích 1 až 5 Αβ. V některých metodách se protilátka specificky váže na epitop ve zbytcích 1 až 7 Αβ. V některých metodách se protilátka specificky váže na epitop ve zbytcích 3 až 7 Αβ. V některých metodách se protilátka specificky váže na epitop ve zbytcích 1 až 3 Αβ. V některých metodách se protilátka specificky váže na epitop ve zbytcích 1 až 4 Αβ. V některých metodách se protilátka váže na epitop obsahující volný Nterminální zbytek Αβ. V některých metodách se protilátka váže na epitop obsahující volný N-terminální zbytek Αβ. V některých metodách se protilátka váže na epitop ve zbytcích 1 až 10 Αβ, kde zbytek 1 a/nebo zbytek 7 Αβ je kyselina aspartová. V některých metodách se protilátka specificky váže na peptid Αβ, aniž se váže na amyloidní prekurzorový protein plné délky (APP). V některých metodách je izotyp protilátky lidský IgGl.
V některých metodách se protilátka váže u pacientů na amyloidní depozit a vyvolává jasnou odezvu proti amyloidnímu depozitu. Například taková zřejmá odezva může být ovlivněna fagocytózou zprostředkovanou receptorem Fc.
Tyto způsoby mohou být použity u pacientů, kteří jsou bez symptomů i se symptomy onemocnění. Protilátka používaná v takových metodách může být lidská, humanizovaná, chimérová nebo nelidská protilátka a může být monklonální nebo polyklonální. V některých metodách se protilátka připravuje z člověka imunizovaného peptidem Αβ, kdy člověkem může být pacient léčený protilátkou.
U některých metod se protilátka aplikovala s farmaceutickým nosičem, jako farmaceutický prostředek. U některých metod se protilátka aplikovala v dávce 0,0001 až 100 mg/kg, upřednostňuje se alespoň 1 mg/kg protilátky na tělesnou hmotnost. V některých metodách se protilátka aplikovala ve více násobné dávce po dlouhou dobu, například alespoň 6 mesicu.
některých metod se prostředek s postupným uvolněním, například intraperitoneálně, intrakraniálně, intramuskulárně, protilátka aplikovala jako Protilátka se může aplikovat orálně, subkutánně, topicky, intranásálně nebo intravenozně.
V některých metodách se protilátka aplikovala aplikací polynukleotidu, který u pacienta kóduje alespoň jeden protilátkový řetězec. Polynukleotid se exprimuje, přičemž u pacienta vzniká protilátkový řetězec. Polynukleotid kóduje těžký a lehký řetězec protilátky. Polynukleotid se exprimuje, přičemž u pacienta vzniká těžký a lehký řetězec. V některých
metodách se v krvi pacienta monitorovalo množství aplikované protilátky.
Vynález popisuje způsoby prevence nebo léčby onemocnění spojené s amyloidními depozity Αβ v mozku pacienta. Metody se mohou použít například při léčbě Alzheimerovy nemoci nebo Downova syndromu nebo poruch poznávání. Takové metody zahrnují aplikaci Αβ nebo jeho analogů, které vyvolávají imunogenní odezvu proti jistým epitopům v Αβ. Některé metody zahrnují aplikaci pacientovi účinné dávky polypeptidu, který obsahuje N-terminální segment alespoň zbytků 1 až 5 Αβ. První zbytek Αβ je N-terminální zbytek polypeptidu, kde polypeptid je volný Cterminální segment Αβ. Některé metody zahrnují aplikaci pacientovi účinné dávky polypeptidu, který obsahuje Nterminální segment Αβ, segment, který začíná zbytkem 1 až 3 Αβ a končící zbytky 7 až 11 Αβ. Některé metody zahrnují aplikaci pacientovi účinné dávky činidla, která vyvolává imunogenní odezvu proti N-terminálnímu segmentu Αβ. Segment obsahuje zbytek 1 až 3 Αβ a končí zbytky 7 až 11 Αβ, aniž se vyvolává imunogenní odezva proti epitopu ve zbytcích 12 až 43 Αβ43.
V některých shora popsaných metodách N-terminální segment Αβ je spojen svým C-koncem k heterolognímu peptidu. V některých shora uvedených metodách N-terminální segment Αβ je spojen s Nkoncem heterologního polypeptidu. V některých shora uvedených metodách N-terminální segment Αβ je spojen svým N a C-koncem k prvnímu a druhému heterolognímu polypeptidu. V některých shora uvedených metodách N-terminální segment Αβ je spojen svým N-koncem s heterologním peptidem a svým C-koncem s alespoň jednou další kopií N-terminálního segmentu. V některých shora popsaných metodách heterologní polypeptid vyvolává odezvu Bbuněk proti N-terminálnímu segmentu. V některých shora uvedených metodách polypeptid dále obsahuje alespoň jednu další kopii N-terminálního segmentu. V některých shora • · · uvedených metodách polypeptid obsahuje z N-konce k C-konci Nterminální segment Αβ, velké množství dalších kopií Nterminálního segment Αβ a heterologní aminokyselinový segment. V některých shora uvedených metodách N-terminální segment obsahuje Αβ1-7. V některých shora uvedených metodách Nterminální segment obsahuje Αβ3-7.
V některých metodách fragment neobsahuje alespoň 5 aminokyselin C-konce v Αβ43. V některých metodách fragment obsahuje až 10 kontinuálních aminokyselin z Αβ. Fragmenty se v typickém případě aplikují v množství vyšším než 10 mikrogramů v dávce pro jednoho pacienta.
V některých metodách se fragment aplikuje s adjuvans, které zvyšuje imunitní odezvu na peptid Αβ. Adjuvans a fragment se mohou aplikovat v jakémkoliv pořadí nebo společně jako vakcinační prostředek. Adjuvans může být například hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, MPL(tm), QS-21 (Stimulation(tm)) nebo nekompletní Freundovo adjuvans.
Vynález dále popisuje farmaceutické prostředky obsahující fragmenty Αβ nebo jejich činidla vyvolávající imunogenní odezvu na stejné epitopy Αβ, které se popisují shora v textu, a
Vynález také popisuje farmaceutické prostředky libovolné protilátky popsané shora v textu a farmaceuticky přijatelný nosič.
Vynález dále popisuje způsoby testování aktivity protilátky při léčbě onemocnění spojené s depozity Αβ v mozku pacienta (například Alzheimerova nemoc). Takové metody zahrnují kontakt protilátky s polypeptidem, který obsahuje alespoň pět kontinuálních aminokyselin N-terminálního segmentu Αβ, který začíná zbytkem 1 a 3 Αβ, polypeptide neobsahuje Cterminální segment Αβ. Pak se stanoví, zda se protilátka specificky váže na polypeptid, přičemž specifické navázání indikuje, že protilátka je aktivní při léčbě onemocnění.
adjuvans. obsahuj ící ··· ··
Vynález dále popisuje metody testování aktivity protilátky při čištění biologické entity spojené s antigenem. Takové metody zahrnují kombinování biologické entity spojené s antigenem a protilátky a fagocytových buněk nesoucích receptory Fc v kultivačním médiu. Monitoruje se množství biologické entity spojené s antigenem, které zůstává v médiu. Redukce množství biologické entity spojené s antigenem indikuje, že protilátka má neutralizační aktivitu proti biologické entitě spojené s antigenem. Antigen je možné poskytnout jako tkáňový vzorek nebo v izolované formě. Antigen je možné poskytnout jako tkáňový vzorek z mozku pacienta trpícího Alzheimerovou nemocí nebo savce, který vykazuje Alzheimerovu patologii. Jiné vzorky tkání, proti kterým může být testována neutralizační aktivita protilátky, zahrnují vzorky tkáně zhoubného bujení, nemaligní abnormální buněčný růst nebo tkáňové vzorky obsahující abnormální extrabuněčnou matrici.
Vynález popisuje způsoby detekce amyloidního depozitu u pacienta. Takové metody zahrnují aplikaci protilátky pacientovi, přičemž tato protilátka se zvláště váže na epitop v aminokyselinách 1 až 10 Αβ a detekuje přítomnost protilátky v mozku pacienta. V některých metodách se protilátka váže na epitop ve zbytcích 4 až 10 Αβ. V některých metodách je protilátka značena paramagnetickou značkou a detekuje se nukleární magnetickou rezonanční tomografií.
Vynález dále popisuje diagnostické kity vhodné pro použití ve shora popsaných metodách. Takový kit obsahuje protilátku, která se specificky váže na epitop se zbytky 1 až 10 Αβ. Některé kity nesou značku popisující použití protilátky pro diagnostiku a monitorování Alzheimerovi nemoci in vivo.
Definice • · · · ·
Termín „podstatná shoda znamená, že dvě peptidové sekvence, když jsou uspořádány optimálně, například použitím programů GAP nebo významnosti mezer, standardní míry shodu sekvencí.
BESTFIT za použití sdílí alespoň 65 í Upřednostňuje se alespoň 80 nebo 90 % shody sekvence, více se upřednostňuje alespoň 95 % shody sekvence nebo více (například 99 % shoda sekvence nebo vyšší). Upřednostňují se polohy zbytků, které nejsou shodné a liší se substitucemi aminokyselin.
Při porovnání sekvencí v typickém případě jedna sekvence působí jako referenční sekvence, se kterou se testovaná sekvence porovnává. Když se použije algoritmus porovnání sekvence, testovaná a referenční sekvence jsou vstupní data, jestli je to nutné, stanoví se subsekvenční koordináty a navrhnou se programové parametry sekvenčního algoritmu. Algoritmus porovnání sekvence pak vypočítá procento shody sekvence v případě testovaných sekvencí vztaženo k referenční sekvenci na základě označených programových parametrů.
Optimální uspořádání sekvencí za účelem porovnání může být doprovázeno například algoritmem lokální homologie (popisuje se v publikaci Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), algoritmem homologického uspořádání (popisuje v publikaci Needleman and Wunsh, J. Mol. Biol. 48:
(1970)), vyhledáváním v případě metody podobnosti (popisuje se v publikaci Pearson and Lipman, Porc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), počítačovou implementací těchto algoritmů (GAP,
BESTFIT, FASTA a TFASTA v softwaru Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) nebo vizuálně (v obecném případě se popisuje v publikaci Ausubel et al.,). Jeden příklad algoritmu, který je vhodný pro stanovení procenta sekvenční shody a pro stanovení sekvenční podobnosti je vhodný algoritmus BLAST, v publikaci Altschul et al., J. Mol.
(1990) . Software vhodný pro analýzu BLAST je veřejně dostupný se
443 který se popisuje Biol. 215: 403-410 • 4 • *· u instituce National Center for Biotechnology Inforamtion (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). V typickém případě standardní parametry programu se mohou použít k porovnání sekvencí, ačkoli je možné také použít parametry klienta. V případě aminokyselinových sekvencí program BLAST používá jako standardní délku slova (W) rovnou třem, pravděpodobnost (E je 10 a skórující matrici BLOSUM62 (popisuje se v publikaci Henikoff and Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989)).
Pro účely klasifikace substitucí aminokyselin na konzervativní a nekonzervativní se aminokyseliny rozdělují následovně: skupina I (hydrofóbní postraní řetězce): norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile, Skupina II (neutrální hydrofilní postraní řetězce): Cys, Ser, Thr, skupina III (kyselé postraní řetězce): Asp, Glu, skupina IV (zásadité postranní řetězce) : Asn, Gin, His, Lys, Arg, skupina V (zbytky ovlivňující orientaci řetězce): Gly, Pro a skupina VI (aromatické postranní řetězce): Trp, Tyr, Phe. Konzervativní substituce zahrnují substituce mezi aminokyselinami ve stejné třídě. Nekonzervativní substituce obsahují změny členů jedné z těchto skupin za člena jiné skupiny.
Terapeutická činidla podle vynálezu v typickém případě v podstatě neobsahují nežádoucí nečistoty. To znamená, že činidlo je v typickém případě přibližně z 50 % (hmot./hmot.) čisté, stejně jako je v podstatě bez interferujících proteinů a nečistot. V některých případech jsou činidla alespoň přibližně z 80 % (hmot./hmot.) , více se upřednostňuje alespoň z 90 % nebo přibližně z 95 % (hmot./hmot.) , čistá. Použitím běžného postupu čištění proteinu se mohou získat alespoň z 99 % (hmot./hmot.) homogenní peptidy.
Specifické navázání mezi dvěmi entitami znamená afinitu alespoň ΙΟ6, 107, 10®, 109 M1 nebo 1O10 M_1. Preferují se afinity vyšší než 108 M1.
Termín „protilátka nebo „imunoglobulín zahrnuje neporušené protilátky a jejich vazebné fragmenty. V typickém případě fragmenty soutěží s neporušenou protilátkou, ze které se získaly pro specifické navázání na fragment antigenů zahrnující separované Fab'F(ab')2, Fabc a těžké řetězce, lehké řetězce Fab, Fv. Fragmenty se produkují metodou rekombinace DNA nebo enzymatickou nebo chemickou separací neporušených imunoglobulinů. Termín „protilátka také zahrnuje jeden nebo více imunoglobulinových řetězců, které jsou chemicky konjugovány nebo se exprimuji jako fúzní proteiny s jinými proteiny. Termín „protilátka také zahrnuje bispecifickou protilátku. Bispecifická nebo bifunkční protilátka je umělou hybridní protilátkou, která má dva různé páry těžkého/lehkého řetězce a dvě různá vazebná místa. Bispecifické protilátky mohou vznikat použitím různých metod, které zahrnují fúzi hybridomů nebo spojení fragmentů Fab' (popisuje se například v publikaci Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al., J.
Immunol. 148, 1547-1553 (1992)).
APP695, APP751 a APP770 odpovídá dlouhým polypeptidům s 695, 751 a 770 aminokyselinovými zbytky kódovanými lidským genem APP (opisuje se v publikaci Kang et al. , Nátuře 325, 773 (1987), Ponte et al., Nátuře 331, 525 (1988) a Kitaguchi et al., Nátuře 331, 530 (1988)). Aminokyseliny s lidským amyloidním prekurzorovým proteinem (APP) jsou označeny čísly podle sekvence izoformy APP770. Termíny, jako jsou Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 a Αβ43 znamenají peptid Αβ obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 39, 1 až 40, 1 až 41, 1 až 42 a 1 až 43.
Termín „antigen znamená entitu, na kterou se protilátka váže specificky.
Termín „epitop nebo „antigenní determinanta znamená místo na antigenů, na které odpovídají buňky B a/nebo T.
Epitopy buňky B se mohou tvořit z kontinuálních aminokyselin • fc • *
fc nebo nekontinuálních aminokyselin srovnaných vedle sebe terciálním balením proteinu. Epitopy tvořené z kontinuálních jsou v typickém případě vystaveny expozici denaturačním rozpouštědlům, zatímco epitopy tvořené terciálním balením se v typickém případě ztratí ošetřením v denaturačních rozpouštědlech. Epitop v typickém případě zahrnuje alespoň 3 a obvykle více alespoň 5 nebo 8 až 10 aminokyselin v jedinečné prostorové konformaci. Metody stanovující prostorovou konformaci epitopů zahrnují například krystalografii pomocí paprsků X a dvou dimenzální jadernou magnetickou rezonanci (popisuje se například v publikaci Epitop Mapping Protocols in Meyhods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)). Protilátky, které rozeznávají stejný epitop se mohou identifikovat jednoduchým imunotestem, který vykazuje schopnost jedné protilátky blokovat navázání jiné protilátky na cílový antigen. T-buňky rozeznávají kontinuální epitopy obsahující přibližně 9 aminokyselin pro buňky CD8 nebo přibližně 13 až 15 aminokyselin pro buňky CD4. T buňky, které rozeznávají epitop, se mohou identifikovat testy in vitro, které měří proliferaci závislou na antigenů, jak se stanovilo začleněním 3H-tymidinem primárních T buněk při odezvě na epitop (popisuje se v publikaci Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 111019 (1994)) odumíráním v závislosti na antigenů (test cytotoxicity u lymfocytu, popisuje se v publikaci Tigges et al., J. Immunol. 156, 3901-3910) nebo vylučováním cytokinů.
Termín „imunologická nebo „imunní odezva je založen na pozitivní humorální (to znamená zprostředkované protilátkami) a/nebo buněčné (zprostředkované T-buňkami specifické pro antigen nebo jejich produkty vylučování) odezvy řízené proti amyloidnímu peptidů u recipientního pacienta. Taková odezva může být aktivní odezva indukovaná aplikací imunogenem nebo pasivní odezva vyvolaná aplikací protilátky nebo primární T buňkou. Buněčná imunitní odezva se vyvolala přítomností polypeptidových epitopů ve spojení s molekulami MHC třídy I
nebo třídy II, aby se aktivovaly pomocné buňky T CD4+ specifické pro antigen a/nebo cytotoxické T buňky CD8+. Odezva může také vyvolat aktivaci monocytů, makrofágů, buněk NK, bazofilů, dendritických buněk, astrocytů, buněk mikroglia, eozinofilů nebo jiných komponentů přirozené imunity. Přítomnost imunologické odezvy zprostředkované buňkou se mohou stanovit proliferačními testy (buňky T CD4+) nebo testy CTL (cytotoxický lymfocyt T) (popisuje se v publikaci Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994), Tigges et al., J. Immunol. 156, 3901-3910)). Relativní příspěvek humorální a buněčné odezvy při ochranném nebo terapeutickém účinku imunogenu se může odlišovat separátně izolací protilátek a Tbuněk z imunizovanovaného syngenního zvířete a měřením ochranného nebo terapeutického účinku u druhého subjektu.
Termín „imunogenní činidlo nebo „imunogen je schopný vyvolat imunologickou odezvu proti jemu samému při aplikaci savci nebo při spojení s adjuvans.
Termín „samotný polynukleotid znamená polynukleotid, který netvoří komplexy s koloidními materiály. Samotné polynukleotidy se někdy klonují do plazmidového vektoru.
Termín „adjuvans znamená sloučeninu, která, když se aplikuje ve spojení s antigenem vyvolává imunitní odezvu na antigen, ale když se aplikuje samotná, nevyvolává imunitní odezvu na antigen. Adjuvans může vyvolat imunitní odezvu několika mechanizmy, které zahrnují aktivaci lymfocytů. stimulaci buněk B a/nebo T a stimulaci makrofágů.
Termín „pacient zahrnuje lidské nebo jiné savčí subjekty, které se ošetřily profylakticky nebo terapeuticky.
Termín „desagregované nebo monomerické Αβ znamená rozpustné, monomerické peptidové jednotky Αβ. Jedna metoda přípravy monomérních Αβ zahrnuje rozpuštění lyofilizovaného peptidu v neředěném DMSO a sonikaci. Výsledný roztok se centrifugoval, aby se se odstranily nerozpustné částice.
Agregované Αβ je směs oligomérů, ve které monomerní jednotky se uchovávají spolu s nekovalentními vazbami.
Soutěž mezi Αβ protilátkami se stanovila testem, ve kterém testovaný imunoglobulin inhibuje specifické navázání referenční protilátky na běžný antigen, jako je Αβ. Je známa řada typů kompetetivních vazebných testů, například: přímý nebo nepřímý radioimunologický test na pevné fázi (RIA), přímý nebo nepřímý enzymatický imunologický test na pevné fázi (EAI), sendvičový kompetetivní test (popisuje se v publikaci Stáhli et al., Methods in enzymology 9: 242-253 (1983)), přímý biotin-avidinový EIA na pevné fázi (popisuje se v publikaci Kirkland et al., J. Immunol. 137: 3614-3619 (1986)), přímý značený test na pevné fázi, přímý značený sendvičový test na pevné fázi (popisuje se v publikaci Harlow and Lané, „Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)), přímý značený test RIA na pevné fázi, kdy se jako značka použije 1-125 (popisuje se v publikaci Morel et al. Molec. Immunol. 25(1): 7-15 (1988)), přímý biotin-avidinový test EIA na pevné fázi (popisuje se v publikaci Cheung et al., a přímý značený test RIA Immunol. 32: 77-82 (1990)).
referenční stanovením nebo buněk
Virology 176: 546-552 (1990)) (Moldenhauer et al., Scand. J.
V typickém případě takový test zahrnuje použití čištěného antigenů vázaného na pevný povrch nebo na buňky nesoucí buď neznačený testovaný imunoglobulin a značený imunoglobulin. Kompetetivní inhibice se měří množství značky vázané na pevný povrch v přítomnosti testovaného imunoglobulinu. Obvykle testovaný imunoglobulin je přítomen v nadbytku. Protilátky identifikované kompetetivním testem (kompetetivní protilátky) zahrnují protilátky vázající se na samotný epitop jako referenční protilátka a protilátky vázající se na přilehlý epitop dostatečně blízký epitopu vázaném na referenční protilátku, aby se objevila prostorová překážka. Obvykle, když je přítomná kompetetivní protilátka v nadbytku, bude inhibovat
9 specifické navázání referenční protilátky na běžný antigen alespoň z 50 nebo 75 %.
Kompetice nebo metody „obsahující jeden nebo více zmiňovaných elementů mohou zahrnovat jiné elementy, které nejsou specificky uvedeny. Například prostředek, který obsahuje peptid Αβ obsahuje izolovaný peptid Αβ a peptid Αβ, jako komponent větší polypeptidové sekvence.
prevence nebo amyloidogenních komponent amyloidního
I. Obecný popis
Několik amyloidogenních onemocnění a stavů se charakterizovalo přítomností depozitů peptidů Αβ, který tvoří agregáty s nerozpustnou hmotou v mozku pacienta. Taková onemocnění zahrnují Alzheimerovu nemoc, Downův syndrom a poruchy poznávání. Později se vyskytuje symptom Alzheimerovy nemoci a Downova syndromu, ale stav pacienta nemusí vykazovat žádnou z charakteristik žádného uvedeného onemocnění. Příkladem jsou slabé poruchy poznávání nebo ztráta paměti spojená s věkem pacientů, u kterých se ještě nevyvinula nebo nikdy se nevyvine Alzheimerova nemoc. Slabá porucha poznávání může být definována skóre v testu „Mini-Mental State Exam* v souladu s dohodnutými zvyklostmi. Taková onemocnění jsou charakterizována agregáty Αβ, které mají strukturu skládaného β-listu a barví se barvivém červeň Congo. Základní přístup léčby Alzheimoravy nemoci nebo jiných vytvořením imunogenní odezvy na depozitu u pacienta se popisuje v dokumentu WO 99/27 944 (uvedeno jako citace). Dokument opakuje a potvrzuje účinnost základního přístupu. Dokument se svým principem dotýká zdokonalených činidel, které se používají v metodách. Taková zdokonalení jsou předpokládány na základě lokalizovaných preferovaných epitopů v Αβ proti kterému je řízena imunogenní odezva. Identifikace preferovaných epitopů v Αβ vede ke vzniku činidel a metod, které mají nemoci « · zvýšenou účinnost, snížený potenciál pro vedlejší účinky a/nebo vedou ke zjednodušení výroby, tvorby a aplikace.
II. Terapeutická činidla
Imunogenní odezva může být aktivní, jako když se imunogen aplikuje za účelem vyvolání protilátek reaktivních s Αβ u pacienta, nebo může být pasivní, jako když se aplikuje protilátka, která se váže na Αβ u pacienta.
1. Činidla vyvolávající aktivní imunitní odezvu
Terapuetická činidla vyvolávají imunogenní odezvu specificky řízenou na jisté epitopy v peptidech Αβ. Mezi preferovaná činidla patří samotný peptid Αβ a jeho segmenty. Také se mohou použít varianty takových segmentů, analogů a napodobenin přirozeného peptidu Αβ, které vyvolávají protilátky a/nebo s nimi zkříženě reagují s protilátkami vytvořenými proti preferovaným epitopům peptidu Αβ.
Peptid Αβ také známý jako β-amyloidní peptid nebo peptid A4 (popisuje se v dokumentu US 4 666 829, Glenner and Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984)) je peptid obsahující 39 až 43 aminokyselin, který je základní komponent charakteristických plaků Alzheimerovy nemoci. Peptid Αβ se vytvořil zpracováním větších proteinů APP dvěma enzymy, které se nazývají sekretázy β a γ (popisuje se v publikaci Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Známé mutace v APP spojené s Alzheimerovým onemocněním se objevují v blízkosti místa sekretázy β a γ nebo v Αβ. Poloha 717 je například blízko místa štěpení APP sekretázou γ při zpracování peptidu Αβ a polohy 670/671 jsou přibližně v místě štěpení sekretázy β. Věří se, že mutace způsobují AD interakcí se štěpícími reakcemi, kterými se tvoří Αβ, tak že vznikne forma peptidu Αβ se zvýšeným množstvím aminokyselin 42/43.
• ·
Αβ má neobvyklé vlastnosti, které se mohou fixovat a aktivovat klasickou a alternativní kaskádou komplementu. Zvláště se váže na Clq a hlavně na C3bi. Toto spojení umožňuje navázání na makrofágy, které vede k aktivaci buněk B. Navíc se C3bi dále odbourává a pak se váže na CR2 na B buňkách způsobem závislým na T buňkách, který vede k 10 000 zvýšení aktivace těchto buněk. Tento mechanizmus způsobuje, aby Αβ vytvořil imunitní odezvu z nadbytkem jiných antigenů.
Αβ vykazuje několik přirozeně se objevujících forem. Lidské formy Αβ se nazývají Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 a Αβ43.
Sekvence těchto peptidů a jejich vztah k prekurzoru APP se ilustruje na obrázku č. 1 v publikaci Hardy et al., TINS 20, 155-158(1997). Αβ42 má například sekvenci (SEQ ID NO: 42):
H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-GlnLys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-IIe-Gly-Leu-MetVal-Gly-Gly-Val-Val-IIe-Ala-OH.
Αβ41, Αβ40 a Αβ39 se liší od Αβ42 vypuštěním Ala, Ala-Ile, a Ala-Ile-Val z C-konce. Αβ43 se liší od Αβ42 přítomností treoninového zbytku na C-konci.
Imunogenní fragmenty Αβ jsou v několika metodách vzhledem k nepoškozené molekule výhodné z několika důvodů. První důvod je, že pouze jisté epitopy v peptidů Αβ vyvolávají použitelnou imunogenní odezvu při léčbě Alzheimerova onemocnění, stejná dávka fragmentu, který obsahuje takové epitopy poskytuje vyšší molární koncentraci použitelných imunogenních epitopů ve srovnání s dávkou nepoškozeného Αβ. Za druhé, jisté imunogenní fragmenty Αβ vytvoří imunogenní odezvu proti amyloidním depozitům, aniž dojde k podstatné imunogenní odezvě proti proteinu APP, ze kterého je Αβ odvozen. Výroba fragmentů peptidů Αβ je jednoduší ve srovnání s neporušeným Αβ, což způsobuje jejich menší velikost. Za čtvrté, fragmenty Αβ • · ··· ·· ·*· ···· netvoří agregáty s neporušeným A, zjednodušují přípravu farmaceutických prostředků a jejich aplikaci.
Některé imunogenní fragmenty Αβ mají sekvenci alespoň 2, 3, 5, 6, 10 nebo 20 kontinuálních aminokyselin z přirozeného peptidu. Některé imunogenní fragmenty nemají více než 10, 9, 8, 7, 5 nebo 3 kontinuální zbytky z Αβ. Preferují se fragmenty z N-terminální poloviny Αβ. Preferované imunogenní fragmenty zahrnují Αβ1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3 a 1-4. Označení fragmentu Αβ1-5 například indikuje fragment zahrnující zbytky 1 až 5 peptidu Αβ a nedostatek jiných zbytků Αβ. Zvláště výhodné jsou fragmenty začínající zbytky 1 až 3 peptidu Αβ a končící zbytky 7 až 11. Fragment Αβ1-12 se může také použít, ale je méně výhodný. V některých metodách je fragmentem N-terminální fragment, který je jiný než Αβ1-10. Jiné méně výhodné fragmenty zahrnují Αβ13-28, 17-28, 1-28, 25-35, 35-49 a 35-42. U těchto fragmentů je nutné před použitím testovat aktivitu odstranění nebo prevence amyloidních depozitů, jak se popisuje v sekci Příklady provedení vynálezu. V některých metodách se použijí fragmenty, kterým chybí alespoň jeden a někdy alespoň pět nebo 10 C-terminálních aminokyselin přítomných v přirozeně se vyskytujících formách Αβ. Například fragment, kterému chybí 5 aminokyselin C-konce Αβ43 zahrnuje prvních 38 aminokyselin z Nkonce Αβ. Jiné komponenty amyloidních plaků, jako je například synuklein a jeho epitopické fragmenty se mohou také použít při vyvolání imunogenní odezvy.
Pokud není uvedeno jinak odkaz na Αβ zahrnuje přirozené lidské aminokyselinové sekvence uvedené shora v textu stejně jako analogy zahrnující alely, druhy a indukované varianty. Analogy se v typickém případě liší od přirozeně se vyskytujících peptidů jednou, dvěmi nebo několika polohami, často konzervativními substitucemi. Analogy v typickém případě vykazují alespoň 80 nebo 90 % shodu sekvence s přirozenými
18 • ·· ♦ 9 9 9 9 9 9 ♦ 999 • 9 • · 9 9« 9 99 99 9 9 9 9 9 < · 9 9 9 » ♦ · · 9 · 9 *9 9 9 ••9 9999 99 9
peptidy. Některé analogy také zahrnuj í nepřirozené
aminokyseliny nebo modifikace N nebo C terminálních
aminokyselin jedné, dvou nebo několika poloh. Například přirozený zbytek kyseliny aspartové v poloze 1 a/nebo 7 Αβ může být nahrazen kyselinou izoaspartovou. Příklady nepřirozených aminokyselin jsou D-aminokyseliny, a,a-disusbtituované aminokyseliny, N-alkylované aminokyseliny, kyselina mléčná, 4-hydroxyprolin, γ-karboxyglutamát, ε-Ν,N,N-trimethyllisin, ε-N-acetyllysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmethionin, 3-methylhistidin, 5-hydroxylysin, ω-N-methylarginin a isoaspartová kyselina. U fragmentů a analogů se může testovat profylaktická nebo terapeutická účinnost transgenního zvířecího modelu v porovnání s neléčenými kontrolami nebo s placebem, jak se popisuje dále v textu.
Peptid Αβ, jeho fragmenty a analogy se mohou syntetizovat syntézou peptidů na pevné fázi nebo rekombinantní expresí nebo se mohou získat z přirozených zdrojů. Automatické syntetizátory peptidů jsou běžně dostupné u řady výrobců, jako je Applied Biosystems, Foster City, California. Rekombinantní exprese může probíhat v bakteriích, jako je E. coli, v kvasinkách, v hmyzích nebo savčích buňkách. Postupy rekombinantí exprese se popisuje v publikaci Sambrook et al., Moíecular Clonning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2d ed., 1989). Některé formy peptidů Αβ jsou také běžně dostupné (například u firem American Peptides Company, lne., Sunnyvale, CA a California Peptide Research, lne., Napa, CA).
Terapeutická činidla také zahrnují delší polypeptidy, které zahrnují například aktivní fragment peptidů Αβ spolu s jinými aminokyselinami. Preferovaná činidla například zahrnují fúzni proteiny obsahující segment peptidů Αβ fúzovaný s heterologní aminokyselinovou sekvencí, která vyvolává odezvu u pomocných T buněk proti heterologní aminokyselinové sekvenci a tím odezvu B buněk proti segmentu Αβ. U takových polypeptidů • * se může testovat profylaktická a terapeutická účinnost u zvířecích modelů ve srovnání s neléčenými kontrolami nebo s placebem, jak se popisuje dále v textu. Peptid Αβ, analog, aktivní fragment nebo jiný polypeptid se může aplikovat ve spojení nebo v multimérní formě nebo v disociované formě. Terapeutická činidla také zahrnují multiméry monomérních imunogenních činidel.
V dalších variantách může být imunogenní peptid, jako je fragment Αβ, prezentován bakterií nebo virem, jako část imunogenního prostředku. Nukleová kyselina kódující imunogenní peptid je začleněna do genomu nebo episomu viru nebo bakterie. Nukleová kyselina je začleněna takovým způsobem, že imunogenní peptid se exprimuje jako vylučovaný protein nebo jako fúzní protein s vnějším povrchovým proteinem viru nebo s transmembránovým proteinem bakterie tak, že se vyjadřuje peptid. Viry nebo bakterie používané při takových metodách by měly být nepatogenní nebo utlumené. Vhodné viry zahrnují adenoviry, HSV, virus Venezuelské koňské encefalitidy a jiné viry alfa, virus vesikulární stomatitidy a jiné viry rhabdo, virus vakcínie a neštovic. Vhodné bakterie zahrnují Salmonella a Shigella. Zvláště vhodná je fúze imunogenního peptidu s HbsAg HBV. Terapeutická činidla také zahrnují peptidy a jiné sloučeniny, které nepotřebují mít podstatnou aminokyselinovou peptidu Αβ, ale které neslouží jako vyvolávají podobnou imunitní odezvu. U libovolných peptidů a proteinů tvořících skládané β-listy se testuje jejich vhodnost. Mohou se použít anti-idiotypické protilátky proti monoklonálním protilátkám proti Αβ nebo jiným amyloidogenním peptidům. Takové anti-Id protilátky napodobují antigen a tvoří proti nim imunitní odezvu (popisuje se v publikaci Essential Immunology (Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6th ed.), p.181). Činidla sekvenci podobnou napodobeniny Αβ a jiná než peptidy by měly vyvolat imunogenní odezvu proti • 0 polypeptidy, fosfolipidy, sloučeniny, jednomu nebo více preferovaných segmentů peptidy Αβ uvedených shora v textu (například segmenty 1-10, 1-7, 1-3 a 3-7).
Taková činidla výhodně vyvolávají imunogenní odezvu, která je určena jednomu ze segmentů, aniž je určena jiným segmentům peptidu Αβ.
U náhodných knihoven peptidů nebo jiných sloučenin se může také testovat jejich vhodnost. Kombinační knihovny je možné produkovat v případě řady typů sloučenin, které se mohou syntetizovat postupným způsobem. Takové sloučeniny zahrnují beta-točivé napodobeniny, polysacharidy, hormony, prostaglandiny, steroidy, aromatické heterocyklické sloučeniny, benzodiazepiny, oligomérní glyciny substituované na N-konci a oligokarbamáty. Velké kombinační knihovny sloučenin se mohou zkonstruovat způsobem kódovaných syntetických knihoven (ESL) popsaných v dokumentu WO 95/12 608 (Affymax), WO 93/06 121 (Affymax), WO 94/06 051 (Columbia University), WO 95/35 503 (Pharmacopeia) a
WO 95/30 642 (Scripps). Peptidové knihovny je možné vytvořit metodami vyjadřujícími fága (popisuje se v dokumentu WO 91/18 980 (Devlin)).
U kombinačních knihoven a jiných sloučenin se na začátku testuje jejich vhodnost tím, že se stanoví jejich kapacita vázat protilátky nebo jejich lymfocyty (B nebo Τ) , o kterých se ví, že jsou specifické pro peptid Αβ nebo jiné amyloidogenní peptidy. Například počáteční testování se může provést libovolným polyklonálním sérem nebo monoklonální protilátkou proti peptidu Αβ nebo jeho fragmentu. U sloučenin se pak může testovat schopnost vázat se na specifický epitop v Αβ (například 1-10, 1-7, 1-3, 1-4, 1-5 a 3-7).
mohou testovat stejnými postupy, které se mapování specifit protilátkových epitopů. U sloučenin určených takovým testováním se pak dále analyzuje kapacita vyvolat protilátky nebo reaktivní lymfocyty proti Αβ nebo jeho
Sloučeniny se popisují při • « fragmenty. Vícenásobné ředění séra se například může testovat na mikrotitračních destičkách, které se předem- potáhly peptidem Αβ nebo jeho fragmentem a provedl se standardní test ELISA za účelem testovat reaktivitu protilátek vůči Αβ nebo fragmentu. U sloučenin se pak testuje profylaktické a terapeutická účinnost u transgenních zvířat, které mají dispozice pro amyloidogenní onemocnění, jak se popisuje v sekci příkladů. Taková zvířata zahrnují například myší nesoucí mutaci APP v poloze 717, jak se popisuje v publikaci Games et al., Nátuře 373, 523 (1995), a myši nesoucí švédskou mutaci APP v místě 670/671 tak, jak se popisuje v dokumentu US 5 612 486 (McConlogue et al.,) a v publikaci Hsiao et al., Science 274, 99 (1996), Staufenbiel et al., Proč. Nati. Acad.
Sci. USA 94, 13287-13292 (1997), Sturchler-Pierrat et al.,
Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997), Borchelt et al., Neuron 19, 939-945 (1997)). Stejný testovací přístup se použil u jiných analogů potenciálních činidel Αβ a delších peptidu, které zahrnují fragmenty Αβ, jak se popisuje shora v textu.
2. Činidla vyvolávající pasivní imunitní odezvu
Terapeutická činidla podle vynálezu zahrnují protilátky, které se specificky váží na peptid Αβ nebo jiný komponent amyloidních plaků. Takové protilátky mohou být monoklonální nebo polyklonální. Některé takové protilátky se specificky váží na agregovanou formu Αβ, aniž se váží na disociovanou formu. Některé protilátky se specificky váží na disociovanou formu, aniž se váží na agregovanou formu. Některé protilátky se váží na agregovanou a disociovanou formu. Některé takové protilátky se váží na přirozeně se vyskytující krátkou formu peptidu Αβ (to je Αβ39, 40 nebo 41), aniž se váží na přirozeně se vyskytující dlouhou formu Αβ (to je Αβ42 a Αβ43) . Některé
A * protilátky se váží na dlouhou formu, aniž se váží na krátkou formu. Některé protilátky se váží na Αβ, aniž se váží na amyloidní prekurzorový protein plné délky. Protilátky používané při terapeutických metodách mají obvykle neporušenou konstantní oblast nebo alespoň dostatečnou konstantní oblast k interakci s receptorem Fc. Preferuje se lidský izotyp IgGl, protože vykazuje nejvyšší afinitu lidských izotypů pro receptor FcRI na fagocytární buňky. Mohou se také použít bispecifícké fragmenty Fab, ve kterých jedno rameno protilátky má specifitu pro Αβ a druhé rameno je specifické pro Fc receptor. Některé protilátky se vážou na Αβ s vazebnou afinitou vyšší nebo rovnou přibližné hodnotě ΙΟ6, ΙΟ7, ΙΟ8, 109 nebo 1O10 M-1.
Polyklonální sérum v typickém případě obsahuje smíchané populace protilátek vázajících se na několik epitopů v Αβ. Polyklonální sérum však může být specifické pro určitý segment Αβ, jako je segment Αβ1-10. Monoklonální protilátky se váží na specifický epitop v Αβ, který může být konformačním nebo nekonformačním epitopem. Profylaktická a terapeutická účinnost protilátek se může testovat použitím postupů pro transgenní zvířecí model popsaný v sekci příkladů. Preferované monoklonální protilátky se váží na epitop ve zbytcích 1-10 Αβ (s prvním N-terminálním zbytkem přirozeného Αβ označeného 1). Některé preferované monoklonální protilátky se váží na epitop v aminokyselinách 1 až 5 a některé na epitop v aminokyselinách 5 až 10. Některé preferované protilátky se váží na epitopy v aminokyselinách 1 až 3, 1 až 4, 1 až 5, 1 až 6, 1 až 7 nebo 3 až 7. Některé preferované protilátky se váží na epitop, který začíná zbytky 1 až 3 a končí zbytky 7 až 11 peptidů Αβ. Méně výhodné protilátky zahrnují ty, které se váží na epitopy se zbytky 10 až 15, 15 až 20, 25 až 30, 10 až 20, 20, 30 nebo 10 až 25 peptidů Αβ. Doporučuje se, že u takových protilátek se testuje před použitím aktivita v myším modelu, což se popisuje ··
dále v textu v sekci Příklady provedení vynálezu. Zjistilo se, například, že jisté protilátky proti epitopům ve zbytcích 10 až 18, 16 až 24, 18 až 21 a 33 až 42 nevykazují aktivitu. U některých metod se používá více monoklonálních protilátek vykazuje vazebnou specifitu vůči různým epitopům. Takové protilátky se mohou aplikovat postupně nebo současně. Mohou se také použít protilátky proti amyloidním komponentům, které jsou jiné než Αβ. Například protilátky mohou být řízeny amyloidním asociovaným proteinem synuklein.
Když se řekne, že protilátky se váží na epitop ve specifikovaných zbytcích, jako je například Αβ 1-5, znamená to, že se protilátka specificky váže na polypeptid obsahující specifikované zbytky (to je v tomto příkladu Αβ 1-5) . Taková protilátka nepřichází nezbytně do kontaktu s každým zbytkem v Αβ 1-5. Vazebnou afinitu ani podstatně neovlivňuje žádná jediná substituce nebo delece aminokyseliny v Αβ 1-5. Specifita epitopu protilátky se může stanovit například vytvořením knihovny vyjadřující fága, ve které různí členové vyjadřují různé subsekvence Αβ. V knihovně vyjadřující fága se pak mohou vybrat členi, kteří se specificky váží na testovanou protilátku. Izolovala se rodina sekvencí. V typickém případě taková rodina obsahuje běžnou jadernou sekvenci a různé délky lemujících sekvencí u různých členů. Nejkratší jaderná sekvence vykazující specífíké navázání na protilátku definuje epitop vázaný protilátkou. U protilátek se také testuje specifita epitopu v kompetičním testu s protilátkou, jejíž specifita epitopu se již stanovila. Například protilátky, které soutěží s protilátkou 3D6 o navázání na Αβ se váží na stejný nebo podobný epitop jako protilátka 3D6, to znamená na zbytky Αβ 1-5. Podobně, protilátky, které soutěží s protilátkou 10D5 se váží na stejný nebo podobný epitop, to je na epitop ve zbytcích Αβ 3-6. Testování protilátek na specifitu pro epitop je použitelný prediktor terapeutické účinnosti. Například je ··· η
*0 • 0
0 pravděpodobné, že protilátka, která se váže na epitop ve zbytcích 1 až 7 Αβ bude účinná při prevenci a léčbě Alzheimerovi nemoci.
Monoklonální nebo polyklonální protilátky, které se specificky váží na preferovaný segment Αβ, aniž se vážou na jiné oblasti Αβ mají řadu výhod vzhledem k monoklonálním protilátkám, které se váží na jiné oblasti nebo polyklonální séra vůči neporušenému peptidu Αβ. Zaprvé, v případě stejné hmotnostní dávky, dávky protilátek, které se specifiky váží na výhodné segmenty obsahují vyšší molární dávky protilátek účinných při odstranění amyloidních plaků. Za druhé, protilátky, které se specificky váží na výhodné segmenty mohou vyvolat odstraňující odezvu proti amyloidním depozitům, aniž vyvolají odstraňující odezvu proti neporušenému polypeptidu APP, čímž se snižuje potencionální vedlejší účinek.
i. Obecné charakteristiky imunoglobulinů
Je známo, že základní strukturální jednotka protilátky obsahuje tetramér podjednotek. Každý tetramér se skládá ze dvou shodných párů polypeptidových řetězců, přičemž každý pár má jeden lehký (molekulová hmotnost je přibližně 25 000) a jeden těžký řetězec (molekulová hmotnost je přibližně 50 000 až 70 000). Aminotermínální část každého řetězce zahrnuje variabilní oblast, která obsahuje přibližně 100 až 110 nebo více aminokyselin, jenž jsou primárně odpovědné za rozeznání antigenu. Karboxy-terminální část každého řetězce definuje konstantní oblast, která je primárně odpovědná za funkci efektoru.
Lehké řetězce se klasifikují buď jako kappa nebo lambda. Těžké řetězce se klasifikují jako gamma, alfa, delta nebo epsilon a definují protilátkový izotop, jako je IgG, IgM, IgA, IgD a IgE. V lehkém a těžkém řetězci je variabilní a konstantní oblast spojena oblastí „J, která obsahuje 12 nebo více aminokyselin. V těžkém řetězci k tomuto účelu také slouží *·
I *
I 4
44« oblast „D, která obsahuje přibližně o 10 aminokyselin více (popisuje se v publikaci Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7).
Variabilní oblasti každého páru lehkého/těžkého řetězce tvoří vazebné místo protilátky. Tak neporušená protilátka má dvě vazebná místa. Mimo případu bifunkčních nebo bispecifických protilátek jsou tyto dvě vazebná místa stejná. Všechny řetězce vykazují stejnou obecnou strukturu relativně konzervativních rámcových hypervariabilními oblastmi, spojených třemi oblastí (FR) které se také nazývají oblasti stanovující komplementaritu nebo CDR. CDR ze dvou řetězců každého páru tvoří oblasti základní struktury (FR) spojené třemi hypervariabilními oblastmi, které se také nazývají oblasti stanovující komplementaritu nebo CDR. CDR ze dvou řetězců každého páru tvoří oblasti základní struktury, což umožňuje jeho navázání na specifický epitop. Z N-konce do Ckonce oba lehký a těžký řetězec obsahuje oblasti FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Přiřazení aminokyselin ke každé oblasti je v souladu s definicemi podle Kabata (popisuje se v publikací Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991) nebo Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), Chothia et al., Nátuře 342: 878-883 (1989)).
ii. Produkce protilátek, které nejsou lidské
Produkce monoklonálních protilátek, které nejsou lidské, například myší, protilátky morčat, králičí nebo krysí, se může uskutečnit například imunizací zvířete s Αβ. Také se mohou použít delší peptidy obsahující Αβ nebo imunogenní fragment Αβ nebo anti-idiotypické protilátky proti protilátce proti Αβ (popisuje se v publikaci Harlow and Lané, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988). Takový imunogen se může získat z přirozeného zdroje, syntézou peptidů nebo rekombinanntí expresí. Imunogen se může aplikovat jako • · ·· • ·· ♦ · · · • · · • ··· 4 • ♦ ··· ·· ·· • » *
• ····
4· fúzovaný s nosičovým proteinem nebo s ním tvoří komplex, jak se popisuje dále v textu. Imunogen se dále může aplikovat spolu s adjuvans. Může se použít několik typů adjuvans, jak se popisuje dále v textu. V případě imunizace laboratorních zvířat se preferuje úplné Freundovo adjuvans a pak následuje neúplné adjuvans. Pro přípravu polyklonálních protilátek se v typickém případě použijí králíci nebo morčata. Při přípravě monoklonálních protilátek se v typickém případě používají myši. U protilátek se testuje specifické navázání na Αβ. U protilátek se dále testuje schopnost navázání na specifickou oblast Αβ. Pozdější testování se může provést stanovením navázání protilátky na sbírku delečních mutantů peptidu Αβ a stanovení, které Αβ z delečních mutantů se váže na protilátku. Navázání se může provést například Westernovým blotem nebo testem ELISA. Nejmenší fragmenty, které vykazují specifické navázání na protilátku, definují epitop protilátky. V jiném případě specifita epitopu se může stanovit kompetetivním testem, kde testované a referenční protilátky soutěží o navázání na Αβ. Jestliže testované a referenční protilátky soutěží, pak se váží na stejný epitop nebo epitopy dostatečně blízké, přičemž navázání jedné protilátky interferuje s navázáním druhé protilátky. Výhodným izotopem takových protilátek je myší izotyp IgG2 nebo ekvivalentní izotyp v jiném druhu. Myší izotyp IgG2 je ekvivalent lidského izotypu IgGl.
iii. Chimérové a humanizované protilátky
Chimérové a humanizované protilátky mají stejnou nebo podobnou vazebnou specifitu a afinitu jako myší nebo jiná nelidská protilátka, která poskytuje počáteční materiál pro konstrukci chimérové nebo humanizované protilátky. Chimérové protilátky jsou protilátky, jejichž geny lehkého a těžkého řetězce se mají zkonstruovat v typickém případě genovou manipulací ze segmentů genu imunoglobulinu, které patří k různým druhům. Například variabilní segmenty (V) genů z myší spojit s lidskými monoklonální protilátky se mohou konstantními segmenty (C) , jako je IgGl a IgG4. Preferuje se lidský izotyp IgGl. Typická chimérová protilátková je tak hybridní protein, který obsahuje oblast V nebo oblast vázající se na antigen z myší protilátky a oblast C nebo efektorovou oblast z lidské protilátky.
Humanizované protilátky mají zbytky základní struktury variabilní oblasti, které v podstatě pochází z lidské (nazývá se akceptorová protilátka) a oblasti komplementaritu pocházející v podstatě z myší (nazývá se donorový imunoglobulin) (popisuje se protilátky stanovuj ící protilátky v publikaci Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989) a v dokumentu WO 90/07861, US 5 693 762, US 5 693 761, US 5 585 089, US 5 530 101 a US 5 225 539 (Winter). Konstantní oblast(i), jestli jsou přítomné, pocházejí také v podstatě nebo zcela z lidského imunoglobulínu. Lidské variabilní oblasti se obvykle vybraly z lidských protilátek, jejichž sekvence základní struktury vykazují vysoký stupeň sekvenční shody s oblastmi myších variabilních oblastí, ze kterých se získaly CDR. Zbytky základní struktury variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce se mohou získat ze stejných nebo různých sekvencí lidské protilátky. Sekvence lidské protilátky mohou být sekvence přirozeně se vyskytujících lidských protilátek nebo mohou být konvenční sekvence několika lidských protilátek (popisuje se v dokumentu Carter et al., WO 92/22 653) . Jisté aminokyseliny ze zbytků základní struktury lidské variabilní oblasti se vybralo pro substituci založené na jejím možném vlivu na konformaci CDR a/nebo na navázání na antigen. Zkoumání takového možných vlivů se provádí modelováním, testováním charakteristik aminokyselin v určitých polohách nebo empirickým pozorováním účinků substituce nebo mutageneze určitých aminokyselin.
Například když se zbytek základní struktury variabilní oblasti liší od zbytku základní struktury vybrané lidské variabilní oblasti, pak by se měla aminokyselina základní struktury obvykle substituovat ekvivalentní aminokyselinou základní struktury z myší protilátky, když se očekává, že
aminokyselina:
(1) se nekovalentně váže přímo na antigen,
(2) sousedí oblastí CDR,
(3) interaguje jiným způsobem s oblastí CDR (například je
přibližně v 6 N oblasti CDR) nebo
(4) leží v meziprostoru v VL-VH
Jinými kandidáty substituce jsou akceptory lidských aminokyselin základní struktury, které jsou v případě lidského imunoglobulinu v této poloze neobvyklé. Tyto aminokyseliny se mohou substituovat aminokyselinami z ekvivalentí polohy myší donorové protilátky nebo z ekvivalentních poloh více typických lidských imunoglobulinu. Jiní kandidáti substituce jsou akceptorové lidské aminokyseliny základní struktury, které jsou v případě lidského imunoglonulinu v této poloze neobvyklé. Základní struktury variabilní oblasti humanizovaných imunoglobulinu obvykle vykazují alespoň 85 % sekvenční shody se sekvencí základní struktury lidské variabilní oblasti nebo s konvenční sekvencí.
iv. Lidské protilátky
Lidské protilátky proti Αβ se připravují různými způsoby, které se popisují dále v textu. Takové lidské protilátky se vybraly pomocí kompetetivních vazebných experimentů nebo když mají stejnou specifitu k epitopu, jako určitá myší protilátka, tak jako jeden z myších monokionálů popsaných v příkladu XI. Lidské protilátky se mohou také testovat za účelem zjištění určité epitopové specifity použitím pouze fragmentu Αβ, jako imunogenu a/nebo testováním protilátek proti souboru delečních • « • · mutantů Αβ. Lidské protilátky máji s výhodou izotypovou specifitu lidského IgGl.
(1) Způsob triomů
Základní přístup a příklad buněčného fúzního partnera SPAZ-4 vhodného pro použití v tomto přístupu se popisuje v publikaci Oestberg et al., Hybridoma 2: 361-367 (1983), (Oestberg) US 4 634 664 a (Engleman et al.,) US 4 634 666.
Buněčné linie produkující protilátky získané touto metodou se nazývají triomy, protože potomky tří buněk: dvou lidských buněk a jedné myší. Na začátku se myšší linie myelomu fúzuje s lidským B-lymfocytem, aby se získal xenogenní hybridní buňka, která neprodukuje protilátku, jako je buněčná linie SPAZ-4 popsaná v publikaci Oestberg et al., Hybridoma 2: 361367 (1983). Xenogenní buňka se pak fúzuje s imunizovaným lidským B-lymfocytem, aby se získala buněčná linie produkující triomy. Zjistilo se, že triomy produkují protilátky, které jsou stabilnější ve srovnání s obyčejnými hybridomy připravenými z lidských buněk.
Imunizované B-lymfocyty se získaly z krve, sleziny, lymfatických žláz nebo z kostní dřeně lidského donora. Jestliže jsou nutné protilátky proti specifickému antigenů nebo epitopů, preferuje se použít tento jejich epitop nebo antigen při imunizaci. Imunizace se může provést buď in vivo nebo in vitro. V případě imunizace in vivo se B-buňky v typickém případě izolovaly z člověka imunizovaného Αβ, jeho fragmentem, větším polypeptidem, který obsahuje Αβ nebo fragment nebo anti-idiotypickou protilátku vůči protilátce vůči Αβ. V některých metodách se buňky B izolovaly ze stejného pacienta, kterému se aplikovala protilátkové terapie. V případě imunizace in vitro, se B-lymfocyty v typickém případě vystavily účinku antigenů po dobu 7 až 14 dní v kultivačním médiu, jako je RPMI-1640 (Engleman et al.,) doplněném 10 % lidskou plazmou. Imunizované B-lymfocyty se • φ • ·· · *« φφφ φ φφφ · φφφ φ φ φ ··· · · φ φ · φ φ φφφ φφ φφφ φφφφ ·Φ φ fúzovaly s xenogenní hybridní buňkou, jako je SPAZ-4. Buňky se například ošetřují 40 až 50 % polyethylenglykolem s MW 1 000 až 4 000 při teplotě přibližně 37 °C po dobu 5 až 10 minut. Buňky se separovaly z fúzní směsi a pomnožily se v kultivačním médiu, které je selektivní pro požadované hybridy (například HAT nebo AH). Klony vylučující protilátky vykazující požadovanou vazebnou specífítu se identifikovaly testováním schopnosti kultivačního média triomů vázat se na Αβ nebo jeho fragment. Lidské protilátky produkující triomy vykazující požadovanou specifitu se subklonovaly způsobem limitovaného ředění a růstem in vitro v kultivačním médiu. U získaných buněčných linií triomů se pak testovala schopnost vázat se na Αβ nebo jeho fragment.
Ačkoli triomy jsou geneticky stabilní neprodukují velké množství protilátek. Síla exprese se může zvýšit klonováním genů protilátek z triomů do jednoho nebo více expresívních vektorů a transformací vektoru do standardní savčí, bakteriální nebo kvasinkové buněčné linie.
(2) Transgenní savci, kteří nezahrnují člověka
Lidské protilátky proti Αβ mohou být také produkovány z transgenních savců, kteří obsahují transgeny kódující alespoň segment lidského imunoglobulinového lokusu. Obvykle endogenní imunoglobulinový lokus takových transgenních savců je funkčně deaktivován. Upřednostňuje se, aby segment lidského imunoglobulinového lokusu zahrnoval neuspořádané sekvence komponentů těžkého a lehkého řetězce. Deaktivace endogenních imunoglobulinových genů a zavedení exogenních imunoglobulinových genů se může dosáhnout cílenou homologní rekombinací nebo zavedením chromozomů YAC. Transgenní zvířata, které vznikají v tomto postupu, jsou schopny funkčně přestavět sekvence imunoglobulinového komponentu a exprimovat repertoár protilátek různých izotypů kódovaných lidskými imunoglobulinovými geny, aniž exprimují endogenní • ·· · • · · · · imunoglobulinové geny. Produkce a vlastnosti savců, kteří vykazují tyto vlastnosti se popisují detailněji například v dokumentu Lonberg et al., WO 93/12 227 (1993), US 5 877 397, US 5 874 299, US 5 814 318, US 5 789 650, US 5 770 429, US 5 661 016, US 5 633 425, US 5 625 126, US 5 569 825, US 5 545 806 a v publikaci Nátuře 148, 1547-1553 (1994), Nátuře Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10 741 (1991). Zvláště vhodné jsou transgenní myši. Protilátky proti Αβ se získaly imunizací transgenního savce tak, jak se popisuje v dokumentu Lonberg nebo Kucherlapati uvedených shora v textu s Αβ nebo s jeho fragmentem. Monoklonální protilátky se připravily například fúzí B-buněk z takových savců s vhodnou buněčnou linií myelomu za použití běžné technologie podle Kohlera-Milsteina. Lidské polyklonální protilátky se mohou také připravit ve formě séra z lidí imunizovaných imunogenním činidlem. Takové polyklonální protilátky se mohou koncentrovat afinitním čištěním použitím Αβ nebo jiného amyloidního peptidu, jako afinitního činidla.
(3) Metody vyjadřující fága
Dalším přístupem, jak získat lidské protilátky proti Αβ je testování knihovny DNA z lidských B buněk podle obecného protokolu, který se popisuje v publikaci Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989). Jak se popisuje v případě metodologie triomů takové B buňky je možné získat z lidí imunizovaných Αβ, fragmenty, delšími polypeptidy, které obsahují Αβ nebo fragmenty nebo anti-idiotypickými protilátkami. Takové B buňky se získaly z pacientů, kterým se aplikovala protilátková léčba. Vybraly se protilátky vázající se na Αβ nebo jejich fragmenty. Sekvence kódující takové protilátky (nebo vazebné fragmenty) se pak klonují a amplifikují. Protokol popsaný v publikaci Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989) je účinnější v kombinaci s technologií vyjadřující fága (popisuje • · · * se v dokumentu Dower et al., WO 91/17 271 a McCafferty et al., WO 92/01 047, US 5 877 218, US 5 871 907, US 5 858 657, US5 837 242, US 5 733 743 a US 5 565 332. V těchto metodách se produkují fágové knihovny, ve kterých členové na svém povrchu vykazují různé protilátky. Protilátky se obvykle vykazují jako fragmenty Fv nebo Fab. Protilátky vykazující fága s požadovanou specifitou jsou vybrány afinitním obohacením peptidu Αβ nebo jeho fragmentu.
Různé metody vykazující fága produkují lidské protilátky, které mají vazebnou specifitu vybrané myší protilátky (Winter WO 92/20 791). V této metodě se jako počáteční materiál používá variabilní oblast buď těžkého nebo lehkého řetězce vybrané myší protilátky. Jestliže se například jako počáteční materiál vybrala variabilní oblast lehkého řetězce, zkonstruovala se fágová knihovna, ve které členové vykazují stejnou variabilní oblast lehkého řetězce (to je myší počáteční materiál) a odlišnou variabilní oblast těžkého řetězce. Vybrané variabilní oblasti těžkého řetězce se získaly z knihovny znovu uspořádaných variabilních oblastí lidského těžkého řetězce. Fág vykazuje silné specifické navázání pro Αβ (například alespoň 108 a přednostně alespoň 109 M_1) . Variabilní oblast těžkého řetězce z tohoto fága pak slouží jako počáteční materiál při konstrukci další fágové knihovny. V této knihovně každý fág vykazuje stejnou variabilní oblast těžkého řetězce (to je oblast identifikovanou z první vyjadřující knihovny) a odlišnou variabilní oblast lehkého řetězce. Variabilní oblasti lehkého řetězce se získaly z knihovny znovu uspořádaných variabilních oblastí lidského lehkého řetězce. Opět se vybral fág vykazující silné specifické navázání na Αβ. Tyto fágové vykazují variabilní oblasti zcela lidských protilátek proti Αβ. Tyto protilátky mají obvykle stejnou nebo podobnou specifitu k epitopů jako myší počáteční materiál.
v.
Výběr konstantní oblasti • * zda se požaduje a/nebo toxicita komplement závislý zprostředkovaná buňkou.
Variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce chimérových, humanizovaných nebo lidských protilátek se mohou vázat na alespoň část lidské konstantní oblasti. Volba konstantní oblasti závisí zčásti na skutečnosti, na protilátce
Například izotypy IgGl a IgG3 mají aktivitu komplementu a izotypy IgG2 a IgG4 tuto aktivitu nevykazují. Volba izotypu může také způsobit vstup protilátky do mozku. Preferuje se lidský izotyp IgGl. Konstantní oblasti lehkého řetězce mohou být lambda nebo kappa. Protilátky se mohou exprimovat jako tetraméry, které obsahují dva lehké a dva těžké řetězce, jako separované těžké řetězce, lehké řetězce, jako fragment Fab, Fab'F(ab')2 a Fv nebo jako jednořetězcové protilátky, ve kterých variabilní oblasti lehkého řetězce jsou spojeny mezerníkem.
vi. Exprese rekombinantních protilátek
Chimérové, humanizované a lidské protilátky v typickém případě vznikají rekombinanntí expresí. Rekombinantní polynukleotidové konstrukce v typickém případě zahrnují expresi kontrolní sekvence operativně spojené s kódujícími sekvencemi protilátkových řetězců, které zahrnují přirozeně asociované nebo heterologní promotorové oblasti. Výhodné je, když expresívní kontrolní sekvence jsou eukaryontní promotorové systémy ve vektorech schopných transformovat nebo transfekovat eukaryontní hostitelské buňky. Když se vektor začlení do vhodného hostitele, hostitel se udržuje za podmínek vhodných pro silnou expresi nukleotidových sekvencí a pak dochází ke sběru a čištění zkříženě reagujících protilátek. Tyto expresívní vektory jsou v typickém případě replikovatelné v hostitelských organizmech buď jako epizomy nebo jako integrální část hostitelské chromozomální DNA. Běžné expresívní vektory obsahují selekční markéry, jako například rezistence na ampicilin nebo na hydromycin, aby se umožnila kvasinky. s vhodnými počátek replikace, nutnosti. Typické kinázu a promotory vektory, které detekce těchto buněk transformovaných požadovanými sekvencemi
DNA.
Bakterie E. coli je jeden prokaryontní hostitel, který je zvláště použitelný při klonováni sekvencí DNA podle vynálezu. Za účelem exprese je možné použít mikroorganizmy jako jsou Saccharomyces je preferovaný kvasinkový hostitel mají sekvence řídící expresi, terminační sekvence a podobně, podle promotory zahrnují 3-fosfoglycerátovou jiné glykolytické enzymy. Indukovatelné kvasinkové zahrnují mezi jinými promotory pocházející z dehydrogenázy alkoholu, izocytochrom C a enzymy odpovědné za využití maltózy a galaktózy.
Savčí buňky jsou preferovaným hostitelem vhodným pro expresi nukleotidových segmentů, které kódují imunoglobuliny nebo jejich fragmenty (popisuje se v publikaci Winnacker, Genes and Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)) . V oboru se vyvinula řada buněčných linií vhodného hostitele, které jsou schopné vylučovat neporušené heterologní proteiny. Tyto linie zahrnují CHO, různé buněčné linie COS, buňky HeLa, buňky L a buněčné linie myelomu. Upřednostňují se buňky, které nejsou lidské. Expresívní vektory pro tyto buňky mohou zahrnovat expresívní kontrolní sekvence, jako počátek replikace, promotor, zesilovač (popisuje se v publikaci Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49 (1986)) a nezbytná informační místa pro zpracování, jako jsou místa pro navázání ribozómu, místa sestřihu RNA, polyadenylační místa a terminační sekvence transkripce. preferované sekvence řídící expresi jsou promotory získané z endogenních genů, cytomegaloviru, SV40, adenoviru, bovinního papilomaviru a podobně (popisuje se v publikaci Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992)).
V jiném případě sekvence kódující protilátky se mohou začlenit do transgenů, aby se mohly zavést do genomu transgenního zvířete a následně exprimovat v mléku • · · · transgenního zvířete (popisuje se například v publikaci US 5 741 957, US 5 304 489, US 5 849 992) . Vhodné transgeny zahrnují kódující sekvence lehkého a/nebo těžkého řetězce v operativním spojení s promotorem a zesilovačem z genu, který je specifický pro prsní žlázu, jako je kasein nebo beta laktoglobulin.
Vektory obsahující segmenty DNA mohou být přeneseny do hostitelské buňky dobře známými metodami, které závisí na typu buněčného hostitele. V případě prokaryontních buněk se běžně využívá chlorid vápenatý, zatímco v případě jiných buněčných hostitelů se využije aplikace fosforečnanu vápenatého, elektroporace, lipofekce, biolistika nebo transfekce založená na virech. Jiné metody používané pro transformaci savčích buněk zahrnují použití polybrenu, protoplastové fúze, lipozomů, elektroporace a mikroinjekce (v obecném případě se popisuje v publikaci Sambrook et al.,). Za účelem produkce transgenních zvířat, se mohou transgeny zavést injekcí do oplodněných oocytů nebo se embryonálních kmenových buněk přenesou do oocytů bez jader.
Když se protilátka exprimuje, může se čistit podle standardního postupu, který zahrnuje čištění HPLC, kolonovou chromatografii, gelovou elektroforézou a podobně (v obecném případě se popisuje v publikaci Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).
mohou začlenit do genomu a jádra takových buněk se
3. Nosičové proteiny
Některá činidla vyvolávající imunitní odezvu zahrnují vhodný epitop pro vyvolání imunitní odezvy proti amyloidním depozitům, ale jsou příliš malé, aby byly imunogenní. V této situaci se peptidový nosič může vázat na vhodný nosič, přičemž vyvolá imunitní odezvu. Vhodné nosiče zahrnují sérové albuminy, hemocyanin přílipkovitývh plžů, molekuly imunoglobulinu, tyroglobulin, ovalbumin, toxoid tetanu nebo toxoid z jiné patogenní bakterie, jako je difterie, E. coli, cholera nebo H .pylori nebo utlumený derivát toxínu. Jiné nosiče zahrnují epitopy T buňky, které se váží na velké množství alel MHC, například alespoň 75 % všech lidských alel MHC. Takové nosiče jsou někdy známy v oboru, jako univerzální epitopy T-buňky. Příklady univerzálních epitopů T-buňky zahrnuj í:
hemaglutinin influenzae: HA307-319 (SEQ ID NO: 43) PKYVKQNTBKLAT
PADRE (běžné zbytky jsou tučným písmem) (SEQ ID NO: 44)AKXVAAWTLKAAA malárie CS: epitop T3 (SEQ ID NO: 45) EKKIAKMEKASSVFNV povrchový antigen hepatitidy B: HBsAgi9-28 (SEQ ID NO: 4 6) FFLLTRILTI protein teplotního šoku 65: hsp65i53-i7i (SEQ ID NO: 47) DQSIGDLIAEAMDKVGNEG mikroorganizmus Calmette-Guerin (SEQ ID NO: 48) QVHFQPLPPAVVKL toxoid tetanu: TT83o-844 (SEQ ID NO: 49) qyikANSKFIGITEL toxoid tetanu: TT947_967 (SEQ ID NO: 50) fnnetVSFWLRVPKVSASHLE
HIV gpl20 TI: (SEQ ID NO: 51) KQIINMWQEVGKAMYA.
Jiné nosiče vhodné pro stimulaci nebo zesílení imunitní odezvy zahrnují cytokiny, jako je IL-1, peptidy IL-1 α a β, IL2, ylNF, IL-10, GM-CSF a chemokiny, jako je MlPlot a β a RANTES. Imunogenní činidla mohou být také spojeny s peptidy, které zvyšují transport skrz tkáň, jak se popisuje v dokumentu 0'Mahony, WO 97/17 613 a WO 97/17 614.
Imunogenní činidla se mohou vázat na nosiče chemickou vazbou. Metody navázání imunogenu na nosič zahrnují tvorbu disulfidových vazeb použitím N-sukcinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionátu (SPDP) a sukcinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-l-karboxylová kyselina (SMCC) (jestliže peptidu chybí sulfylhydrylová skupina, může se toto provést adicí cysteinového zbytku). Tato činidla umožňují vznik disulfidové vazby mezi činidlem a peptidovými cysteinovými zbytky na jednom proteinu a amidové vazby prostřednictvím ε-aminoskupiny na lyzinu nebo jiné volné aminoskupiny v jiných aminokyselinách. Různá činidla tvořící disulfid/amid se popisují v publikaci Immun. Rev. 62, 185 (1982). Jiná • * bifunkční spojovací činidla tvoří thioether spíše než disulfidovou vazbu. Řada těchto činidel tvořících thioether jsou běžně dostupné a zahrnují reaktivní estery kyseliny 6-maleimidokapronové kyseliny, 2-bromooctové kyseliny a 2-jodooctové kyseliny, 4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-l-karboxylové kyseliny. Karboxylové skupiny mohou být aktivovány jejích kombinováním se sukcinimidem nebo sodnou solí l-hydroxyl-2-ni~ tro-4-sulfonové kyseliny.
Imunogenní peptidy se mohou také exprimovat jako fúzní proteiny s nosiči (to je heterologní peptidy). Imunogenní peptid může být spojen s nosičem svým N-koncem, svým karboxylovým koncem nebo oběma konci. Ve fúzním proteinu může být přítomno velké množství repetic imunogenního peptidu. Imunogenní peptid může být spojen s velkým množstvím kopií heterologního peptidu například na obou koncích. Některé nosičové peptidy slouží k vyvolání odezvy pomocných T-buněk proti nosičovému peptidu. Indukované pomocné buňky T naopak vyvolávají odezvu B-buňky proti imunogennímu peptidu spojenému s nosičovým peptidem.
Některá činidla podle vynálezu obsahují fúzní protein, ve kterém N-terminální fragment Αβ je spojen svým C-koncem s nosičovým peptidem. U takových činidel N-terminální zbytek fragmentu Αβ stanovuje N-terminální zbytek fúzního proteinu. Takové fúzní proteiny jsou účinné při vyvolání protilátek, které se váží na epitop, který vyžaduje, aby N-terminální zbytek Αβ byl ve volné formě. Některá činidla podle vynálezu obsahují velké množství repetic N-terminálního segmentu Αβ spojeného svým C-koncem s jednou nebo více kopií nosičového peptidu. N-terminální fragment Αβ začleněný do takových fúzních proteinů někdy začíná Αβ1-3 a končí Αβ7-11. Αβ1-7, Αβ1-3, 1-4, 1-5 a 3-7 jsou preferované N-terminální fragmenty Αβ. Některé fúzní proteiny obsahují různé N-terminální segmenty Αβ fc fc fcfcfc « fcfc· fc · fcfc · · fc fcfc · • · fcfc fcfc • fcfc fcfc fcfcfc fcfcfcfc ·· fc v tandemu. Fúzní protein může například obsahovat Αβ1-7, pak následuje Αβ1-3 a pak následuje heterologní peptid.
V některých fúzních proteinech N-terminální segment Αβ se fúzuje svým N-koncem s heterologním nosičovým peptidem. Stejné druhy N-terminálních segmentů Αβ se mohou využít jako Cterminální fúze. Stejné fúzní proteiny obsahují heterologní peptid spojený s N-koncem N-terminálního segmentu Αβ, který se naopak váže na jeden nebo více dalších N-terminálních segmentů Αβ v tandemu.
Některé příklady fúzních proteinů vhodných pro použití podle vynálezu jsou zobrazeny dále v textu. Některé tyto fúzní proteiny obsahují segmenty Αβ spojené s epitopy toxoidu tetanu, které se popisují v dokumentu US 5 196 512, EP 378 881 a EP 427 347. Některé fúzní proteiny obsahují segmenty Αβ spojené s nosičovými peptidy popsanými v dokumentu US 5 736 142. Některé heterologní peptidy jsou univerzální epitopy T buněk.
V některých metodách činidlo pro aplikaci je jednoduše jediný fúzní protein se segmentem Αβ spojeným s heterologním segmentem v lineární konfiguraci. U některých metod je činidlo multimér fúzních proteinů reprezentovaný obecným vzorcem 2X, ve kterém symbol x je celé číslo od 1 do 5. Symbol x je s výhodou 1, 2 nebo 3, přičemž nejvýhodnější je, když symbol x je 2.
V případě, že symbol x je 2, pak takový multimér má čtyři fúzní proteiny spojené s výhodnou konfigurací, která se nazývá MAP4 (popisuje se v dokumentu US 5 229 490) . Epitopy Αβ jsou podtrženy.
Konfigurace MAP4 je zobrazena dále v textu, kde se produkují rozvětvené struktury syntézou počátečního peptidů na N-konci a aminy postranních řetězců lyzinu. V závislosti na počtu násobků lyzinů je začleněno do sekvence a na možnosti rozvětvení, výsledná struktura bude prezentovat více N-konců.
V tomto příkladu se na rozvětveném lyzinu, který obsahuje «· ·
jádro, vytvořily čtyři shodné N-konce. Taková mnohočetnost velmi zvyšuje odpovědi příbuzných B buněk.
AN90540 (Αβ 1-7/toxoid tetanu 830-844 v konfiguraci MAP4) (SEQ ID NO: 52):
DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL
AN90550 (Ap 1-7/toxoid tetanu 947-967 v konfiguraci MAP4) (SEQ ID NO: 53):
daefrhdfnnftvsfwlrvpkvsashle
AN90542 (Αβ 1-7/toxoid tetanu 830-844 + 947-967 v lineární konfiguraci) (SEQ ID NO: 54):
daefrhdqyikanskfigitelfnnftvsfwlrvpkvsashle
AN90576: (Αβ 3-9/toxoid tetanu 830-844 v konfiguraci MAP4) (SEQ ID NO: 55):
EFRHDSGQYIKANSKEIGITEL
Peptid se popisuje v dokumentu US 5 736 142 (všechny lineární konfigurace):
AN90562 (Αβ 1-7/peptid) (SEQ ID NO: 56) : 'AKXVAAWTLKAAADAteRHD
AN90543 (Αβ 1-7/) (SEQ ID NO: 57) : DAEFRHDDAEFRHDDAEFRHDAKXVAAWTLKAAA
Jiné příklady fúzních proteinů (imunogenní epitop Αβ je znázorněn tučným písmem) zahrnují:
(SEQ ID NO: 58): AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD
(SEQ ID NO: 59)
(SEQ ID NO: 60)
(SEQ ID NO: 61)
(SEQ ID NO: 62)
(SEQ ID NO: 63)
(SEQ ID NO: 64)
(SEQ ID NO: 65)
(SEQ ID NO: 66)
(SEQ ID NO: 67)
(SEQ ID NO: 68)
(SEQ ID NO: 69)
(SEQ ID NO: 70)
(SEQ ID NO: 52)
DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA
DAEFRHD-ISQAVHAAHAE1NEAGR
FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR
EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR
PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD
DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT
DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT
DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNVQYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEDAEFRHD
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL na pryskyřici s dvěmi větvemi peptid ___
Lys-Gly-Cys peptid' (SEQ ID NO: 71) (synukleinový fúzní protein v konfiguraci MAP4) :
EQVTNVGGAISQAVHAAHAEINEAGR
Při vytvoření imunogenu, které se používají pro vytvoření protilátek proti Αβ, které jsou vhodné pro využití při pasivní imunizaci, se používají stejné nebo podobné nosičové proteiny a metody spojení. Například Αβ nebo fragment spojený s nosičem se může aplikovat laboratornímu zvířeti při produkci monoklonálních protilátek proti Αβ.
4. Nukleová kyselina kódující terapeutická činidla
Imunitní odezvy proti amyloidním depozitům se mohou také vyvolat aplikací nukleových kyselin, které kódují segmenty peptidů Αβ a jejich fragmentů, jiných peptidových imunogenů nebo protilátek a jejich řetězců komponentů užívaných pro pasivní imunizaci. Takové nukleové kyseliny mohou být DNA nebo RNA. Segment nukleové kyseliny kódující imunogen je v typickém případě spojen s regulačními elementy, jako je promotor a zesilovač, který umožňuje expresi segmentu DNA v požadovaných cílových buňkách pacienta. V případě exprese v krevních buňkách, jestli je to nutné pro vyvolání imunitní odezvy, elementy promotoru a zesilovače z genů lehkého nebo těžkého řetězce imunoglobulinu nebo hlavní intermediální časný promotor a zesilovač CMV jsou vhodné k přímé expresi. V případě aplikace dvouřetězcových protilátek se mohou dva řetězce klonovat do stejných nebo separovaných vektorů.
Je dostupná řada virových vektorových systémů, které zahrnují retrovirové systémy (popisuje se například v publikaci Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)), adenovirové vektory (popisuje se na příklad v publikaci Bett et al., J. Virol. 67, 5911 (1993)), adenoasociované virové vektory (popisuje se například v publikaci 179, 1867 (1994)), virové vektory zahrnují virus vakcinie a viry planých neštovic, virové vektory z rodu alfa virů, jako jsou ty získané ze Sindbiho a Semlikiho viru (popisuje se například v publikaci Dubensky et al. , J. Virol. 70, 508-519 (1996)), venezuelský virus koňské encefalitidy (popisuje se v dokumentu US 5 643 576) a rhabdoviry, jako je virus vesikulární stomatitidy (popisuje se v dokumentu WO 96/34 625) a papilomaviry (popisuje se v publikaci Ohe et al., Human Gene therapy 6, 325-333 (1995), Woo et al., WO 94/12 629 a Xiao and Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)).
DNA kódující imunogen nebo vektor obsahující DNA kódující imunogen mohou být baleny do lipozomů. Vhodné lipidy a
Zhou et al., J. Exp. Med. z rodiny neštovic, které • ·
příbuzné analogy se popisují v dokumentu US 5 208 036, 5 264 618, 5 279 833 a 2 283 185. Vektory a DNA kódující imunogen se mohou také adsorbovat nebo mohou být spojeny s určitými nosiči, které například zahrnují polymethylmethakrylátové polyméry a polylaktidy a póly(laktid-ko-glykolidy) (popisuje se v publikaci McGee te al., J. Micro Encap. (1996)).
Vektory pro genovou terapii nebo samotná DNA se mohou zavést in vivo aplikací jednotlivým pacientům v typickém případě systémovou aplikací (například intravenozně, intraperitoneálně, nasálně, do zažívacího traktu, intradermálně, intramsukulárně, subdermálně nebo intrakraniálně infúzí) nebo povrchovou aplikací (popisuje se například v dokumentu US 5 399 346). Takové vektory mohou dále zahrnovat činidla, jako je bupivacin (popisuje se v dokumentu US 5 593 970) . DNA může být také aplikována za použití genové pušky (popisuje se v publikaci Xiao and Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)) DNA kódující imunogen se sráží na povrchu mikroskopických kovových částic. Mikroprojektily se zrychlují šokovou vlnou nebo expanzí plunného hélia a pronikají tkání do hloubky několika buněčných vrstev (The Accel™ Gene delivery Device, vyrobeno Agacetus, lne. Middleton, WI). V jiném případě samotná DNA prochází kůží do krevního řečiště jednoduše nanesením DNA na kůži s chemickým nebo mechanickým drážděním (popisuje se v dokumentu WO 95/05 853).
V jiném případě vektory kódující imunogeny se mohou zavést do buněk ex vivo, kterými jsou buňky explantované z jednotlivého pacienta (například lymfocyty, aspiráty kostní dřeně, biopsie tkáně) nebo univerzální donorové hematopoietické kmenové buňky, pak následuje reimplantace buněk do pacienta obvykle po výběru buněk, které mají začleněný vektor.
• ·
III. Testování protilátek za účelem zjištění odstraňující aktivity
Vynález popisuje metody testování aktivity protilátky pro odstranění amyloidního depozitu nebo libovolného jiného antigenu nebo asociované biologické entity, v případě které je požadovaná aktivita pro odstranění. Aby se testovala aktivita proti amyloidnímu depozitu, vzorek tkáně z mozku pacienta s Alzheimerovou nemocí nebo zvířecí model, který vykazuje charakteristickou patologii Alzheimerovy nemoci, je v kontaktu s fagocytárními buňkami, které nesou receptor Fc, jako jsou mikrogliální buňky, a stestovanou protilátkou v kultivačním médiu in vitro. Fagocytární buňky mohou být primární kulturou nebo buněčnou linií, jako je BV-2, C8-B4 nebo THP-1. U některých metod se mohou komponenty kombinovat na mikroskopickém sklíčku, přičemž dochází k mikroskopickému monitorování. U některých metod se provede paralelně více reakcí v prohlubních mikrotitrační destičky. V takovém formátu separované miniatruní mikroskopické sklíčko se může přenést do oddělených prohlubní nebo na detekční formát, který se detekuje jinak než mikroskopicky, jako je detekce Αβ testem ELISA. Provedou se série měření množství amyloidního depozitu v reakční směsi in vitro, začíná se ze základní hodnoty, dříve než proběhne reakce a dáel následuje jedna nebo více testovacích hodnot během reakce. Antigen je možné detekovat barvením, například fluorescenčně značenou protilátkou proti Αβ nebo jiného komponentu amyloidních plaků. Protilátka používaná jako počáteční materiál může nebo nemusí být stejná jako protilátka, u které se testuje její odstraňující aktivita. Redukce vztažená k základní hodnotě během reakce amyloidních depozitů indikuje, že testovaná protilátka má odstraňující aktivitu, takové protilátky mohou být pravděpodobně použitelné při prevenci nebo léčbě Alzheimerovy nebo jiné amyloidogenní nemoci.
· · · ·
Analogové metody se mohou použít k testování protilátek za účelem zjištění aktivity při odstranění jiných typů biologických entit. Tento test se může použít při detekci odstraňující aktivity proti libovolnému typu biologické entity. V typickém případě biologická entita má nějakou úlohu v lidském nebo zvířecím onemocnění. Biologická entita se může připravit jako vzorek tkáně nebo izolovaná forma. Jestliže se vyskytuje jako vzorek tkáně, tento vzorek se s výhodou nefixuje a umožňuje rychlý přístup vzorku tkáně a zabraňuje konformaci komponentů náchylných k zafixování. Příklady tkáňových vzorků, které se testovaly v tomto testu zahrnují tkáň zhoubného bujení, pre-karcinogenní tkáň, tkáň obsahující benigní růst, jako jsou bradavice a mateřská znaménka, tkáň infikovanou patogenními organizmy, tkáň infiltrovanou zánětlivými buňkami, tkáň nesoucí patologické matrice mezi buňkami (například fibrinózní perikarditida), tkáň nesoucí aberující antigeny a zjizvenou tkáň. Příklady izolovaných biologických entiti, které se mohou použít zahrnují Αβ, virové antigeny nebo viry, proteoglykany, antigeny jiných patogenních mikroorganizmů, nádorové antigeny a adhezivní molekuly. Takové antigeny se mohou získat z přirozených zdrojů, rekombinantní expresí nebo chemickou syntézou. Vzorek tkáně nebo izolovaná biologická entita přijde do kontaktu s fagocytárními buňkami, které nesou receptory Fc, jako jsou monocyty nebo mikrogliální buňky a protilátku, která se testuje v kultivačním médiu. Protilátka může být proti biologické entitě v testu nebo proti antigenu asociovaným s entitou. Později se u objektu testuje, zda biologická entita je zástupně fagocytována s antigenem. Obvykle, ačkoli to není nutné, protilátka a biologická entita dříve než se přidají fágocytické buňky (někdy spojená s antigenem) jsou vzájemně v kontaktu. Koncentrace biologické entity a/nebo asociovaný antigen, je-li přítomen, zůstává v kultivačním médiu a pak se monitoruje. Snížení množství nebo koncentrace antigenu nebo asociované biologické entity v kultivačním médiu ukazuje, že protilátka vykazující odstraňující odezvu na antigen a/nebo asociovanou biologickou entitu v konjugaci s fagocytárními například v příkladu 14).
buňkami (popisuje se které vykazují Takoví jedinci
IV. Pacienti podrobeni léčbě
Pacienti, kteří se podrobili léčbě zahrnují jednotlivce, jimž hrozí onemocnění, ale nevykazují symptomy, stejně jako pacienti, kteří již vykazují symptomy. V případě Alzheimerovy nemoci se vybral pacient, který je v nebezpečí, že trpí Alzheimerovou nemocí, pokud žije dostatečně dlouho. Proto se tyto metody mohou aplikovat profylakticky na obecnou populaci, aniž je potřeba zhodnotit nebezpečí pacienta. Současné metody jsou zvláště použitelné u jednotlivců, genetické nebezpečí Alzheimerovy nemoci, zahrnují ty, kteří mají příbuzný, kteří trpí tímto onemocněním a ty, jejichž nebezpečí je stanoveno analýzou genetických nebo biochemických markérů. Genetické markéry nebezpečí v případě Alzheimerovy nemoci zahrnují mutace v genu APP, zvláště mutace v poloze 717 a 670 a 671, které jsou známy jako mutace podle Hyrdyho a Swedishe (Hardy, TINS20, 154 (1997)). Jiné markéry nebezpečí jsou mutace v genech presenilinu, PSI a PS2 a ApoE4, historie v rodině týkající se AD, hypercholesterolemie nebo atheroskleróza. Jednotlivci trpící Alzheimerovou nemocí jsou rozeznávány na základě charakteristické demence, stejně jako přítomností nebezpečných faktorů popsaných shora v textu. Navíc pro identifikaci jednotlivců, kteří trpí AD, je dostupná řada diagnostických testů. Tyto testy zahrnují měření množství CSG tau a Αβ42. Zvýšené množství tau a snížené množství Αβ42 znamená onemocnění AD. Jednotlivci trpící Alzheimerovou nemocí se mohou také diagnostikovat použitím kritéria ADRDA, jak se diskutuje v příkladech.
U pacientů, kteří nevykazují symptomy, může léčba začít v libovolném stáří (například v deseti, ve dvaceti a ve třiceti letech). Obvykle však není nutné začít léčbu dříve než pacient dosáhne čtyřiceti, padesáti, šedesáti nebo sedmdesáti let. Léčba v typickém případě vyžaduje více dávek v určitém časovém úseku. Léčba může být monitorována testováním protilátek nebo odezvami T- buněk nebo B-buněk na terapeutické činidlo (například peptid Αβ) . Jestliže odezva klesá indikuje se posilovači dávka. V případě pacientů s Downovým syndromem, léčba může začít v prenatálním stádiu aplikací terapeutického činidla matce nebo krátce po narození.
V. Léčebné režimy
V případě profylaktických aplikací se farmaceutické prostředky nebo léčiva aplikují pacientovi, který je náchylný nebo je v nebezpečí Alzheimerovy nemoci v množství, které je dostatečné, aby eliminovalo nebo snížilo nebezpečí, omezilo vážnost onemocnění nebo oddálilo projevy onemocnění, které zahrnují biochemické, histologické symptomy a/nebo symptomy v chování, komplikace a zprostředkované patologické fenotypy, které se projevují během vývoje onemocnění. V případě terapeutických aplikací se prostředky nebo léčiva aplikují pacientovi, který trpí nebo se očekává, že bude trpět nemocí, v množství, které je dostatečné pro uzdravení nebo alespoň částečnému zastavení symptomů onemocnění (biochemické, histologické symptomy a symptomy chování), které zahrnují komplikace a zprostředkované patologické fenotypy při vývoji onemocnění. U některých metod aplikace činidla redukuje nebo eliminuje myokognitivní poruchy u pacientů, kteří ještě nemají vyvinutou charakteristickou patologii Alzheimerovy nemoci. Množství adekvátní pro provedení terapeutické nebo profylaktické léčby se definuje jako terapeuticky profylakticky účinná dávka. V profylaktickém terapeutickém režimu se činidla obvykle aplikují v několika dávkách až se dostatečně aktivuje imunitní odezva. V typickém nebo nebo • · 9 9
9 9 9 9 případě imunitní odezva se monitoruje a jestliže imunitní odezva slábne aplikuje se opakovaná dávka.
Účinné dávky prostředků podle vynálezu při léčbě shora popsaných stavů kolísají v závislosti na řadě různých faktorů, které zahrnují způsoby aplikace, cílové místo, fyziologický stav pacienta, zda pacient je člověk nebo zvíře, zda se aplikují jiné léky a zda léčba je profylaktická nebo terapeutická. Pacientem je obvykle člověk, ale mohou se také léčit zvířata, která zahrnují transgenní savce. Léčebné dávky je nutné titrovat, aby se optimalizovala bezpečnost a účinnost. Množství imunogenu závisí na skutečnosti, zda se také aplikuje adjuvans. Při nepřítomnosti adjuvans je nutné vyšší dávka. Množství aplikovaného imunogenu někdy kolísá v rozmezí 1 až 500 pg na jednoho pacienta a více obvyklé je rozmezí 5 až 500 ng, což se aplikuje člověku injekcí. Je možné injekcí aplikovat i vyšší dávku, který se pohybuje v rozmezí 1 až 2 mg. V typickém případě se používá dávka 10, 20, 50 nebo
100 pg. Koncentrace imunogenu také závisí na hmotnostním poměru epitopu imunogenu v imunogenu ku hmotnosti imunogenu jako celku. V typickém případě na jeden mikrogram imunogenu se použije 103 až 10~5 mikromolů epitopu imunogenu. Časový režim injekcí může v podstatě kolísat jednou denně, jednou za rok aý jednou za deset let. V daném dni, kdy se aplikuje dávka imunogenu, se pacientovi aplikuje dávka vyšší než 1 pg a obvykle je vyšší než 10 pg, jestliže se také aplikuje adjuvans a může být vyšší než 10 ng a obvykle je vyšší než 100 ng, když se adjuvans neaplikuje. Typický režim zahrnuje imunizaci, po které následují v časových intervalech zesilovací injekce. Intervaly mohou být například 6 týdnů. Jiný režim zahrnuje imunizaci následovanou zesilovacími injekcemi, které se provádí o 1, 2 a 12 měsíců později. Jiný režim zahrnuje aplikaci injekce každé dva měsíce po celý život. V jiném *« * »4 44 4 • · 44 4 4 44 ·« • 4 4 * 4 4 4
4444 4 4444 * • * 4 4 4 4 ··· 44 444 4444 ·* »44 případě se posilující injekce aplikují nepravidelně na základě monitorování imunitní odezvy.
V případě pasivní imunizace protilátkou rozmezí dávky je od přibližně 0,0001 až 100 mg/kg a obvykleji 0,01 až 5 mg/kg tělesné hmotnosti hostitele. Dávky například mohou být 1 mg/kg tělesné hmotnosti nebo 10 mg/kg tělesné hmotnosti nebo v rozmezí 1 až 10 mg/kg. Příklad léčebného režimu zahrnuje aplikaci jednou ze každé dva týdny nebo jednou za měsíc nebo jednou za každé 3 až 6 měsíců. Při některých metodách se dvě nebo více monoklonálních protilátek s různými vazebními specifitami aplikují současně, přičemž v tomto případě dávka každé aplikované protilátky spadá do označeného rozmezí. Protilátka se obvykle aplikuje ve více dávkách. Intervaly mezi jednotlivými dávkami mohou být týden, měsíc nebo rok. Intervaly mohou být také nepravidelné podle měření množství protilátky v krvi pacienta proti Αβ. V některých metodách se dávka nastavila tak, aby se dosáhla koncentrace protilátky v plazmě 1 až 1 000 μρ/ml a u některých metod je to 25 až 300 μg/ml. V jiném případě se protilátka může aplikovat jako formulace s nepřetržitým uvolněním. Dávka a frekvence kolísá v závislosti na poločasu rozpadu protilátky. V obecném případě lidské protilátky vykazují nejdelší poločas rozpadu, pak následují humanizované protilátky, chimérové protilátky a protilátky, které nejsou lidské. Dávka a frekvence aplikace může kolísat v závislosti na skutečnosti, zda léčba je profylaktická nebo terapeutická. Při profylaktické aplikaci se aplikuje relativně nízká dávka v relativně častých intervalech po dlouhý časový úsek. Některým pacientům se aplikuje léčba po zbytek jejich života. Při terapeutické aplikaci je někdy nutná relativně vysoká dávka v relativně krátkých intervalech až do okamžiku, kdy se redukuje nebo ukončí postup onemocnění a s výhodou dokud pacient vykazuje částečné nebo úplné odstranění symptomů onemocnění. Pak může pacient přejít na profylaktícký režim.
• 4
4»··
Dávky nukleových kyselin kódujících imunogeny jsou v rozmezí od 10 ng do lg, 100 ng do 100 mg, 1 pg do 10 mg nebo 30 až 300 pg DNA v případě jednoho pacienta. Dávky vhodné pro infekční virové vektory kolísají od 10 do 100 nebo více virionů v jedné dávce.
Činidla vyvolávající imunitní odezvu se mohou aplikovat parenterálním, topickým, intravenózním, orálním, subkutánním, intraarteriálním , intrakraniálním, intraperitoneálním, intranasálním nebo intramuskulárním způsobem vhodným pro profylakci a/nebo terapii. Nejvíce typickým způsobem aplikace imunogenního činidla je subkutánní aplikace, ačkoli ostatní způsoby mohou být stejně účinné. Dalším běžným způsobem je intramuskulární injekce. Tento typ injekce se v typickém případě zavede do svalů ne paži nebo noze. Při některých metodách se činidla zavedou injekcí přímo so určité tkáně, kde se akumuloval depozit. Příkladem je intrakraniální injekce. Při aplikaci protilátky se preferuje intramuskulární injekce na intravenózní fúzi. Při některých metodách se určité terapeutické protilátky zavádějí injekcí přímo do lebky. Při některých metodách se protilátky aplikují jako nepřerušovaně uvolňovaný prostředek, jako je například Medipad™.
Činidla podle vynálezu se mohou aplikovat v kombinaci s jinými činidly, které jsou alespoň částečně účinné při léčbě amyloidního onemocnění. V případě Alzheimerova a Downova syndromu, kdy se amyloidogenní depozit objevuje v mozku, činidla podle vynálezu se mohou také aplikovat ve spojení s jinými činidly, které zvyšují prostup činidel podle vynálezu přes bariéru krev-mozek.
Imunogenní činidla podle vynálezu, jako jsou peptidy, se někdy aplikují v kombinaci s adjuvans. V kombinaci s peptidem se mohou použít různá adjuvans, jako je Αβ, aby se vyvolala imunitní odezva. Výhodné adjuvans zvyšuje intrinsickou odezvu na imunogen, aniž způsobuje konformační změny v imunogenu, který ovlivňuje kvalitativní formu odezvy. Výhodná adjuvans
• ·· • <·· • 9 9
• · 9 99 9 9 9 • • 9
• · · 9 · • 9
• ··· 3 • 9 9 9 9
• 9 ·· «9 9 9 ·»· 9999 9 a· 9 99
zahrnují hydroxid hlinitý a fosforečnan hlinitý, 3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A (MPL™) (popisuje se v dokumentu
GB 2 220 211 (RIBI ImmunoChem Research lne., Hamilton,
Montana, nyní součást Corixa). Přípravek Stimulon™QS-21 je triterpenglykozid nebo saponin izolovaný z kůry stromu
Quillaja Saponaria Molina, který roste v Jižní Americe (popisuje se v publikaci Powell and Newmann, Plenům Press, NY, 1995, v dokumentu US 5 057 540 (Aquila BioPharmaceuticals,
Framingham, MA) . Jiná adjuvans jsou oleje ve vodních emulzích (jako je skvalen nebo arašídový olej) v kombinaci se stimulanty imunity, jako jsou monofosforyllipid A (popisuje se v publikaci Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Jiné adjuvans je CpG (popisuje se v dokumentu WO 98/40 100). V jiném případě Αβ se může spojit s adjuvans. Takové spojení by však nemělo podstatně změnit konformaci Αβ stejně jako podstatu imunitní odezvy na Αβ. Adjuvans se může aplikovat jako komponent terapeutického prostředku s aktivním činidlem nebo se může aplikovat odděleně, jako konkurence terapeutickému činidlu nebo po jeho aplikaci.
Preferovaná třída adjuvans jsou sole hliníku (alum), jako hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, síran hlinitý. Taková adjuvans se mohou použít a nebo bez jiných specifických imunostimulačních činidel, jako je MPL nebo 3-DMP, QS-21, polymerní nebo monomérní aminokyseliny, jako je polyglutamová kyselina nebo polylyzin. Jiná třída adjuvans je emulze oleje ve vodě. Taková adjuvans se mohou použít s nebo bez specifických imunostimulačních činidel, jako jsou muramylpeptidy (například N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MPD), N-acetylnormuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)-ethylamin (MTP-PE), N-acetylgluksaminyl-A-acetylmuramyl-L-Al-Disoglu-L-Ala-dipalmitoxypropylamid (DTP-DPP)theramidTM) nebo jiné komponenty buněčné stěny bakterií. Emulze olej ve vodě obsahuje 2% skvalen, 0,2 komponentů buněčné stěny zahrnují a) MF59 (popisuje se v dokumentu WO 96/14 837) obsahuje 5 % skvalen, 0,5 % Tween 80 a 0,5% Spán 85 (obsahuje různé množství MTP-PE), které tvoří submikrónové částice za použití mikrofluidizéru, jako je model 110Y (Microfluidics, Newton MA) , b) SAF, který obsahuje 10 % skvalen, 0,4 % Tween
80, 5 % pluronický blokovaný polymér L121 a thr-MDP, buď mikrofluídizovaný do submikrónové emulze nebo se míchal vortexem za vzniku emulze s velkými částicemi a c) adjuvanční systém Ribi™ (RAS) (Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT) , který % Tween 80 a jeden nebo více bakterií ze skupiny zahrnující monofosforyllipid A (MPL), dimykolát trehalosy (TDM) a skleton buněčné stěny (CWS), přičemž se upřednostňuje MPL + CWS (Detox™) . Jiná třída preferovaných adjuvans je saponinové adjuvans, jako je Stimulon™ (QS-21, Aquila, Framingham, MA) nebo z nich vytvořené částice, jako je ISCOM (imunostimulační komplexy) a ISCOMATRIX. Jiná adjuvans zahrnují úplné Freundovo adjuvans (CFA) a neúplné Freundovo adjuvans (IFA). Jiná adjuvans zahrnují cytokiny, jako je interleukin (IL-1, IL-2 a IL-12), faktor stimulující makrofágové kolonie (M-CSF), faktor nekrózy nádoru (TNF).
Adjuvans se může aplikovat s imunogenem jako jediný kompozice nebo se může aplikovat před imunognem, nebo jako konkurence a nebo pop aplikaci imunogenu. Imunogen a adjuvans se mohou dávkovat do stejné zkumavky nebo se mohou dávkovat do oddělených zkumavek a míchat se dohromady před použitím. Imunogen a adjuvans se v typickém případě balí s značkou, která indikuje terapeutickou aplikaci. Jestliže se imunogen a adjuvans balí odděleně, pak jednotlivá balení v typickém případě zahrnují instrukce pro smíchání před použitím. Volba adjuvans a/nebo nosiče záleží na stabilitě imunogenní formulace, která obsahuje adjuvans, způsobu aplikace , dávkového plánu, účinnosti adjuvans pro některé vakcinované druhy a u lidí farmaceuticky přijatelné adjuvans, je adjuvans vhodné pro aplikaci lidem. Úplné Freundovo adjuvnas není vhodné pro aplikaci lidem. Výhodné je Alum, MPL a QS-21. Současně je možné použít dvě nebo více adjuvans. Preferované kombinace zahrnují alum s MPL, alum s QS-21, MPL a QS-21 a alum, QS-21 a MPL. Může se také použít neúplné Freundovo adjuvans (popisuje se v publikaci Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)) v kombinaci s alum, QS-21 a MPL a je možné použít všechny jejich kombinace.
Činidla podle vynálezu se mohou často aplikovat jako farmaceutické prostředky obsahující aktivní terapeutické činidlo a různé jiné farmaceuticky přijatelné komponenty (popisuje se v publikaci Remington'sPharmaceutical science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980) . Preferovaná forma závisí na módu aplikace a terapeutické aplikace. Prostředky mohou také zahrnovat v závislosti na požadované formulaci, farmaceuticky přijatelné netoxické nosiče nebo ředidla, která se definují jako nástroje běžně používaná k formulaci farmaceutických prostředků pro aplikaci zvířeti nebo člověku. Ředidlo se vybralo tak, že neovlivňuje biologickou aktivitu kombinace. Příklady takových ředidel jsou destilovaná voda, fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem, Ringerovy rozotoky, rozotok dextrózy a Hankenův roztok. Navíc farmaceutický prostředek nebo formulace může také zahrnovat jiné nosiče, adjuvans nebo netoxické, neterapeutické, neimunogenní stabilizátory a podobně.
Farmaceutické prostředky mohou také zahrnovat velké pomalu metabolizivané makromolekuly, jako jsou proteiny, jako je chitosan, kyseliny a kopolyméry funkcionalizovaná sefaróza(TM), agaróza, celulóza a podobně), polymérní aminokyseliny, aminokyselinové kopolyméry a lipidové agregáty (jako je kapky oleje nebo lipozomy). Navíc tyto nosiče mohou fungovat jako imunostimulační činidla (to je jako adj uvans) .
poiysacharidy, polyglykolové kyselian mléčná, (jako je latexem
V případě parenterální aplikace se činidla mohou aplikovat jako dávky roztoku nebo suspenze látky ve fyziologicky přijatelném ředidle s farmaceutickým nosičem, kterým může být sterilní kapalina, jako je voda, oleje, fyziologický roztok, glycerol nebo etanol, ve vhodné formě pro zavedení injekcí. Prostředky mohou navíc obsahovat auxiliární látky, jako jsou smáčecí a emulgifikační činidla, povrchová činidla, látky vhodná pro úpravu pH a podobně. Jiné komponenty farmaceutických prostředků je minerální olej, rostlinného nebo syntetického původu. Je to arašídový olej, sojový olej a minerální olej.
zvířecího, například V obecném případě preferovaným kapalným nosičem jsou glykoly, jako je propylenglykol nebo polyethylenglykol, zvláště v případě roztoků vhodných pro zavedení injekcí. Protilátky se mohou ve formě depotní injekce nebo implantovaného který se může vytvořit takovým způsobem, který aplikovat přípravku, umožňuje látky. Příklad nepřerušované uvolnění aktivní prostředku obsahuje monoklonální protilátku v koncentrací 5 mg/ml, vytvořenou ve vodném pufru, který obsahuje 50 mM L-histidin, 150 mM NaCI, přičemž pH se upravilo HCl na hodnotu
6, 0.
V typickém případě se prostředky připravují v injektovatelné formě, buď jako kapalné roztoky nebo suspenze, pevné formy vhodné pro roztok nebo suspenzi, před aplikací injekce se mohou také připravit kapalné nástroje. Přípravky mohou také být ve formě emulze a kapsulí lipozomů nebo jako mikročástice, jako jsou polylaktid, polyglykolid nebo kopolymer pro zesílení adjuvančního účinku, jak se diskutuje shora v textu (popisuje se v publikaci Langer, Science 249, 1527 (1990) a Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997) . Činadla podle vynálezu se mohou aplikovat ve formě depotní injekce nebo implantovaného přípravku, který může být připraven takovým způsobem, aby se ···· 0 0 0 0 0 • · · 0 0
0 ·00··0· 00 0 umožnilo nepřerušované nebo pulzativní uvolnění aktivní složky.
Další prostředky vhodné pro jiné módy aplikace zahrnují orální, intranasální a pulmonární prostředky, čípky a transdermální aplikace.
Čípky, vazebná činidla a nosiči zahrnují například polyalkylenglykoly a triglyceridy. Takové čípky se mohou vytvořit ze směsi obsahující aktivní látku v rozmezí 0,5 % až 10 %, přičemž se upřednostňuje 1 až 2 %. Orální formulace zahrnují plnidla, jako je manitol, laktosu, škrob, stearát hořčíku, sacharin sodíku, celulózu a uhličitan hořečnatý, které svou čistotou je vhodný pro farmaceutické použití. Tyto prostředky jsou ve formě roztoků, suspenzí, tablet, pilulí, kapsulí, nepřerušované se uvolňujících formulací nebo prášků a obsahují 10 až 95 % aktivní složky, upřednostňuje se 25 až 70 o
Ό .
Povrchová aplikace může vést k transdermálnímu nebo intradermálnímu zavedení. Povrchový aplikace se může provést společnou aplikací činidla s toxinem cholery nebo s detoxidikovanými deriváty nebo jejich podjednotkami nebo jinými podobnými bakteriálními toxiny (popisuje se v publikaci Glenn et al., Nátuře 391, 851 (1998)). Společné aplikace se může dosáhnout použitím komponentů, jako je směs molekul nebo vázané molekuly získané chemickým zesítěním nebo expresí fúzního proteinu.
V jiném případě se transdermálního zavedení může dosáhnout prostupem kůží nebo použitím transferozómů (popisuje se v publikaci Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995),
Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)).
VI. Diagnostické metody
Vynález popisuje metody detekce imunitní odezvy proti peptidu Αβ u pacienta trpícího Alzheimerovou nemocí. Metody jsou zvláště použitelné při monitorování průběhu aplikované léčby. Metody se mohou použít při monitorování terapeutické léčby u pacienta se symptomy a u pacienta, u kterého se symptomy neprojevují. Metody je možné použít při monitorování aktivní imunizace (například protilátka produkovaná při odezvě na aplikaci imunogenu) a pasivní imunizace (například měření množství aplikované protilátky).
1. Aktivní imunizace
Některé metody zahrnují stanovení základní hodnoty imunitní odezvy u pacienta před aplikací dávky činidla a porovnání této hodnoty s hodnotou imunitní odezvy po léčbě. Podstatné zvýšení (to je vyšší než je typická hranice experimentální chyby při opakovaném měření stejného vzorku, vyjádřené jako standardní odchylku od průměru takových měření) hodnoty signálů imunitní odezvy výstupu pozitivní léčby (to znamená, že aplikací činidla se dosáhlo imunitní odezvy nebo se tato imunitní odezva zvýšila). Jestliže hodnota imunitní odezvy podstatně nemění, nebo klesá indikoval se negativní výstup léčby. V obecném případě se očekává, že pacienti, kteří se podrobily počátečnímu průběhu léčby imunogenním činidlem, vykazují zvýšenou imunitní odezvu po následujících dávkách, která dosáhne přímky. Aplikace činidla v obecném případě pokračuje, zatímco imunitní odezva roste. Dosažení stálé hodnoty je indikátorem skutečnosti, že aplikovaná léčba může býti přerušena nebo se může redukovat dávka nebo frekvence zavedení.
V případě jiných metod kontrolní hodnota (to je průměrná a standardní odchylka) imunitní odezvy se stanoví v případě kontrolní populace. V typickém případě jednotlivci v kontrolní populaci nebyli dříve léčeni. Měřené hodnoty imunitní odezvy u pacienta po aplikaci terapeutického činidla se pak porovnávají s kontrolní hodnotou. Podstatné zvýšení vztaženo ke kontrolní hodnotě (například vyšší než jedna standardní odchylka od průměru) signálů pozitivního výstupu léčby. Nedostatek podstatného zvýšení nebo snížení signálů znamená negativní výstup léčby. Aplikace činidla v obecném případě pokračuje, zatímco imunitní odezva se zvyšuje ve vztahu ke kontrolní hodnotě. Jako před tím, dosažení stálé hodnoty ve vztahu ke kontrolním hodnotám je indikátorem, že aplikace léčby se může přerušit nebo se může redukovat dávka nebo frekvence aplikace.
V jiných metodách se z kontrolní populace jednotlivců, kteří se podrobili léčbě terapeutickým činidlem a jejichž imunitní odezvy na léčbu dosáhly stejné hodnoty, stanoví kontrolní hodnota imunitní odpovědi (například průměrná a standardní odchylka). Měřené hodnoty imunitní odpovědi u pacienta se porovnaly s kontrolní hodnotou. Jestliže se u pacienta naměřené množství podstatně neliší od kontrolní hodnoty (například více než o jednu standardní odchylku), je možné léčbu přerušit. Jestliže imunitní odezva pacienta je podstatně pod kontrolní hodnotou, zaručuje se pokračování aplikace činidla. Jestliže hodnota imunitní odezvy přetrvává u pacienta pod kontrolní hodnotou, pak se musí indikovat změna v režimu léčby, například použití odlišného adjuvans.
U jiných metod se u pacienta, kterému se neaplikuje léčba, ale dříve se podrobil léčbě, monitoruje imunitní odezva, aby se stanovilo, zda je nutné obnovit léčbu. Měřená hodnota imunitní odezvy u pacienta se může porovnat s hodnotou imunitní odezvy, které se dosáhlo u pacienta po předchozím průběhu léčby. Podstatné snížení vztažené k předchozímu měření (to je vyšší než typické hranice chyby u opakovaného měření stejného vzorku) indikuje, že léčba může být obnovena. V jiném případě hodnota naměřená u pacienta se může porovnat s kontrolní hodnotou (průměrná plus standardní odchylka) stanovenou v populaci pacientů po prodělání léčby. V jiném případě naměřená hodnota u pacienta se může porovnat s kontrolní hodnotou u populací profylakticky ošetřených pacientů, kteří zůstávají bez symptomů onemocnění, u populací terapeuticky ošetřených pacientů, kteří vykazují zmírnění « ·
charakteristik onemocnění. Ve všech těchto případech podstatné snížení vztaženo ke kontrolnímu množství (to je více než standardní odchylka) je indikátor, že léčba by měla být u pacienta obnovena.
V typickém případě vzorky tkáně pro analýzu jsou krev, plazma, sérum, hleny nebo cerebrospinální kapalina pocházející z pacienta. Vzorek se analyzoval za účelem stanovení imunitní odezvy na libovolnou formu peptidů Αβ, v typickém případě Αβ42. Imunitní odezva se může stanovit na základě přítomnosti například protilátek nebo T-buněk, které se specificky váží na peptid Αβ. Metody ELISA detekující reaktivní T-buňky se popisují shora v textu (v sekci definice). V některých metodách se imunitní odezva stanoví použitím testu odstranění depozitu, jak se popisuje v sekci III shora v textu. U takových metod se testovaný vzorek tkáně pocházející z pacienta nechá v kontaktu s amyloidním depozitem (například z myší PDAPP) a s fagocytárními buňkami, které nesou receptory Fc. Pak se monitoruje následné odstranění amyloidního depozitu. Existence a rozsah odstranění poskytuje indikaci existence a množství protilátek účinných při odstranění Αβ ve vzorku tkáně testovaného pacienta.
2. Pasivní imunizace
V obecném případě postupy vhodné pro monitorování pasivní imunizace jsou podobné těm pro monitorování aktivní imunizace popsané shora v textu. Protilátkový profil, který se vytvoří po pasivní imunizaci, v typickém případě ukazuje bezprostřední pík koncentrace protilátek, po němž následuje exponenciální pokles. Aniž se aplikuje další dávka, pokles množství protilátek dosaženého před léčbou v období od několika dní až měsíců závisí na poločasu rozpadu aplikované protilátky. Například poločas rozpadu některých lidských protilátek je kolem 20 dní.
0 0 · 0 0 0 0 • 0«·· 0 · · 0 0 0 • 0 0 0 0 0 0
000 00 000 0·0 0 0 » 000
U některých metod se před aplikací provede u pacienta základní měření množství protilátky proti Αβ a druhé měření se provede po aplikaci, aby se stanovil pík množství protilátek a pak se provedou další měření v určitých intervalech, aby se monitoroval pokles množství protilátek. Když množství protilátky poklesne na základní hodnotu nebo na hodnotu, která je předem stanoveným procentem maximální hodnoty (například 50 %, 25 % nebo 10 %), aplikuje se další dávka protilátky. Při některých metodách se maximální hodnota a pak následné měřené množství porovnává s dříve stanoveným referenčním množstvím, aby se stanovila výhodný režim profylaktické a terapeutické léčby u jiných pacientů. Jestliže měřené množství protilátky je podstatně nižší než referenční hodnota (například nižší než průměr mínus standardní odchylka referenční hodnoty u populace pacientů), pak se indikuje aplikace další dávky.
3. Diagnostické kity
Vynález dále popisuje diagnostické kity pro provedení diagnostických metod popsaných shora v textu. V typickém případě takové kity obsahují činidlo, které se specificky váže na protilátky proti Αβ. Kit také zahrnuje značení. V případě detekce protilátek proti Αβ značení je v typickém případě ve formě značených anti-idiotypických protilátek. V případě detekce protilátek je činidlo předem vázáno na pevné fázi, jako například v prohlubních titračních destiček. Kity v typickém případě také obsahují instrukce pro použití kitu. Příloha může také zahrnovat graf nebo jiný souhlasný režim odpovídající množství měřené značky s množstvím protilátek proti Αβ. Termín „příloha znamená libovolný psaný nebo zaznamenaný materiál, který je přiložen nebo jinak doprovází kit v libovolném čase během výroby, transportu, prodeje a použití. Například termín „příloha znamená reklamní leták a brožurku, příbalové materiály, instrukce, audío nebo video » ** « » • · 9
999 99 999 ···· 9» 9 kazety, počítačové disky, stejně jako texty tištěné přímo na obalu.
Vynález také popisuje diagnostické kity pro provedení zobrazení in vivo. Takové kity v typickém případě obsahují protilátku vázanou na epitopu Αβ, s výhodou obsahují zbytky 1 až 10. Upřednostňuje se, aby protilátka byla značena nebo aby kit obsahoval sekundární značící činidlo. Je výhodné, aby byl kit označen instrukcemi pro provedení zobrazovacího testu in vivo.
VII. Zobrazení in vivo
Vynález popisuje metody zobrazení amyloidních depozitů in vivo u pacienta. Takové metody jsou použitelné při stanovení a potvrzení diagnózy Alzheimerova onemocnění nebo náchylnosti k tomuto onemocnění. Metodu je například možné použít u pacienta, který vykazuje symptomy demence. Jestliže pacient vykazuje abnormální amyloidní depozity, pak je pravděpodobné, že trpí Alzheímerovou nemocí. Přítomnost abnormálních depozitů amyloidu indikuje náchylnost k symptomatickému onemocnění. Metody je možné také použít pro monitorování postupu onemocnění a/nebo odezvy na léčbu pacientů, u kterých se dříve diagnostikovalo Alzheimerovo onemocnění.
Metody fungují na základě aplikace činidla, jako je protilátka, která se váže na Αβ u pacienta, a po navázání činidla dochází k detekci. Preferované protilátky se váží na deposity Αβ u pacienta, aniž se vážou na polypeptid APP plné délky. Zvláště se preferují protilátky vázající se na epitop Αβ s aminokyselinami 1 až 10. U některých metod se protilátka váže na epitop v aminokyselinách 7 až 10 Αβ. Takové protilátky se v typickém případě váží, aniž se vyvolá podstatná odezva odstranění. U jiných metod se protilátka váže na epitop v aminokyselinách 1 až 7 Αβ. Takové protilátky se v typickém případě váží a vyvolávají odezvu odstranění vůči Αβ. Odezvě odstranění se však dá předcházet použitím fragmentů protilátky, kterým chybí konstanntí oblast plné délky, jako je fragment Fab. U některých metod některé protilátky mohou sloužit jako léčebné a diagnostické činidlo. V obecném případě protilátky vázající se na epitopy C-terminálního zbytku 10 Αβ nevykazují silný signál jako protilátky vázající se na epitopy se zbytky 1 až 10, pravděpodobně proto, že C-terminální epitopy jsou v amyloidním depozitu nepřístupné. Takové protilátky jsou méně výhodné.
Diagnostická činidla se mohou aplikovat intravenózní injekcí do těla pacienta nebo přímo do mozku intrakraniální injekcí nebo provrtáním díry lebkou. Dávka činidla by měla být ve stejném rozmezí jako v případě léčebných metod. V typickém případě se činidlo značí, ačkoli u některých metod se primární činidlo s afinitou pro Αβ není značeno a sekundární značící činidlo se používá k navázání na primární činidlo. Volba značky závisí na způsobu detekce. Fluorescenční značka je vhodná pro optickou detekci. Použití paramagnetických značek je vhodné pro tomografickou detekci, aniž je nutné chirurgická intervence. Radioaktivní značky se mohou také detekovat použitím PET nebo SPÉCT.
Diagnóza se provede porovnáním počtu, velikosti a/nebo intenzity značeného loku s odpovídajícími hodnotami základní linie. Hodnoty základní linie mohou reprezentovat průměrné hodnoty v populaci zdravých jednotlivců. Hodnoty základní linie mohou také reprezentovat dřívější hodnoty stanovené u stejného pacienta. Hodnoty základní linie se mohou stanovit u pacienta před začátkem léčby a srovnávají s hodnotami základní vztažených k signálům základní linie je pozitivní odezva na léčbu.
měřené hodnoty se pak linie. Snížení hodnot
Přehled obrázků na výkrese • · • ·»
Na obrázku č. 1 je znázorněný titr protilátek proti injekci transgenní myši s Αβ1-42.
Na obrázku č. 2 je znázorněn amylodní uzel v hippocampusu. Procento oblasti hipokampální oblasti obsazené amyloidními plaky definovanými reaktivitou s monoklonální protilátkou 3D6 specifickou pro Αβ se stanovilo počítačovou kvantitativní zobrazující analýzou imunoreaktivních mozkových sekcí. Hodnoty u jednotlivých myší se rozdělily podle léčebných skupin. Horizontální čára každé skupiny indikuje střední hodnotu rozdělení.
Na obrázku č. 3 je zobrazena neuritická degenerace oblasti hippocampální oblasti neurity definovanými jejich reaktivitou s lidskou monoklonální 8E5 specifickou pro APP, se definovalo kvantitativní počítaimunoreaktivních mozkových sekcí. Hodnoty u jednotlivých myší jsou zobrazeny u skupiny léčené AN1792 a kontrolní skupiny, které se aplikovalo PBS. Horizontální čára každé skupiny označuje střední hodnotu třídění.
v hippocampusu. Procento obsazené degenerovanými
Na obrázku č. 4 jsou zobrazeny astrocyty v retrospleniálním kortexu. Procento plochy kortikální oblasti obsazené gliálním vláknitým kyselým proteinem (GFAP)-pozitivní astrocyty se stanovilo kvantitativní počítačovou zobrazovací analýzou imunoreaktivních mozkových sekcí. Hodnoty u jednotlivých myší jsou rozděleny podle léčené skupiny a střední hodnoty skupin jsou označeny horizontální čarou.
Na obrázku č. 5 jsou zobrazeny geometrické průměry titrů protilátek proti Αβ1-42 po imunizaci v rozsahu osmi dávek AN1792, které obsahují 0, 14, 0,4, 1,2, 3,7, 11, 33, 100 nebo 300 μg.
Obrázek č. 6 znázorňuje kinetiky protilátkové odezvy na imunizaci AN1792. Titry se vyjádřil jako geometrické průměry hodnot pro 6 zvířat v každé skupině.
· • 4 4 •··4 44 4
Obrázek č. 7 znázorňuje kvantitativní analýzu zobrazení kortikálního amyloidního uzlu myší ošetřených PBS a AN1792.
Obrázek č. 8 znázorňuje kvantitativní analýzu zobrazení neuritového plakového uzle u myší ošetřených pBS a AN1792.
Obrázek č. 9 znázorňuje kvantitativní analýzu zobrazení procenta retrospleniálního kortexu obsazeného astrocytózou u myší ošetřených PBS a AN1792.
Obrázek č. 10 znázorňuje proliferační test lymfocytů na slezinné buňky, které se ošetřily AN1792 (horní soubor) nebo ošetřené PBS (spodní soubor).
Obrázek č. 11 znázorňuje celkové množství Αβ v kortexu. Graf rozptylu jednotlivých profilů u myší imunizovaných deriváty Αβ nebo APPP kombinované s Freundovým adjuvans.
Obrázek č. 12 znázorňuje amyloidní uzel v kortexu identifikovaný kvantitativní analýzou obrazu imunoreaktivních mozkových sekcí v případě myší imunizovaných peptidovými konjugáty Αβ1-5, Αβ1-12 a Αβ13-28, agregáty Αβ plné délky AN1792(Αβ1-42) a AN1528(Αβ1-40) a kontrolní skupiny ošetřené PBS.
Obrázek č. 13 znázorňuje geometrické průměry titrů protilátky specifické pro Αβ v případě skupiny myší imunizované deriváty Αβ nebo APP kombinované s Freundovým adjuvans.
Obrázek č. 14 znázorňuje geometrické průměry titrů protilátky specifické pro Αβ v případě skupin morčat imunizovaných AN1792 nebo jeho palmitoylovaným derivátem kombinovaným s adjuvans.
Obrázek č. 15 (A až E) znázorňuje množství Αβ v kortexu dvanáct měsíců starých myší PDAPP ošetřených AN1792 nebo AN1528 různými adjuvans.
Obrázek č. 16 znázorňuje střední hodnotu titrů u myší ošetřených polyklonální protilátkou proti Αβ.
Obrázek č. 17 znázorňuje střední hodnotu titru u myší ošetřených monoklonální protilátkou 10D5 proti Αβ.
• e
Obrázek č. terminální odezvu
AN1792.
Obrázek č. 18 znázorňuje střední hodnotu titru u myší ošetřených monoklonální protilátkou 2F12 proti Αβ.
znázorňuje mapu epitopu: Omezenou NSérum opic cynomolgus odebrané v den 175 se testovalo testem ELISA proti sérii 10-mérních přesahujících peptidů (SEQ ID NO: 1 až 41), které překrývají celou sekvenci AN1792. Zvíře č. F10920M zobrazuje reprezentativní Nterminální omezenou odezvu na peptid DAEFRHDSGY (SEQ ID NO: 9), který překrývá aminokyseliny 1 až 10 peptidu AN1792, který se použil jako imunizační činidlo.
Obrázek č. 20 znázorňuje mapu epitopu: neomezenou Nterminální odezvu. Sérum opic cynomolgus odebrané v den 175 se testovalo testem ELISA proti sérii 10-mérních přesahujících peptidů (SEQ ID NO: 1 až 41), které překrývají celou sekvenci zobrazuje reprezentativní NF10975F
Zvíře č.
terminální neomezenou odezvu. Reaktivita je proti dvěma peptidům N-terminálním a jednomu peptidu C-terminálnímu s peptidem DAEFRHDSGY (SEQ ID NO: 9), který překrývá aminokyseliny 1 až 10 peptidu AN1792.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Profylaktická účinnost Αβ proti AD
Příklady popisují aplikaci peptidu Αβ42 transgenní myši, která nadměrně exprimuje APP s mutací v poloze 717 (APP717V->f) / které vykazují predispozici k vývoji neuropatie podobné Alzheimerově nemoci. Produkce a charakteristiky těchto myší (myši PDAPP) se popisují v publikaci Games et al., Nátuře 373, 523 (1995)). Tato zvířata v jejich heterozygotní formě začínají ukládat Αβ ve věku šesti měsíců. Ve věku patnácti měsíců zvířata vykazují množství depozitu Αβ ekvivalentní depozitu, který je možné pozorovat u Alzheimerovy nemoci. Myším PDAPP se injekcí zavedl agregovaný Αβ42 nebo fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem. Agregovaný Αβ42 se vybral na • · 4 · • 4 4 • · · 4 · 4 ··· ·· ··· 4·44 44 · základě jeho schopnosti vyvolat protilátky proti více epitopům Αβ.
A. Metody
1. Zdroj myší
Třicet heterogenních samic myší PDAPP se náhodně rozdělilo do následujících skupin: deseti myším se injekcí zavedl agregovaný Αβ42 (jedna myš zemřela při tranzitu), pěti myším se injekcí zavedlo PBS/adjuvans nebo PBS a deset myší slouží jako kontroly, kterým se injekce neaplikovala. Pěti myším se zavedla injekce s peptidy, které se získaly ze sekvence sérového amyloidního proteinu (SAP).
2. Příprava imunogenu
Příprava agregovaného Αβ42: dva miligramy Αβ42 (US Peptides lne., kat. č. K-42-12) se rozpustily v 0,9 ml vody a doplnily se na objem 1 ml přidáním 0,1 ml lOx koncentrovaného PBS. Tato směs se míchala na vortexu a nechala se inkubovat přes noc při teplotě 37 °C, což jsou podmínky, při kterých dochází k agregaci peptidu. Nepoužitý Αβ se uchovával jako sušený lyofilizovaný prášek při teplotě -20 °C až do doby aplikace další injekce.
3. Příprava injekcí
V případě každé injekce se 100 μρ agregovaného Αβ42 v PBS na jednu myš emulgovalo v poměru 1:1 s úplným Freundovým adjuvans (CFA) do konečného objemu 400 μΐ emulze pro první imunizaci, po dvou týdnech následuje zesilovací dávka, která obsahuje stejné množství imunogenu v neúplném Freundově adjuvans (IFA). Dvě další dávky se podaly jako IFA v měsíčním intervalu. V měsíčním intervalu se uskutečnily následné imunizace s 500 mikrolitry PBS. Injekce se zavedly intraperitoneálně (i.p.).
• · · · ·
Injekce PBS se aplikovaly podle stejného rozvrhu a myším se injekcí zavedla směs PBS/adjuvans v poměru 1:1 v objemu 400 μΐ pro každou myš nebo 500 μΐ PBS v případě každé myši. Injekce SAP se zavádějí podle stejného plánu za použití dávky 100 μΐ v jedné injekci.
4. Titrace myší krve, příprava tkáně a imunohistochemie
V názvu uvedené metody se popisují v sekci Obecné materiály a metody
B. Výsledky
Myším PDAPP se injekcí zavedl agregovaný Αβ42, peptidy SAP nebo fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem. Skupina myší PDAPP se také nechala bez aplikace injekce jako pozitivní kontroly. Titry myší agregovaného Αβ42 se monitorovaly každý měsíc od čtvrté posilovači injekce až do věku myši jeden rok. Myši se usmrtily ve věku 13 měsíců. Ve všech testovaných časech osm z devíti myší, kterým se aplikoval agregovaný Αβ42, se vyvinul vysoký titr protilátek, který zůstává stejný v průběhu série injekcí (titry vyšší než 1/10 000) . Devátá myš měla nízký, ale měřitelný titr s přibližnou hodnotou 1/1 000 (obrázek č. 1, tabulka č. 1) . Myši, kterým se injekcí zavedl SAPP měly titry pro tento imunogen 1 : 1 000 až 1: 30 000, přičemž pouze jedna myš překročila hodnotu titru 1 : 10 000.
Myši ošetřené PBS se titrovaly proti agregovanému Αβ42 v šestém, desátém a dvanáctém měsíci. Myši ošetřené PBS v ředění 1/100, když se titrovaly proti agregovanému Αβ42, překročily pouze čtyřikrát hodnotu pozadí, jinak vykazovaly ve všech časových bodech hodnoty nižší než je čtyřnásobek hodnoty pozadí (tabulka č. 1) . Odezva specifická na SAP byla zanedbatelná v těchto časových bodech v případě všech titrů nižších než je hodnota 300.
Sedm z devíti myší ze skupiny ošetřené agregovaným Αβ42 nevykazují ve svém mozku detekovatelný amyloid. Naopak mozková tkáň z myší ve skupinách ošetřených SAP a PBS obsahovaly velké množství amyloidních depozitů v hipoccampusu, stejně jako v přední části mozku. Patern uložení byl stejný jako patern, který vykazují neošetřené kontroly, přičemž zahrnuje ohrožené oblasti, jako vnější molekulovou vrstvu hipoccampálního gyrus dentatus. Jedna myš ze skupiny, které se zavedl injekcí Αβ1-42, vykazovala velmi redukovaný amyloidní uzel, který se nachází v hippocampusu. U myší ošetřených Αβ1-42 se identifikovala izolovaná plaka.
Kvantitativní zobrazovací analýza amyloidního uzlu v hippocampu ověřila dramatickou redukci dosaženou u zvířat ošetřených Αβ42(ΑΝΐ792) (Obr. č. 2). Střední hodnoty amyloidního uzlu v případě skupiny ošetřené PBS (2,22 %) a v případě kontrolní skupiny (2,65 %) byly podstatně vyšší než u myší imunizovaných AN1792 (0,00%, p=0,0005). Naopak střední hodnota v případě skupiny imunizované peptidy SAP (SAPP) byla 5, 7 4 %. Mozková tkáň z neošetřených kontrolních myší obsahovala řadu amyloidních depozitů Αβ, které se vizualizovaly monoklonální protilátkou specifickou pro Αβ 3D6 v hippocampusu, stejně jako v retrospleniálním kortexu. Podobný patern amyloidního depozitu je možné také vidět u myší imunizovaných pomocí SAPP nebo PBS (Obr. č. 2) . Navíc pro tyto pozdější tři skupiny jsou charakteristické ohrozitelné podskupiny mozku, které je možné klasicky vidět v AD, jako je vnější molekulová vrstva hippocampálního gyrus dentus, ve všech těchto třech skupinách.
Mozky, které neobsahovaly depozity Αβ také neobsahovaly neuritické plaky, které jsou v typickém případě vizualizovány u myší PDAPP s lidským APP protilátkou 8E5. Všechny mozky ze zbývajících skupin (kterým se injekcí zavedl SAP, PBS a kterým se neaplikovala žádná injekce) vykazovaly řadu neuritických » · demonstrovaly ošetřených AN1792
Mozky z myší v jiných a klastrované astrocyty plaků, které jsou typické pro neošetřené myši PDAPP. Malý počet neuritických plaků vykazuje jedna myš, která byla ošetřena AN1792 a jedno seskupení dystrofických neuritů se zjistilo u druhé myši ošetřené AN1792. Analýzy zobrazení hippocampusu zobrazené na obrázku č.
odstranění dystrofických neuritů u myší (střední hodnota 0,00%) ve srovnání s recipienty ošetřenými PBS (střední hodnota 0,28 %, p=0,0005).
Skupina, které se zavedlo injekcí Αβ1-42, také v mozku nevykazuje plaky spojené se zánětem, které jsou charakteristické pro astrocyty skupinách obsahovaly nadbytečné pozitivní na GFAP, které jsou typické pro Αβ plaky spojené s gliozou. Soubor sklíček, které reagovaly s GFAP se obarvily Thioflavinem S, aby bylo možné lokalizovat depozity Αβ. Astrocyty pozitivní na GFAP jsou spojeny s plaky Αβ u myší ošetřených SAP, PBS a neošetřených kontrol. Žádné takové spojení se nezjistilo u myší ošetřených Αβ1-42, které nevykazují plaky, zatímco u jedné myši ošetřené AN1792 se identifikovala minimální glióza spojená s plaky.
Zobrazovací analýza, uvedená na obrázku č. 4, v případě retrosleniálního kortexu, ověřila, že redukce v počtu astrocytů je podstatná, když střední hodnota je 1,56 %, u myší ošetřených AN1792 ve srovnání se střední hodnotou větší než 6 %, kterou vykazují skupiny imunizované peptidy SAP, PBS nebo neošetřené skupiny (p=0,0017).
Důkaz pocházející z myší ošetřených Αβ1-42 a PBS indikuje, že imunoreaktivita MHC II spojená s plaky není přítomna u myší, kterým se injekcí zavedl Αβ1-42, což je stejné jako nedostatek zánětlivé odezvy vztažené k Αβ.
Sekce myších mozků také reagovaly s monoklonálními protilátkami, které jsou specifické pro monoklonální protilátky specifickými pro MAC-1, což je buněčný povrchový » · protein. existuj e přítomen
Protein MAC-1 (CDllb) člen rodiny integrinu a jako heterodimér s CD18. Komplex CDllb/CDl8 je na monocytech, makrofágách, neutrofilech a přirozených žírných buňkách (Mak a Simad). Rezidentní buněčné typy reaktivní s MAC-1 v mozku jsou pravděpodobně makroglia založená na podobné fenotypické morfologii v sekcích, které imunologicky reagují s proteinem MAC-1. Značení MAC-1, které se spojuje s plaky, bylo nižší v mozku myší ošetřených AN1792 ve srovnání s kontrolní skupinou ošetřenou PBS, přičemž se zjistilo, že souvisí ze skutečností, že nedochází k zánětlivé odezvě vyvolané Αβ.
C. Závěr
Nedostatek plaků Αβ a reaktivní neuronální a gliotické změny v mozku myší, kterým se injkecí zavedlo Αβ1-42, indikuje, že se v jejich mozku uložilo extrémně málo amyloidu nebo depozit neexistuje, také nedochází k výskytu patologických následků, jako je glióza a neuritická patologie. Myši PDAPP ošetřené Αβ1-42 vykazují v podstatě stejný nedostatek patologických jevů jako kontrolní netransgenní myši. Proto injekce Αβ1-42 jsou vysoce účinné při prevenci ukládání nebo odstranění lidského Αβ z mozkových tkání a při eliminaci následných neuronálních a zánětlivých degenerativních změn. Pak aplikace peptidů Αβ se může použít při prevenci a léčbě AD.
Příklad 2: Studie odezvy na dávku
Skupiny obsahující samice myší staré pět týdnů Swiss
Webster (N=6) se imunizovaly 300, 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,4 nebo 0,13 pg Αβ, který se vytvořil intraperitoneální aplikaci CFA/IFA. Tři dávky se aplikovaly v týdenních intervalech a o měsíc později se aplikovala čtvrtá dávka. První dávka se emulzifikovala s CFA a zbývající dávky se emulzifikovaly s IFA. Krev zvířat se odebrala 4. až 7. den po každé • · · * fcfcfc • fcfc · imunizaci, přičemž měření titrů protilátek se začalo po druhé dávce. Zvířatům v souboru tří skupin, která se imunizovala 11, 33 nebo 300 gg antigenů, se dále odebírala krev v měsíčních intervalech po dobu čtyř měsíců po čtvrté imunizaci, přičemž se monitoroval pokles protilátkové odezvy v rozmezí dávek imunogenních formulací. Těmto zvířatům se aplikovala konečná pátá imunizace v sedmém měsíci po začátku studie. O týden později se zvířata usmrtila a měřily se protilátkové odezvy na AN1792 a provedly se toxikoligické analýzy.
Pokles odezvy na dávku se pozoroval od 300 do 3,7 gg, aniž dochází k odezvě na nejnižší dávky. Střední hodnoty titrů protilátek jsou po třetí dávce přibližně 1:1 000 a po 4. dávce, která obsahovala přibližně 11 až 300 gg antigenů, přibližně 1:10 000 (popisuje se na obrázku č. 5).
Titry protilátek dramaticky rostou ve všech případech. Nízká protilátková odezva se detekovala u myší, kterým se aplikovala dávka 0,4 gg antigenů. Skupiny myší, kterým se aplikovalo 1,2 a 3,7 gg antigenů vykazovaly porovnatelné titry s GMT přibližné hodnoty 1 000 a nejvyšší čtyři dávky spojené s GMT přibližně 25 000 s výjimkou skupiny s dávkou 33 gg s nižší hodnotou GMT 3 000. Po čtvrté imunizaci růst titru byl u většiny skupin mírnější. Ve skupinách s nižší dávkou antigenů od 0,14 gg do 11 gg je možné vidět jasnou odezvu na dávku, která se pohybuje v rozsahu žádná detekovatelná protilátka v případě recipientů 0,14 gg až GMT 36 000 v případě recipientů 11 gg. Titry v případě čtyř skupin s nejvyšší dávkou 11 až 300 gg jsou sdružovány dohromady. Po dvou imunizacích titr protilátek závisí na dávce antigenů po celém rozmezí od 0,4 do 300 gg. Třetí imunizací titry nejvyšších čtyř dávek byly všechny srovnatelné a po další imunizaci zůstaly na stálé hodnotě.
Měsíc po čtvrté imunizaci byly titry dvakrát až třikrát vyšší ve skupině, které se aplikovalo 300 gg ve srovnání · *·«· · · · • · · » · · • ··* · · · · · · * · · · 0 0
0·· 00 400 000« 00 0 s titry měřenými z krve odebrané pět dní po imunizaci (Obrázek č. 6). Toto pozorování naznačuje, že maximum anamnestické protilátkové odezvy se objevilo později než pět dní po imunizaci. Nejmenší zvýšení (50 %) bylo možné zaznamenat ve skupině, které se aplikovalo 33 μς. Ve skupině s dávkou 300 μς ve dvou měsících po poslední dávce GMT hluboce pokleslo o přibližně 70 %. Po dalším měsíci byl pokles méně prudký přibližně 45 % (100 μρ) a přibližně 14 % v případě dávky 33 μς a 11 pg. Pak rychlost poklesu titrů cirkulujících protilátek následující přerušení imunizace se jeví, že probíhá ve dvou fázích se strmým poklesem v prvním měsíci po maximální odezvě a pak následuje mírnější rychlost poklesu.
Titry protilátek a kinetiky odezvy u těchto myší Swiss Webster jsou podobné těm u mladých heterozygotních transgenních myší PDAPP imunizovaných paralelním způsobem. Dávky účinné pro indukci imunitní odezvy u lidí jsou v typickém případě podobné dávkám účinným u myší.
Příklad 3: Testování terapeutické účinnosti proti AD
Tento test se navrhl tak, aby se u imunogenních činidel mohla testovat aktivita přetrvávajících nebo vratných neuropatologických charakteristik AD u starých zvířat. Imunizace s Αβ o délce 42 aminokyselin (AN1792) začala v době, kdy jsou už v mozku myší PDAPP přítomny amyloidní plaky.
V průběhu této studie se u neošetřených myší PDAPP vyvinula řada neurodegenerativních změn, které se podobaly těm vyskytujícím se v případě AD (popisuje se v publikaci Games et al., Nátuře 373, 523 (1995) a Johnson-Wood et al., Proč. Nati.
USA 94, 1550-1555 (1997)). Ukládání Αβ do plaků je spojeno s degenerativní neuronální která zahrnuje aberantní axonální a dendritické které se nazývají dystrofické neurity. Amyloidní které jsou obklopeny a také obsahují dystrofické
Acad. Sci. amyloidních odezvou, elementy, depozity, neurity se nazývají neuritické plaky. U myší AD a PDAPP mají • ·
Φ· ·
Φ Φ «··
Φ
Φ ΦΦ • Φ «Φ • t ·
Φ Φ « • 9 · «
Φ · r
Φ ΦΦΦΦ ΦΦ dystrofické neurity odlišnou globurální strukturu, jsou imunoreaktivní se souborem protilátek, které rozeznávají APP a cytoskeletové komponenty a vykazují komplexní subbuněčné degenerativní změny na úrovni ultrastruktury. Tyto charakteristiky umožňují selektivní a reprodukovatelné a pro nemoc relevantní měření tvorby neuritických plaků v mozku PDAPP. Dystrofický neuronální komponent neuritických plaků PDAPP je snadno vizualizovatelný s protilátkou specifickou pro lidský APP (monoklonální protilátka 8E5) a je snadno měřitelná počítačovou analýzou zobrazení. Proto vedle měření účinků AN1792 na tvorbu amyloidních plaků se sledovaly účinky této léčby na vývoj neuritické dystrofie.
Astrocyty a mikroglia jsou jiné než neuronální buňky, které odpovídají a odrážejí stupeň poškození neuronů. Astrocyty pozitivní na GFAP a mikroglia pozitivní na MHC-II se v případě AD běžně vyskytují a jejich aktivace se zvyšuje spolu s vážností onemocnění. Proto jsme také monitorovaly vývoj reaktivní astrocytózy a mikrogliózy u myší ošetřených AN1792.
A. Materiál a metody
Z Charles River se získalo R48 heterozygotních samic myší PDAPP ve věku 11 až 11,5 měsíců a náhodně se rozdělily do dvou skupin: 24 myší se imunizovalo 100 pg AN1792 a 24 myší se imunizovalo PBS. AN1792 a PBS se kombinovalo s Freundovým adjuvans. Skupiny imunizované AN1792 a PBS se dále rozdělily, když dosáhly věku přibližně 15 měsíců. V 15-ti měsících věku přibližně polovina každé skupiny zvířat ošetřených AN1792 a PBS se usmrtila (n=10 a 9), zbytek pokračoval v imunizaci až do ukončení v přibližně 18 měsíců (n=9 a 12) . Během studie zemřelo celkem 8 zvířat (5 imunizovaných AN1792 a 3 imunizované PBS) . Vedle imunizovaných zvířat jsou pro porovnání v ELISA testu zahrnuty neošetřené myši PDAPP ve věku jednoho roku (n=10), 15-ti měsíců (n=10) a 18 měsíců (n=10), • · ·· ·· ···
aby se mohlo změřit množství Αβ a APP v mozku myší. V imunohistochemické analýze jsou zahrnuty také zvířata stará jeden rok.
Pokud není uvedeno jinak, metodologie byla jako v příkladu
1. Peptidy AN1792 z US Peptides lot 12 a California Peptides lot ME0339 se použily při přípravě antigenu pro šest imunizací, které se aplikovaly před dosažením 15-ti měsíců. Peptidy California Peptides lot ME0339 a ME0439 se použily pro tři další imunizace, které se aplikovaly mezi 15 a 18 měsíci.
V případě imunizace 100 μg AN1792 ve 200 μΐ PBS nebo v samotné PBS se emulgovalo v poměru 1:1 (vol:vol) s úplným Freundovým adjuvans (CFA) nebo s neúplným Freundovým adjuvans (IFA) nebo PBS v konečném objemu 400 μΐ. První imunizace se zavedla s CFA, které se použilo jako adjuvans, další čtyři dávky se aplikovaly s IFA a konečné čtyři dávky se aplikovaly se samotným PBS, aniž se přidalo adjuvans. V průběhu sedmi měsíců se aplikovalo celkem devět imunizací ve dvoutýdenních intervalech v případě prvních třech dávek a zbývající injekce se aplikovaly ve čtyřtýdenním intervalu. Skupiny, které se léčily pouze čtyři měsíce, se usmrtily ve věku 15-ti měsíců, se podrobily pouze prvním 6-ti imunizacím.
B. Výsledky
1. Účinky léčby AN1792 na amyloidní uzle
Výsledky léčby AN1792 na kortikální amyloidní uzel stanovené kvantitativní zobrazovací analýzou jsou uvedeny na obrázku č. 7. Střední hodnota v případě kortikálního amyloidního uzle byla 0,28 % ve skupině neošetřených myší
PDAPP ve věku 12-ti měsíců. Uvedená hodnota reprezentuje vznik plaků u myší na začátku studie. Za 18 měsíců se amyloidní uzel zvětšil víc jak 17 krát na 4,8 % u myší ošetřených PBS, zatímco u myší ošetřených AN1792 se amyloidní uzel změnšil pouze o 0,01 %, což je znatelně méně než u neošetřených myší ve věku 12-ti měsíců a ve skupině myší ošetřených PBS ve věku • · · ·
4·· ·· ·······
15-ti a 18-ti měsíců. Amyloidní uzel se podstatně redukoval u recipientů AN1792 při stáří 15 měsíců (96 % redukce, p=0,003) a 18 měsíců (více jak 99% redukce, p=0,0002).
V typickém případě kortikální amyloidní depozit u myší PDAPP začal v předním a retrospleniálním kortiku (RSC) a pokračoval ventralním-laterálním směrem, aby zahrnoval temporální a entorhinální kortiky (EC). V EC u 12 měsíců starých myší se nezjistil žádný nebo pouze malé množství amyloidu, což odpovídá věku, při kterém se poprvé aplikoval AN1792. Po čtyřech měsících léčby s AN1792 se velice snížilo ukládání amyloidu v RSC a postupné zahrnutí EC bylo zcela eliminováno léčbou s AN1792. Pozdější pozorování vykazuje, že AN1792 zcela zastavil postup amyloidních depozitů, které v normálním případě pokračuje v temporálním a ventrálním kortiku, stejně jako trvalé nebo možné vratné ukládání v RSC.
Výrazné účinky léčby AN1792 na vývoj kortikálního amyloídního uzle u myší PDAPP jsou dále demonstrovány skupinou myší ve věku 18-ti měsíců, které se léčily po dobu sedmi měsíců. Skoro úplná absence kortikálního amyloidu se zjistila v případě myši ošetřené AN1792, přičemž úplně chybí difúzní plaky stejně jako se redukovaly zhutněné plaky.
2. Léčba s AN1792 spojená s buněčnými a morfologickými změnami
V oblastech mozku, které v typickém případě obsahují amyloidní depozity se našla populace buněk pozitivních na Αβ. Překvapivě v několika mozcích z recipientů AN1792 se našlo velmi málo nebo žádné extrabuněčné kortikální amyloidní plaky. Ukázalo se, že většina Αβ ímunoreaktivity je obsažena v buňkách velkým lobulárním nebo nahromaděným sóma. Fenotypicky tyto buňky tvoří aktivovaná mikroglia nebo monocyty. Tyto buňky imunologicky reagují s protilátkami, které rozeznávají ligandy exprimované aktivovanými monocyty a mikrogliem (MHC II a CDllb) a jsou příležitostně spojeny se stěnou nebo s lumenem cév. Porovnání přilehlých sekcí značených protilátkami, které • · · · ··· ·· ······· jsou specifické pro Αβ a MHC-II ukázalo, že podobné paterny těchto buněk rozeznávají obě třídy protilátek. Detailní testování mozků ošetřených AN1792 ukázalo, že buňky pozitivní na MHC II jsou omezeny na blízkost limitovaného amyloidu, který zbývá v těchto zvířatech. Při používaných fixačních podmínkách buňky nejsou imunoreaktivní s protilátkami, které rozeznávají ligandy T buňky (CD3, CD3e) nebo B buňky (CD45RA, CD45RB) nebo antigen běžný pro leukocyty (CD45), ale reagovaly s protilátkou, která rozeznává leukosialin (CD43), který zkříženě reaguje s monocyty. U žádné z myší ošetřených PBS se nenašly takové buňky.
Myši PDAPP pravidelně vyvíjejí těžký amyloidní depozit ve vnější molekulové vrstvě hippokampálního gyrusu dentate. Ukládání tvoří zřetelnou brázdu v suboblasti, která v klasickém případě obsahuje amyloidní plaky při AD. Charakteristické objevení těchto depozitů u myší ošetřených PBS se podobá objevení depozitů dříve charakterizované u neošetřených myší PDAPP. Ukládání amyloidu zahrnuje difúzní a zhutněné plaky v nepřerušovaném pruhu. Naopak u řady mozků z myší ošetřených AN1792 by se měl tento patern drasticky změnit. Ukládání amyloidu v hyppocampusu dále neobsahuje difúzní amyloid a pruhový patern byl zcela porušen. Je přítomno řada neobvyklých zvýrazněných struktur, které reagují s protilátkami proti Αβ, několik z nich jsou buňky obsahující amyloid.
U zvířat ošetřených AN1792 se často pozorovaly buňky pozitivní na MHC-II v blízkosti extrabuněčného amyloidu. Patern buněk, které jsou Αβ pozitivní, byl velmi podobný u několika mozků z myší ošetřených AN1792. Distribuce těchto monocytických buněk se omězila do blízkosti uloženého amyloidu a byla zcela nepřítomna v jiných oblastech mozku, které neobsahují plaky Αβ. Konfokální mikroskopie sekcí značených MHCII a Αβ ukázala, že materiál plaků byl obsažen v mnoha monocytických buňkách.
Kvantitativní analýza zobrazení sekcí značených MHC II a MÁCI ukázala trend směrem ke zvýšené imunoreaktivitě v RSC a hippocampusu myší ošetřených AN1792 ve srovnání se skupinou ošetřenou PBS, která dosáhla podstatnosti při měření reaktivity MAC 1 v hippocampusu.
Tyto výsledky indikují aktivní odstranění amyloidu v oblastech mozku nesoucí plaky zprostředkované buňkami.
3. Účinky ΆΝ1792 na množství Αβ: stanovením v testu ELISA a) Kortikální množství
U neošetřených myší PDAPP střední hodnota množství celkového Αβ v kortexu ve 12-měsících byla 1 600 ng/g, v 15-ti měsících vzrostla na 8 700 ng/g (tabulka č. 2). V 18-ti měsících hodnota byla 22 000 ng/g. Během průběhu experimentu hodnota vzrostla víc jak desetkrát. Zvířata ošetřená PBS vykazují v 15-ti měsících celkové množství Αβ 8 600 ng/g. Toto množství vzrostlo na hodnotu 19 000 ng/g v 18-ti měsících. Naopak zvířata ošetřená AN1792 vykazují v 15-ti měsících o 81 % méně celkového množství Αβ (1 600 ng/g) ve srovnání se skupinou imunizovanou PBS. Podstatně nižší množství celkového Αβ (p=0, 0001) (5 200 ng/g) se zjistilo v 18-ti měsících, kdy když se porovnávaly skupiny ošetřené AN1792 a PBS (tabulka č. 2), což reprezentuje 72 % redukci množství Αβ, které by bylo jinak přítomno. Podobné výsledky se získaly, když se porovnaly kortikální množství Αβ42, jmenovitě skupiny, které se ošetřily AN1792, obsahuje daleko méně Αβ42, ale v tomto případě rozdíly mezi skupinami ošetřenými AN1792 a PBS byly podstatné v 15-ti měsících (p=0,04) i v 18-ti měsících (p=0,0001, tabulka č. 2).
Tabulka č. 2: Průměrné množství Αβ (ng/g) v kortexu
neošetřené PBS AN1792
věk celkem Αβ42 (n) celkem Αβ42 (n) celkem Αβ42 (n)
• · • ·
12 1 600 1 300 (10)
15 8 700 8 300 (10) 8 600 7 200 (9) 1 600 1300* (10)
18 22000 18500 (10) 19000 15900 (12) 5200** 4000** (9)
*p=0,0412 **ρ=0,0001
b) Množství hippocampusu
U neošetřených myší PDAPP střední hodnota množství celkového Αβ v kortexu ve 12-ti měsících byla 15 OOOng/g, v 15ti měsících vzrostla na 51 000 ng/g. V 18-ti měsících hodnota byla 81 000 ng/g (tabulka č. 3). Podobně, zvířata ošetřená PBS vykazují v 15-ti měsících hodnoty 40 000 ng/g a v 18-ti měsících hodnotu 65 000 ng/g. Naopak zvířata ošetřená AN1792 v 18-ti měsících vykazují hodnotu podstatně nižší ve srovnání se skupinou imunizovanou PBS (p=0,0105, tabulka č. 3). Měření Αβ42 dává stejný patern výsledků. Množství ve skupině ošetřené AN1792 bylo podstatně nižší než ve skupině ošetřené PBS (39 000 ng/g verzus 57 000 ng/g, p=0,002) při 18-ti měsíčním vývoji (tabulka č. 3).
Tabulka č. 3: Průměrné množství Αβ (ng/g) v kortexu
neošetřené PBS AN1792
věk celkem Αβ42 (n) celkem Αβ42 (n) celkem Αβ42 (n)
12 15500 11100 (10)
15 51500 44400 (10) 40100 35,70 (9) 24,50 22100 (10)
18 80800 64200 (10) 65400 57,10 (12) 50,90 38900 ** (9)
*p=0,0105 **p=0,0022 (c) Množství v mozečku » · φ ♦ · • · • · 4 9
994 4094 44 «
U neošetřených myší PDAPP průměrná hodnota cerebelárního množství celkového Αβ ve 12-ti měsících byla 15 000 ng/g (tabulka č. 4) . V 15-ti měsících průměrná hodnota vzrostla na 28 ng/g. V 18-ti měsících hodnota byla 35 ng/g (tabulka č. 3).
Zvířata ošetřená PBS vykazují v 15-ti měsících hodnoty 21 ng/g a v 18-ti měsících hodnotu 43 ng/g. Naopak zvířata ošetřená AN1792 v 15-ti měsících vykazují hodnotu 22 ng/g celkového Αβ a podstatně nižší (p=0,002) v 18-ti měsících (25 ng/g) než odpovídající skupina PBS (tabulka č. 4).
Tabulka č. 4: Průměrné množství Αβ (ng/g) v mozečku
neošetřené PBS AN1792
věk celkový Αβ (n) celkový Αβ (n) celkový Αβ (n)
12 15, 6 (10)
15 27,7 (10) 20, 8 (9) 21,7 (10)
18 35,0 (10) 43,1 (12) 24,8* (9)
*p=0,0018
4. Účinky léčby AN1792 na množství APP
Molekula APP-α a APP celé délky obsahují celou sekvenci Αβ nebo její část a tak může být potencionálně působit vytvořením imunitní odezvy na AN1792. Ve studiích se zaznamenalo slabé zvýšení množství APP, jako zvýšení neuropatologické charakteristiky u myší PDAPP. V kortexu se léčbou množství buď ΑΡΡ-α/FL (plné délky) nebo APP-α se podstatně nezměnilo s výjimkou, že množství APP-α se zmenšilo o 19 % v 18-tém měsíci u skupiny ošetřené AN1792 ve srovnání se skupinou ošetřenou PBS. Hodnoty APP ve skupině ošetřené AN1792 v 18-ti měsících podstatně nevzrostla z hodnoty, kterou vykazuje neošetřená skupina v 12-ti a 15-ti měsících a skupina ošetřená PBS v 15-ti měsících. Ve všech případech hodnoty APP zůstaly v rozmezí, které se normálně zjistilo u myší PDAPP.
•••4
5. Účinky léčby AN1792 na neurodegenerativní a gliotickou patologii
Neuritícký plakový uzel se v předním kortexu myší ošetřených AN1792 podstatně redukoval ve srovnání se skupinou ošetřenou PBS jak ve věku 15-ti měsíců (84 %, p=0,03) tak i ve věku 18-ti měsíců (55%, p=0,01) (obr. č. 8). Průměrná hodnota neuritického plakových uzlů se zvýšila z 0,32 % na 0,49 % ve skupině ošetřené PBS mezi věkem 15.ti a 18-ti měsíců věku. To je v kontrastu s vysoce redukovaným vývojem neuritických plaků ve skupině ošetřené AN1792 s průměrnými hodnotami neuritických plakových uzlů 0,05 % a 0,22 % ve skupinách ve věku 15-ti a 18-ti měsíců.
Zdá se, že imunizace s AN1792 je velmi dobře tolerována a reaktivní astrocyty se také podstatně redukovaly v RSC myší ošetřených AN1792 ve srovnání se skupinou ošetřenou PBS ve věku 15-ti (56 %, p=0,011) a 18-ti (39 %, p=0,028) měsíců věku (obrázek č. 9). Průměrné hodnoty procenta astrocytózy ve skupině ošetřené PBS se zvýšily mezi 15-tým a 18-tým měsícem z
4,25 % na 5,21 %. Léčba AN1792 potlačila vývoj astrocytózy v obou časových bodech na 1,89 % a 3,2 %. To naznačuje, že neuropil nebyl poškozen odstraňovacím postupem.
6. Protilátkové odezvy
Jak se popisuje shora v textu 12 měsíců starým heterozygotním myším PDAPP (N=24) se aplikovaly série 5 imunizací 100 μρ AN1792 emulzifikovaných s Freundovým adjuvans a aplikovaly se intraperitoneálně v týdnu 0, 2, 4, 8 a 12 a šestá imunizace se provedla v týden 16 samotným PBS (bez Freundova adjuvans). Jako negativní kontrola se použila paralelní sada 24 transgenních myší odpovídající věkem, které se imunozovaly PBS emulgovaným stejnými adjuvans a zavedly se podle stejného rozvrhu. Zvířatům se odebraly vzorky třetí a sedmý den po každé imunizaci, přičemž se začalo po druhé
dávce. Testem ELISA se měřily protilátkové odezvy na AN1792. Geometrické průměry titrů (GMT) v případě zvířat, která se imunizovala AN1792 byly po první, druhé a třetí a poslední (šesté) dávce přibližně 1 900, 7 600 a 45 000. U kontrolních zvířat po šesté imunizaci se nenaměřily žádné protilátky specifické pro Αβ.
Přibližně polovina zvířat se ošetřovala po dobu dalších tří měsíců. Imunizace se aplikovala přibližně 20, 24 a 27 týdnů. Každá z těchto dávek se zavedla v samotném PBS bez Freundova adjuvans. Průměrný titr protilátek zůstal po tuto dobu nezměněn. Ve skutečnosti titry protilátek zůstávají stabilní od čtvrtého do osmého odběru krve, což odpovídá období překrývající patou až devátou injekci.
Aby se stanovilo, zda protilátky specifické pro Αβ vyvolané imunizací, které se detekovaly v séru myší ošetřených AN1792, jsou také spojené s ukládáním amyloidu v mozku, tak se soubor sekcí z myší ošetřených AN1792 a PBS nechaly reagovat s protilátkou specifickou pro myší IgG. Na rozdíl od skupiny ošetřené PBS se plaky Αβ v mozku myší ošetřených AN1792 potáhly endogenním IgG. Tento rozdíl mezi dvěmi skupinami je možné spatřit ve věku 15-ti i 18-ti měsíců. Zvláštní byl nedostatek značení ve skupině ošetřené PBS navzdory přítomnosti těžkého amyloidního uzlu u těchto myší. Tyto výsledky vykazují, že imunizace se syntetickým proteinem Αβ tvoří protilátky, které rozeznávají Αβ v amyloidních plakách nebo se něj váží.
7. Imunitní odezvy zprostředkované buňkou
Sedmý den po deváté imunizaci se z devíti myší PDAPP imunizovaných AN1792 a 12 myší imunizovaných PBS ve věku 18-ti měsíců odstranila slezina. Izolovaly se splenocyty a kultivovaly se po dobu 72 hodin v přítomnosti Αβ40, Αβ42 nebo Αβ40-1 (obrácené pořadí proteinu). Jako pozitivní kontrola sloužil mitogen Con A. S proteinem s koncentrací vyšší než 1,7
μΜ se dosáhlo optimální odezvy. Buňky pocházející ze všech devíti zvířat imunizovaných AN1792 proliferovaly jako odezva na protein Αβ40 nebo Αβ1-42, se stejným množstvím začlenění obou proteinů (obrázek č. 10, horní část). Neexistuje odezva na reverzní protein Αβ40-1. Buňky kontrolních zvířat neodpovídají na žádný z proteinů Αβ (Obrázek č. 10, spodní část) .
D. Závěr
Výsledky této studie ukazují, že imunizace AN1792 myší PDAPP zpracovávající existující amyloidní depozity zpomaluje a předchází postupnému amyloidnímu ukládání a brzdí následné neuropatologické změny v mozku starých myší PDAPP. Imunizace s AN1792 podstatně zastavila ukládání amyloidu ve strukturách, které v normální případě ustupují před amyloidózou. Pak aplikace peptidů Αβ má pozitivní účinek při léčbě AD.
Příklad 4: Testování fragmentů Αβ
100 myší PDAPP ve věku 9 až 11 měsíců se imunizovaly devíti různými oblastmi APP a Αβ, aby se stanovilo, zda epitopy umožňují účinnou odpověď. Devět různých imunogenů a jedna kontrola se zavádějí injekcí (i.p.), jak se popisuje shora v textu. Imunogeny zahrnují čtyři lidské peptidové konjugáty Αβ 1-12, 13-28, 32-42, 1-5, všechny jsou spojené s anti-myšími protilátkami IgG prostřednictvím cysteinové vazby, jsou to aminokyseliny polypeptidů APP 592-695, agregovaný lidský Αβ 140, agregovaný lidský Αβ 1-40, agregovaný lidský Αβ 25-35 a agregovaný Αβ42 hlodavců. Agregovaný Αβ42 a PBS se použily jako pozitivní a negativní kontroly. V jedné léčebné skupině se použilo deset myší. Titry se monitorovaly, jak se uvádí shora v textu a myši se usmrtily na konci 4 měsíce injekcí. Po smrti krys se provedla histochemická a toxikologická analýza, stanovilo se množství Αβ.
• * • ·« · ·
A. Materiály a metody
1. Příprava imunogenů
Příprava spojených peptidů Αβ: čtyři lidské peptidové konjugáty Αβ (aminokyselinové zbytky 1-5, 1-12, 13-28 a 33-42, každý tvoří konjugát s ovčím antímyším IgG) se připravily spojením s umělým cysteinem, který se přidal do peptidů Αβ za použití síťovadla sulfo-EMCS. Peptidové deriváty Αβ se syntetizovaly s následující konečnou aminokyselinovou sekvencí. V každém případě poloha začleněného cysteinového zbytku je označena podtrženým písmenem. Peptidový derivát Αβ 13-28 také obsahuje dva glycinové zbytky, které se přidaly dříve než karboxylový terminální cystein.
peptid Αβ1-12 peptid Αβ1-5 peptid Αβ33-42 peptid Αβ13-28
NH2-DAEFRHDSGYEVC-COOH (SEQ ID NO: 72) NH2-DAEFRC-COOH (SEQ ID NO: 73)
NH2-C-aminoheptanová kyselina GLMVGGVVIA-COOH (SEQ ID NO: 74) Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH (SEQ ID NO: 75)
Aby proběhla kuplovací reakce, deset miligramů ovčích anti-myšího IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) se dialyzovalo přes noc proti 10 mM borátu sodnému, pH 8,5. Dialyzované protilátky se pak koncentrovaly na objem 2 ml za použití zkumavek Amicon Centriprep. Deset miligramů činidla sulfo-EMCS [N(ε-maleimidokuproyloxy)sukcinimid] (Molecular Sciences Co.) se rozpustil v jednom mililitru deionizované vody. 40-ti násobný molární nadbytek činidla sulfo-EMCS se přidal po kapkách za stálého míchání k ovčímu anti-myšímu IgG a pak se roztok míchal po dalších deset minut. Aktivovaný ovčí anti-myší IgG se čistil a pufr se vyměnil pasáží pře gelovou filtrační kolonu o objemu 10 ml (Pierce Presto Column, získanou u firmy Pierce Chemicals), která se uvedela do
rovnováhy 0,1 M NaPO4, 5 mM EDTA, pH6,5. Frakce obsahující protilátky identifikované absorbancí při vlnové délce 280 nm se slily a ředily se na koncentraci přibližně 1 mg/ml za použití 1,4 mg na jednotku OD, jako extinkční koeficient. 40ti násobný molární nadbytek peptidů Αβ se rospustil ve 20 ml 10 mM NaPO4 pH8,0 s výjimkou peptidů Αβ33-42, kdy se nejdříve rozpustilo 10 mg peptidů v 0,5 ml DMSO a pak se ředilo ve 20 ml pufru 10 mM NaPO4. Každý roztok peptidů se přidal do 10 ml aktivovaného ovčího antí-myšího IgG a směs se míchala kolébáním při teplotě místnsoti po dobu 4 hodin. Výsledné konjugáty se zakoncentrovaly na konečný objem, který je menší než 10 ml za použití zkumavek Amicon Centriprep apak se dialyzovaly proti PBS, aby pufr nahradil pufr a odstranil se volný peptid. Za účelem sterilizace se konjugáty pasážovaly pře filtry o velikosti pórů 0,22 mikronů a pak se rozdělily na akviloty do frakcí, které obsahují 1 mg a uchovávaly se zmrazené při teplotě -20 °C. Koncentrace konjugátů se stanovila za použití proteinových testů BCA (Pierce Chemicals) s koňským IgG za účelem vytvoření standardní křivky. Konjugace se dokumentovala zvýšením molekulové hmotnosti konjugovaných peptidů ve vztahu vztaženo na aktivovaný ovčí anti.myší IgG. Ovčí anti-myší konjugát Αβ1-5 je výsledek spojení dvou konjugací, zbytek byl z jedné přípravy.
2. Příprava agregovaných peptidů Αβ
Lidské peptidy 1-40 (AN1528, California Peptides lne., Lot
ME0541), lidské 1-42 (AN1792, California Peptides lne., Lots
ME0339 a ME0439), lidský 25-35 a 1-42 hlodavce (California Peptides lne., Lot ME0218) peptidy se rozpustily za účelem přípravy každé sady injekcí z lyofilizovaného prášku, které se udržovaly vysušené při teplotě -20 °C. pro tyto účely se přidaly dva miligramy peptidů do 0,9 ml deionizované vody a směs se míchala vortexem, aby se vytvořil relativně jednotný roztok nebo suspenze. Ze čtyř uvedených peptidů v tomto kroku • * · jediným rozpustným peptidem byl AN1528. Pak se k k AN1528 přidalo alikvot lOx koncentrovaného PBS o objemu 100 μΐ a v tento okamžik AN1528 se začal srážet. Suspenze se opět míchala vortexem a inkubovala se přes noc při teplotě 37 °C a použila se následující den.
Příprava proteinu pBx6: Zkonstruoval se expresívní plazmid kódující pBx6, což je fúzní protein obsahující N-terminální vedoucí sekvenci bakteríofágové polymerázy MS-2 obsahující 100 aminokyselin, po které následují aminokyseliny 592-695 APP (βΑΡΡ) se zkonstruovaly, jak se popisuje v publikaci Oltersdorf et al., J. Biol. Chem. 265, 4492-4497 (1990). Plazmid se přenesl do bakterie E.coli a protein se exprimoval po indukci promotoru. Bakterie se lyžovala v 8M močovině a pBx6 se částečně čistil preparativní SDS PAGE, Frakce obsahující pBx6 se identifikovaly westernovou analýzou za použití králičích polyklonálních protilátek proti pBx6, slily se dohromady, použitím zkumavek Amicon Centriprep se zvýšila koncentrace a dialyzovaly se proti PBS. Čistota přípravku odhadovaná pomocí SDS PAGE obarvenou Coomassieovou modří byla přibližně 5 až 10
O.
o ·
B. Výsledky a diskuze
1. Návrh studie
Jedno sto samců a samic heterozygotních transgenních myší PDAPP devět až dvanáct měsíců starých se získalo z instituce Charles River Laboratory a Taconíc Laboratory. Myši se rozdělily do deseti skupin, aby se imunizovaly různými oblastmi Αβ a APP kombinovanými s Freundovým adjuvans. Zvířata se rozdělila tak, aby si ve skupině odpovídala pohlaví, věkem, původem a zdrojem jak, jen to je možné. Imunogeny zahrnují čtyři peptidy Αβ získané z lidské sekvence 1-5, 1-12, 13-28 a
33-42, přičemž je každý konjugovaný s ovčím anti-myším IgG, čtyři agregované peptidy Αβ, lidský 1-40 (AN1528), lidský 1-42 (AN1792), lidský 25-35 a 1-42 z hlodavců a fúzní polypeptid ··· · • · označený jako ρΒχβ, který obsahuje aminokyselinové zbytky APP 592-695. Desátá skupina, která sloužila jako kontrola, se imunizovala PBS kombinovaným s adjuvans.
V případě každé imunizace 100 pg každého peptidů Αβ ve 200 pl PBS nebo 200 pg derivátu pBx6 APP ve stejném objemu PBS nebo samotné PBS se emulgovalo s úplným Freunodvým adjuvans (CFA) v objemu 1:1 (objem : objem), přičemž v případě první imunizace konečný objem je 400 pl, pak následovaly 4 zesilující dávka obsahující stejné množství imunogenu v neúplném a konečná dávka obsahovala PBS. dávek se (IFA) třech imunizace aplikovala intervalech a pak
Freundovým adjuvans V případě prvních intraperitoneálně ve dvoutýdenních v intervalu jednoho měsíce. Po čtyřech až sedmi dnech po každé imunizaci se zvířatům odebrala krev, přičemž se začalo po druhé dávce, a v krvi se stanovil titr protilátek. Zvířata se usmrtila přibližně jeden týden po konečné dávce.
1. Množství Αβ a APP v mozku
Po přibližně čtyřech měsících imunizace různými peptidy Αβ nebo deriváty APP se získal mozek ze zvířat perfundovaných fyziologickým roztokem. Jedna hemisféra se připravila imunohistochemickou analýzou a druhá se použila pro kvantifikaci množství Αβ a APP. Aby se měřila koncentrace různých forem amyloidního peptidů beta a amyloidního prekurzorového proteinu, izolovala se hemisféra a připravil se homogenát hippocampalní, kortikální a cerebelární oblastiv 5 M guanidinu. Homogenát se naředil a množství amyloidu a APP se kvantifikovalo porovnáním sérií ředění standardů peptidů Αβ nebo APP, jejichž koncentrace jsou známé, v testu ELISA.
Průměrná koncentrace celkového Αβ v případě kontrolní skupiny imunizované PBS byla 5,8 krát vyšší v hippocamusu než v kortexu (průměrná hodnota 24 318 ng/g hippocampální tkáně ve srovnání s 4 221 ng/g v tkáni kortexu). průměrná hodnota
• · ♦ « » · » · · • · » · ··· ·»·· ·» « v cerebellum kontrolní skupiny (23,4 ng/g tkáně) byla přibližně 1 000 krát nižší než v hippocampusu. Tato množství jsou podobná množství, které bylo dříve zaznamenáno v případě heterozygotních transgenních myší PDAPP uvedeného stáří (Johnson-Wood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)).
V případě kortexu subsada léčených skupin vykazovaly průměrnou hodnotu celkového množství Αβ a Αβ1-42, které se podstatně liší od hodnot, které vykazuje kontrolní skupina (p je menší než 0,05), těmto zvířatům se aplikoval AN1792, Αβ1-42 hlodavců nebo peptidový konjugát Αβ1-5, jak je zobrazeno na obrázku č. 11. Průměrná hodnota množství celkového Αβ se redukovala ve srovnání s kontrolou pro tuto léčenou skupinu o 75 %, 79 % a respektive 61 %. Existují se rozeznatelné korelace mezi titry ptoilátek specifickými pro Αβ a množství Αβ v kortikální oblasti mozku v případě libovolné skupiny.
V hippocampusu průměrné snížení celkového Αβ spojeného s léčbou AN1792 (46 %, p=0,0543) nebyla větší, než se pozorovalo v kortexu (75 %, p=0,0021). Redukce však nebyla o tolik větší v hippocampusu než v kortexu. Redukce Αβ hippocampusu je 11 186 ng/g tkáně verzus 3 171 ng/g tkáně v kortexu. V případě skupin zvířat, kterým se aplikoval Αβ1-42 nebo Αβ1-5 hlodavců, se průměrná hodnota množství celkového Αβ redukovala o 36 % a 26 %. Dáno malou velikostí skupin a vysokou variabilitou množství amyloidního peptidu od zvířete k zvířeti v obou skupinách, tyto redukce nebyly podstatné.
Když se měřilo Αβ1-42 v hippocampusu, žádné redukce indukované léčbou nebyly podstatné. Vzhledem k malé velikosti uzlů Αβ v kortexu, změny v této oblasti jsou citlivějším indikátorem účinků léčby. Změny množství Αβ měřené testem ELISA v kortexu jsou podobné, nikoliv identické s výsledky imunohistochemické analýzy (popisuje se dále v textu).
0 0 • 0 • · · • 00 ♦· ♦ 0
0 • ·
0
000 0000
0 00 0
Celkové množství Αβ se také měřilo v cerebellum, což je oblast, která je minimálně ovlivněna patologií AD. Žádná z průměrných koncentrací Αβ libovolných skupin imunizovaných různými peptidy Αβ nebo deriváty APP se liší od kontrolní skupiny v této oblasti mozku. Tento výsledek naznačuje, že nepatologické množství Αβ není ovlivněno léčbou.
Koncentrace APP v kortexu a v cerebelu léčených nebo kontrolních myší se také stanovila testem ELISA. Použily se dva různé testy APP. První test označený ΑΡΡ-α/FL rozeznává jak APP alfa (a, vylučovaná forma APP, která se štěpila v sekvenci Αβ) a formy APP v plné délce (FL), zatímco druhý test rozeznává pouze APP-α. Na rozdíl od úbytku Αβ spojeného s léčbou v sadě léčených skupin, množství APP se nezměnilo u všech léčených myší ve srovnání s kontrolními zvířaty. Tyto výsledky ukazují, že imunizace s peptidy Αβ nesnižuje množství APP, spíše léčebný účinek je specifický pro Αβ.
Celkové množství Αβ a Αβ1-42 se v kortexu podstatně redukovalo léčbou AN1792, Αβ1-42 hlodavce nebo konjugátem Αβί42. V hippocampususe celkové množství Αβ podstatně redukovalo pouze léčbou AN1792. Žádné jiné změny v množství Αβ nebo APP v hippocampální, kortikální nebo cerebelární oblasti spojené s léčbou nebyly podstatné.
2. Histochemická analýza
Mozky z podsady šesti skupin se připravily za účelem imunohistochemické analýzy, přičemž tři skupiny se imunizovaly konjugáty peptidu Αβ Αβ1-5, Αβ1-12 a Αβ13-28, dvě skupiny se imunizovaly agregáty Αβ plné délky AN1792 a AN1528 a kontrolní skupina se ošetřila PBS. Výsledky zobrazovací analýzy amyloidního uzle v mozkových sekcích z těchto skupin jsou zobrazeny na obrázku č. 12. Existují podstatné redukce amyloidního uzle v kortikálních oblastech tří léčených skupin
9 9
9
9 9 • 9
9 ve srovnání s kontrolními zvířaty. Největší redukce amyloidního uzle se pozorovala ve skupině, které se aplikovalo AN1792, kde průměrná hodnota se redukovala z 97 % (p=0,001). Podstatné redukce se také pozorovaly v případě těch zvířat ošetřených AN1528 (95 %, p=0,005) a peptidovým konjugátem Αβ1-5 (67 %, p=0,02) .
Výsledky získané kvantifikací celkového množství Αβ nebo Αβ1-42 testem ELISA a zobrazením amyloidního uzle se v některém rozsahu liší. Léčba pomocí AN1528 měla podstatný vliv na množství kortikálního amyloidního uzlu , když se provedla kvantitativní zobrazovací analýza, ale neměla vliv na koncentraci celkového Αβ ve stejné oblasti, která se stanovila testem ELISA. Rozdíl mezi těmito dvěma výsledky je pravděpodobně způsoben specifitami testů. Zobrazovací analýza měří pouze nerozpustný Αβ agregovaný do plaků. Naopak test ELISA měří všechny formy Αβ, což znamená rozpustné a nerozpustné, monomérní a agregované. Protože se uvažuje, že patologie onemocnění je spojena s formou Αβ spojenou s nerozpustnými plaky, metoda zobrazovací analýzy je ciltivější pro zobrazení účinků líčby. Protože však test ELISA je rychlejší a jednodušší, hodně se používá pro účely testování velkého množství vzorku. Může se také ukázat, že redukce Αβ spojená s léčbou je větší v případě Αβ spojeného s plaky než celkového Αβ.
Aby se stanovilo, zda protilátky specifické pro Αβ vyvolané imunizací u léčených zvířat reagovaly s amyloidem uloženým v mozku, podsada sekcí z léčených zvířat a kontrolních myší se nechaly reagovat s protilátkou specifickou pro myší IgG. Na rozdíl od skupiny ošetřené PBS, plaky obsahující Αβ se potáhly endogenním IgG v případě zvířat imunizovaných konjugáty peptidů Αβ. Jsou to Αβ1-5, Αβ1-12 a Αβ13-28 a agregáty Αβ plné délky, jako je AN1792 a AN1528.
• · · • · •4 · • · ♦ · ·
Mozky zvířat imunizovaných jinými peptidy Αβ nebo APP peptidem pBx6 se tímto testem neanalyzovaly.
3. Měření titrů protilátek
Čtyři až sedm dni po každé imunizaci se myším odebraly vzorky krve, přičemž se začalo po druhé imunizaci. Vzorky krve se odebraly celkem pětkrát. Titry protilátek se měřily jako protilátky vázající se na Αβ-42 za použití sendvičového testu ELISA na plastových destičkách s velkým množstvím prohlubní, které se potáhly Αβ1-42. Jak se zobrazilo na obrázku č. 13 maximální titry protilátek se vyvolaly po čtvrté dávce imunogenních prostředků, které vyvolaly nejvyšší titry protilátek specifických pro AN1792: AN1792 (maximum GMT: 94
647), AN1528 (maximum GMT 88 231), konjugát ΑβΙ-12 (maximum
GMT: 47 216) a Αβ1-42 hlodavce (maximum GMT: 10 766). Titry u těchto skupin klesají po následující páté a šesté dávce. Vv případě zbývajícíh pěti imunogenů maximálních titrů se dosáhlo po páté nebo šesté dávce a měly daleko nižší hodnotu než jsou titry čtyř skupin s nejvyšší hodnotou titrů: konjugát Αβ1-5 (maximum GMT: 2 356), pBx6 (maximum GMT: 1 986), konjugát Αβ13-28 (maximum GMT: 1 183), konjugát Αβ33-42 (maximum GMT: 658),
Αβ25-35 (maximum GMT: 125). Také se měřily titry protilátek proti homologním peptidům za použití stejného testu ELISA v sendvičovém formátu, tyto skupiny se imunizovaly Αβ1-5, Αβ13-28, Αβ25-35, Αβ33-42 nebo Αβ1-4έ hlodavce. Tyto titry byly přibližně stejné jako titry naměřené proti Αβ1-42 s výjimkou imunogenu Αβ1-42 hlodavce, kdy titry protilátek proti homolognímu imunogenu jsou přibližně dvakrát vyšší. Hodnota titru protilátek proti AN1792 u jednotlivých zvířat nebo průměrné hodnoty léčených skupin nekorelují s účinností měřenou jako redukce Αβ v kortexu.
0 00 • · · • · 0 • ··· · • 00 •0 0 0 * 0 • · · 00 0 0 0 0 0 0 0 0
·· 00 0 0 ·♦· 0000 0 0 00 00
4. Lymfoproliferativní odezvy
Lymfoproliferace závislá na Αβ se měřila použitím buněk sleziny sebraných přibližně jeden týden po konečné šesté imunizaci. Čerstvě sklizené buňky v počtu 105 do jedné prohlubně se kultivovaly po dobu 5-ti dní v přítomnosti Αβ1-40 v koncentraci 5 μΜ za účelem stmulace. Buňky ze sady sedmi z desíti skupin se také kultivovaly s mitogenem T buňky PHA a jako negativní kontorla se buňky kultivovaly bez přidání peptidu.
Lymfocyty získané z většiny zvířat proliferovaly jako odezva na PHA. Nepozorovala se žádná podstatná odezva na reverzní peptid Αβ1~40. Buňky ze zvířat imunizované většími agregovanými peptidy Αβ AN1792, Αβ1-42 hlodavců a AN1528 silně proliferovaly, když se stimulovaly Αβ1-40 s vyšším cpm u recipienta AN1792. Jedno zvíře v každé skupině imunizované konjugátem Αβ1-12, Αβ13-28 a Αβ25-35 proliferovalo jako odezva na Αβ1-40. Zbývajícím skupinám se aplikoval konjugát Αβ1-5, konjugát Αβ33-42 pBx6 nebo PBS se neaplikovalo žádnému zvířetis odezvou stimulovanou Αβ. Tyto výsledky se shrnuly v tabulce č.
dále v textu.
Tabulka č. 5
Imunogen Konj ugát aminokyseliny Αβ jedinci s odezvou
Αβ1-5 ano 5-mér 0/7
Αβ1-12 ano 12-mér 1/8
Αβ13-28 ano 16-mér 1/9
Αβ25-35 11-mér 1/9
Αβ33-42 ano 10-mér 0/10
Αβ1-40 40-mér 5/8
Αβ1-42 42-mér 9/9
9
r Αβ1-42 42-mér 8/8
pBx6 0/8
PBS 0-mér 0/8
Tyto výsledky ukazují, že AN1792 a AN1528 stimuluje silné odezvy T buněk, které nejvíce odpovídají fenotypu CD4+. Nepřítomnost odezvy specifické pro Αβ u zvířat imunizovaných Αβ1-5 není překvapujííc, protože peptidové epitopy rozeznávané T buňkami CD4+ obsahují obvykle přibližně 15 aminokyselin, ačkoli kratší peptidy mohou někdy fungovat s nižší účinností. Pak většina epitopů pomocných T buněk v případě čtyř konjugovaných peptidů jsou pravděpodobně zbytky v konjugačním partneru IgG, nikoliv v oblasti Αβ. Tuto hypotézu podporuje velmi nízký výskyt proliferativních odezev zvířat v každé z těchto skupin. Protože konjugát Αβ1-5 byl účinný při podstatném omezení množství Αβ v mozku nepřítomnosti T buněk specifických pro Αβ, efektorová imunitní odezva vyvolaná imunizací s tímto peptidem se jeví být protilátka.
Nadostatek T-buněk a nízká protilátková odezva na fúzní peptid pBx6, který obsahuje minokyseliny APP 592 až 695 zahrnující všechny zbytky Αβ může způsobovat nízkou imunogennost tohoto určitého přípravku. Slabá imunogennost agregátu Αβ25-35 je pravděpodobně způsobena peptidem, který je příliš malý, aby obsahoval správný epitop T buňky, aby pomohl vyvolat protilátkovou odezvu. Jestliže by se tento peptid konjugoval s nosičovým proteinem, bude pravděpodobně více imunogenní.
pn zjevne pak klíčová
Příklad 5: Příprava polyklonálních protilátek pro pasivní ochranu
125 netrandgenních myší se imunizovalo 100 pg Αβ1-42 plus adjuvans CFA/IFA a usmrtily se ve věku 4 až 5 měsíce.
» · ··· ·
4444 «· 4
4 ·« • > 4 • 4 · » 4 ·
4« »0*
IgG se specifická
Z imunizovaných zvířat se odebraly vzorky krve separovaly od jiných komponentů krve. Protilátka pro imunigen se může částečně čistit afinitní chromatografií. Z jedné myší se průměrně získalo přibližně 0,5 až 1 mg protilátky specifické pro imunogen, celkem se získalo 60 až 120 mg.
Příklad 6: Pasivní imunizace protilátkou proti Αβ
Skupinám myší PDAPP ve věku 7 až 9 měsíců se injekcí aplikovalo 0,5 mg polyklonální protilátky proti Αβ v PBS nebo specifických monoklonálních protilátek proti Αβ, jak se ukazuje dále v textu. Všechny protilátky se čistily, aby se dosáhlo nízkého množství endotoxinu. Monoklonální protilátky se mohou připravit proti fragmentu tím, že se do myši injekcí zavedl fragment nebo kratší forma Αβ, přičemž se připravily hybridoma a testovaly se za účelem zjištění protilátky, která se specificky váže na požadovaný fragment Αβ, aniž se váže na jiné přesahující fragmenty Αβ.
Tabulka č. 6
protilátka epitop
2H3 Αβ1-12
10D6 Αβ1-12
266 Αβ13-28
21F12 Αβ33-42
myší polyklonální anti-lidské Αβ4 2 anti-agregovaný Αβ42
Myšim, je-li potřeba, se aplikovala injekce v období čtyř měsiců, aby se udržela koncentrace cirkuluj icich protilátek měřená testem ELISA vyšši než 1/1000 definované v testu ELISA
Αβ42 nebo jiným imunogenem. Titry se monitorovaly jak se • d*l ·· 1 · • · · • »·· • fc ·♦♦ fcfc šesti popisuje shora v textu a myši se usmrtily na konci měsíců injekcí. Množství Αβ a toxikologie se stanovily po usmrcení myší. V jedné skupině bylo deset myší. Další studie pasivní imunizace se popisuje v příkladech XI a XII dále v textu.
Příklad 7: Porovnání různých adjuvans
Tento příklad porovnává kapacitu stimulovat imunitní odezvu CFA, alum, emulzi olej ve vodě a MPL .
A. Materiál a metody
1. Návrh studie
100 samic morčat Hartley ve stáří šesti týdnů získaných z Elm Hill se rozdělilo do deseti skupin, aby se imunizovalo AN1792 nebo palmitoylovaným derivátem kombinovaným s různým adjuvans. Sedmi skupinám se aplikoval injekcí AN1792 (33 pg pokud není uvedeno jinak) kombinovaný s a) PBS, b) Freundovým adjuvans, c) MPL, d) skvalenem, e) MPL/skvalenem, f) nízkou dávkou alum nebo g) vysokou dávkou alum (300 pg AN17 92) . Dvěma skupinám se aplikovaly injekce palmitoylovaného derivátu AN1792 (33 pg) kombinovaného s a) PBS nebo b)skvalenem. Nakonec desáté skupině se aplikovalo samotné PBS bez antigenu nebo dalšího adjuvans. V případě skupiny, které se aplikovalo adjuvans se první dávka emulgovala s CFA a zbývající čtyři dávky s IFA. V případě všech skupin s výjimkou skupiny, které se aplikovalo alum a jenž se aplikovalo 300 pg ΆΝ1792, se antigen aplikoval v dávce 33 pg. V případě CFA/IFA se injekce aplikovaly intraperitoneálně a intramuskulárně do čtyřhlavého svalu buď levé nebo pravé zadní končetiny. První tři dávky se aplikovaly ve dvoutýdenním intervalu a pak následují dvě dávky v měsíčním intervalu. Šest až sedm dní po každé imunizaci, začalo se po druhé dávce, se odebraly vzorky krve za účelem stanovení titrů protilátky.
• ·
2. Příprava imunogenů
Dva miligramy Αβ42 (California Peptide, Lot ME0339) se přidaly do 0, 9 ml dejonizované vody a směs se míchala na vortexu za vzniku relativně jednotné suspenze. Přidal se alikvot 10 x koncentrovaného PBS (lx PBS, 0,15 M NaCI, 0,01 M fosforečnan sodný, pH7,5) o objemu 100 μΐ. Suspenze se opět zamíchala na vortexu a inkubovala se přes noc při teplotě 37°C a použila se další den. Nepoužitý Αβ1-42 se uchovával s desikantem jako lyofilizovaný prášek při teplotě -20 °C.
Palmitoylovaný derivát AN1792 se připravil spojením s anhydridem kyseliny palmitové rozpuštěným v dimethylformamidu a aminoterminálním zbytkem AN1792 před odstraněním nascentního peptidu z pryskyřice ošetřením kyselinou fluorovodíkovou. Aby se připravily dávky přípravku s úplným Freundovým adjuvans (CFA) (skupina 2) v případě první imunizace se 33 μρ AN1792 ve 200 μΐ PBS emulgovalo v poměru 1:1 (objem : objem) s CFA v konečném objemu 400 μΐ. V případě další imunizace se antigen podobně emulgoval s neúplným Freundovým adj uvans (IFA) .
Aby se připravily dávky prostředku s MPL v případě skupinu 5 a 8, lyofilizovaný prášek (Ribi ImmunoChem Research, lne., Hamilton, MT) se přidaly do 0,2 % vodného triethylaminu, aby konečná koncentrace byla 1 mg/ml a míchaly se vortexem. Směs se zahřála na teplotu 65 až 70 °C po dobu 30 vteřin, aby vznikla slabě neprůsvitná jednotná suspenze micel. Pro každou sadu injekcí byl připraven čerstvý roztok. V případě každé injekce ve skupině 5 se pezprostředně před použitím v borokřemičité zkumavce smíchalo 33 gg AN1792 v 16,5 μΐ PBS, 50 pg MPL (50 μΐ) a 162 μΐ PBS.
Aby se připravily dávky prostředků s emulzí olej ve vodě,
AN1792 v PBS se přidalo do 5 % skvalenu, 0,5 % Tween 80, 0,5 %
Spán 85 v PBS, aby se dosáhlo konečné koncentrace 33 pg AN1792 * · v 250 μΐ (skupina 6) . Směs se emulgovala 15 až 20-ti násobným průchodem přes dvou komorové ruční zařízení až průměr kapek emulze odpovídá 1,0 μπι, což je průměr standardní latexové částice, když se pozoruje pod mikroskopem. Výsledná suspenze byla opalescentní mléčně bílá. Pro každou sérii injekcí se připravily čerstvé emulze. V případě skupiny 8 se přidal ke skvalenu v koncentraci 50 μς v jedné dávce MPL v 0,2 % triethylaminu a směs detergentu, aby došlo ke vzniku emulze. V případě palmitoylového derivátu (skupina 7) se přidalo 33 μg palmitoyl-NH-Apl-42 v jedné dávce ke skvalenu a vše se míchalo na vortexu. Směs se pak přidala do PBS, aby se dosáhlo konečných koncentrací 5 % skvalen, 0,5 % Tween 80, 0,5 % Spán 85 a směs se emulgovala, jak se uvádí shora v textu.
Aby se připravily dávky prostředků s alum (skupiny 9 a 10) , AN1792 v PBS se přidaly do Alhydrogelu (gel hydroxidu hlinitého, Accurate, Westbury, NY), aby se dosáhlo koncentrace 33 μg (v případě nízké dávky, skupina 9) nebo 300 μς (vysoká dávka, skupina 10) AN1792 v 5 mg alum v konečné dávce o objemu 250 μΐ. Suspenze se slabě míchala po dobu 4 hodin při teplotě místnosti.
3. Měření titrů protilátky
Šest až sedm dní po imunizaci se odebraly morčatům vzorky krve. Začalo se po druhé imunizaci a odebraly se celkem čtyři vzorky krve. Titry protilátek proti Αβ42 se měřily testem ELISA, jak se popisuje v sekci Obecný materiál a metody.
4. Příprava tkáně
Přibližně po 14-ti dnech se usmrtily všechny morčata aplikací CO2. sebrala se cerebrospinální tekutina a mozky se vyňaly a izolovaly se tři oblasti mozku (hippocampus, kůra mozková a mozeček) a použily se ke stanovení koncentrace celkového proteinu Αβ za použití testu ELISA.
« v * v • · • · · · · • · · · · • · · • · · · · · ·
B. Výsledky
1. Protilátkové odezvy
Existuje široké rozmezí potence různých adjuvans,
v případě, že se měří jako protilátkové odezva na imunizaci
AN1792. Jak je zobrazeno na obrázku č. 14, když se AN1792
aplikuje v PBS, po dvou až třech imunizacích se nedetekovala žádná protilátka ani po čtvrté a páté dávce s geometrickým průměrem titrů (GMT) pouze okolo 45 se nedetekovala žádná odezva. Emulze vyvolala po třetí dávce střední titry (GMT
255) , které se udržely i po čtvrté dávce (GMT 301) a snížily se po konečné dávce (GMT 54) . V případě AN1792 vázaný na alum v dávce 300 pg, která je více imunogenní v daném čase než dávka 33 pg, existuje jasná odezva na antigen v závislosti na dávce. Při maximu protilátkové odezvy po čtvrté imunizaci je rozdíl mezi dvěma dávkami 43 % s hodnotou GMT přibližně 1 940 (v případě dávky 33 pg) a 3 400 (v případě dávky 300 pg) .
Protilátkové odezva v případě dávky 33 pg AN1792 plus MPL je velmi podobná protilátkové odezvě vytvořené na skoro desetkrát vyšší dávku antigenu (300 pg) vázaného na alum. Přidání MPL k emulzi snižující potenciál prostředků ve srovnání s potenciálem MPL jako adjuvans je 75 %. Palmitoylovaný derivát AN1792 je zcela neimunogenní, když se aplikoval v PBS a poskytl slabé titry přítomné v emulzi s hodnotou GMT 340 a 105 v případě třetího a čtvrtého odbětu krve. Nejvyšší titry protilátek se vytvořily s Freundovým adjuvans s maximální hodnotou GMT okolo 87 000, hodnota je skoro 30-ti násobně vyšší než hodnota GMT dalších dvou nejsilnějších prostředků, což je MPL a vysoká dávka AN1792/alum.
Nejslibnější adjuvans identifikované v této studii jsou
MPL a alum. Z těchto dvou se více preferuje MPL, protože je nutná desetkrát nižší dávka, aby vznikla stejná protilátkové odezva, jako se získala za použití alum. Odezva se může zvýšit zvýšením dávky antigenu a/nebo adjuvans a optimalizací • · imunizačního rozvrhu. V případě AN1792 je emulze velmi slabé adjuvans a přidání emulze k adjuvans MPL se snižuje intrinsická aktivita samotného MPL.
2. Množství Αβ v mozku
Čtrnáctidenní morčata se uspala, odebrala se cerebrospinální tekutina (CSF) a také se odebraly mozky zvířat ze skupiny, která se imunizovala Freundovým adjuvans (skupina
2) , MPL (skupina 5), alum s vysokou dávkou (300 gg) AN1792 (skupina 10) a z kontrolní skupiny imunizované PBS (skupina
3) . Aby se stanovilo množství peptidu Αβ, izolovala se jedna hemisféra a připravily se homogenáty hippocampalní, kortikální a cerebelární oblasti v 5 M guanidinu. Homogenáty se naředily a kvantifikovaly porovnáním série ředění standardního proteinu Αβ se známou koncentrací v testu ELISA. Množství proteinu Αβ v hippocampusu, v kortexu a v v mozečku bylo velmi podobné ve všech čtyřech skupinách navzdory širokému rozmezí protilátkové odezvy vůči Αβ vyvolané těmito prostředky. Průměrné množství Αβ přibližně 25 NG/g tkáně se měřilo v hippocampusu, 21 ng/g v kůře mozkové a 12 ng/g v mozečku. Přítomnost vysokého titru cirkulujících protilátek vůči Αβ po dobu tří měsíců u některých těchto zvířat nezměnila celkové množství Αβ v jejich mozku. Množství Αβ v CSF bylo také v jednotlivých skupinách docela podobné. Nedostatečně velký účinek imunizace AN1792 na andogenní Αβ indikuje, že imunitní odezva se zaměřuje na patologické formace Αβ.
Příklad 8: Imunitní odezva na různá adjuvans u myší
Pro studii se použily samice myší Swiss Webster ve věku šesti týdnů, přičemž jedna skupina obsahuje 10 až 13 zvířat. Imunizace se aplikovala v den 0, 14, 28, 60, 90 a 20 subkutánně a objem dávky je 200 μΐ. PBS se použil jako pufr pro všechny aplikace. Sedm dní po každé imunizaci se zvířatům odebrala krev, přičemž po druhé dávce se začalo s analýzou titrů protilátek testem ELISA. Léčebný režim každé skupiny se shrnul v tabulce č. 7.
Tabulka č. 7: Návrh experimentu
skupina Na adj uvansb dávka antigen dávka (μα)
1 10 MPL 12,5 ug AN1792 33
2 10 MPL 25 μg AN1792 33
3 10 MPL 50 μg AN1792 33
4 13 MPL 125 μg AN1792 33
5 13 MPL 50 μg AN1792 150
6 13 MPL 50 μg AN1528 33
7 10 PBS AN1792 33
8 10 PBS žádný 33
9 10 emulgov. skvalen 5 % AN1792 33
10 10 míchaný skvalen 5 % AN1792 33
11 10 alum 2 mg AN1792 33
12 13 MPL + alum 50 μg/2 mg AN1792 33
13 10 QS-21 5 hg AN1792 33
14 10 QS-21 10 μg AN1792 33
15 10 QS-21 25 AN1792 AN1792 33
16 13 QS-21 25 AN1792 AN1792 150
17 13 QS-21 25 AN1792 AN1528 33
18 13 QS-21 + MPL 25 μg/50 MO AN1792 33
19 13 QS-21 + alum 25 μg/2 mg AN1792 33
Poznámka:
• · ·
• · a Počet myší v každé skupině na začátku experimentu b Uvedená adjuvans. Pufr v případě všech těchto formulací je PBS. V případě skupiny 8 se neaplikovalo adjuvans ani antigen.
Titry protilátek získané v testu ELISA proti Αβ42 v každé skupině jsou zobrazeny v tabulce č. 8 dále v textu.
• · · • · · · • · · · · · · • · · · · · * ·· · • · · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ·
Tabulka č. 8: Geometrické průměry titrů protilátek
týden odběru krve
léčba skupina 2.9 5.0 8.7 12.9 16.7
1 248 1797 2577 6180 4177
2 598 3114 3984 5287 6878
3 1372 5000 7159 12333 12781
4 1278 20791 14368 20097 25631
5 3288 26242 13229 9315 23742
6 61 2536 2301 1442 4504
7 37 395 484 972 2149
8 25 25 25 25 25
9 25 183 744 952 1823
10 25 89 311 513 817
11 29 708 2618 2165 3666
12 198 1458 1079 612 797
13 38 433 566 1080 626
14 104 541 3247 1609 838
15 212 2630 2472 1224 1496
16 183 2616 6680 2085 1631
17 28 201 375 222 1540
18 31699 15544 23095 6412 9059
19 63 243 554 299 441 I
Tabulka ukazuje, že nejvyšší titry se získaly ve skupině 4, 5 a 18, ve kterých se jako adjuvans použilo 125 pg MPL, 50 pg MPL a QS-21-MPL.
Příklad 9: Terapeutická účinnost různých adju\J*ns
Studium terapeutické účinnosti se provedlo na transgenních myších PDAPP se sadou adjuvans vhodných pro použití u lidí, aby se stanovila jejich schopnost vyvolat imunitní odezvy na Αβ a vyvolat odstranění amyloidních depozitů v mozku zprostředkované imunitním systémem.
180 samic a samců heterozygotních transgenních myší PDAPP myší ve věku 7,5 až 8,5 měsíců se získalo z instituce Charles
River Laboratories. Myši se rozdělily do devíti skupin, které obsahují 15 až 23 zvířat v jedné skupině, aby se imunizovaly
100
s AN1792 nebo AN1528 v kombinaci s různými adjuvans. Zvířata se rozdělila tak, aby zvířata ve skupině sobě co možná nejvíce odpovídala věkem, pohlavím a původem. Adjuvans zahrnují alum, MPL a QS-21, každý je kombinovaný s oběma antigeny a Freundovo adjuvans (FA) se kombinovalo pouze s AN1792. Další skupina se imunizovala s AN1792 vytvořeným v pufru PBS plus thimerosal, které sloužilo jako konzervační činidlo, a neaplikovalo se adjuvans. Devět skupin se imunizovalo samotným PBS a sloužilo jako negativní kontrola.
Píprava agregovaných peptidů Αβ: peptidy lidský Αβ1-40 (AN1528, California Peptides lne., Napa, CA, Lot ME0541) a lidský Αβ1-42 (AN1792, California Peptides lne., Lot ME0439) se čerstvě rozpustily za účelem přípravy každé sady injekcí z lyofílizovaných prášků, které se uchovávaly s desikačním činidlem při teplotě -20 °C. Pro tento účel se do 0,9 ml deionizované vody přidaly dva miligramy peptidu a směs se míchala vortexem, přičemž vznikl relativně jednotný roztok nebo suspenze. AN1528 byl v tomto kroku rozpuštěný na rozdíl od AN1792. Pak se přidal alikvot o objemu 100 μΐ 10 krát koncentrovaného PBS (Ix PBS: 0,15 M NaCl, 0,01 M fosforečnan sodný, pH7,5) a ve stejný okamžik začal AN1528 precipitovat. Suspenze se opět zamíchaly vortexem a inkubovaly se přes noc při teplotě 37 °C a použily se následující den.
Aby se připravily dávky formulací s alum (skupina 1 a 5) , peptid Αβ v PBS se přidaly jako alhydrogel (dvou procentní gel hydroxidu hlinitého, Sargeant, lne., Clifton, NJ), aby se dosáhlo koncentrací 100 μg peptidu Αβ na 1 mg alum. Ke konečnému objemu dávky se přidal 10 x koncentrovaný PBS a konečný objem dávky byl 200 μΐ v Ix koncentrovaném PBS. Před injekcí se pak suspenze jemně míchala přibližně po dobu 4 hodiny při teplotě místnosti.
Aby se připravily dávky prostředku v případě MPL (skupina a 6) , lyofilizovaný prášek (Ribi ImmunoChem Research, lne., • ·
101
Hamilton, MT, Lot 67039-E0896B) se přidal k 0,2 % vodnému roztoku triethylaminu, aby konečná koncentrace byla 1 mg/ml a zamíchala se na vortexu. Směs se zahřála na teplotu 65 až 70 °C po dobu 30 vteřin, aby vznikla slabě opalescentní jednotná suspenze micel. Roztok se uchovával při teplotě 4 °C. V případě každé sady injekcí se bezprostředně před použitím smíchalo v borokřemičité zkumavce pro jednu dávku 100 μg peptidu v 50 μΐ PBS, 50 μς MPL (50 μΐ) a 100 μΐ PBS.
Aby se připravily dávky prostředků s QS-21 (skupina 3 a 7) lyofilizovaný prášek (Aquila, Framingham, MA, Lot A7018R) se přidal do PBS, pH6,6 až 6,7, aby konečná koncentrace byla 1 mg/ml a vše se míchalo na vortexu. Roztok se uchovával při teplotě -20 °C. V případě každé sady injekcí se pro jednu dávku bezprostředně před použitím smíchalo 100 μρ peptidu v 50 μΐ PBS, 25 μς QS-21 v 25 μΐ PBS a 125 μΐ PBS.
Aby se připravily dávky prostředků s Freundovým adjuvans (skupina 4), 100 μg AN1792 ve 200 μΐ PBS se emulgovalo v objemu 1:1 (objem:objem) s úplným Freundovým adjuvans (CFA) v konečném objemu 400 μΐ v případě první imunizace. V případě následných imunizací se antigen podobně emulgoval s neúplným Freudnovým adjuvans (IFA). V případě prostředků, které obsahují adjuvans alum, MPL nebo QS-21, 100 μς AN1792 nebo AN1528 v jedné dávce se kombinovalo s alum (1 mg v jedné dávce) nebo MPL (50 μς v jedné dávce) nebo QS-21 (25 μg v jedné dávce) v konečném objemu 200 μΐ PBS a tyto dávky se zavedly subkutánní inokulaci v oblasti zad mezi lopatky. V případě skupiny, které se aplikovalo FA, a v případě první imunizace se 100 μg AN1792 emulgovalo v objemu 1:1 (objem:objem) s úplným Freundovým adjuvans (CFA), aby konečný objem byl 400 μΐ a injekce se zavedla intraperitoneálně. Následujících pět zesilovacích dávek obsahuje stejné množství imunogenu v neúplném Freundově adjuvans (IFA). V případě skupiny, které se aplikuje AN1792 bez adjuvans, se 10 μg AN1792 kombinovalo s
102 μς thimerosalu v konečném objemu 50 μΐ PBS a zavedlo se subkutánně. Deváté kontrolní skupině se subkutánně aplikovalo pouze 200 μΐ PBS. Imunizace se provedla ve dvoutýdenních intervalech v případě prvních tří dávek, pak jednou měsíčně v den 0, 16, 28, 56, 85 a 112. Šestý a sedmý den po každé imunizaci se zvířatům odebraly vzorky krve, aby se mohly stanovit titry protilátek. S odběry se začalo po druhé dávce. Zvířata se usmrtila přibližně jeden týden po konečné dávce. Množství peptidu Αβ a APP v mozku se měřilo testem ELISA a imunohistochemickým hodnocením přítomnosti amyloidních plaků v sekcích mozku. Navíc titry protilátek specifické pro Αβ a také se stanovily proliferativní a cytokinové odezvy závislé na Αβ.
Tabulka č. 9 ukazuje, že nejvyšší titry protilátek proti Αβ1-42 vyvolaly FA a AN1792, titry, které tvoří píky po čtvrté imunizaci (pík GMT: 75 386) a po konečné šesté imunizaci hodnota klesají na 59 %. Maximální průměrná hodnota titru vyvolaná MPL pomocí AN1792 byla o 62 % nižší než se vytvořila pomoci FA (maximální hodnota GMT je 28 867) a také se dosáhla na začátku ímunizačního schématu po třech dávkách. Po šesté imunizaci následuje znížení maximálních hodnot o 28 %.
Maximální prměrná hodnota titru vytvořená QS-21 kombinovaná s AN1792 (GMT je 1 511) byla přibližně 5 krát nižší než se získala s MPL. Navíc kinetiky odezvy byly pomalejší, protože byla nutná další imunizace, aby se dosáhlo maximální odezvy. Titry vytvořené alum vázaným na AN1792 byly výrazně vyšší než titry, které se získaly pomocí QS-21 a kinetické odezvy byly rychlejší. V případě AN1792 zavedených v PBS s thímerosalem, frekvence a velikost titrů byla značně vyšší než než titry v případě samotného PBS. Maximální titry vytvořené s MPL a AN1528 (maximální GMT 3099) byly přibližně 9 krát nižší než titry vytvořené AN1792. Alum vázaný na AN1528 byl velmi málo imunogenní s nízkými titry vytvořenými pouze u některých
103 « fcfc ♦ fcfc fcfc · ♦ fcfcfc fcfc · fc · · fcfc • fcfc · fcfcfcfc • fcfcfcfc · fcfcfcfc · • · fcfc fcfcfc fcfcfc fcfc fcfcfc fcfcfcfc fcfc fcfcfc zvířat. Maximální titry vytvořené s MPL a AN1528 (maximální hodnota GMT je 3099) byly přibližně 9 krát nižší než titry vytvořené AN1792. Alum vázaný na AN1528 byl velmi málo imunigenní a pouze u některých zvířat došlo k vytvoření nízkého titru. Žádné protilátkové odezvy nebyly pozorovány u kontrolních zvířat imunizovaných samotným PBS.
Tabulka č. 9: Geometický průměr hodnot titrů protilátek3 týden odběru krve
• léčba 3,3 5j0 9,0 13^0 17,0
Alum/ 102 1,081 2,366 1,083 572
AN1792 (12/21)b (17/20) (21/21) (19/21) (18/21)
MPL/ 6241 28,867 1,1242 5,665 8,204
ANI 792 (21/21) (21/21) (21/21) (20/20) (20/20)
QS-21/ 30 227 327 1,511 1,188
ANI 792 (1/20) (10/19) (10/19) (17/18) (14/18)
CFA/ 10,076 61,279 75,386 41,628 30,574
ANI 792 (15/15) (15/15) (15/15) (15/15) (15/15)
Alum/ 25 33 39 37 31
ANI 528 (0/21) (1/21) (3/20) (1/20) (2/20)
MPL/ 184 2,591 1,653 1,156 3,099
ANI 528 (15/21) (20/21) (21/21) (20/20) (20/20)
QS-21/ 29 221 51 820 2,994
ANI 528 (1/22) (13/22) (4/22) (20/22) (21/22)
PBS plus 25 33 39 37 47
Thimerosal (0/16) (2/16) (4/16) (3/16) (4/16)
PBS 25 25 25 25 25
1 (0/16) (0/16) (0/15) (0/12) (0/16)
• » « 9
104
999 9999
Poznámka :
aGeometrický průměr titrů protilátek měřený proti Αβ1-42 bPočet zvířat ve skupině, kteří vykazují odezvu.
Výsledky léčby AN1792 nebo AN1528 s různými adjuvans nebo s thimerosalem u kortikálního amyloidního uzle u dvanáct měsíců starých myší se stanovené testem ELISA se zobrazily na obrázku č. 15. U kontrolních myší PDAPP ve věku 12-ti měsíců imunizovaných PBS se průměrná hodnota celkového Αβ v kortexu byla 1 817 ng/g. Znatelně redukované množství Αβ se pozorovalo u myší ošetřených AN1792 plus CFA/IFA, AN1792 plus alum, AN1792 plus MPL a QS-21 plus AN1792. S Αβ nížení dosáhlo statistické významnosti (p je menší než 0,05) pouze v případě AN1792 plus CFA/IFA. Jak je zobrazeno v příkladu I a II, účinky imunizace redukujícího množství Αβ je v podstatě vyšší u myší 15 a 18 měsíců starých. Očekává se, že kompozice AN1792 plus alum, AN17 Αβ92 plus MPL a AN1792 plus QS-21 dosáhnou statistické významnosti při léčbě starších myší. Naopak AN1792 plus konzervační činidlo thimerosal vykazují průměrné množství peptidu Αβ stejné jako se vyskytuje u myší ošetřených PBS. Podobné výsledky se získaly, když se porovnávalo kortikální množství Αβ42. Průměrné množství Αβ42 u kontrolních zvířat imunizovaných PBS byla 1 624 ng/g. U myší ošetřených AN1792 plus CFA/IFA, AN1792 plus alum, AN1792 plus MPL a AN1792 plus QS-21 se pozorovala snížená průměrná hodnota množství 403, 1149, 620 a 714. Průměrné množství u myší ošetřených AN1792 a thimerosalem bylo 1 619 ng/g Αβ42.
Další studie účinnosti terapie s adjuvans/imunogen se provedla u samic a samců heterozygotních transgenních myší PDAPP ve věku 9 až 10,5 měsíce. Trvání studie bylo 25 týdnů a provedla se s 29 až 40 zvířaty v jedné léčené skupině. Zvířata nakonec dosáhla věku 15 až 16,5 měsíce. Léčené skupiny se identifikovaly v tabulce 10 dále v textu.
·» ·
adj uvans imunogen ředící pufr aplikace
skupina 1 MPL-SE AN1792-GCS (75 pg) PBS SC (250 pl)
skupina 2 ISA 51 AN1792-GCS (75 pg) PBS IP (400 pl)
skupina 3 QS21 AN1792-GCS (75 pg) PBS SC (250 pl)
skupina 4 QS21 zkrácený AN1792-GCS (75 pg) PBS SC (250 pl)
skupina 5 PBS SC (250 pl)
Tabulka č. 10 zkratky: MAP -multiantigenní peptid, TT -epitop T-buňky toxoidu tetanu (830 až 840), SQ - subkutánní, IP intraperitoneální, PBS - fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem, ISA-51 je běžně dostupné adjuvans podobné IFA, GCS je formulace glycin/citrát/sacharóza, MPL-SE je MPL ve stabilizované emulzi voda olej.
Rozvrh imunizace byl identický pro všechny léčené skupiny s výjimkou skupiny 3. Myším se zavedla injekce v týdnu 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24 a vzorky krve se odebraly v týdnu 3, 5, 9, 13, 17, 21 a 25. Skupinám 1,2 se aplikovalo osm injekcí a skupině 3 se aplikovaly 4 injekce během období 25 týdnů. Skupině 4 vykazující zkrácený rozvrh imunizace QS21/AN1792 se aplikovala injekce pouze v týdnu 0, 2, 4 a 8. Této skupině se neaplikovala injekce po zbytek studie, ačkoli se vzorky krve odebíraly podle stejného plánu jako ve zbytku studie, aby se sledoval pokles titrů. Skupina 3 a 5 charakterizovaná jako QS21/AN1792 a PBS slouží jako pozitivní a negativní kontroly této studie.
Titry se stanovily testem pro stanovení titru proti protilátkám Αβ.
Skupina 1 je skupina charakterizovaná jako MPL-SE/AN1792 s maximální hodnotou geometrického průměru titrů (GMT) 17 100 v deváte týdnu, která se snížila na hodnotu GMT 10 000 v 25.
106 týdnu. Na počátku titry MPL-SE rostly vyšší rychlostí než u kontrolní skupiny charakterizované QS21/AN1792 (skupina 4).
Skupina 2 je skupina charakterizovaná jako ISA 51/AN1792, která během studie produkuje vysoké titry, kdy hodnota GMT je nad 100 000 po dobu alespoň posledních devíti týdnů studie.
Skupina 3 je charakterizovaná jako kontrolní skupina QS21/AN1792, která dosáhla maximálního titru v 17-ti týdnech s maximální hodnotou GMT 16 000. Titr pak v dalších 8 týdnech poklesl na hodnotu GMT 8 700. U jednoho zvířete v této skupině se titr vůbec nezvýšil v průběhu celého experimentu.
Skupina 4 charakterizovaná jako QS21/AN1792 se zkráceným programem imunizace dosáhla maximální hodnoty titru 7 300 ve 13. týdnu, což je pět týdnů po poslední injekci. Hodnota titru se pak snížila na hodnotu GMT 2 100 (25-týden) . V kontrolní skupině se u jednoho zvířete nevytvořil detekovatelný titr protilátek, zatímco jiné zvíře ztratilo všechny titry na konci období poklesu periody.
Skupina 5 je skupina imunizovaná samotným PBS a nevykazovala žádné titry protilátek.
Aby bylo možné hodnotit množství kortikálního Αβ, měřilo se celkové množství Αβ a Αβ1-42 testem ELISA. Vyňala se jedna mozková hemisféra za účelem získání kortikální, hippocampální a cerebelární tkáně, pak následovala homogenizace v pufru guanidinu a v mozku se testovalo množství Αβ. Množství kortikálního celkového Αβ a Αβ42 je podobné. Za účelem stanovení významnosti mezi skupinami s hodnotou p= 0,05 indikující podstatnou změnu v množství Αβ se provedla statistická analýza podle Mann-Whitney.
Všechny léčené skupiny podstatně snížily celkové množství Αβ ve srovnání s kontrolní skupinou PBS (tabulka č. 11). Skupina MPL-SE/AN1792 ukázala největší změnu v množství Αβ a je podstatně lepší než v jiných léčených skupinách. Skupina se zkrácenou imunizací QS21/AN1792 byla podobná ve všech změnách
107 • · · · ·· ·· · •· · · ··· · · · · · ··· · · · · · • · · · · · · · · · · • · · · · · · ··· 4 9 4 9 9 9 4 4 4 9 4 9 9 9
Αβ v kontrolní skupině imunizované QS21, kterým se aplikovalo všech osm injekcí. Množství Αβ ve skupině ISA 51/AN1792 byly podobně sníženy ve srovnání se skupinou CFA/IFA:MAP (Αβι_7) ·
Tabulka 11: množství kortikálního Αβ
PBS MPL-SE ISA QS-21 QS-21 (4)
průměr (ng/g tkáně) 7 335 1 236 3 026 2 389 2 996
rozmezí (ng/g tkáně) 550-18 358 70-3 977 23-9 777 210-11 167 24-16 834
hodnota p — <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001
N 38 29 36 34 40
Závěrem, adjuvans MPL-SE, ISA-51 a QS21 kombinovaná s AN1792 jsou účinná při vyvolání imunitní odezvy a podstatně oddalují ukládání Αβ v kortexu.
Příklad 10: Analýza toxicity
Shromáždily se tkáně za účelem histopatologického testu při ukončení studií popsaných v příkladu 2, 3 a 7. Navíc testy hematologie a klinické chemie se provedly v konečných vzorcích krve z příkladu 3 a 7. Hodnotila se většina hlavních orgánů, které zahrnují mozek, plíce, lymfatické žlázy, gastrointestinální trakt, játra, ledviny, nadledvinky a pohlavní žlázy. Ačkoli se při studiu zvířat pozorovaly sporadické léze, neexistovaly zřejmé rozdíly ani v tkáni ani ve vážnosti lézí u zvířat ošetřených AN1792 a u zvířat, která nebyla ošetřena. U zvířat imunizovaných AN1528 se nezjistily žádné histopatologické léze ve srovnání se zvířaty ošetřenými PBS a neléčenými. Mezi skupinami, kterým se aplikovalo adjuvans a zvířaty ošetřenými PBS popsanými v příkladu 7
108 ·· · ·· ·· « · · · ··· · · * 11 111 9 119 1 • ···· · 9111 1 • · · · · · · ··· ·· ··· 1911 11 111 neexistují žádný rozdíly v profilu klinické chemie. Ačkoli existuje podstatné zvýšení několika hematologických parametrů u zvířat ošetřených AN1792 a Freundovým adjuvans, jak se popisuje v příkladu 7, ve srovnání se zvířaty ošetřenými PBS, tyto typy účinků se očekávaly od léčby Freundovým adjuvans a dále se u léčby AN1792 nezaznamenaly žádné jiné nežádoucí účinky. Ačkoli toto vyšetření nespadá do toxikologického hodnocení, patologie mozku myšší PDAPP se testovaly jako část konečné účinnosti. V žádné jiné studii se nezaznamenaly žádný nežádoucí účinek spojený s morfologií mozku. Tyto výsledky indikují, že léčba AN1792 je dobře tolerována a je v podstatě bez vedlejších účinků.
Příklad 11: Léčba protilátkami proti Αβ
Tyto příklady testují kapacitu různých monoklonálních a polyklonálních protilátek proti Αβ inhibovat akumulaci Αβ v mozku heterozygotních transgenních myší.
1. Návrh studie
Šedesát samců a samic heterozygotních transgenních myší PDAPP ve věku 8,5 až 10,5 měsíců se získalo v instituci Charles River Laboratory. Myši se rozdělily do šesti skupin, aby se ošetřily protilátkami určenými proti Αβ. Zvířata se rozdělila do skupin tak, aby co nejvíce odpovídala pohlavím, věkem, původem a zdrojem. Jak je uvedeno v tabulce č. 10 protilátky zahrnovaly čtyři myší monoklonální protilátky specifické pro Αβ, 2H3 (určené proti zbytkům 1 až 12 Αβ) , 10D5 (určené proti zbytkům 1 až 16 Αβ) , 266 (určené proti zbytkům 13-28 Αβ a a váží se na monomérní, ale ne agregovaný AN1792), 21F12 (určený proti zbytkům 33-42 Αβ). Pátá skupina se ošetřila frakcí polyklonálních protilátek specifických pro Αβ (které vznikly imunizací s agregovaným AN1792). Negativní kontrolní skupině se aplikovalo ředidlo, PBS bez protilátek.
109
Monoklonální protilátky se zavedly injekcí v dávce přibližně 10 mg/kg (předpokládá se, že myši vážily 50 g) . Injekce se aplikovaly intraperitoneálně v průměru každých sedm dní, aby se udržovaly titry protilátek proti Αβ na hodnotě kolem 1 000. Ačkoli v případě monoklonální protilátky 266 se naměřily nižší titry, protože se neváže dobře na agregovaný AN1792, který se použil v testu jako značený antigen, v případě uvedené skupiny se udržoval stejný dávkovači režim. Skupině se v prvních třech týdnech přestala aplikovat monoklonální protilátka 2H3, protože se in vivo protilátka velmi rychle odstranila. Před každou dávkou určenou pro měření protilátek se zvířatům odebral vzorek krve. Léčba pokračovala po dobu šesti měsíců, celkem po dobu 196 dní. Zvířata se usmrtila jeden týden po konečné dávce.
Tabulka č. 12: návrh experimentu
léčená skupina Na použitá protilátka specifita protilátek isotyp protilátky
1 9 žádné (samotné PBS) NAb ΝΑ
2 10 polyklonální Αβ1-42 smíšený
3 0 mAbc2H3 Αβ1-12 IgGl
4 8 mAb 10D5 Αβ1-16 IgGl
5 6 mAb 266 Αβ13-28 IgGl
6 8 mAb 21F12 Αβ33-42 IgG2a
Poznámka:
a. Počet myší ve skupině na konci experimentu. Všechny skupiny na začátku experimentu zahrnovaly 10 zvířat.
b. Zkratka NA znamená, že se protilátka neaplikovala.
c. Zkratak mAb znamená monoklonální protilátka.
2. Materiál a metody
a. Příprava protilátek
110
0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 · · · 0 0 0 ·«·
000 0 0000
0000 0 000 0 0
0 0 0 0 0 0
000 00 «00 0000 00 000
Z krve ze dvou skupin zvířat se připravily polyklonální protilátky proti Αβ. První skupina zahrnuje 100 samic myší Swiss Webster, ketré jsou 6 až 8 týdnů staré. Imunizovaly se v den 0, 15 a 29 se 100 μς AN1792 kombinovaným s CFA/IFA. Čtyři injekce se aplikovaly v den 36 s poloviční dávkou AN1792. Zvířata se nechala vykrvácet v den 42, připravilo se sérum a séra se smíchala a získal se celkový objem 64 ml. Druhá skupina obsahovala 24 samic myší izogeních s myšíma PDAPP, které nejsou v případě lidského genu APP transgenní a jsou ve věku 6 až 9 týdnů. Myši se imunizovaly v den 0, 14, 28 a 56
100 gg AN1792 kombinovaným s CFA/IFA. Tyto zvířata se nechala také vykrvácet v den 63, připravily se séra a spojila se, přičemž celkový objem je 14 ml. Dvě sady sér se spojily. Protilátková frakce se čistila ve dvou krocích srážení s 50 % saturovaným síranem amonným. Konečná sraženina se dialyzovala proti PBS a testovala se přítomnost endotoxinu. Množství endotoxinu bylo nižší než 1 EU/mg.
Monklonální protilátky proti Αβ se připravily z tekutiny ascitů. Z tekutiny se nejdříve odstranily lipidy tak, že se k ledem chlazené tekutině přidal koncentrovaný dextransulfát sodný, vše se promíchalo na ledu až se dosáhlo konečné koncentrace 0,238 %. Pak se přidal za stálého míchání koncentrovaný CaClž až se dosáhlo konečné koncentrace 64 mM. Tento roztok se centrifugoval při 10 000 x g a odstranil se pelet. Supernatant se míchal na ledu se stejným objemem saturovaného síranu amonného přidávaného po kapkách. Roztok se opět centrifugoval při 10 000 x g a odstranil se supernatant. Pelet se resuspendoval a dialyzoval se proti 20 mM Tris-HCl, 0,4 M NaCl, pH7,5. Tato frakce se aplikovala na kolonu FPLC Sepharose Q od firmy Pharmacia a eluovala se reverzním gradientem 0,4 M až 0,275 M NACI v 20 mM Tris-HCl, pH7,5.
Maximum protilátek se identifikoval absorbancí při vlnové délce 280 nm a vhodné frakce se slily. Přípravek čištěných protilátek se charakterizoval měřením koncentrace proteinu za
111
použití metody BCA a stanovením čistoty za použití SDS-PAGE. U protlátek se také testovala přítomnost endotoxinu. Množství endotoxinu bylo nižší než 1 EU/mg. Titry s hodnotou nižší než 100 byly označeny jako titr s hodnotou 25.
3. Množství Αβ a APP v mozku
Po přibližně šesti měsících léčby různými přípravky protilátek proti Αβ se izoloval mozek ze zvířat po perfúzi fyziologickým roztokem. Jedna hemisféra se připravila pro imunohistochemickou analýzu a druhé se použila pro kvantifikaci množství Αβ a APP. Za účelem měření koncentrací různých forem amyloidního peptidů beta a amyloidního prekurzorového proteinu (APP) se izolovala hemisféra a připravily se homogenáty hippocampální, kortikální a cerebelární oblasti v 5 M guanidinu. Tyto homogenáty se naředily a množství amyloidního peptidů nebo APP se kvantifikovalo porovnáním sérií ředění standardů peptidů Αβ nebo APP známých koncentrací ve formátu ELISA.
Celkové množství Αβ a Αβ1-42 se stanovilo v homogenátech v kortexu a hippocampusu testem ELISA a množství celkového Αβ v mozečku je zobrazeno v tabulce č. 11, 12 a 13. Průměrná koncentrace celkového Αβ v případě kontrolní skupiny inokulované s PBS byla 3,6 násobně vyšší v hippocampusu než v mozkové kůře (průměr je 63 389 ng/g hippocampální tkáně ve srovnání s 17 818 ng/g v případě mozkové kůry). Průměrné množství v mozečku kontrolní skupiny (30,6 ng/g tkáně) bylo víc jak 2 000 krát nižší než v hippocampusu. Tato množství jsou podobná množství, které jsme dříve zmiňovaly v případě heterozygotních transgenních myší PDAPP tohoto věku (JohnsonWood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)).
V případě mozkové kůry jedna léčená skupina vykazovala průměrné množství Αβ, které se podstatně liší od množství kontrolní skupiny (hodnota p je menší než 0,05), těmto
112
zvířatům se aplikovaly polyklonální protilátky proti Αβ, jak se uvádí v tabulce č. 13. Průměrné množství Αβ1-42 se redukovalo na 65 % ve srovnání s kontrolou pro tuto léčenou skupinu. Průměrné množství Αβ1-42 bylo také podstatně sníženo o 55 % ve srovnání s kontrolou v jedné další léčené skupině. Těmto zvířatům se aplikovala dávka s mAb 10D5 (hodnota p je rovna 0,0433) .
Tabulka č. 13: mozková kůra
CN «šT CQ. rf hodnota ELISA CO co Γ Lf) +1 r—) CN CO CN τ—t Γ sr CO CO +1 tr Lf) tr «—l lf) co co +1 co cn co t~4 CN cn co +1 cn oo sr Γ 11005±6324
>0) CL CQ. rf > 0 Λ4 i—1 <L> U hodnota ELISA co in «sr r- -H o Lf) i—1 ΙΏ i—1 CN cn +1 CN «—1 cn m cn CN cn co +1 Lf) cn co cn co cn CN cn +1 o CN cn CN CO O r+1 i—1 CO tr CN x—1
střední hodnoty CN tr CQ. rf 03 G ><D g N o*> rf s Lf) co 1 Lf) lf) 1 cn co 1 CN t
u řů (Ú Ρ O G Ό 0 ,G rf 53 r—1 > o o o co co o o Lf) Lf) CN r—1 O CO o o Γ o
43 4-> x. 0 rf G ω Ό K O G1 λ ω CN O co co t—t CN cn co tr T rH CN CD r—( CO •tb 00 CO r~ lf) CO i—1
CQ. rf > O Λ4 t--1 4) υ OJ G >0) g N oV> rf z u~> co 1 CD lf) 1 cn tr l lf) 1-1 1
u cu 43 +J 0 c T3 0 JG o rf S Lf) uo o o o cn t—1 O i—! O Lf) Lf) CN 1—1 o OO cn co CN o
43 4-> Λ O rf G W T3 H 0 Gl xj ω 00 rd CO Γi—t o co t—1 co lf) i—1 cn r- «=J* «—l cn co Lf) i—4 lf) r-4
cn o f—1 00 co co
léčená skupina co PQ l· polyklonální j protilátky proti Αβ42 lf) Q o r- § co co CN Λ CN t—1 tu t—1 CN 1
b
-P
G (V g
•H
P
0) a
x <D
H
o o
G G
o '(0
A! >
o
(0 a:
G •H
<1> t—1
><D G CL
G +J b
•H •H Φ
CL 4b G
b S b
A< 'b a:
W G G i—1
G Φ >1
<D b g jg
> S b o
G to
-P Φ N o
b 1—1
>P >ω TO Ή
G o G
> 'fO CL to
N a: b P
•P b AJ b
+J N -P to
ω b> '>, b G
>υ i—1 P b
o tb b a: -P
CL G G N «
b O υ TO Φ
114
V hippocamusu průměr procentuálního snížení celkového množství Αβ spojeného s léčbou s monoklonálních protilátek proti Αβ (50 %, p=0,0055) nebylo tak velké, jako hodnota, která se naměřila v kortexu (65 %) (Tabulka č. 14). Absolutní hodnota redukce však byla skoro 3 krát vyšší v hippocampusu než v kůře mozkové (31 683 ng/g v hippocampusu versus 11 658 ng/g tkáně v kůře mozkové) . Když se měří množství jako více amyloidogenní forma Αβ, Αβ1-42, spíše než jako celkové množství Αβ snížení dosažené polyklonální protilátkou bylo podstatné (p=0,0025). Střední hodnoty ve skupinách ošetřených mAb 10D5 a 266 se redukovaly na 33 % a 21 %.
LO
Tabulka č. 14: Hippocampus >1
4-> Oj i—'I •H 4-> O
CL • ·» <« · « • · <
« ··· • « • · · · ·
-P £
Φ £
-H β
Φ cr x
<L) •H
o o
α β
o 'fd
λ: >
o
(d rá
c -H
ω i—1
><D β cr
β +j fd
•H -H ω
cr Λ β
o s β
r; 'Π3 λ:
cn c β •—1
β Q) ί>1
Φ β & Λ
> £ ω ο
β Ό
+-> Φ Ν ο
β 1-f
>0 >0) Ό < Ή
β O ζ β
> 'fO cr Ό
N r: rd β
4-> β Λί β
rd +J N -μ Ό
r: ω Cn 'ί>Ί fd β
É >o \ <—t β fd
'(0 0 Cn β λ: -Ρ
β cr β β Ν ω
N
O Og β X3 o Ό <υ
116 • · ·
Celkové množství Αβ se také měřilo v mozečku (Tabulka č. 15). Tyto skupiny se imunizovaly polyklonální protilátkou proti Αβ a protilátkou 266, která vykazuje podstatnou redukci celkového množství Αβ (43 % a 46 %, hodnota p je 0,0033 respektive 0,0184) a dále, že skupina ošetřená protilátkou 10D5 vykazuje podstatnou redukci (29 %, hodnota p=0,0675).
Tabulka č. 15: mozeček
léčená skupina N střední hodnoty průměry
celkový Αβ celkový Αβ
hodnota ELXSAb hodnota Pc % změna hodnota ELISA
PBS 9 30,64 NAd NA 40,00+131,89c
polyklonální protilátky proti Αβ42 10 17,61 0,0033 -43 18,15+4,36
mAb 10D5 8 21,68 0,0675 -29 27,29+19,43
mAb 266 6 16, 59 0,0184 -46 19,59+6,59
mAb 21F12 8 29,80 >0,9999 -3 32,88+9,90
Poznámka:
a. Počet zvířat ve skupině na konci experimentu
b. ng/g tkáně
c. nalýza podle Mann Whitney
d. zkratka NA znamená neaplikováno
e. standardní odchylka
Koncentrace APP v mozkové kůře a v mozečcích, které pocházejí z myší ošetřených protilákou nebo PBS se také stanovila testem ELISA. Využily se dva různé testy APP. První test označený ΑΡΡ-α/FL rozeznává APP-α (a, vylučovaná forma APP, která se štěpila v sekvenci Αβ) a formy plné délky (FL) APP, zatímco druhý test rozeznává pouze APP-α. Na rozdíl od poklesu množství Αβ spojené s léčbou u subsady léčených skupin, množství APP se nezměnilo u všech ošetřených zvířat ve srovnání s kontrolními zvířaty. Tyto výsledky indikují, že
117 • 4 · · 4 · 4 444 ·4 4·· 4444 44 4·4 imunizace s protilátkami proti Αβ snižují množství Αβ, aniž se snižuje množství APP.
Množství Αβ v mozkové tkáni, hippocampusu a v mozečku zvířat ošetřených polyklonální protilátkou vytvořenou proti AN1792 se podstatně redukovalo. Menší rozsah monoklonálních protilátek proti aminoterminální oblasti Αβ1-42, specificky proti aminokyselinám 1 až 16 a 13 až 28 také vykazuje podstané léčebné účinky.
4. Histochemické analýzy
Morfologie Αβ-imunoreaktivních plaků v podsadách mozků z myší, které jsou zahrnuty ve skupinách ošetřených PBS, polyklonální protilátkou Αβ42, 21F12, 266 a 10D5 se kvalitativně porovnávalo s morfologií předchozích studií, ve kterých se používají standardní imunizační postupy s Αβ42. Redukce amyloidní usazeniny, morfologie erodovaných plaků a imunoreaktivita Αβ spojená s buňkou úzce mění účinky způsobené postupem standardní imunizace. Tato pozorování podporují výsledky testů ELISA, kdy se aplikací protilátky Αβ42 dosáhlo podstatné redukce jak v množství celkového Αβ tak Αβ42.
V podobném kvalitativním hodnocení se ukázalo, že se snížil počet a výskyt amyloidních plaků ve skupině myší imunizovaných 10D5, přičemž existuje důkaz, že imunoreaktivita Αβ je spojená s buňkou. Vzhledem ke kontrolním léčeným zvířatům frakce polyklonálního Ig proti Αβ a jedna z monoklonálních protilátek (10D5) redukovala uzle plaků o 93 % respektive o 81 % (hodnota p je menší než 0,005). Ukázalo se, že protilátky 21F12 mají relativně malý účinek na plakové uzle. Mikrografy mozku po léčbě pabAβl-42 vykazují difúzní usazeniny a nepřítomnost řady větších kompaktních plaků ve skupině myší ošetřených pabAβl-42 ve srovnání s kontrolními ošetřenými zvířaty.
118 ••0 0 0· ·0 0 0 0 0 0 · · · « · · · · • 00 0 0 « 0 0
000 · 0 00·« 0 0 0 0 0 · 0 0 ··· ·· «00 00·· ·· ···
5. Měření titrů protilátek
Podsadě tří náhodně vybraných myší z každé skupiny se před každou intraperitoneální inokulaci odebral vzorek krve. Celkem se získalo 30 vzorků krve. Titry protilátek se měřily jako protilátky vázající se na Αβ1-42 za použití sendvičového testu ELISA s plastovými destičkami s velkým množstvím prohlubní potaženými Αβ1-42, jak se popisuje v sekcí Obecné materiály a metody. Průměrné titry pro každý vzorek krve jsou zobrazeny na obrázku č. 16 až 18 v případě polyklonální protilátky a monoklonální protilátky 10D5 a 21F12. Průměrné hodnoty titrů v tomto čase jsou přibližně 1 000 v případě polyklonálního protilátkového přípravku a byly slabě nižší než je tato hodnota v případě zvířat ošetřených 10D5 a 21F12.
6. Lymfoproliferativní odezvy
Lymfoproliferace závislá na Αβ se stanovila za použití buněk sleziny, které se shromáždily osm dní po konečné infúzi protilátek. Čerstvě shromážděné buňky v počtu 105 v prohlubni se kultivovaly po dobu 5 dní v přítomnosti Αβ1-40 v koncentraci 5 μΜ za účelem stimulace. Jako pozitivní kontrola se další buňky kultivovaly s mitogenem T buňky PHA a jako negativní kontrola se buňky kultivovaly samotné bez přidání peptidu.
Splenocyty z dospělých myší PDAPP imunizovaných různými protilátkami proti Αβ se stimulovaly in vitro AN1792 a stanovila se proliferativní a cytokinová odezva. Účelem těchto testů je stanovit, zda pasivní imunizace umožnila prezentaci antigenu a tak aktivaci odezvy T buňky specifické pro AN1792. U myší pasivně imunizovaných protilátkami proti Αβ se neprojevila žádná proliferativní nebo cytokinová odezva specifická pro AN1792.
Příklad 12: Další studie pasivní imunizace
119 • ·· »·· ·· · ··· · · · · · · · · · ··· * ···· • ··· ·> · 9 · · · · • · 9 9 9 9 9
999 99 999 9999 99 999
Při druhé studii se opakovala léčba protilátkou 10D5 a testovaly se dvě další protilátky proti Αβ a to monoklonální protilátka 3D6 (Αβι_5) a 16C11 (Αβ33_42) . Kontrolním skupinám se aplikovalo buď PBS nebo protilátka TM2a. Myši byly starší ve srovnání s předchozí studií (11,5 až 12 měsíců staré heterozygotní myši), jinak experiment proběhl stejným způsobem. Po šesti měsících léčby plakové uzle redukované protilátkou 10D5 byly větší než 80 % ve srovnání s kontrolami, které se ošetřily PBS nebo protilátkou TM2a (hodnota p je 0,003). Jedna z dalších protilátek proti Αβ protilátka 3D6 byla stejně účinná, přičemž uzle redukovala z 86 % (hodnota p=0,003). Podobná zjištění se získala měřením testem ELISA s Αβ42. Tyto výsledky demonstrují, že protilátková odezva proti peptidů Αβ v nepřítomnosti imunity T buňky je dostatečná pro snížení amyloidního depozitu u myší PDAPP, ale že ne všechny protilátky proti Αβ jsou účinné. Zvláště účinné jsou protilátky proti epitopům, které obsahují aminokyseliny 1 až 5 nebo 3 až 7 Αβ.
Ukázalo se, že pasivně aplikované protilátky proti Αβ redukovaly rozsah plaků v myším modelu Alzheimerovy nemoci. Když se udržuje v séru nízká koncentrace protilátek (25 až 70 pg/ml), protilátky mají přístup k CNS v množství dostatečném pro dekoraci beta-amyloidních plaků. Vstup protilátky do CNS není způsoben abnormálním přestupem bariéry krev-mozek, protože nedošlo ke zvýšení vaskulární permeability, jak změřil Evans Blue u myší PDAPP. Navíc koncentrace protilátky v mozkovém parenchymu dospělých myší PDAPP byl stejný jako v netransgenních myších, což reprezentuje 0,1 % koncentraci protilátek v séru (s ohledem na isotyp).
Příklad 13: Sledování navázání protilátek
Aby se stanovilo, zda protilátky proti Αβ by mohly působit přímo v CNS, se u mozků získaných z myší perfúzovaných ·
• ·
120 • « · * • 9» na konci příkladu XII, aplikovaných protilátek.
fyziologickým roztokem testovala přítomnost popsané periférně
Nefixované kryostatické mozkové sekce se vystavily působení fluorescenčního činidla určenému proti myšímu imunoglobulinu (kozí anti-myší IgG-Cy3). Plaky v mozcích skupiny myší ošetřených protilátkou 10D5 a 3D6 byly silně překryté protilátkou, zatímco ve skupině myší ošetřených protilátkou 16C11 toto zabarvení neexistuje. Aby se ukázal plný rozsah uložení plaků, sériové sekce každého mozku byly nejdříve imunoreaktivní s protilátkou proti Αβ a pak se sekundárním činidlem. Protilátky 10D5 a 3D6, které vznikly po periferní aplikaci, se vyskytují v nadbytku ve většině plaků v CNS. V těchto léčených skupinách se uzle plaků velmi redukovaly v porovnání se skupinou 16C11. Tato data indikují, že periferně aplikované protilátky mohou vstupovat do CNS, kde může přímo docházet k vymizení amyloidu. Je pravděpodobné, že protilátka 16C11 má také přístup k plakům, ale není schopna se vázat.
Příklad 14: Testy ex vivo pro testování aktivity protilátky proti amyloidním depozitům
Aby se testoval účinek protilátek na zmizení plaků, zavedl se test ex vivo, ve kterém se primární mikrogliální buňky kultivovaly s nefixovanými kryostatickými sekcemi mozku myší PDAPP nebo lidí trpících AD. Mikrogliální buňky se získaly z cerebrálních kortiků neonatálních myší DBA/2a (1 až 3 dni). Kortiky se mechanicky disociovaly v HBSS (Hanksův rovnovážný roztok solí, Sigma) s 50 μg/ml DNázy I (Sigma). Disociované buňky se filtrovaly přes filtr, který zachytí buňky o průměru 100 μιη (Falcon) a centrifugovaly se při 1 000 ot./min po dobu 5 minut. Pelet se resuspendoval v růstovém médiu (DMEM s vysokým obsahem glukózy, 10 % FBS, 25 ng/ml rmGM-CSF) a buňky se nanesly s vysokou hustotou do plastové kultivační nádoby T-75. Po 7 až 9 dnech se nádoby nechaly rotovat na míchačce při 200
121
♦ ·· • ·· 44 «
• * * 94 4 4 * · • 41
λ « • ·
• ··· 4 • 4 4 • ·
• · 4 4 • 4
• · 44 944 4494 94 « 4
ot./min. po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C. Suspenze buněk se centrifugovala při 1 000 ot./min. a resuspendovala v testovaném médiu.
Deseti mikrometrové sekce mozků myši PDAPP nebo člověka trpícího AD (posmrtný čas je měnší než 3 hodiny) se nechaly roztát a nanesly se na kruhová skleněná mikroskopická sklíčka pokrytá polylyzinem a umístily se do prohlubní tkáňových kultivačních destiček s 24 prohlubněmi. Sklíčka se dvakrát omyla testovacím médiem, který obsahuje H-SFM (médium, které neobsahuje sérum hybridomů, Gibco BRL) s 1% FBS, glutaminem, penicilinem/streptomycinem a 5 ng/ml rmGM-CSF (R&D) . Kontrolní protilátky nebo protilátky proti Αβ se přidaly v dvou násobné koncentraci (konečná koncentrace je 5 pg/ml) po dobu jedné hodiny. Mikrogliální buňky se pak nanesly v hustotě 0,8 x 106 buněk/ml testovaného média. Kultivace se prováděla v humidizovaném inkubátoru (37 °C, v atmosféře 5 % CO2) po dobu 24 hodin nebo více. Na konci inkubace se kultury fixovaly s 4 % paraformaldehydem a jejich prostupnost se zvyšovala 0,1 % Tritonem-X100. Sekce se nechaly reagovat s protilátkou 3D6 značenou biotinem a pak následoval konjugát streptavidinu s Cy3 (jackson ImmunoResearch) . Exogenní mikrogliální buňky se zviditelnily jaderným barvením (DAPI). Kultury se pozorovaly v obráceném fluorescenčním mikroskopu (Nikon, TE300) a fotomikrografy se připravily za použití digitálního fotoaparátu SPOT a softwaru SPOT (Diagnostic instriments). V případě westernový analýzy se kultury extrahovaly v 8M močovině ředěné 1:1 v redukčním trícinovém vzorkovém pufru a nanesl se na 16 % tricinový gel (Novex) . Po transferu na immobilon se bloty vystavily působení pabAβ42 v koncentraci 5 pg/ml a pak anti-myším protilátkám konjugovaným s HRP a vyvinuly se s ECL (Amersham).
Když se provedl test se sekcemi mozku myší PDAPP v přítomnosti protilátky 16C11 (jedna z protilátek proti Αβ
122 • · · se sekcemi Protilátka mozků člověka 10D5 vyvolaly nebyla účinná in vivo) , beta-amyloidní plaky zůstaly neporušeny a nepozorovala se žádná fagocytóza. Naopak když se kultivovaly přilehlé sekce v přítomnosti protilátky 10D5, amyloidní depozity ve velkém rozsahu vymizely a mikrogliální buňky vykazují řadu fagocytových vesikul, které obsahují Αβ. Identické výsledky se získaly trpícího Alzheimerovou nemocí, fagocytózu plaků AD, zatímco protilátka 16C11 nebyla účinná. Navíc test poskytuje prorovnatelné výsledky, když se provede buď s myšími nebo lidskými mikrogliálními buňkami a s myšími, králičími protilátkami nebo s ptorilátkami primátů proti Αβ.
Tabulka č. 16 ukazuje, zda došlo k navázání a/nebo fagocytóze v případě vazebných specifit několika různých protilátek. Může být vidět, že protilátky vázající se na epitopy v aminokyselinách 1 až 7 se váží a odstraňují amyloidní depozity, zatímco protilátky vázající se na epitopy v aminokyselinách 4 až 10 odstraňují amyloidní depozity. Protilátky vázající se na zbytek 10 v C-terminálním epitopů se neváží ani neodstraňují amyloidní depozity.
Tabulka č.
16: Analýza epitopové specifity
protilátka barvení fagocytóz.a
epitop isotyp
N.-term. mAb
3D6 1-5 IgG2b + +
10D5 3-6 IgGl + +
22C8 3-7 IgG2a + +
6E10 5-10 IgGl + -
14A8 4-10 krysí IgGl -
13-28
18G11 10-18 krysí IgGl -
266 16-24 IgGl - —
22D12 18-21 IgG2b - —
123
C-term.
2G3 -40 IgGl - -
16C11 -40/-42 IgGl - -
21F12 -42 IgG2a - -
imunní sérum
králičí (CFA) 1-6 +
myší (CFA) 3-7 +
myší (QS- 21) 3-7 + +
opičí (QS- 21) 3-7 + +
myší (MAP1- 7) 1-5 + +
Tabulka č. 17 ukazuje výsledky získané s několika protilátkami proti Αβ, kdy se srovnává jejich schopnost vyvolat fagocytosu v testu ex vivo a redukovat plakové uzle in vivo ve stádiích pasivního transferu. Ačkoli protilátka 16C11 a 21F12 se váže na agregovaný syntetický peptid Αβ s vysokou aviditou, tyto protilátky nereagují s beta-amyloidními plaky v nefixovaných sekcích mozku a nemohou způsobit fagocytózu v testu ex vivo a nejsou účinné ani in vivo. Protilátka 10D5, 3D6 a polyklonální protilátka proti Αβ byla aktivní ve všech třech měřeních. Protilátka 22C8 se váže silněji na analogovou formu přirozeného Αβ, ve kterém kyselina aspartová v poloze 1 a 7 je nahrazena kyselinou iso-aspartovou. Tyto výsledky ukazují, že účinnost in vivo je způsobena odstraněním plaků způsobeným přímo protilátkou v CNS a test ex vivo předpovídá účinnost in vivo.
Stejný test se použil při testování odstranění protilátky proti fragmentu synucleinu, který se označuje jako NAC.
124 • · · · φ · e · 9 ··· · ··· · · » · · ··· · ·«·« • · · · · · · · · · · • « · · · · · ··· ·· ······· · · ···
Ukázalo se, že synuclein je protein spojený s amyloidními plaky. Protilátka proti NAC je v kontaktu se vzorkem mozkové tkáně, který obsahuje amyloidní plaky. Jako kontrola se použilo králičí sérum. Následné monitorování vykazuje značnou redukci počtu a velikosti plaků udávající odstraňující aktivitu protilátky.
Tabulka č. 17: Test ex vivo jako prediktor účinnosti in vivo
protilátka isotyp avidita pro agregovaný Αβ (pM) navázání na β-amyloidní plaky účinnost ex vivo účinnost in v i vo
monoklonální
3D6 IgG2b 470 + + +
10D5 IgGl 43 + + +
16C11 IgGl 90 - - -
21F11 IgG2a 500 - - -
TM2a IgGl - - - -
polyklonální
1-42 směs 600 + + +
Konfokální mikroskopie se použila k potvrzení, že Αβ se internalizovalo během průběhu testu ex vivo. V přítomnosti kontrolních protilátek exogenní mikrogliální buňky se uchovaly v kofokální ploše nad tkání, kde existovaly nepatogenní vesikuly, které obsahují Αβ, a plaky v sekci zůstávají neporušené. V přítomnosti protilátky 10D5 skoro všechen materiál byl obsažen ve vesikulech v exogenních mikrogliálních buňkách. Aby se stanovilo, zda internalizovaný peptid byl odstraněn, kultury ošetřené 10D5 se extrahovaly v různé době 8 M močovinou a testovaly se westernovou analýzou. V bodě odpovídajícím jedné hodině, kdy se ještě neobjevila fagocytóza, reakce s polyklonální protilátkou proti Αβ ukázala silný pruh odpovídající molekulovou hmotností 4 kD (odpovídá
125 ·· · · · · · · • ···· * · · · · · • · · · · · · ··· «« 9999999 99 999 peptidu Αβ). Fagocytóza zprostředkovaná protilátkou vede k její degradaci.
Aby se stanovilo, zda fagocytóza v testu ex vivo byla zprostředkována Fc, připravily se fragmenty F(ab)2 protilátky 3D6 proti Αβ. Ačkoli fragmenty F(ab')2 si ponechaly svou úplnou schopnost reagovat s plaky, nejsou schopny způsobit fagocytózu pomocí mikrogliálních buněk. Navíc fagocytóza s celou protilátkou by mohla být blokována činidlem proti myším receptorům Fc (anti-CD16/32). Tato data indikují, že odstranění Αβ in vivo je zprostředkované fagocytózou zprostředkovanou receptorem Fc.
Příklad 15: Průchod protilátek skrz bariéru krev-mozek
Tento příklad stanovuje koncentraci protilátky zavedené do mozku, pak následuje intravenózní injekce do periferální tkáně normálních myší nebo myší PDAPP. Myši PDAPP nebo normální kontrolní myši se perfúzovaly s 0,9% NaCl. Získaly se oblasti mozku (hippocampus nebo kůra mozková) a rychle se zamrazily. Mozek se homogenizoval v 0,1 % tritonu s inhibitory proteázy. Imunoglobulin se detekoval v extraktech testem ELISA. Fab 2 kozí anti-myší IgG se potáhl na destičku RIA jako značící činidlo. Sérum nebo extrakty mozků se inkubovaly po dobu jedné hodiny. Isotypy se detekovaly s anti-myším IgGl-HRP nebo IgG2a-HRP nebo IgG2b-HRP (Caltag). Protilátky bez ohledu na isotyp byly přítomny v CNS v koncentraci, která je 1: 1 000, když se zjišťuje v krvi. Když koncentrace IgGl byla trojnásobek koncentrace IgG2a v krvi, byla také trojnásobek koncentrace IgG2a v mozku, obě protilátky tvoří 0,1 % jejich množství v krvi. Tento výsledek se pozoroval u transgenních a netransgenních myší.
Příklad 16: Terapeutická účinnost peptidu Αβ v konfiguraci MAP
Studie účinnosti terapie adjuvans/imunogen se provedla za použití samic a samců heterozygotních transgenních myší PDAPP
126 ve věku 9 až 10,5 měsíce, přičemž se testovala účinnost fúzního proteinu, který obsahuje Αβ1-7 v tetramérové konfiguraci MAP, jak se popisuje shora v textu. Trvání studie bylo 25 týdnů a do skupiny se zařadilo 29 až 40 zvířat. Zvířata na konci studie byla 15 měsíců stará. Metody používané při této studii jsou stejné jako při terapeutické studii s různými adjuvans v příkladu VIII shora v textu. Léčené skupiny se definují dále v textu v tabulce č. 18.
Tabulka č. 18:
adjuvans imunogen ředící pufr aplikace
skupina 1 CFA/IFA MAP(ΑβΙ- 7:TT)(100gg) PBS IP (400 μί)
skupina 2 QS21 AN1792- GCS(75μρ) PBS SC (250 μί)
skupina 3 PBS - - SC (250 μί)
Zkratky uvedené v tabulce: MAP znamená multiantigenní peptid, TT znamená epitop T buňky toxoidu tetanu (830-844), SC znamená subkutánní, IP znamená peritoneální, PBS znamená fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem, GCS je formulace glycin/citrát/sacharóza.
Imunizační rozvrh byl pro všechny skupiny stejný. Myším se zavedla injekce v týdnu 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, přičemž se vzorky krve odebraly v týdnu 3, 5, 9, 13, 17, 21 a 25.
Skupinám 1, 2, 3, 4 a 6 se aplikovalo osm injekcí, skupina 2 a
3 QS21/AN1792 a PBS sloužily jako pozitivní a negativní
kontroly. Titry se stanovily testem pro stanovení titru protilátky
proti Αβ.
Skupina 1 je skupina CFA/IFA:MAP(Αβ1-7:TT) vyjadřující nízký titr. Maximální hodnota GMT byla pouze 1 200 v týdnu 13 a v týdnu 25 klesla na 600. 3 z 30 myší nevykazují žádný titr a dalších sedm myší nepřekročily na konci studie titr 400.
• ·
127
Skupina 2 je kontrolní skupina QS21/AN1792, která dosáhla maximální hodnoty titru v 17. týdnu, přičemž hodnota GMT je 16 000. Titr pak poklesl během dalších 8 týdnů na hodnotu GMT 8 700. Jedno zvíře v této skupině netvoří titr protilátek v průběhu celého experimentu.
Skupina 3 se imunizovala samotným PBS a nevykazuje žádný titr protilátek.
Obě léčené skupiny vykazují podstatné snížení množství kortikálního Αβ ve srovnání s kontrolní skupinou imunizovanou PBS (tabulka č. 19). Skupina CFA/IFA:MAP(Αβ1-7) podstatně snížila množství Αβ ve srovnání s kontrolní skupinou PBS navzdory relativně nízkých titrů protilátek proti Αβ.
Tabulka č. 19: Množství kortikálního Αβ
PBS MAP QS-21
průměr (ng/g tkáně) 7 335 3 692 2 389
rozmezí (ng/g tkáně) 550-18 358 240-10 782 210-11 167
hodnota p 0,0003 menší než 0,0001
N 38 30 34
Imunogen Αβ 1-7 MAP je účinný při vyvolání dostatečné imunitní odezvy s ohledem na ukládání Αβ v kortexu.
Příklad 17: Mapování epitopu imunogenní odezvy na Αβ u opic
Tento příklad analyzuje odezvu primáta na imunizaci s AN1792 (to je Αβ1-42). 11 skupin opic (4/pohlaví/skupina) se imunizovaly AN1792 (dávka obsahuje 75 nebo 300 μ9) v kombinaci s adjuvans QS-21 (dávka obsahuje 50 nebo 100 μg) nebo 5 % sterilní dextrosy ve vodě (D5W, kontrolní skupina). Všem zvířatům se aplikovaly IM injekce podle jednoho ze tří rozvrhů, jak je zobrazeno v tabulce č. 20, přičemž se
128
aplikovalo celkem 4, 5 nebo 8 dávek. 175 den studie se shromáždily vzorky séra (z 4 opic/pohlaví/skupina) a vzorky CSE (z 3 opic/pohlaví/skupina) získané 176 den studie a hodnotila se jejich schopnbost vázat se na peptid Αβ1-40 a APP.
Tabulka č. 20: Zařazení do skupin a obsah dávky
skupina č. rozvrh3 #opic (M/F) dávka AN1793 ^g/dávka) dávka QS-21 (gg/dávka) způsob aplikace
lb 1 4/4 0 0 IM
2 1 4/4 prostředek2 50 IM
3 1 4/4 prostředek 100 IM
4 1 4/4 75 50 IM
5 1 4/4 300 50 IM
6 1 4/4 75 100 IM
7 1 4/4 300 100 IM
8 2 4/4 75 100 IM
9 2 4/4 300 100 IM
10 3 4/4 75 100 IM
11 3 4/4 300 100 IM
a. rozvrh 1: dávka v den 1, 15, 29, 57, 85, 113, 141, 169, rozvrh 2: dávka v den 1, 29, 57, 113, 169, rozvrh 3, dávka v den 1, 43, 85, 169.
b. kontrolní skupině se aplikovala injekcí D5W
c. prostředek obsahuje pufr glycin/citrát/sacharosa, který je ekcipientem pro AN1792.
Skutečné uspořádání lineárního peptidů rozeznávaného protilátkami ve vzorcích séra ze zvířat imunizovaných AN1792 se stanovil testem ELISA, který měří navázání těchto protilátek na přesahující se peptidy, které překrývají celou sekvenci Αβ1-42. Ppetidy značené biotinem s částečnou sekvencí AN1792 se získaly z instituce Chiron Technologies, jako peptidy obsahující 10 aminokyselin s překryvem 9 zbytků
129 • · · » • · ·· · (syntéza č.5366, č. 5331 a č.5814). Prvních 32 peptidů je na C-konci znečeno biotinem linkerem GGK. Posledních 10 peptidů jsou značeny biotinem na N-konci s linkerem, který obsahuje EGEG (SEQ ID NO: 70) . Lyofilizované peptidy značené biotinem se rozpustily v koncentraci 5 mM v DMSO. Tyto zásobní roztoky peptidů se ředily na koncentraci 5 μΜ v TTBS (0,05 % Tween 20, 25 mM Tris HCl, 137 mM NaCl, 5, 1 mM Kel, pH=7,5). Alikvoty o objemu 100 μΐ tohoto 5 μΜ roztoku se přidaly ve dvou provedeních do destiček s 96 prohlubněmi, které jsou potaženy streptavidinem (Pierec). Destičky se inkubovaly po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti, pak se promyly čtyřikrát TTBS. Vzorky séra se ředily ředidlem bez azidu, aby se normalizovaly titry a do každé prohlubně se přidalo 100 μΐ. Tyto destičky se inkubovaly po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti a pak se promyly čtyřikrát TTBS. Kozí anti-lidské protilátky konjugované s HRP (Jackson ImmunoResearch) se ředily 1: 10 000 v ředidle bez azidu a do prohlubně se přidalo 100 μΐ. Destičky se opět inkubovaly a promyly. Aby se vyvinula barevná reakce, do prohlubně se přidalo TMB (Pierce) o objemu 100 μΐ a vše se inkubovalo po dobu 15 minut a pak se přidalo 30 μΐ 2M H2SO4, tim se zastavila reakce. Optická hustota se měřila při vlnové délce 400 nm na kolorimetrickém čtecím zařízení Vmax nebo Spectramax.
Imunizace s AN1792 vede k produkci protilátek u 100 % zvířat ve všech skupinách, kterým se aplikovala dávka v den 175. Průměrné hodnoty titrů ve skupinách jsou v rozmezí 14 596 až 56 084. Objevuje se trend, že titry jsou vyšší, když se imunizuje s vyšší koncentrací antigenu a/nebo adjuvans, ale nedemonstrovaly se statisticky podstatné rozdíly, které jsou způsobené variabilitou odezvou u jednotlivých zvířat na imunizaci.
Séra, která jsou pozitivní na protilátky vůči AN1792 jsou také pozitivní v případě protilátek vůči Αβ1-40. Průměrné titry
130 ve skupině jsou v rozmezí 36 867 až 165 991 a jako v případě titrů proti antigenu AN1792 nevykazují statisticky podstatné rozdíly mezi skupinami v den 175. Navázání na AN1792 vykazuje vysoce pozitivní korelaci s navázáníma na Αβ1-40 (Spearman r =
0,8671).
Ze 48 imunizovaných opic podle různého rozvrhu AN1792 se získalo 33 vzorků CSF s adekvátním objemem a kvalitou. 32 (97 %) z nich těchto opic vykazují pozitivní titry vůči AN1792. Hodnoty titrů jsou v rozmezí 2 až 246 se střední hodnotou 49,44±21,34. Množství protilátek proti AN1792 v CSF je 0,18±0,ll % hodnoty, která se naměřila v séru a vykazuje vysoce pozitivní korelaci (Spearman r=0,7840) s titry v séru. Žádné rozdíly v procentu protilátky nebylo možné vidět ve skupinách nebo mezi pohlavím v CSF. Množství protilátky v CSF je konzistentní s pasivním transferem periferně vytvořené protilátky přes bariéru krev-mozek do centrálního nervového systému.
Testování sady vzorků CSF pozitivních na protilátku proti AN1792 demonstrovalo, že jako protilátka ve vzorcích séra tak protilátka v CSF zkříženě reaguje s Αβ1-40. Titry protilátek proti Αβ1-40 ukázaly vysokou korelaci (Spearman r=0,9634) s titry protilátky proti AN1792. Testování sady vzorků CSF s nejvyššími titry protilátky vůči AN1792 nevykazují žádné navázání na APP, jako v případě sérových protilátek.
Když se sérum ze dne 175 testovalo proti sériím překrývajících se desetimérních peptidu, protilátky ze všech opic vázaných na peptid, jejichž sekvence pokrývá aminokyseliny 1 až 10 peptidu AN1792 (aminokyseliny peptidu APP 653 až 672). U některých zvířat to byl pouze jediný peptid, u něhož se dalo měřit navázání (zobrazeno na obrázku
č. 19).
U jiných zvířat se mohou měřit jiná reaktivita, ale ve všech případech převládá reaktivita s N-terminální peptidovou sekvencí, další reaktivity spadají do dvou skupin. První a
131 • · 4 ·· nejběžnější skupinou je navázání peptidů kolem N-konce 1-10 peptidu AN1792 (obrázek č. 20). Navázání tohoto typu bylo řízeno na peptid překrývající aminokyseliny 1 až 8, 1 až 9 a 2 až 11 peptidu AN1792. Tyto reaktivity kombinované s reaktivitou s peptidem 1 až 10 reprezentují naprostou většinu reaktivity u všech zvířat. Mapování epitopu jednotlivých zvířat v čase indikuje, že reaktivita protilátek s peptidem 1 až 10 postupuje k přilehlým peptidům. To demonstruje silnou aktivaci imunitní odezvy vůči N-konci peptidu AN1792 s jeho volným terminálním zbytkem kyeliny aspartové. Druhá minoritní detekovatelná aktivita u některých zvířat je navázání peptidů lokalizovaných na C-konci na hlavní oblast kolem peptidů pokrývájicích aminokyseliny 7 až 16, 11 až 20 a 16 až 25 peptidu AN1792. Tyto reaktivity je možné spatřit u pouze 10 až 30 % opic.
Variabilita odezvy mezi různými zvířaty (například zda aminokysleiny 1 až 10 jsou exkluzivním nebo převládajícím reaktivním epitopem) nekoreluje a dávkou antigen/adjuvans, s rozvrhem aplikace dávky nebo s titrem protilátky a je pravděpodobně odrazem genetického uspořádání u každého jednotlivého zvířete.
Příklad 18: Prevence a léčba člověka
Aby se stanovila bezpečnost aplikace pro člověka se provedla fáze I studie, která zahrnuje aplikaci jediné dávky. Terapeutické činidlo se aplikovalo ve vzrůstajících dávkách různým pacientům, přičemž se začalo přibližně u 0,01 množství předpokládané účinnosti a a zvyšování dávky probíhalo s faktorem 3 až se množství přiblížilo desetinásobku účinné myší dávky.
Aby se stanovila terapeutická účinnost provedla se fáze II studie. Vybraly se pacienti trpící časnou nebo střední fázi
Alzheimerovy nemoci, což se definovalo použitím kritérií uznávaných institucí Alzheimer's disease and Related Disorders
132 funkce
Association (ADRDA). Vhodní pacienti dosáhly skóre v testu „Mini-Mental State Exam (MMSE) v rozmezí 12 až 26. Jiná výběrová kritéria je skutečnost, že pacienti pravděpodobně přežijí trvání studie a nevyskytují se komplikace, jako je užívání léků, které mohou interferovat. Základní hodnocení provádí použitím klasických se pacienta psychometrických standardů, jako je MMSE ADS, které jsou jednotným měřítkem pro hodnocení pacientů trpících Alzheimerovou nemocí.
Tato psychometrická stupnice slouží jako míra postupu Alzheiemrovy nemoci. Vhodné stupnice kvalitativního života se může také použít k monitorování léčby. Postup onemocnění může být dále sledováno MRI. Profily krve pacientů mohou také být monitorvány testy protilátky pro imunogen a odezvy T buněk.
Pacienti jsou náhodně rozděleni a léčeni buď terapeutickým činidlem nebo placebem. Pacienti se sledují alespoň každých šest měsíců. Účinnost se stanovila podstatnou redukcí postupu léčené skupiny vztaženo ke skupině, kde se aplikovalo placebo.
Druhá fáze studie se provedla tak, že se hodnotila konverze pacientů z časnou ztrátou paměti, která není způsobena Alzheimerovou nemocí, která se nazývá ztráta paměti spojená s věkem (AAMI) nebo lehká oligofrénie (MCI) na možnou Alzheimerovu nemoc, jak se definuje kriterii ADRDA. Pacienti s vysokým nebezpečím konverze na Alzheimerovu nemoc se vybraly neklinické populace testováním referenčních populací, kde se sledovaly známky ztráty paměti a jiné obtíže spojené se symptomy ztráty paměti stádia pre-Alzheimerovy nemoci, výskyt Alzheimerovy nemoci v rodině, faktory genetických předpokladů pro toto onemocnění, věk, pohlaví a jiné rysy, které znamenají velké nebezpečí vzniku Alzheimerovy nemoci. Vytvořilo se základní skoré získané ve vhodných testech zahrnující MMSE a ADAS spolu s jinými stupnicemi navrženými tak, že se hodnotí více normální populace. Tyto populace pacientů se sledují v intervalech přibližně šesti měsíců a konečný bod v případě
133 >·· 4
4 každého pacienta je zda jeho onemocnění konvertuje na Alzheimerovu nemoc, jak ji definují kritéria ADRDA na konci pozorování.
Příklad 19: Obecné materiály a metody
1. Měření titrů protilátek
Myším se odebrala krev z ocasní žíly o objemu 200 μΐ do mikrocentrifugové zkumavky. Morčatům se nejdříve vyholola oblast hlezna a pak se použila jehla 18 gauge a odebrala se krev z matatarsální žíly a krev se jímala do mikrocentrifugační zkumavky. Krev se nechala srážet po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti (RT), míchala vortexem a centrifugovala se při 14 000 x g po dobu deseti minut, aby se separovala ze séra sraženina. Sérum se pak přeneslo do čisté mikrocentrifugační zkumavky a uchovávalo se při teplotě 4°C až do titrace.
Titry protilátek se stanovily testem ELISA. Mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi (destičky Costar EIA) se potáhly 100 μΐ roztoku, který obsahuje buď 10 pg/ml Αβ42 nebo SAPP nebo jiné antigeny, jak se píše v každé zprávě v potahovacím pufru (0,1 M fosforečnan sodný, pH8,5, 0,1 % azid sodný) a uchovávaly se přes noc při teplotě místnosti. Prohlubně se vysály a do prohlubní se přidalo sérum s počátečním ředěním 1/100 v ředícím pufru (0,014 M fosforečnanu sodného pH7,4, 0,15 M NaC, 0,6 % albuminu v bovinním séru, 0,05 % thimerosalu). Sedm sérií ředění vzorků se připravilo přímo na plotny ve třech krocíc, aby se dosáhlo konečného ředění 1/218 700. Ředění se inkubovalo v potažených prohlubních destiček po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Destičky se pak promyly čtyřikrát PBS, které obsahuje 0,05 % Tween 20. Druhá protilátka kozí anti-myší Ig konjugované s křenovou peroxidázou (získané od firmy Boehringer mannheim) se přidalo do prohlubní jako 100 μΐ ředění 1/3 000 v ředícícm pufru a vše se inkubovalo po dobu jedné hodiny při teplotě místnsoti.
134 ♦ · · • · · · · «· ·· *
Destičky se promyly čtyřikrát v PBS, Tween 20. Aby se vyvinul chromogen, do každé prohlubně se přidal 100 μΐ TMB (3,3', 5,5'tetramethylbenzidin získaný od firmy Pierce Chemicals) vše se inkubovalo po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Reakce se zastavila přidáním 25 μΐ 2M H2SO4. Intenzita barvy se pak odečítala na molekulovém zařízení Vmax při vlnové délce 450 nm až 650 nm.
Titry se definovaly jako převrácená hodnota ředění séra dávající jednu polovinu maxima hodnoty OD. Maximální hodnota OD se v obecném případě odečítala z počátečního ředění 1/100 s výjimkou případů s velmi vysokými titry, v případě, že vyšší počáteční ředění je nezbytné k ustanovení maximální hodnoty OD. Jestliže 50 % bod spadá mezi dvě ředění provedla se lineární extrapolace, aby se vypočítal konečný titr. Aby se vypočítal geometrický průměr titrů protilátek, titry nižší než 100 seautomaticky označily jako titry s hodnotou 25.
2. Testy proliferace lymfocytů
Myším se provedla anesteze isofluranem. Sleziny se odstranily a promyly se dvakrát 5 ml PBS, který obsahuje 10 % fetální boviní sérum deaktivované teplem (PBS-FBS) a pak se homogenizovalo při teplotě 50 vyjádřeno v jednotce Centricon (Dako A/S, Norsko) v 1,5 ml PBS-FBS po dobu 10 vteřin při 100 ot./min v Medimachine (Dako), po níž následuje filtrace přes nylonové síto s velikostí pórů 100 mikronů. Splenocyty se promyly jednou 15 ml PBS-FBS, pak se vytvořil pelet centrifugací při 200 x g po dobu 15 minut. Červené krevní buňky se lyžovaly tím, že se resuspendováním peletu centrifugací při 200 x g po dobu 5 minut. Červené krevní buňky se lyžovaly tím, že se resuspendoval pelet v 5 ml pufru, který obsahuje 0,15 M NH4C1, IM KHCO3, 0,1 M NaEDTA, pH7,4 po dobu pěti minut při teplotě místnosti. Leukocyty se pak promyly způsobem popsaným shora v textu. Čerstvě izolované buňky sleziny (105 buněk v prohlubni) se kultivovalo ve třech • ♦
135 provedeních na mikrotitračních destičkách pro tkáňové kultury s dnem ve tvaru U s 96 prohlubněmi. (Corning, Cambridge, MA) v kultivačním médiu RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) doplněném 2,05 mM L penicilinu/streptomycinu a 10 gluatminem, 1 % směsí □ FBS deaktivovaným teplem po
Arlington Heights IL) UniFilter a počítaly Scintillation Counter dobu 96 hodin při teplotě 37 °C. Také se v různých dávkách, které jsou v rozmezí 5 až 0,18 mikromolů ve čtyřech krocích přidaly různé peptidy Αβ, jsou to například Αβ1-16, Αβ1-40, Αβ1-42 nebo reverzní peptid Αβ40-1. Buňky v kontrolních prohlubních se kultivovaly s Concanavalinem A (ConA) (Sigma, cat. # C-5275, v koncentraci 1 mikrogram/ml), aniž se přidal protein. K buňkám se přidal na posledních 24 hodin 3H-thymidin (do jedné prohlubně se přidal 1 od firmy Amersham Corp.,
Buňky se pak sklidily na destičky se v zařízení Top Count Microplate (Packard Instruments, Downers Grove,
IL) . Výsledky se exprimovaly jako počet impulzů radioaktivity za jednu minutu (cpm) začleněných do nerozpustných makromolekul.
4. Příprava mozkové tkáně
Po usmrcení se mozek odstranil a jedna hemisféra se připravila pro imunohistochemickou analýzu, zatímco tři oblasti mozku (hippocampus, kortex a mozeček) se získaly z jiné hemisféry a použily se k měření koncentrace různých proteinů Αβ a forem APP za použití specifického testu ELISA (Johnson-Wood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)) .
Tkáně určené pro test ELISA se homogenizovaly v 10-ti objemech guanidinového pufru chlazeného ledem (5,0 M guanidinHCl, 50 mM Tris-HCl, pH8,0). Homogenáty se zamíchaly mírným mícháním za použití Adams Nutatoru (Fisher) po dobu tří až čtyř hodin, pak se skladovaly při teplotě -20 °C, aby se
136 • ·♦·· kvantifikovalo množství Αβ a APP. Dřívější experimenty se ukazují, že analyty byly stabilní za těchto podmínek uchovávání a že syntetický protein Αβ (Bachem) by se mohl kvantitativně získat, když se přidá do homogenátů kontrolní mozkové tkáně z mláďat myší (Johnson-Wood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)).
5. Měření množství Αβ
Homogenáty mozku se ředily v poměru 1:10 s kaseinovým ředidlem chlazeným ledem (0,25 % kasein, PBS, 0,05 % azid sodný, 20 pg/ml aprotininu, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 pg/ml leupeptidinu) a pak se centrifugovaly při 16 000 x g po dobu 20 minut při teplotě 4°C. Standardy syntetického proteinu Αβ (1 až 42 aminokyselin) a standardy APP se připravily tak, aby zahrnovaly 0,5 M guanidin a 0,1 % albuminu bovinního séra (BSA) v konečné kompozici. Sendvičový test ELISA pro „celkový Αβ využívá monoklonální protilátku 266, která je specifická pro aminokyseliny 13 až 28 proteinu Αβ (Seubert et al., Nátuře 359, 325-327 (1992)), jako značící protilátka, a monoklonální protilátku 3D6 značenou biotinem, která je specifická pro aminokyseliny 1 až 5 proteinu Αβ (Johnson-Wood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)) jako reportní protilátka. Monoklonání protilátka 3D6 nerozeznává vylučovaný
APP nebo
APP v celé délce, ale detekuje druhy Αβ s aminoterminální kyselinou aspartovou. Tento test má nižší limit citlivosti přibližně 50 ng/ml (11 nM) a nevykazuje zkříženou reaktivitu s endogenním myším proteinem Αβ v koncentracích do 1 ng/ml (Johnson-Wood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)).
Sendvičový test ELISA specifický pro Αβ1-42 používá ιηΑβ
21F1, která je specifická pro aminokyseliny 33 až 42 peptidů Αβ (Johnson-Wood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)) jako značené protilátky. V tomto testu se jako
137
444 9 reportní protilátka používá ηιΑβ 3D6, která má nižší limit citlivosti okolo 125 μ9/πι1 (28 μΜ, Johnson-Wood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)). V případě testu ELISA pro protein Αβ se 100 μΐ buď πΑβ 266 (v koncentraci 10 μς/ιηΐ) nebo ιηΑβ 21F12 v koncentraci 5 μς/ιηΐ potáhlo na dno prohlubní destiček s 96 prohlubněmi (Costar) inkubací přes noc při teplotě místnosti. Roztok se odstranil aspirací a ptohlubně se blokovaly přidáním 200 μΐ 0,25 % lidského sérového albuminu v pufru PBS po dobu alespoň jedné hodiny při teplotě místnosti. Blokační roztok se odstranil a destičky se uchovávaly vysušené při teplotě 4°C až do použití. Destičky se znovu před použitím hydratovaly v promývacím pufru (fyziologický roztok pufrovaný Tris (0,15 M NaCI, 0,01 M TrisHCl, pH 7,5) plus 0,05 % Tween 20). Vzorky a standardy se přidaly do prohlubní v trojnásobných alikvotech o objemu 100 μΐ a pak se inkubovaly přes noc při teplotě 4 °C. Destičky se promyly alespoň třikrát v promývacím pufru mezi každým krokem testu. Protilátky ιηΑβ306 značené biotinem se ředily na koncentraci 0,5 μg/ml v kaseinovém testovacím pufru (0,25 % kaseinu, PBS, 0,05 % Tween 20 pH 7,4) a přidaly se do prohlubní a inkubovaly se po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Konjugát avidinu a křenové peroxidázy (avidin-HRP se získal od firmy Vector, Burlingame, CA) ředěný 1: 40 000 v kaseinovém testovacím pufru přidal se do prohlubní a kultivovaly se po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Přidal se kolorimetrický substrát SLOW TMB-ELISA (Pierce) a nechal se reagovat po dobu 15 minut při teplotě místnosti, enzymatická reakce se zastavila přidáním 25 μΐ 2M H2SO4. Reakční produkt se kvantifikoval za použití molekulového zařízení Vmax a změřil se rozdíl v absorbanci při vlnové délce 450 nm a 650 nm.
6. Měření množství APP
138 ··· ··
Využily se dva různé testy pro měření APP. První označený ΑΡΡ-α/FL rozeznává obě formy APP APP-alfa (a) a APP plné délky (FL) . Druhý test se specifikoval pro APP-α. Test APP-a/FL rozeznává vylučovaný APP zahrnující prvních 12 aminokyselin Αβ. Protože reportní protilátka (2H3) není specifická pro místo aclip, které se vyskytuje mezi aminokyselinami 612 až 613 APP695 (Esch et al. , Science 248, 1122-1124, (1990)), tento test také rozeznává APP plné délky (APP-FL) . Předchozí experimenty používají imobilizované protilátky APP s cytoplazmatickým ocasem APP-FL, aby vyčerpaly mozkové homogenáty APP-FL, což naznačuje, že přibližně 30 až 40 % ΑΡΡα/FL APP je FL (data nejsou zobrazena). Reportní protilátka v případě obou testů ΑΡΡ-α/FL a APP-α je mAb 8E5, které se vytvořily proti aminokyselinám 444 až 592 formy APP695 (Games et al., Nátuře 373, 523 (1995)). Reportní mAb v případě testu
ΑΡΡ-α/FL je mAb 2H3, která je specfická pro aminokyseliny 597608 APP695 (Johnson-Wood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)) a reportní protilátkou v testu pro APP-a je derivát mAb 16H9, který vznikl vůči aminokyselinám 605 až 611 peptidu APP. Nižší limit citlivosti testu APP-aFL je přibližně 11 ng/ml (150 pM) (Johnson-Wood et al., Proč. .Nati. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)) a limit citlivosti testu specifického pro APP-α je 22 ng/ml (0,3 nM) . V případě obou testů APP se mAb 8E5 potáhly na prohlubně destiček EIA s 96 prohlubněmi způsobem stejným, jako se popisuje shora v textu v případě mAb 266. Čištěný rekombinantní vylučovaný APP-α se použil jako referenční standard v případě testu APP-α a testu ΑΡΡ-α/FL (Esch et al., Science 248, 1122-1124, (1990)). Vzorky homogenátu mozku v 5 M guanidinu se ředily v poměru 1:10 v ředícím pufru vhodném pro test ELISA (0,014 M fosforečananový pufr pH7,4, 0,6 % bovinnní sérový albumin,
0,05 % thimerosal, 0,5 M NaCl, 0,1 % NP40). Vzorky se pak
139 fc ·« fc fcfc ·· · • fcfcfc fcfc · « fcfc·· • fcfc · fcfcfcfc • fcfcfc · · fcfcfcfc· • · fcfc fcfcfc fcfcfc fcfc fcfcfc fcfcfcfc fcfc fcfcfc ředily v poměru 1:4 ve vzorkovém pufru, které obsahuje 0,5 M guanidin. Ředěné homogenáty se pak centrifugovaly při 16 000 x g po dobu 15 vteřin při teplotě místnodti. Standardy APP a vzorky se pak přidaly na destičku ve dvounásobných alikvotech a ínkubovaly se po dobu 1,5 hodiny při teplotě místnosti. Reportní protilátka 2H3 nebo 16H9 se inkubovala se vzorky po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Konjugát streptavidin-alkalická fosfatáza (Boehringer Mannheim) se ředily v poměru 1:1 000 ve vzorkovém pufru a ínkubovaly se v prohlubních po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Přidal se fluorescenční substrát 4-methylumbeliferylfosforečnan a inkuboval se po dobu 30 minut při teplotě místnosti a destičky se odečítaly na fluorimetru Cytofluor™ 2350 (Millipore) při vlnové délce 365 nm (excitace) a 450 nm (emise) .
7. Imunohistochemie
Mozky se fixovaly po dobu tří dní při 40C ve 4% paraformaldehydu v PBS a pak se uchovávaly jeden až sedm dní při teplotě 4 °C v 1% paraformaldehydu v PBS až do přípravy sekcí. Na zařízení vibratom se nařezaly koronární sekce o tloušce 40 mikronů při teplotě místnosti a uchovávaly se v ochraném činidle pro hluboké zmrazení (30 % glycerol, 30 % ethylenglykol v fosforečnanovém pufru) při teplotě -20 °C a pak se provedlo imunohistochemické zpracování. V případě každého mozku se připravilo šest sekcí na úrovní dorzálního hippocampusu, každý se separoval intervaly 240 μπι, které se ínkubovaly přes noc s jednou následující protilátkou: 1) protilátka proti Αβ (mAb, 3D6, specifické pro lidský Αβ) ředěné na koncentraci 2 pg/ml v PBS a 1% horském séru nebo 2) mAb specifické pro lidské APP 8E5 značené biotinem ředěné na koncentraci 3 pg/ml v PBS a 1 % koňské sérum nebo 3) mAb specifické pro gliální fibrilární kyselý protein (GFAP, Sigma Chemical Co.) ředěný 1:5 s 0,25 % Triton X-100 a 1 % horským
140 ··« · sérem ve fyziologickém roztoku pufrovaným Tris pH7,4 (TBS) nebo 4) mAb specifické pro CDllb , antigen MAC-1 (Chemicon International) ředěné 1:100 s 0,25 % Triton X-100 a 1 % králičím sérem v TBS nebo 5) mAb specifické pro antigen MHC II (Pharmingen) ředěné v poměru 1:100 s 0,25 % Triton X-100 a 1 % králičím séru v TBS nebo 6) krysí mAb specifické pro CD43 (Pharmingen) ředěné 1:100 1 % králičím sérem v PBS nebo 7) krysí mAb specifické pro CD 45RA (Pharmingen) ředěný 1:100 s 1 % králičím sérem v PBS nebo 8) krysí monoklonální Αβ specifické pro CD 45RB (Pharmingen) ředěné 1:100 s 1 % králičím sérem v PBS nebo 9) krysí monoklonální protilátky proti Αβ specifické pro CD45 (Pharmingen) ředěné 1:100 1 % králičím sérem v PBS nebo 10) polyklonální křečci protilátky proti Αβ specifické pro CD3e (Pharmingen) ředěné 1:100 s 1 % králičím sérem v PBS nebo 11) krysí monoklonální protilátky specifické pro CD3 (Serotec) ředěné v poměru 1:200 s 1 % králičím sérem v PBS nebo s 12) roztok PBS, který neobsahuje primární protilátku obsahující 1% normální koňské sérum.
Sekce, které reagovaly s roztoky protilátek popsanými v paragrafech 1, 2 a 6 až 12 shora v textu se předem ošetřily 1 % Tritonem X-100, 0,4 % peroxidem vodíku v PBS po dobu 20 minut při teplotě místnosti, aby se zablokovala endogenní Dále se inkubovaly přes noc při teplotě 4 °C protiltákou. Sekce, které reagovaly s 3D6 nebo 8E5 nebo CD3e pak hodiny při teplotě místnosti s komplexem, který zahrnuje křenovou peroxidázu-avidin-biotin, s komponenty kitu „A a „B ředěném v poměru 1: 7 5 v PBS (Vector Elitě Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA). Sekce, které reagovaly s protilátkami specifickými pro CD 45RA, CD 45RB, CD45, CD3, a roztok PBS se inkubovaly po dobu jedné hodiny při teplotě místnsoti s anti-krysím IgG značeným biotinem (Vector) ředěným 1:75 v PBS nebo s anti-myším IgG (Vector) značeným biotinem a ředěným 1:75 v PBS. Sekce pak peroxidáza s primární monoklonálními protilátkami reagovaly po dobu jedné
141 • Λ ··· reagovaly po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti s komplexem křenová peroxidáza-avidin-biotin s komponenty kitu „A a „B ředěnými v poměru 1:75 v PBS (Vector Elitě Standard
Kit, vector Labs, Burlingame, CA).
Sekce se vyvíjely v 0,01 % peroxidu vodíku, 0,05 % 3,3'diaminobenzidinu (DAB) při teplotě místnsoti. Sekce určené pro inkubaci s protilátkami specifickými pro GFAP, MAC-l-AND MHC II se předem ošetřily s 0,6 % peroxidem vodíku při teplotě mísntosti, aby se blokovala endogenní peroxidáza, a pak se inkubivaly přes noc s primární protilátkou při teplot 4 °C. Sekce, které reagovaly s protilátkou GFAP, se inkubovaly po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti s anti-myší protilátkou připravenou imunizací koně ředěné v poměru 1:200 s TBS. Sekce dále reagovaly po dobu jedné hodiny s komplexem avidin-biotin-peroxidáza (Vector Laboratories, Vectastain Elitě ABC kit) ředěným 1:1 000 s TBS. Sekce, které se inkubovaly s monoklonální protilátkou specifickou pro MAC-1 nebo MHCII jako s primární protilátkou následně reagovaly po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti s anti-krysím IgG značeným biotinem připraveným v králíkovi ředěným v poměru 1:200 s TBS, pak následuje inkubace po dobu jedné hodiny s komplexem avidin-biotin-peroxidasa ředěném 1:1 000 s TBS. Sekce se inkubovaly s protilátkami specifickými pro GFAP, MAC1 a MHC Iia pak se vizualizovaly léčbou při teplotě místnsoti s 0,05 % DAB, 0,01 % peroxidem vodíku , 0,04 % chloridem nikelnatým, TBS po dobu 4 a 11 minut.
Imunologicky značené sekce se nanesly na skleněná sklíčka (VWR, sklíčka Superfrost), vzduchem sušená přes noc, namočené v roztoku Propar (Anatech) a překrytá krycími sklíčky za použití média Permount (Fisher).
Za účelem stanovení počtu plaků Αβ obarvením podsada GFAP pozitivních sekcí se nanesla na sklíčka Superfrost a inkubovaly se ve vodném 1 % Thoflavinu S (Sigma) po dobu 7 minut a pak následovalo imunohistochemické zpracování. Sekce
142 se pak dehydratovaly a čistily v roztoku Propar, pak se přidalo médium Permount a přikryly krycími sklíčky.
Zobrazovací analýza
Videometrický systém zobrazovací analýzy 150 (Oncor, lne.,
Gaithersburg, videokameru kvantifikaci
MD) spojený s Nikon Microphot-FX přes CCD a monitor Sony Trinitron se použil pro imunoreaktivních sklíček. Zobrazení sekce se uchovávalo v pufru vhodném pro video a stanovilo se prahové zabarveni a práh saturace, aby se vybral a vypočítal celková plocha pixelů pokrytých imunologicky značenou strukturou. V případě každé sekce se manuelně načrtl hippocampus a vypočítala se celková plocha obsazená pixely. Procentické zastoupení amyloidního uzle se měřilo jako (frakce hippocampalní oblasti, která obsahuje usazeniny Αβ imunoreaktivní s monoklonální protilátkou 3D6) x 100. Podobně procentové zastoupení neuritického uzle se měřilo jako (frakce hippocampální oblasti, která obsahuje dystrofické neurity reaktivní s monoklonální protilátkou 8E5) x 100. Systém CCranberry Township, PA) operující Software Application je spojen prostřednictvím kamery
Imaging (Compix, lne., s programem Simple 32 s mikroskopem Nikon Microphot-FX
Optronicsa použil se při kvantifikaci procenta retrospinálního kortexu obsazeném GFAP-pozitivními astrocyty a MAC-1 a MHC IIpozitivními mikroglii. Zobrazení imunoreaktivnísekce se uchovávalo v pufru vhodném pro video a stanovil se práh založený na monochromu, aby se vybral a vypočítal plocha celkového počtu pixelů obsazených imunologicky značenými buňkami. V případ každé sekce se manuálně načrtl retrospinální kortex (RSC) a vypočítala se celková plocha pixelů obsazená RSC. Procentické zastoupení astrocytů se definovalo jako: (frakce RSC obsazená GFAP-reaktivními astrocyty) x 100. Podobně microglióza vyjádřená v procentech se definovala jako: (frakce RSC obsazená MAC-lnebo MHC II-reaktivními mikroglii) x
143
* * 99 ·· · · 00 9 · 09
• • • · • ·
·· »·· · • ·· • · • · ··· 9990 9 9 · 0 9 09 99
100. V případě analýzy zobrazení se v případě každého zvířete kvantitativně hodnotilo šest sekcí na úrovní dorzálního hippocampusu, kdy každá je oddělena intervalem 24 gm. V každém případě osoba, která hodnotila sekce, neznala status léčby zvířat.
Z předchozích informací je zřejmé, že vynález popisuje řadu použití. Například vynález popisuje použití libovolných protilátek proti Αβ popsaných shora v textu při léčbě, profylaxi nebo diagnostice amyloidogenního onemocnění nebo při výrobě léku nebo diagnostického prostředku. Podobně vynález popisuje použití libovolných epitopických fragmentů Αβ popsaných shora v textu vhodných pro léčbu nebo profylaxi amyloidního onemocnění nebo při výrobě léku pro použití stejným způsobem.
9
999 99 999 9·99 99 999
IO o co σ> Xk <' Φ< td σ τ) nj
3
ρ;
- οχ
ro Xk ro _*. -J _*
tn o o tn σ Ο
O o o ο ο ο
O o o σ ο
O o o σ ο
< 3
Φ< Ρί
οχ
nj Φ
σ 3 ω fO tn σι tn •α
pí o O tn tn σ Ο
p- σ O σ ο ο
o O o ο ο
ro O σ> o o o σ ο
A Xk tn X A Xk 3 p: rt (V h 3 < οχ
X cr X V)< 3·
tr X cr
x X3 xa X £} - w φ cn O o> o tn o ο ο σι Ο 3. Ρί
ω o o o σ ο ΙΟ οχ
o o O ο ο Ρ·
L_l. o o O ο ο -*
A A A Φ 3 χ-
Xk Xk Xk pí Ω P' Ρί οχ Φ
X X X Η
cr rr rr N §
X xa X X3 X lO - <3 (D Xk o tn o tn O tn tn γο ο Ο 0) Φ
Xk CL o σ o ο ο CO
P o o o ο ο Ρ·
td o o o ο ο 3
A X A Xk X A Xk X 3 p: ox BS S 3 Ρί οχ jekcí
ΓΓ rr rr 0 Ν
x X X _ σ
o o xa tn fT>< 3 Φ ro to Xk ο ο Ο Xk Φ < Φ
o o O ο ο U
P· o o o ο ο Ρ ,
A Xk A Xk A Xk *< ž 3 O 3 Ρί οχ φ •Q Μ
X X X ití Φ
tT cr cr 3 Ο
x xa X O X n Pí 10 o tn tn tn tn Ο < Φ 3
a> X5 o σ o Ο ο tn Ρί'
P· o o o ο ο
o σ o ο ο
A Xk A Xk A A. 3 Ui< \ P O 3 *<
X X X o
rr or cr
X Q X xa X Q o tn o co tn tn σ
-xl o σ σ ο ο σ>
σ σ o ο σ
o o o ο ο
3
Ρί
οχ
• ro ro tn tn α> ,
tn o O ο ο Ο
o o σ ο ο -Ο
σ σ σ ο ο
o o o ο ο
3
Ρί
ΟΧ
ro Xk σ> σ> ο
o o σ ιο ο Ο
o oio to Ρ α>
o O ιο ιο Ιο
o o Ιοιοιο
Tabulka č. 1: Titr při 50 % maximální OD • · 0 0 0 · 0 00 · 0 ' • · 0 0 0 0 0 0 0 0 • •0 0 0 0 0 0 0 0 • 0000 0 0 · 000 0 0 0 0 ·· 0000 • · 0 ·· 00 000000

Claims (5)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    Použití protilátky, která se váže na Αβ, pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení onemocnění spojeného s amyloidními depozity Αβ v mozku pacienta.
    Použití podle nároku 1, ve kterém je onemocnění charakterizováno poruchami kognitivních funkcí.
    Použití podle nároku 1, ve kterém onemocnění je
    Alzheimerova nemoc.
    Použití podle nároku 1, ve kterém onemocnění je Downův syndrom. Použití podle nároku 1, ve kterém onemocnění je mírná porucha kognitivních funkcí. Použití podle nároku 1, ve kterém protilátka je lidský
    izotyp IgGl.
    Použití podle libovolného z předchozích nároků, ve kterém pacient je člověk.
    Použití podle libovolného z předchozích nároků, ve kterém se protilátka specificky váže na epitop ve zbytcích 1 až 10 Αβ.
    Použití podle libovolného z nároků 1 až 8, ve kterém se protilátka specificky váže na epitop ve zbytcích 1 až 6 Αβ.
    Použití podle libovolného z nároků 1 až 8, ve kterém se protilátka specificky váže na epitop ve zbytcích 1 až 5 Αβ.
    • · ·
    146 • · · ·· ··
    11. Použití podle libovolného z nároků 1 až 8, ve kterém se protilátka specificky váže na epitop ve zbytcích 1 až 7 Αβ.
    12. Použití podle libovolného z nároků 1 až 8, ve kterém se protilátka specificky váže na epitop ve zbytcích 3 až 7 Αβ.
    13. Použití podle libovolného z nároků 1 až 8, ve kterém se protilátka specificky váže na epitop ve zbytcích 1 až 3 Αβ.
    14. Použití podle libovolného z nároků 1 až 8, ve kterém se protilátka specificky váže na epitop ve zbytcích 1 až 4 Αβ.
    15. Použití podle libovolného z předchozích nároků, ve kterém se protilátka váže na amyloidní depozit u pacienta a vyvolává odezvu odstranění amyloidního depozitu.
    16. Použití podle nároku 15, ve kterém odezva odstranění je fagocytární odezva zprostředkovaná receptorem Fc.
    17. Použití podle libovolného z předchozích nároků, ve kterém se protilátka specificky váže na epitop obsahující volný Nterminální zbytek Αβ.
    18. Použití podle libovolného z předchozích nároků, ve kterém se protilátka specificky váže na epitop ve zbytcích 1 až 10 Αβ, přičemž zbytek 1 a/nebo zbytek 7 Αβ je kyselina isoaspartová.
    19. Použití podle libovolného z předchozích nároků, ve kterém pacient nevykazuje žádné symptomy.
    20. Použití podle libovolného z předchozích nároků, ve kterém pacient je mladší než 50 let.
    147
    21. Použití podle libovolného z předchozích nároků, ve kterém pacient vykazuje dědičný rizikový faktor, který indikuje náchylnost k Alzheimerovi nemoci.
    22. Použití podle libovolného z nároků 1 až 21, ve kterém pacient vykazuje neznámé rizikové faktory Alzheimerovi nemoci.
    23. Použití protilátka podle libovolného z předchozích je lidská protilátka. nároků, ve kterém 24. Použití protilátka podle libovolného z nároků 1 je humanizovaná protilátka. až 22, ve kterém 25. Použití protilátka podle libovolného z nároků 1 je chimerová protilátka. až 22, ve kterém 26. Použití protilátka podle libovolného z nároků 1 je myší protilátka. až 22, ve kterém 27. Použití protilátka podle libovolného z předchozích je polyklonální protilátka. nároků, ve kterém 28. Použití protilátka podle libovolného z nároků 1 je monoklonální protilátka. až 26, ve kterém 29. Použití podle libovolného z předchozích nároků, ve kterém
    léčivo dále obsahuje účinnou dávku aspoň jedné další protilátky, která se váže ba odlišný epitop Αβ.
    30. Použití podle nároků 1 až 5 nebo 7 až 28, v kterém izotyp protilátky je IgGl nebo IgG4.
    • · • · · • ·« · ·
    148
    31. Použití podle nároků 1 až 5 nebo 7 až 28, v kterém izotyp protilátky je IgG
  2. 2 nebo IgG
  3. 3.
    32. Použití podle libovolného z nároků 1 až 31, ve kterém protilátka obsahuje dvě kopie stejného páru lehkého a těžkého řetězce.
    33. Použití podle libovolného z nároků 1 až 31, ve kterém protilátka je bispecifickou protilátkou, která obsahuje první pár lehkého a těžkého řetězce, který se specificky váže na epitop Αβ, a druhý pár lehkého a těžkého řetězce, který se specificky váže na receptor Fc na mikrogliálních buňkách.
    34. Použití podle libovolného z předchozích nároků, ve kterém je řetězec protilátky fúzován s heterologním polypeptidem.
    35. Použití podle libovolného z předchozích nároků, ve kterém dávka léčiva obsahuje protilátku v množství alespoň 1 mg/kg tělesné hmotnosti.
    36. Použití podle nároku 35, ve kterém dávka léčiva obsahuje protilátku v množství alespoň 10 mg/kg tělesné hmotnosti.
    37. Použití podle libovolného z předchozích nároků, ve kterém léčivo je farmaceutický prostředek obsahující nosič.
    38. Použití podle nároků 1 až 23, 27 a 8 až 37, v kterém protilátka je lidská protilátka proti Αβ připravená z buněk B z člověka imunizovaného peptidem Αβ.
    39. Použití podle nároku 38, ve kterém člověk imunizovaný Αβ peptidem je pacient.
    • φ • * · φφφ · φ φ φ φ „ ···· φφφφφ
    149 · · ···· ♦ · · ··· · · • φφφφφ··· • φ · φ· ♦ · ······
    40. Použití podle libovolného z předchozích nároků, ve kterém se protilátka specificky váže na Αβ peptid, aniž dochází k navázání amyloidního prekurzorového proteinu plné délky (APP) .
    41. Použití podle libovolného z předchozích nároků, ve kterém se protilátka aplikuje intraperitoneálně, orálně, intranasálně, subkutánně, intramuskulámě, topicky nebo intravenozně.
    42. Použití polynukleotidu pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení onemocnění spojeného s amyloidními depozity Αβ v mozku pacienta, ve kterém se při podávání léčiva pacientovi polynukleotid exprimuje za vzniku aspoň jednoho řetězce protilátky v pacientovi.
    43. Použití podle nároku 42, ve kterém polynukleotid kóduje těžké nebo lehké řetězce protilátky, přičemž při podávání pacientovi se polynukleotid se exprimuje za vzniku těžkých a lehkých řetězců v pacientovi.
    44. Použití podle libovolného z předchozích nároků, který dále zahrnuje sledování množství aplikované látky v krvi pacienta.
    45. Použití podle libovolného z předchozích nároků, ve kterém se léčivo aplikuje ve více dávkách v období alespoň šesti měsíců.
    46. Použití podle libovolného z nároků 1 až 45, v kterém je léčivo nepřerušovaně se uvolňující prostředek.
    150 ·· * ·· ♦« ·· ·· • ♦ · · · & 0 · · 0 ·
  4. 4 4 9 9 4 4 9 9 4 4 9
  5. 9 4 4494 · 4 · 444 9 4 4 4
    4 4 4 4 9 4 9 9 4 •4 · ·· ·· 000000
    47. Použití polypeptidu obsahujícího N-terminální segment alespoň zbytků 1 až 5 Αβ, přičemž první zbytek k Αβ je terminální zbytek polypeptidu, který obsahuje neobsahuje Cterminální segment pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení onemocnění spojeného s amyloidními depozity Αβ v mozku pacienta.
    48. Použití podle charakterizováno nároku 47, ve kterém je poruchami kognitivních funkcí.
    onemocnění
    49. Použití podle nároku Alzheimerova nemoc.
    47, ve kterém onemocnění je
    50. Použití podle nároku 47, ve kterém onemocnění je Downův syndrom.
    51. Použití podle nároku 47, ve kterém onemocnění je mírná porucha kognitivních funkcí.
    52. Použití polypeptidu obsahujícího N-terminální segment Αβ, přičemž segment začíná zbytkem 1 až 3 Αβ a končí zbytky 7 až 11 Αβ pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení onemocnění spojeného s amyloidními depozity Αβ v mozku pacienta.
    53. Použití podle nároku 52, ve kterém je onemocnění charakterizováno poruchami kognitivních funkcí.
    54. Použití podle nároku 52, ve kterém onemocnění je
    Alzheimerova nemoc.
    syndrom.
    55. Použití podle nároku 52, ve kterém onemocnění je Downův
    151 fc ·»·· • fc • · · • fc ·· ·· fcfc • fcfc · • · · • fcfc • fcfc • fc fcfcfcfc
    56. Použití podle nároku 52, ve kterém onemocnění je mírná porucha kognitivních funkcí.
    57. Použití podle libovolného z nároků 47 až 56, ve kterém Nterminální segment Αβ je spojen svým C-koncem s heterologním polypeptidem.
    58. Použití podle nároku 57, ve kterém N-terminální segment zahrnuje aminokyselinou sekvenci DAEFRHD.
    59. Použití podle nároku 58, ve kterém polypeptid zahrnuje aminokyselinovou sekvenci DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL.
    60. Použití podle nároku 52, ve kterém N-terminální segment Αβ je spojen svým N-koncem s heterologním peptidem.
    61. Použití podle nároku 60, ve kterém polypeptid zahrnuje aminokyselinovou sekvenci AKXVAAWTLKAAADAEFRHD.
    62. Použití podle nároku 52, ve kterém N-terminální segment Αβ je spojen svými N- a C-konci s prvním a druhým heterologním peptidem.
    63. Použití podle nároku 52, ve kterém N-terminální segment Αβ je spojen svými N-koncem s heterologním peptidem a svým Ckoncem s alespoň jednou další kopií N-terminálního segmentu.
    64. Použití podle libovolného z nároků 57 až 61 a 63, ve kterém heterologní peptid vyvolává odezvu T-buňky proti heterolognímu polypeptidu a tím odezvu B buňky proti Nterminálnímu segmentu.
    152
    44 4 4« *44 *44 • * 4 4 4 4 4
    4 4444444 4 • · * 4 · 4 ·
    4* 4 44 44
    4444
    65. Použití podle nároku 52, ve kterém polypeptid dále obsahuje alespoň jednu další kopii N-terminálního segmentu.
    66. Použití podle nároku 53, ve kterém polypeptid obsahuje od N-konce k C-konci N-terminální segment Αβ, velké množství dalších kopií N-terminálního segmentu a heterologní aminokyselinový segment.
    67. Použití podle libovolného z nároků 47 až 66, ve kterém Nterminální segment obsahuje Αβ1-7
    68. Použití podle libovolného z nároků 47 až 57, 60 a 62, ve kterém N-terminální segment obsahuje Αβ3-7
    69. Použití podle libovolného z nároků 47 až 56, ve kterém polypeptid obsahuje Αβ1-7. 70. Použití podle libovolného z nároků 47 až 56, ve kterém polypeptid obsahuje Αβ3-7. 71. Použití podle libovolného z nároků 47 až 66, ve kterém
    polypeptid neobsahuje alespoň 5 C-terminálních aminokyselin v Αβ43.
    72. Použití podle libovolného z nároků 47 až 70, ve kterém léčivo dále obsahuje adjuvans pro zvýšení imunitní odezvy proti N-terminálnímu segmentu.
    73. Použití podle libovolného z nároků 47 až 70, ve kterém se adjuvans pro zvýšení imunitní odezvy proti N-terminálnímu segmentu podává před podáním léčiva.
    153 ·« «0 00 0 00 0 0 00 0
    0 0 0 0 0 0 0
    0 000000 0 0 0 0 0 0 0 0 ·· 00 00 0000
    74. Použití podle libovolného z nároků 47 až 70, ve kterém se adjuvans pro zvýšení imunitní odezvy proti N-terminálnímu segmentu podává po podání léčiva.
    0 75. Použití podle libovolného adjuvans je alum. z nároků 72 až 74, ve kterém 76. Použití podle libovolného adjuvans je MPL. z nároků 72 až 74, ve kterém 77. Použití podle libovolného adjuvans je QS-21. z nároků 72 až 74, ve kterém 78. Použití podle libovolného adjuvans je neúplné Freundovo z nároků adjuvans. 72 až 74, ve kterém 79. Použití podle libovolného z nároků 47 až 78 a , ve kterém
    dávka léčiva obsahuje množství polypeptidu větší než 10 mg.
    80. Použití činidla, které vyvolává imunogenní odezvu proti Nterminálnímu segmentu Αβ, což je segment začínající zbytkem 1 až 3 Αβ a končící zbytky 7 až 11 Αβ, aniž se vyvolá imunogenní odezva proti epitopu ve zbytcích 12 až 43 Αβ43 pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení onemocnění spojeného s amyloidními depozity Αβ v mozku pacienta.
    81. Použití podle nároku 80, ve kterém je onemocnění charakterizováno poruchami kognitivních funkcí.
    82. Použití podle nároku 80, ve kterém onemocnění je
    Alzheimerova nemoc.
    154 ·· · • · · · ♦ · · · · « ·· ·· ·♦ • · · ·· ····
    83. Použití podle nároku 80, ve kterém onemocnění je Downův syndrom.
    84. Použití podle nároku 80, ve kterém onemocnění je mírná porucha kognitivních funkcí.
    85. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ícísetím, že obsahuje polypeptid podle libovolného z nároků 47 až 70.
    86. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ícísetím, že obsahuje protilátku podle libovolného z nároků 1 až 18, 23 až 28, 30 až 34, 38 a 39.
    87. Způsob testování aktivity protilátky při léčení onemocnění spojného s amyloidními depozity Αβ v mozku pacienta, v y z n ačující se t im, s polypeptidem obsahujícím aminokyselin N-terminálního že zahrnuje kontakt protilátky alespoň pět pokračujících segmentu Αβ, který začíná zbytkem mezi 1 a 3 Αβ, přičemž polypeptid neobsahuje Cterminální segment Αβ a stanovení, zda se protilátka specificky váže na polypeptid, přičemž specifické navázání indikuje, že protilátka vykazuje aktivitu při léčbě Alzheimerovy nemoci.
    88. Způsob podle nároku 87, vyznačujícíse t im, že onemocnění je Alzheimerova nemoc.
    89. Způsob testování aktivity protilátky při odstranění biologické entity fyzikálně spojené s antigenem, vyznač ující se t im, že zahrnuje kombinování biologické entity spojené s antigenem, protilátky a fagocytových buněk nesoucích receptory Fc v médiu, sledování množství biologické entity spojené s antigenem zbývající v médiu, ·» · • · ♦ • · · ·
    155 i tm # · • · · snížení množství biologické aktivity spojené s antigenem indikující, že protilátka vykazuje aktivitu odstranění vůči antigenu.
    90. Způsob podle nároku 89, vyznačujícíse t ím, že v kroku sledování se sleduje množství antigenu zbývajícího v médiu.
    91. Způsob podle nároku 89 nebo 90, vyznačuj ící se t í m, že kombinování zahrnuje přidání biologické entity spojené s antigenem do média a kontakt média s fagocytárními buňkami, které nesou receptory Fc.
    92. Způsob podle nároku 89 až 91, vyznačující se t í m, že biologická entita spojená s antigenem slouží jako vzorek tkáně.
    93. Způsob podle nároku 89 až 92, vyznačující se t í m, že antigen je biologická entita.
    94. Způsob podle nároku 92, vyznačujícíse t ím, že vzorek tkáně obsahuje amyloidní depozit.
    95. Způsob podle libovolného z nároků 92 až 94, v y z n a č u jící se t ím, že vzorek tkáně je z mozku pacienta trpícího Alzheimerovou nemocí nebo savce, který vykazuje Alzheimerovu patologii.
    96. Způsob podle libovolného z nároků 89 až 95, v y z n a č u jící se t ím, že antigen je Αβ.
    97. Způsob podle libovolného z nároků 89 až 95, v y z n a č u jící se t ím, že fagocytární buňky jsou mikroglyální buňky.
    156 • · · « » · «
    4 ··«««* • · β ** ·
    98. Způsob podle libovolného z nároků 92 až 97, v y z n a č u jící se t ím, že vzorek tkáně se vybral ze skupiny zahrnující vzorek karcinogenní tkáně, vzorek tkáně infikované virem, vzorek tkáně obsahující zánětlivé buňky, nemaligní abnormální buněčný růst a vzorek tkáně obsahující abnormální extrabuněčnou matrici.
    99. Použití protilátky, která se specificky váže na epitop v aminokyselinách 1 až 10 Αβ pro přípravu reagentu pro detekci amyloidního depozitu.
    100. Použití podle nároku 99, ve kterém se protilátka váže na epitop ve zbytcích 4 až 10 Αβ.
    101. Použití podle nároku 99, ve kterém se protilátka váže na epitop ve zbytcích 8 až 10 Αβ.
    102. Použití podle libovolného z nároků 99 až 101, ve kterém je protilátka značena.
    103. Použití podle nároku 102, ve kterém je protilátka značena paramagnetickou značkou.
    104. Použití podle nároku 102, ve kterém se značená látka detekuje nukleární magnetickou rezonancí.
    105. Použití podle libovolného z nároků 99 až 104, ve kterém protilátce chybí kapacita vyvolat u pacienta odezvu odstranění při navázaní na amyloidní depozit.
    157 »· « ti.
    » · · · · « • · · i > « · • ····. « t • · · . · ·· *· ·· » 4 >44 4 ··« · 4 4 4 ♦ *44 *» ·· 4444
    106. Diagnostická sada, vyznačující se tím, že zahrnuje protilátku, která se specificky váže na epitop se zbytky 1 až 10 Αβ.
    107. Sada podle nároku 106, vyznačujícíse t í m, že dále zahrnuje značení popisující použití protilátky při diagnostice in vivo nebo sledování onemocnění, které je spojené s amylodními depozity Αβ v mozku pacienta.
CZ2001-3824A 1999-05-28 2000-05-26 Fragment Aβ vázaný k nosičovému peptidu, farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení onemocnění spojeného s amyloidními deposity Aβ v mozku pacienta jej obsahující a jeho použití CZ304876B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/322,289 US7964192B1 (en) 1997-12-02 1999-05-28 Prevention and treatment of amyloidgenic disease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20013824A3 true CZ20013824A3 (cs) 2002-11-13
CZ304876B6 CZ304876B6 (cs) 2014-12-29

Family

ID=23254226

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2001-3824A CZ304876B6 (cs) 1999-05-28 2000-05-26 Fragment Aβ vázaný k nosičovému peptidu, farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení onemocnění spojeného s amyloidními deposity Aβ v mozku pacienta jej obsahující a jeho použití

Country Status (38)

Country Link
US (6) US7964192B1 (cs)
EP (3) EP2108376B1 (cs)
JP (2) JP5580504B2 (cs)
KR (2) KR100961485B1 (cs)
CN (2) CN1359301B (cs)
AR (1) AR024074A1 (cs)
AT (1) ATE434444T1 (cs)
AU (1) AU5303100A (cs)
BG (2) BG65882B1 (cs)
BR (1) BR0011000A (cs)
CA (1) CA2370311C (cs)
CL (1) CL2010000018A1 (cs)
CO (1) CO5170495A1 (cs)
CZ (1) CZ304876B6 (cs)
DE (2) DE60042451D1 (cs)
EA (2) EA006630B1 (cs)
EE (1) EE05671B1 (cs)
ES (1) ES2624908T3 (cs)
GB (2) GB2368794B (cs)
HK (1) HK1045116B (cs)
HR (2) HRP20010877B1 (cs)
HU (1) HU230550B1 (cs)
IL (2) IL146435A0 (cs)
IS (1) IS6154A (cs)
MX (1) MXPA01011621A (cs)
MY (1) MY132784A (cs)
NO (3) NO337301B1 (cs)
NZ (1) NZ515403A (cs)
PE (1) PE20010191A1 (cs)
PL (1) PL200458B1 (cs)
SG (3) SG140456A1 (cs)
SK (1) SK287513B6 (cs)
TR (2) TR200202231T2 (cs)
TW (1) TWI263503B (cs)
UA (1) UA81215C2 (cs)
UY (1) UY26182A1 (cs)
WO (1) WO2000072880A2 (cs)
ZA (1) ZA200109487B (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ306683B6 (cs) * 2000-02-24 2017-05-03 Washington University Léčivo pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci

Families Citing this family (173)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1072897A (en) 1995-12-12 1997-07-03 Karolinska Innovations Ab Peptide binding the klvff-sequence of amyloid beta
AU743827B2 (en) * 1997-04-09 2002-02-07 Intellect Neurosciences, Inc. Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6743427B1 (en) 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20030147882A1 (en) 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
IL142948A0 (en) * 1999-09-03 2002-04-21 Univ Ramot Agents and compositions and methods utilizing same useful in diagnosing and/or treating or preventing plaque forming diseases
US20020094335A1 (en) * 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
EP1752472A3 (en) * 1999-12-08 2007-04-25 Intellect Neurosciences, Inc. Chimeric amyloid beta peptides
CA2393763A1 (en) * 1999-12-08 2001-06-14 Mindset Biopharmaceuticals (Usa), Inc. Chimeric peptides as immunogens, antibodies thereto, and methods for immunization using chimeric peptides or antibodies
MXPA02007796A (es) 2000-02-21 2003-12-08 Pharmexa As Metodo novedoso para la disminucion de cuerpos amiloides.
EP1259251B1 (en) * 2000-02-21 2005-10-19 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
AU7487301A (en) 2000-05-22 2001-12-03 Univ New York Synthetic immunogenic but non-amyloidogenic peptides homologous to amyloid beta for induction of an immune response to amyloid beta and amyloid deposits
WO2002003911A2 (en) 2000-07-07 2002-01-17 Lars Lannfelt Prevention and treatment of alzheimer's disease
AU1225702A (en) * 2000-09-19 2002-04-02 Evotec Neurosciences Gmbh Methods and compounds for treating brain amyloidosis
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
TWI255272B (en) * 2000-12-06 2006-05-21 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
WO2002068955A1 (en) 2001-02-23 2002-09-06 Elan Pharmaceuticals, Inc. Transgenic knockouts of bace-1
US7320790B2 (en) 2001-04-30 2008-01-22 Eli Lilly And Company Humanized antibodies
EP1385545B1 (en) * 2001-04-30 2009-01-07 Eli Lilly And Company Humanized antibodies recognizing the beta-amyloid peptide
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
EP1519740A4 (en) * 2001-08-17 2005-11-09 Lilly Co Eli FASTER IMPROVEMENT OF COGNITION IN DISEASES ASSOCIATED WITH A-BETA
CA2451998A1 (en) * 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company Anti-a.beta. antibodies
CA2457145C (en) * 2001-08-17 2010-12-21 Washington University Assay method for alzheimer's disease
WO2003016467A2 (en) * 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company Use of antibodies having high affinity for soluble ass to treat conditions and diseases related to ass
DK1944040T3 (da) 2001-08-17 2012-10-29 Univ Washington Analysefremgangsmåde for Alzheimers sygdom
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
WO2003045128A2 (en) 2001-11-21 2003-06-05 New York University SYNTHETIC IMMUNOGENIC BUT NON-DEPOSIT-FORMING POLYPEPTIDES AND PEPTIDES HOMOLOGOUS TO AMYLOID β, PRION PROTEIN, AMYLIN, α-SYNUCLEIN, OR POLYGLUTAMINE REPEATS FOR INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE THERETO
CA2500462A1 (en) * 2001-12-26 2004-03-25 Universidad De Zaragoza Polyclonal antibodies, preparation method thereof and use of same
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
EP2292247A3 (en) 2002-03-05 2011-10-05 Ramot at Tel Aviv University Ltd. Immunizing composition and method for inducing an immune response against the beta-secretase cleavage site of amyloid precursor protein
MY139983A (en) * 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
WO2003086310A2 (en) * 2002-04-12 2003-10-23 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Prevention of brain inflammation as a result of induced autoimmune response
PL209696B1 (pl) * 2002-04-19 2011-10-31 Univ Toronto Peptyd, kompozycja peptydowa, kompozycja immunogenna, zastosowania kompozycji immunogennej oraz sposób określania czy związek stanowi inhbitor odkładania się i tworzenia włókienek amyloidu
JP2005523335A (ja) * 2002-04-25 2005-08-04 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 高齢被検体の不安障害および気分障害の治療方法
EP1523499A2 (en) * 2002-07-24 2005-04-20 Innogenetics N.V. Fragments of beta-amyloid as targets for vaccination against alzheimer disease
US9535076B2 (en) * 2002-09-12 2017-01-03 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for eliciting an amyloid-selective immune response
PL377769A1 (pl) * 2002-10-09 2006-02-20 Rinat Neuroscience Corp. Sposób leczenia choroby Alzheimera z zastosowaniem przeciwciał skierowanych przeciw peptydowi beta amyloidu i ich kompozycje
US8697082B2 (en) 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
TW200509968A (en) 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8506959B2 (en) 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US20080014194A1 (en) 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
FR2846667B1 (fr) * 2002-11-06 2004-12-31 Pasteur Institut Fragments variables d'anticorps de camelides a chaine unique diriges contre le peptide beta-amyloide 1-42 et leurs applications pour le diagnostic et le traitement des maladies neuroagregatives
AT413945B (de) 2003-01-14 2006-07-15 Mattner Frank Dr Impfstoff für die alzheimer-krankheit
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
PL378571A1 (pl) 2003-02-01 2006-05-02 Neuralab Limited Czynna immunizacja dla wytworzenia przeciwciał przeciw rozpuszczalnemu A-ß
EP1596809B1 (en) 2003-02-10 2010-05-26 Applied Molecular Evolution, Inc. Abeta binding molecules
US8663650B2 (en) 2003-02-21 2014-03-04 Ac Immune Sa Methods and compositions comprising supramolecular constructs
US20060251675A1 (en) * 2003-03-17 2006-11-09 Michael Hagen Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
ES2246178B1 (es) * 2003-05-08 2007-03-01 Universidad De Zaragoza. Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas.
US7358331B2 (en) 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
EP1480041A1 (en) * 2003-05-22 2004-11-24 Innogenetics N.V. Method for the prediction, diagnosis and differential diagnosis of Alzheimer's disease
PE20050627A1 (es) 2003-05-30 2005-08-10 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo
JP4888876B2 (ja) * 2003-06-13 2012-02-29 田平 武 アルツハイマー病の治療のための組換えアデノ随伴ウィルスベクター
US7807171B2 (en) 2003-07-25 2010-10-05 Ac Immune Sa Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
US7674599B2 (en) 2003-11-08 2010-03-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples
CN1934127B (zh) * 2003-12-17 2015-08-19 杨森阿尔茨海默氏症免疫治疗公司 Αβ免疫原性肽载体-偶联物及其生产方法
UA93854C2 (ru) 2003-12-17 2011-03-25 Вайет Ллк Иммуногенный конъюгат и способ его получения
GB0410220D0 (en) 2004-05-07 2004-06-09 Kirkham Lea Ann Mutant pneumolysin proteins
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
AT500483B1 (de) 2004-07-13 2006-01-15 Mattner Frank Dr Set zur vorbeugung oder behandlung der alzheimer'schen erkrankung
US20060024667A1 (en) * 2004-07-29 2006-02-02 Karen Manucharyan Compositions and methods for Alzheimer's disease
SG190665A1 (en) 2004-07-30 2013-06-28 Rinat Neuroscience Corp Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
EA013752B1 (ru) 2004-08-09 2010-06-30 Элан Фармасьютикалз, Инк. Предупреждение и лечение синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний
JP2008509915A (ja) * 2004-08-11 2008-04-03 ウイスコンシン アラムナイ リサーチ フオンデーシヨン Ａβの効果を低減する方法およびそのための組成物
EP1787998A4 (en) * 2004-08-11 2008-08-27 Mitsubishi Chem Corp ANTIBODIES AND USE RELATING THERETO
US7294484B2 (en) 2004-08-27 2007-11-13 Wyeth Research Ireland Limited Production of polypeptides
TWI364458B (en) 2004-08-27 2012-05-21 Wyeth Res Ireland Ltd Production of tnfr-lg
US7335491B2 (en) 2004-08-27 2008-02-26 Wyeth Research Ireland Limited Production of anti-abeta
EA200700751A1 (ru) * 2004-10-05 2008-06-30 Элан Фарма Интернэшнл Лимитед Способы и композиции для улучшения продуцирования рекомбинантного белка
US8916165B2 (en) 2004-12-15 2014-12-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized Aβ antibodies for use in improving cognition
PE20061401A1 (es) * 2004-12-15 2006-12-23 Neuralab Ltd ANTICUERPOS Aß PARA MEJORAR LA COGNICION
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
WO2006113347A2 (en) * 2005-04-13 2006-10-26 The University Of Tennessee Research Foundation Diagnostic and therapeutic potential of immune globulin intravenous (igiv) products
MY148086A (en) 2005-04-29 2013-02-28 Rinat Neuroscience Corp Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
EP1879613B1 (en) * 2005-05-05 2011-11-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Peptide conjugate compositions and methods for the prevention and treatment of alzheimer's disease
EP1896504B1 (en) * 2005-06-17 2012-11-21 Wyeth LLC Methods of purifying fc region containing antibodies
CN102898519B (zh) 2005-11-30 2015-10-28 Abbvie公司 抗淀粉样β蛋白的单克隆抗体及其用途
PL2289909T3 (pl) 2005-11-30 2015-04-30 Abbvie Inc Sposób przeszukiwania, proces oczyszczania niedyfundujących oligomerów Abeta, selektywne przeciwciała przeciw niedyfundującym oligomerom Abeta i sposób wytwarzania tych przeciwciał
SI2289909T1 (sl) * 2005-11-30 2015-03-31 Abbvie Inc. Presejalni postopek, postopek za čiščenje nedifuzibilnih Abeta-oligomerov, selektivna protitelesa proti nedifuzibilnim Abeta-oligomerom in postopek za izdelavo protiteles
RS52004B (en) 2005-12-12 2012-04-30 F. Hoffmann-La Roche Ag ANTIBODIES AGAINST AMYLOID BETA WITH GLYCOSILATION IN THE VARIABLE REGION
KR101505201B1 (ko) 2005-12-12 2015-03-24 에이씨 이뮨 에스.에이. 치료적 특성을 갖는 베타 1-42 특이적인 단일클론성 항체
WO2007090126A2 (en) * 2006-01-30 2007-08-09 Invitrogen Corporation Compositions and methods for detecting and quantifying toxic substances in disease states
ZA200807228B (en) * 2006-02-24 2009-11-25 Chiesi Farma Spa Anti-amyloid immunogenic compositions, methods and uses
EP2325209A3 (en) 2006-03-23 2011-08-03 BioArtic Neuroscience AB Improved protofibril selective antibodies and the use thereof
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
JP2009538924A (ja) * 2006-06-01 2009-11-12 エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ａｐｐの神経活性断片
CL2007002070A1 (es) * 2006-07-14 2008-02-08 Ac Immune S A Genentech Inc Anticuerpo quimerico o humanizado, o fragmentos de ellos, que se adhieren especificamente a por lo menos un epitopo en la proteina beta-amiloide; molecula de acido nucleico que lo codifica; composicion que lo comprende; su uso para tratar enfermedade
KR20190003862A (ko) * 2006-07-14 2019-01-09 에이씨 이뮨 에스.에이. 아밀로이드 베타에 대해 인간화된 항체
EP3988566A1 (en) * 2006-07-14 2022-04-27 AC Immune SA Humanized antibody against amyloid beta
CN101611054B (zh) * 2006-10-02 2013-12-25 Ac免疫有限公司 针对淀粉状蛋白β的人源化抗体
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
EP2436696B8 (en) * 2007-01-05 2017-12-13 University of Zurich Anti-beta-amyloid antibody and uses thereof
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
DK2121754T3 (en) 2007-01-18 2015-02-23 Lilly Co Eli Pegylated amyloid BETA FAB
DK3067066T3 (da) 2007-02-23 2019-05-20 Prothena Biosciences Ltd Forebyggelse og behandling af synukleinopatisk og amyloidogenisk sygdom
US8147833B2 (en) * 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
PT3067066T (pt) 2007-02-23 2019-06-17 Univ California Prevenção e tratamento da doença sinucleinopática e amiloidogénica
US20100311767A1 (en) 2007-02-27 2010-12-09 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
ZA200905537B (en) 2007-03-01 2010-10-27 Probiodrug Ag New use of glutaminyl cyclase inhibitors
EP2142514B1 (en) 2007-04-18 2014-12-24 Probiodrug AG Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
CA2685372A1 (en) 2007-05-02 2008-11-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for stabilizing a protein
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
PL2182983T3 (pl) * 2007-07-27 2014-10-31 Janssen Alzheimer Immunotherap Leczenie chorób amyloidowych z wykorzystaniem humanizowanych przeciwciał specyficznych względem Abeta
EP2020602A1 (en) * 2007-08-02 2009-02-04 Araclon Biotech High sensitivty immunoassays and kits for the determination of peptides and proteins of biological interest
WO2009048539A2 (en) 2007-10-05 2009-04-16 Genentech, Inc. Monoclonal antibody
JO3076B1 (ar) * 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
AU2008345022B2 (en) 2007-12-28 2014-11-06 Prothena Biosciences Limited Treatment and prophylaxis of amyloidosis
EP2106802A1 (en) * 2008-04-02 2009-10-07 SIGMA-TAU Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A. Modified peptides as synthetic vaccines in amyloid-associated disease
AT506819B1 (de) 2008-06-12 2011-06-15 Affiris Forschungs Und Entwicklungs Gmbh Vakzin zur behandlung von alzheimer-krankheit
AT506820B1 (de) * 2008-06-12 2011-07-15 Affiris Forschungs Und Entwicklungs Gmbh Vakzine gegen alzheimer-krankheit
EP2145898A1 (en) * 2008-07-15 2010-01-20 CHIESI FARMACEUTICI S.p.A. Anti-amyloid immunogenic compositions, methods and uses
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
US8940276B2 (en) 2008-12-19 2015-01-27 Biogen Idec International Neuroscience Gmbh Human anti-alpha-synuclein antibodies
US8614297B2 (en) 2008-12-22 2013-12-24 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-idiotype antibody against an antibody against the amyloid β peptide
CA2753886C (en) 2009-03-02 2018-06-12 Catholic Healthcare West Diagnostic devices and methods of use
ES2548913T3 (es) 2009-09-11 2015-10-21 Probiodrug Ag Derivados heterocíclicos como inhibidores de glutaminil ciclasa
JP6026284B2 (ja) 2010-03-03 2016-11-16 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤
MA34025B1 (fr) 2010-03-03 2013-02-01 Boehringer Ingelheim Int Polypeptides se liant au bêta-a
JP5688745B2 (ja) 2010-03-10 2015-03-25 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼ（ｑｃ、ｅｃ２．３．２．５）の複素環阻害剤
EP2558494B1 (en) 2010-04-15 2018-05-23 AbbVie Inc. Amyloid-beta binding proteins
WO2011131748A2 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Probiodrug Ag Novel inhibitors
NZ606357A (en) 2010-07-30 2015-05-29 Genentech Inc Safe and functional humanized anti beta-amyloid antibody
WO2012020124A1 (en) 2010-08-12 2012-02-16 Ac Immune S.A. Vaccine engineering
US9062101B2 (en) 2010-08-14 2015-06-23 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
KR101854943B1 (ko) 2010-10-26 2018-05-04 에이씨 이뮨 에스.에이. 소수성 부분을 통해 변형된 펩티드를 포함하는 리포솜 기반 구조체
EP2646462B1 (en) 2010-11-29 2017-04-05 Akershus Universitetssykehus Methods and compositions for monitoring phagocytic activity
WO2012123563A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Probiodrug Ag Benz imidazole derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
PT2723379T (pt) 2011-06-23 2018-11-14 Univ Of Zuerich Moléculas de ligação anti-alfa-sinucleína
US9771617B2 (en) 2011-06-27 2017-09-26 Eisai R&D Management Co., Ltd. Microrna biomarkers indicative of alzheimer's disease
US8906382B2 (en) 2011-07-19 2014-12-09 New York University Method for treating amyloid disease
US9926353B2 (en) 2011-07-19 2018-03-27 New York University Immunotherapeutic modulation of amyloidogenic disease using non-fibrillogenic, non-amyloidogenic polymerized proteins and peptides
GB201113570D0 (en) 2011-08-05 2011-09-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
CN104334184B (zh) * 2011-10-28 2017-12-29 普罗典娜生物科学有限公司 识别α‑突触核蛋白的人源化抗体
JP2015504674A (ja) * 2012-01-11 2015-02-16 アリゾナ ボード オブ リージェンツ ア ボディ コーポレート オブ ザ ステイト オブ アリゾナ アクティング フォー アンド オン ビハーフ オブ アリゾナ ステイト ユニバーシティーＡｒｉｚｏｎａ Ｂｏａｒｄ Ｏｆ Ｒｅｇｅｎｔｓ， Ａ Ｂｏｄｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ Ａｃｔｉｎｇ Ｆｏｒ Ａｎｄ Ｏｎ Ｂｅｈａｌｆ Ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 神経疾患タンパク質の二重特異性抗体フラグメントおよび使用方法
CN104081416B (zh) * 2012-01-20 2018-10-02 A·安那普拉加达 用于客观地表征医学图像的方法和组合物
JP2015526409A (ja) * 2012-07-03 2015-09-10 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・ユーシー Ｃ−末端及び中心エピトープａ−ベータ抗体
WO2014037952A1 (en) * 2012-09-10 2014-03-13 Yeda Research And Development Co. Ltd At The Weizmann Institute Of Science Individualized immunomodulation therapy for neurodegenerative disorders, cns injury and age-related dementia
EP3689904A1 (en) 2013-03-13 2020-08-05 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
US9102752B2 (en) 2013-03-15 2015-08-11 United Biomedical, Inc. Peptide vaccine for prevention and immunotherapy of dementia of the Alzheimer's type
EP2873680A1 (en) 2013-11-13 2015-05-20 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligopeptide and methods for producing conjugates thereof
EP2873679A1 (en) 2013-11-13 2015-05-20 F.Hoffmann-La Roche Ag Camelid single-domain antibody directed against amyloid bêta and methods for producing conjugates thereof
WO2015165961A1 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Affiris Ag Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
CN104122400B (zh) * 2014-07-01 2016-03-02 上海依科赛生物制品有限公司 一种人体β淀粉样蛋白检测试剂盒及其用途
AU2015286824A1 (en) * 2014-07-07 2017-02-09 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Immunogenic products based on mutein amyloid SS (ASS) amino acid sequences and uses thereof
MX2017000378A (es) 2014-07-10 2017-08-25 Bioarctic Neuroscience Ab ANTICUERPOS DE UNION A PROTOFIBRILLAS BETA AMILOIDE (Aß) MEJORADOS.
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
IL302486A (en) 2015-06-24 2023-06-01 Hoffmann La Roche Antibodies against the transnephrine receptor with adapted affinity
MX2018003822A (es) 2015-10-02 2018-06-22 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos contra el cd20 humano y el receptor de transferrina humano y metodos de uso.
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
EP3374381A4 (en) * 2015-11-09 2019-05-15 The University Of British Columbia EPITAOPES IN THE CENTRAL REGION OF BETA-AMYLOID AND RELATED CONFORMATIONAL ANTIBODIES
CN108350053A (zh) 2015-11-09 2018-07-31 英属哥伦比亚大学 淀粉样蛋白β表位及其抗体
AU2016353552B2 (en) 2015-11-09 2022-01-06 The University Of British Columbia N-terminal epitopes in Amyloid beta and conformationally-selective antibodies thereto
US10188749B2 (en) 2016-04-14 2019-01-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to program therapeutic cells using targeted nucleic acid nanocarriers
AU2017259038B2 (en) 2016-05-02 2024-05-23 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing Tau
JP7170316B2 (ja) 2016-05-02 2022-11-14 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド タウ免疫療法
EP3452509A1 (en) 2016-05-02 2019-03-13 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
WO2018057999A1 (en) * 2016-09-22 2018-03-29 William Marsh Rice University Molecular hybridization probes for complex sequence capture and analysis
US20180125920A1 (en) 2016-11-09 2018-05-10 The University Of British Columbia Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions
CN110881274A (zh) 2017-05-02 2020-03-13 普罗塞纳生物科学有限公司 识别tau的抗体
SG11202001281WA (en) 2017-08-22 2020-03-30 Biogen Ma Inc Pharmaceutical compositions containing anti-beta amyloid antibodies
EP3461819B1 (en) 2017-09-29 2020-05-27 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase
US12018069B2 (en) 2018-06-28 2024-06-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compositions for imaging amyloid deposits
SG11202108414UA (en) 2019-03-03 2021-08-30 Prothena Biosciences Ltd Antibodies recognizing tau

Family Cites Families (364)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE878999A (fr) * 1979-09-26 1980-03-26 Herstal Sa Canon composite et procede pour sa fabrication
US4902506A (en) 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
CH652145A5 (de) 1982-01-22 1985-10-31 Sandoz Ag Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen.
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4634666A (en) 1984-01-06 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human-murine hybridoma fusion partner
US5158769A (en) 1984-03-07 1992-10-27 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US5417986A (en) 1984-03-16 1995-05-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Vaccines against diseases caused by enteropathogenic organisms using antigens encapsulated within biodegradable-biocompatible microspheres
US5208036A (en) 1985-01-07 1993-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4713366A (en) 1985-12-04 1987-12-15 The Ohio State University Research Foundation Antigenic modification of polypeptides
US5096706A (en) 1986-03-25 1992-03-17 National Research Development Corporation Antigen-based treatment for adiposity
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5278049A (en) 1986-06-03 1994-01-11 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Recombinant molecule encoding human protease nexin
US5231170A (en) 1986-08-27 1993-07-27 Paul Averback Antibodies to dense microspheres
US5187153A (en) 1986-11-17 1993-02-16 Scios Nova Inc. Methods of treatment using Alzheimer's amyloid polypeptide derivatives
US5220013A (en) 1986-11-17 1993-06-15 Scios Nova Inc. DNA sequence useful for the detection of Alzheimer's disease
US5223482A (en) 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
US4879213A (en) 1986-12-05 1989-11-07 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse
EP0279582A3 (en) 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
US4912206A (en) 1987-02-26 1990-03-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services CDNA clone encoding brain amyloid of alzheimer's disease
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
JPS63245689A (ja) * 1987-03-31 1988-10-12 Suntory Ltd ヒトアミロイド関連蛋白モノクロ−ナル抗体
US4883666A (en) * 1987-04-29 1989-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5583112A (en) 1987-05-29 1996-12-10 Cambridge Biotech Corporation Saponin-antigen conjugates and the use thereof
US5245015A (en) 1991-04-26 1993-09-14 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5869054A (en) 1987-06-24 1999-02-09 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of autoantigens
US5641474A (en) 1987-06-24 1997-06-24 Autoimmune, Inc. Prevention of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5645820A (en) 1987-06-24 1997-07-08 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5571499A (en) 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5849298A (en) 1987-06-24 1998-12-15 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of bovine myelin
US5571500A (en) 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases through administration by inhalation of autoantigens
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5231000A (en) * 1987-10-08 1993-07-27 The Mclean Hospital Antibodies to A4 amyloid peptide
US5089603A (en) 1989-06-21 1992-02-18 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted iga
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5576184A (en) * 1988-09-06 1996-11-19 Xoma Corporation Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
EP0442926A1 (en) 1988-11-10 1991-08-28 Imperial Cancer Research Technology Limited Polypeptides
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
ES2055785T3 (es) 1989-01-17 1994-09-01 Eniricerche Spa Peptidos sinteticos y su uso como vehiculos universales para la preparacion de conjugados inmunogenos aptos para el desarrollo de vacunas sinteticas.
US5227159A (en) * 1989-01-31 1993-07-13 Miller Richard A Anti-idiotype antibodies reactive with shared idiotopes expressed by B cell lymphomas and autoantibodies
US5262332A (en) 1989-04-05 1993-11-16 Brigham And Women's Hospital Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
EP0463151B1 (en) 1990-01-12 1996-06-12 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
JPH05506990A (ja) 1990-04-24 1993-10-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア プロテアーゼ　ネキシン―２の精製、検出、及び使用方法
JP2980677B2 (ja) 1990-04-27 1999-11-22 マクマイケル，ジョン 不正常なアミロイドβタンパク質と関連する中枢神経系疾患状態の治療のための方法および組成物
US5753624A (en) 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
GB9009548D0 (en) * 1990-04-27 1990-06-20 Celltech Ltd Chimeric antibody and method
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
ES2109945T3 (es) 1990-06-01 1998-02-01 Chiron Corp Composiciones y procedimientos para identificar moleculas biologicamente activas.
US5593970A (en) 1990-06-11 1997-01-14 Biochem Pharma Inc. Heterocyclic anthracycline analogs
CA2085127C (en) 1990-06-15 2002-12-10 Barbara Cordell Transgenic non-human mammal displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease
CA2085897A1 (en) 1990-06-19 1991-12-20 George Pieczenik Nonpathogenic variant virus
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
AU665190B2 (en) 1990-07-10 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5780587A (en) 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
DE69127627T2 (de) 1990-08-29 1998-02-19 Genpharm Int Produktion und Nützung nicht-menschliche transgentiere zur Produktion heterologe Antikörper
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
NZ239643A (en) 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
US5702906A (en) 1990-09-25 1997-12-30 Genentech, Inc. Antibodies to neurotrophic factor-4 (NT-4)
JP3583420B2 (ja) 1990-10-05 2004-11-04 メダレツクス・インコーポレーテツド 二特異的試薬を用いた標的免疫化
GB9023352D0 (en) 1990-10-26 1990-12-05 Lynxvale Ltd Vaccinia vectors,vaccinia genes and expression products thereof
WO1992013069A1 (en) 1991-01-21 1992-08-06 Imperial College Of Science, Technology & Medicine Test and model for alzheimer's disease
PT501882E (pt) 1991-03-01 2000-12-29 Merial Sas Processo de imunoneutralizacao anti-lhrm de animais domesticos machos nao castrados e peptido para esse fim
US5192753A (en) 1991-04-23 1993-03-09 Mcgeer Patrick L Anti-rheumatoid arthritic drugs in the treatment of dementia
CA2086831C (en) 1991-05-08 1999-03-16 Reinhard Gluck Immunostimulating and immunopotentiating reconstituted influenza virosomes and vaccines containing them
DE69230142T2 (de) 1991-05-15 2000-03-09 Cambridge Antibody Technology Ltd. Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
US5858657A (en) 1992-05-15 1999-01-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
US5434050A (en) 1991-08-13 1995-07-18 Regents Of The University Of Minnesota Labelled β-amyloid peptide and methods of screening for Alzheimer's disease
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
WO1993006121A1 (en) 1991-09-18 1993-04-01 Affymax Technologies N.V. Method of synthesizing diverse collections of oligomers
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5837268A (en) 1991-10-16 1998-11-17 University Of Saskatchewan GnRH-leukotoxin chimeras
AU3328493A (en) 1991-12-17 1993-07-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5679348A (en) 1992-02-03 1997-10-21 Cedars-Sinai Medical Center Immunotherapy for recurrent HSV infections
EP0625910B1 (en) 1992-02-11 2003-07-23 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Dual carrier immunogenic construct
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5604102A (en) 1992-04-15 1997-02-18 Athena Neurosciences, Inc. Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors
US5441870A (en) 1992-04-15 1995-08-15 Athena Neurosciences, Inc. Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein
US5851787A (en) 1992-04-20 1998-12-22 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding amyloid precursor-like protein and uses thereof
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
DK0652758T3 (da) 1992-06-18 2000-05-08 Harvard College Diferitoxin-vacciner
ES2108278T3 (es) 1992-06-25 1997-12-16 Smithkline Beecham Biolog Composicion de vacuna con coadyuvantes.
US5766846A (en) 1992-07-10 1998-06-16 Athena Neurosciences Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production
US5837672A (en) 1992-07-10 1998-11-17 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide
US6610493B1 (en) 1993-06-17 2003-08-26 Brigham And Women's Hospital Screening compounds for the ability to alter the production of amyloid-β peptide
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
HUT71860A (en) 1992-08-27 1996-02-28 Deakin Res Ltd Retro-, inverso-, and retro-inverso synthetic peptide analogues
HUT72495A (en) 1992-10-01 1996-05-28 Cold Spring Harbor Lab Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5958883A (en) 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
AU5358494A (en) 1992-10-13 1994-05-09 Duke University Method of inhibiting binding of amyloid precursor protein to beta-amyloid protein
ATE474224T1 (de) 1992-10-26 2010-07-15 Elan Pharm Inc Verfahren zur identifizierung von hemmstoffverbindungen der freisetzung von beta- amyloidpeptid (bap)
US5605811A (en) 1992-10-26 1997-02-25 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein
US5972336A (en) 1992-11-03 1999-10-26 Oravax Merieux Co. Urease-based vaccine against helicobacter infection
US6210671B1 (en) 1992-12-01 2001-04-03 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with L-selectin
US5674703A (en) 1992-12-02 1997-10-07 Woo; Savio L. C. Episomal vector systems and related methods
EP0672142B1 (en) 1992-12-04 2001-02-28 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
WO1994016731A1 (en) 1993-01-22 1994-08-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Ganglioside-klh conjugate vaccines with qs-21
EP1308461A3 (en) 1993-01-25 2004-02-11 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to beta-amyloids or their derivatives and use thereof
US5955317A (en) 1993-01-25 1999-09-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to β-amyloids or their derivatives and use thereof
US5358708A (en) 1993-01-29 1994-10-25 Schering Corporation Stabilization of protein formulations
US5472693A (en) 1993-02-16 1995-12-05 The Dow Chemical Company Family of anti-carcinoembryonic antigen chimeric antibodies
CA2115811A1 (en) 1993-02-17 1994-08-18 Claus Krebber A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
CA2115900A1 (en) * 1993-02-22 1994-08-23 Gerald W. Becker Pharmaceutical screens and antibodies
WO1994021680A1 (en) 1993-03-17 1994-09-29 The Government Of The United States Of America As Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide, and their uses in vaccines and disease treatments
AU6414994A (en) 1993-03-18 1994-10-11 Cytimmune Sciences, Inc. Composition and method for reducing toxicity of biologically-active factors
WO1994021292A1 (en) 1993-03-23 1994-09-29 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccine compositions containing 3-o deacylated monophosphoryl lipid a
IT1270939B (it) 1993-05-11 1997-05-26 Angeletti P Ist Richerche Bio Procedimento per la preparazione di immunogeni e reagenti diagnostici,e immunogeni e reagenti diagnostici cosi' ottenibili.
US5723130A (en) 1993-05-25 1998-03-03 Hancock; Gerald E. Adjuvants for vaccines against respiratory syncytial virus
AU7043894A (en) 1993-05-28 1994-12-20 Miriam Hospital, The Composition and method for (in vivo) imaging of amyloid deposits
DK0700445T3 (da) 1993-06-04 2002-05-13 Whitehead Biomedical Inst Stressproteiner og anvendelser deraf
US5464823A (en) 1993-07-20 1995-11-07 The Regents Of The University Of California Mammalian antibiotic peptides
JPH08503490A (ja) 1993-08-18 1996-04-16 モルフォシス・ゲゼルシャフト・フュア・プロタインオプティミールング・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング リポ多糖結合性および中和能のあるペプチド
JPH09501936A (ja) 1993-08-26 1997-02-25 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 生物活性ペプチドをコードする裸のポリヌクレオチドを投与するための方法、組成物および装置
DK96493D0 (da) 1993-08-26 1993-08-26 Mouritsen Og Elsner Aps Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden
WO1995006407A1 (en) 1993-08-30 1995-03-09 The Regents Of The University Of California Novel component of amyloid in alzheimer's disease and methods for use of same
CA2171336C (en) 1993-09-07 2011-06-21 Stephen Dudley Holmes Recombinant il4 antibodies useful in treatment of il4 mediated disorders
US5652334A (en) 1993-09-08 1997-07-29 City Of Hope Method for design of substances that enhance memory and improve the quality of life
US5385887A (en) 1993-09-10 1995-01-31 Genetics Institute, Inc. Formulations for delivery of osteogenic proteins
AU698962B2 (en) 1993-09-14 1998-11-12 Epimmune, Inc. Alteration of immune response using pan DR-binding peptides
US5470951A (en) 1993-09-29 1995-11-28 City Of Hope Peptides for antagonizing the effects of amyloid βprotein
US5858981A (en) 1993-09-30 1999-01-12 University Of Pennsylvania Method of inhibiting phagocytosis
AU7979094A (en) 1993-10-22 1995-05-08 Genentech Inc. Methods and compositions for microencapsulation of adjuvants
GB2298863B (en) 1993-11-02 1998-03-11 Affymax Tech Nv Apparatus and process for the synthesis of diverse compounds especially for generating and screening compound libraries
US5744368A (en) 1993-11-04 1998-04-28 Research Foundation Of State University Of New York Methods for the detection of soluble amyloid β-protein (βAP) or soluble transthyretin (TTR)
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5434170A (en) 1993-12-23 1995-07-18 Andrulis Pharmaceuticals Corp. Method for treating neurocognitive disorders
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5914349A (en) 1994-01-10 1999-06-22 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Compositions containing and methods of using 1-aminoindan and derivatives thereof and process for preparing optically active 1-aminoindan derivatives
US5877399A (en) 1994-01-27 1999-03-02 Johns Hopkins University Transgenic mice expressing APP-Swedish mutation develop progressive neurologic disease
AU1909695A (en) 1994-01-27 1995-08-15 Regents Of The University Of Minnesota Transgenic non-human mammals with progressive neurologic disease
AU692237B2 (en) 1994-02-03 1998-06-04 Picower Institute For Medical Research, The Compositions and methods for advanced glycosylation endproduct-mediated modulation of amyloidosis
AUPM411994A0 (en) * 1994-02-25 1994-03-24 Deakin Research Limited Epitopes
US5795954A (en) 1994-03-04 1998-08-18 Genentech, Inc. Factor VIIa inhibitors from Kunitz domain proteins
US6270757B1 (en) 1994-04-21 2001-08-07 Genetics Institute, Inc. Formulations for IL-11
US6372716B1 (en) 1994-04-26 2002-04-16 Genetics Institute, Inc. Formulations for factor IX
CA2189634A1 (en) 1994-05-06 1995-11-16 John J. Baldwin Combinatorial dihydrobenzopyran library
EP0760676B1 (en) * 1994-05-25 2001-07-11 McMICHAEL, John Materials and methods for treatment of plaquing diseases
US5505947A (en) 1994-05-27 1996-04-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Attenuating mutations in Venezuelan Equine Encephalitis virus
US5622701A (en) 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
US5663046A (en) 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
US5798100A (en) 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US6417178B1 (en) 1994-07-19 2002-07-09 University Of Pittsburgh Amyloid binding nitrogen-linked compounds for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease, in vivo imaging and prevention of amyloid deposits
CA2195642A1 (en) 1994-07-27 1996-02-08 Andreas Suhrbier Polyepitope vaccines
WO1996008565A2 (en) 1994-09-16 1996-03-21 Cancer Research Fund Of Contra Costa RECOMBINANT PEPTIDES DERIVED FROM THE Mc3 ANTI-BA46 ANTIBODY, METHODS OF USE THEREOF, AND METHODS OF HUMANIZING ANTIBODY PEPTIDES
US5872005A (en) 1994-11-03 1999-02-16 Cell Genesys Inc. Packaging cell lines for adeno-associated viral vectors
US6114133A (en) 1994-11-14 2000-09-05 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41)
US5589154A (en) * 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
US5688651A (en) 1994-12-16 1997-11-18 Ramot University Authority For Applied Research And Development Ltd. Prevention of protein aggregation
AU695129B2 (en) 1995-02-06 1998-08-06 Genetics Institute, Llc Formulations for IL-12
US5786180A (en) 1995-02-14 1998-07-28 Bayer Corporation Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide
US5624937A (en) 1995-03-02 1997-04-29 Eli Lilly And Company Chemical compounds as inhibitors of amyloid beta protein production
US5854215A (en) 1995-03-14 1998-12-29 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of β-amyloid peptide aggregation
US6303567B1 (en) 1995-03-14 2001-10-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc . Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5817626A (en) 1995-03-14 1998-10-06 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of beta-amyloid peptide aggregation
CA2214247C (en) 1995-03-14 2004-02-10 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of amyloid aggregation
WO1996029421A1 (en) 1995-03-23 1996-09-26 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Vectors for gene delivery
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
CA2222055A1 (en) 1995-05-23 1996-11-28 Morphosys Gesellschaft Fur Proteinoptimierung Mbh Multimeric proteins
US5948763A (en) 1995-06-07 1999-09-07 New York University Peptides and pharmaceutical compositions thereof for treatment of disorders or diseases associated with abnormal protein folding into amyloid or amyloid-like deposits
US5910427A (en) 1995-06-22 1999-06-08 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Antigen non-specific glycosylation inhibiting factor derivatives
SI0750907T1 (en) 1995-06-30 2002-08-31 American Cyanamid Company Stable macrolide and macrolide vaccine compositions
ATE305039T1 (de) 1995-07-07 2005-10-15 Darwin Molecular Corp Auf chromosom 1 lokalisiertes gen dessen genprodukt mit der alzheimerschen krankheit assoziiert ist.
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
AUPN443995A0 (en) 1995-07-27 1995-08-17 Csl Limited Papillomavirus polyprotein
US6685940B2 (en) 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
US5824322A (en) 1995-08-21 1998-10-20 Cytrx Corporation Compositions and methods for growth promotion
DE69632056T2 (de) 1995-09-14 2004-12-30 The Regents Of The University Of California, Oakland Für natives prp-sc spezifische antikörper
US5731284A (en) 1995-09-28 1998-03-24 Amgen Inc. Method for treating Alzheimer's disease using glial line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US5985242A (en) 1995-10-27 1999-11-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5750361A (en) 1995-11-02 1998-05-12 The Regents Of The University Of California Formation and use of prion protein (PRP) complexes
AU705688B2 (en) 1995-11-10 1999-05-27 Cytogen Corporation Peptides which enhance transport across tissues and methods of identifying and using the same
WO1997018855A1 (en) 1995-11-21 1997-05-29 Eduard Naumovich Lerner Device for enhanced delivery of biologically active substances and compounds in an organism
AU1072897A (en) 1995-12-12 1997-07-03 Karolinska Innovations Ab Peptide binding the klvff-sequence of amyloid beta
JPH09178743A (ja) * 1995-12-27 1997-07-11 Oriental Yeast Co Ltd 可溶性ａｐｐの定量法
US6015662A (en) 1996-01-23 2000-01-18 Abbott Laboratories Reagents for use as calibrators and controls
US5770700A (en) 1996-01-25 1998-06-23 Genetics Institute, Inc. Liquid factor IX formulations
US6096313A (en) 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
JP2000505306A (ja) 1996-02-26 2000-05-09 モルフォシス・アクチェンゲゼルシャフト ２つまたはそれ以上の相互作用性（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列の新規同定方法
US6150091A (en) 1996-03-06 2000-11-21 Baylor College Of Medicine Direct molecular diagnosis of Friedreich ataxia
KR20000005120A (ko) 1996-03-29 2000-01-25 스칸드레트 존 디 파라폭스바이러스 벡터
JP2000509022A (ja) 1996-04-03 2000-07-18 アナージェン，インコーポレイテッド 糖尿病の処置および予防のための環状ペプチドワクチン
AU735733B2 (en) 1996-04-19 2001-07-12 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Antigenically reactive regions of the hepatitis A virus polyprotein
US6284533B1 (en) 1996-05-01 2001-09-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Plasmid-based vaccine for treating atherosclerosis
JP2000516452A (ja) 1996-07-16 2000-12-12 プリュックテュン，アンドレアス 可溶性が増大した免疫グロブリンスーパーファミリードメインおよびフラグメント
EP0960204A4 (en) 1996-07-26 2002-01-23 Sloan Kettering Inst Cancer METHODS AND REAGENTS FOR GENETIC IMMUNIZATION
US7147851B1 (en) 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
ATE298765T1 (de) 1996-08-27 2005-07-15 Praecis Pharm Inc Beta-amyloid peptidaggregation regulierende peptide mit d-aminosäuren
US6057367A (en) 1996-08-30 2000-05-02 Duke University Manipulating nitrosative stress to kill pathologic microbes, pathologic helminths and pathologically proliferating cells or to upregulate nitrosative stress defenses
US6797495B2 (en) 1996-11-05 2004-09-28 The Regents Of The University Of California Somatic cells with ablated PrP gene and methods of use
US6022859A (en) 1996-11-15 2000-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Inhibitors of β-amyloid toxicity
WO1998022120A1 (en) 1996-11-19 1998-05-28 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Diagnostic and therapeutic reagents for alzheimer's disease
US6962984B2 (en) 1996-12-05 2005-11-08 Nihon University IgA nephropathy-related DNA
US20030068316A1 (en) 1997-02-05 2003-04-10 Klein William L. Anti-ADDL antibodies and uses thereof
US6218506B1 (en) 1997-02-05 2001-04-17 Northwestern University Amyloid β protein (globular assembly and uses thereof)
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
CA2278547A1 (en) 1997-03-03 1998-09-11 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Small molecules useful in the treatment of inflammatory disease
US5798102A (en) 1997-03-04 1998-08-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Treatment of cardiomyopathy
EP1005368B1 (en) 1997-03-10 2009-09-02 Ottawa Hospital Research Institute Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide in combination with alum as adjuvants
US8173127B2 (en) 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
AU743827B2 (en) * 1997-04-09 2002-02-07 Intellect Neurosciences, Inc. Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
US20020086847A1 (en) 1997-04-09 2002-07-04 Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
US6787319B2 (en) 1997-04-16 2004-09-07 American Home Products Corp. β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same
US6339068B1 (en) 1997-05-20 2002-01-15 University Of Iowa Research Foundation Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
EP0999853B1 (en) 1997-06-13 2003-01-02 Genentech, Inc. Stabilized antibody formulation
WO1999000150A2 (en) 1997-06-27 1999-01-07 Regents Of The University Of California Drug targeting of a peptide radiopharmaceutical through the primate blood-brain barrier in vivo with a monoclonal antibody to the human insulin receptor
CA2297070A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Morphosys Ag Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
US7078191B1 (en) 1997-08-01 2006-07-18 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Composition and method for the detection of diseases associated with amyloid-like fibril or protein aggregate formation
ATE435661T1 (de) 1997-08-29 2009-07-15 Antigenics Inc Adjuvant qs-21 enthaltende zusammensetzungen mit polysorbate oder cyclodextrin als hilfsmittel
US6175057B1 (en) 1997-10-08 2001-01-16 The Regents Of The University Of California Transgenic mouse model of alzheimer's disease and cerebral amyloid angiopathy
US20010016053A1 (en) * 1997-10-10 2001-08-23 Monte A. Dickson Multi-spectral imaging sensor
US6710226B1 (en) * 1997-12-02 2004-03-23 Neuralab Limited Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6923964B1 (en) 1997-12-02 2005-08-02 Neuralab Limited Active immunization of AScr for prion disorders
US7179892B2 (en) 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6913745B1 (en) * 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US6743427B1 (en) 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
WO1999027949A1 (en) * 1997-12-03 1999-06-10 Brigham And Women's Hospital METHOD OF SUPPRESSING β-AMYLOID-RELATED CHANGES IN ALZHEIMER'S DISEASE
FR2777015B3 (fr) 1998-02-23 2000-09-15 Financ De Biotechnologie Procede et moyens pour l'obtention de modeles cellulaires et animaux de maladies neurodegeneratives
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20050059591A1 (en) 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20050059802A1 (en) 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
ES2230848T3 (es) 1998-04-28 2005-05-01 Smithkline Beecham Corporation Anticuerpos monoclonales con inmunogenicidad reducida.
US20030147882A1 (en) 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US6432710B1 (en) 1998-05-22 2002-08-13 Isolagen Technologies, Inc. Compositions for regenerating tissue that has deteriorated, and methods for using such compositions
US6727349B1 (en) 1998-07-23 2004-04-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Recombinant anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor
US6126967A (en) * 1998-09-03 2000-10-03 Ascent Pediatrics Extended release acetaminophen particles
MXPA01003503A (es) 1998-10-05 2005-01-14 Pharmexa As Nuevos metodos terapeuticos de vacunacion.
CA2354862A1 (en) 1998-10-19 2000-04-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Treatment of systemic lupus erythematosus by down-regulating the autoimmune response to autoantigens
US7112661B1 (en) 1998-10-30 2006-09-26 The Research Foundation Of State University Of New York Variable heavy chain and variable light chain regions of antibodies to human platelet glycoprotein Ib alpha
GB2348203B (en) 1998-11-04 2002-06-19 Imp College Innovations Ltd Solube beta-forms of prion proteins, methods of preparation and use
CN1332641A (zh) 1999-01-19 2002-01-23 法玛西雅厄普约翰美国公司 γ－照射消毒的聚乙烯包装
EP1146898A1 (en) 1999-01-22 2001-10-24 Matthew John During Vaccine-mediated treatment of neurological disorders
US7629311B2 (en) 1999-02-24 2009-12-08 Edward Lewis Tobinick Methods to facilitate transmission of large molecules across the blood-brain, blood-eye, and blood-nerve barriers
US7282570B2 (en) 1999-04-20 2007-10-16 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
ATE384077T1 (de) 1999-05-05 2008-02-15 Neurochem Int Ltd Stereoselektive antifibrillogene peptide
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
PE20010212A1 (es) 1999-06-01 2001-02-22 Neuralab Ltd Composiciones del peptido a-beta y procesos para producir las mismas
ATE405636T1 (de) 1999-06-16 2008-09-15 Boston Biomedical Res Inst Immunologische kontrolle des beta-amyloid gehaltes in vivo
HUP0301349A3 (en) 1999-07-15 2005-12-28 Genetics Inst Llc Cambridge Formulations for il-11
DE60016227T2 (de) 1999-08-04 2005-12-15 Northwestern University, Evanston Globularer aufbau vom amyloid-beta- protein und deren verwendungen
IL142948A0 (en) 1999-09-03 2002-04-21 Univ Ramot Agents and compositions and methods utilizing same useful in diagnosing and/or treating or preventing plaque forming diseases
US6294171B2 (en) 1999-09-14 2001-09-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Methods for treating disease states comprising administration of low levels of antibodies
US6824780B1 (en) 1999-10-29 2004-11-30 Genentech, Inc. Anti-tumor antibody compositions and methods of use
CN1433321A (zh) 1999-11-29 2003-07-30 尼奥切姆公司 预防和治疗Alzheimer症和其他与淀粉样蛋白有关的疾病的疫苗
US20020094335A1 (en) 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
CA2393763A1 (en) 1999-12-08 2001-06-14 Mindset Biopharmaceuticals (Usa), Inc. Chimeric peptides as immunogens, antibodies thereto, and methods for immunization using chimeric peptides or antibodies
US6399314B1 (en) 1999-12-29 2002-06-04 American Cyanamid Company Methods of detection of amyloidogenic proteins
MXPA02007796A (es) 2000-02-21 2003-12-08 Pharmexa As Metodo novedoso para la disminucion de cuerpos amiloides.
EP1259251B1 (en) 2000-02-21 2005-10-19 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
AU4178601A (en) 2000-02-24 2001-09-03 Univ Washington Humanized antibodies that sequester abeta peptide
AU2001253158A1 (en) 2000-04-05 2001-10-23 University Of Tennessee Research Corporation Methods of investigating, diagnosing, and treating amyloidosis
DE60134499D1 (de) 2000-04-13 2008-07-31 Corixa Corp Immunostimulierende zusammnensetzungen die aminoalkyl glucosaminidephosphat und qs-21 enthalten
KR100360985B1 (ko) 2000-04-26 2002-11-18 주식회사 동진쎄미켐 레지스트 스트리퍼 조성물
AU7487301A (en) 2000-05-22 2001-12-03 Univ New York Synthetic immunogenic but non-amyloidogenic peptides homologous to amyloid beta for induction of an immune response to amyloid beta and amyloid deposits
WO2002003911A2 (en) 2000-07-07 2002-01-17 Lars Lannfelt Prevention and treatment of alzheimer's disease
EP1172378A1 (en) 2000-07-12 2002-01-16 Richard Dr. Dodel Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease
US20020009445A1 (en) 2000-07-12 2002-01-24 Yansheng Du Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease
US20030092145A1 (en) 2000-08-24 2003-05-15 Vic Jira Viral vaccine composition, process, and methods of use
PT1317479E (pt) 2000-09-06 2009-10-29 Univ Pasteur Métodos e composições para doenças associadas à amiloidose
IT1319277B1 (it) 2000-10-24 2003-09-26 Chiesi Farma Spa Proteine di fusione utili per il trattamento di immunizzazione dellamalattia di alzheimer.
IL139308A0 (en) 2000-10-26 2001-11-25 Marikovsky Moshe Peptides from amyloid precursor protein which inhibit tumor growth and metastasis
WO2002064084A2 (en) 2000-11-02 2002-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. In vivo multiphoton diagnostic detection and imaging of a neurodegenerative disease
DE60126980T2 (de) 2000-11-27 2007-11-08 Praecis Pharmaceuticals Inc., Waltham Therapeutische agentien und methoden ihrer verwendung zur behandlung von amyloidogenen erkrankungen
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
TWI255272B (en) 2000-12-06 2006-05-21 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
WO2002060920A2 (en) 2000-12-27 2002-08-08 Board Of Regents, University Of Texas System Prion isomers, methods of making, methods of using, and compositions and products comprising prion isomers
FI20002897A (fi) * 2000-12-29 2002-06-30 Nokia Corp Elektroninen laite ja välineet irrotettavan yksikön varmistamiseksi toiminta-asentoon
US20020160394A1 (en) 2001-01-24 2002-10-31 Bayer Corporation Regulation of transthyretin to treat obesity
EP1251138B1 (en) 2001-04-19 2006-07-26 Hermann Dr. Schätzl Prion protein dimers useful for vaccination
EP1385545B1 (en) 2001-04-30 2009-01-07 Eli Lilly And Company Humanized antibodies recognizing the beta-amyloid peptide
US7320790B2 (en) 2001-04-30 2008-01-22 Eli Lilly And Company Humanized antibodies
US6906169B2 (en) 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
GB0113179D0 (en) 2001-05-31 2001-07-25 Novartis Ag Organic compounds
US20020197258A1 (en) 2001-06-22 2002-12-26 Ghanbari Hossein A. Compositions and methods for preventing protein aggregation in neurodegenerative diseases
CA2454587C (en) 2001-07-25 2012-11-13 Protein Design Labs, Inc. Stable lyophilized pharmaceutical formulation of igg antibodies
US20030135035A1 (en) 2001-08-09 2003-07-17 Mark Shannon Human ZZAP1 protein
WO2003016467A2 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company Use of antibodies having high affinity for soluble ass to treat conditions and diseases related to ass
EP1519740A4 (en) 2001-08-17 2005-11-09 Lilly Co Eli FASTER IMPROVEMENT OF COGNITION IN DISEASES ASSOCIATED WITH A-BETA
CA2451998A1 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company Anti-a.beta. antibodies
US20030082191A1 (en) 2001-08-29 2003-05-01 Poduslo Joseph F. Treatment for central nervous system disorders
US7002711B2 (en) * 2001-08-31 2006-02-21 Kabushiki Kaisha Toshiba Image reading device and method
US7781413B2 (en) 2001-10-31 2010-08-24 Board Of Regents, The University Of Texas System SEMA3B inhibits tumor growth and induces apoptosis in cancer cells
JP5290489B2 (ja) 2001-11-08 2013-09-18 アッヴィ・バイオセラピューティクス・インコーポレイテッド Ｉｇｇ抗体の安定な液体医薬製剤
WO2003045128A2 (en) 2001-11-21 2003-06-05 New York University SYNTHETIC IMMUNOGENIC BUT NON-DEPOSIT-FORMING POLYPEPTIDES AND PEPTIDES HOMOLOGOUS TO AMYLOID β, PRION PROTEIN, AMYLIN, α-SYNUCLEIN, OR POLYGLUTAMINE REPEATS FOR INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE THERETO
WO2003051374A2 (en) 2001-12-17 2003-06-26 New York State Office Of Mental Health SEQUESTRATION OF Aβ IN THE PERIPHERY IN THE ABSENCE OF IMMUNOMODULATING AGENT AS A THERAPEUTIC APPROACH FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF BETA-AMYLOID RELATED DISEASES
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
US20030202975A1 (en) 2002-02-21 2003-10-30 Tedder Thomas F. Reagents and treatment methods for autoimmune diseases
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7132100B2 (en) 2002-06-14 2006-11-07 Medimmune, Inc. Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations
KR101070078B1 (ko) 2002-07-19 2011-10-04 노파르티스 파르마 아게 아밀로이드 베타1-6 항원 어레이를 포함하는 백신 조성물
EP1523499A2 (en) 2002-07-24 2005-04-20 Innogenetics N.V. Fragments of beta-amyloid as targets for vaccination against alzheimer disease
JP2006508072A (ja) 2002-10-01 2006-03-09 ノースウエスタン ユニバーシティ アミロイドベータ由来拡散性リガンド（ＡＤＤＬｓ）、ＡＤＤＬ代替物、ＡＤＤＬ結合性分子、およびそれらの使用
US20060019850A1 (en) 2002-10-31 2006-01-26 Korzenski Michael B Removal of particle contamination on a patterned silicon/silicon dioxide using dense fluid/chemical formulations
FR2846667B1 (fr) 2002-11-06 2004-12-31 Pasteur Institut Fragments variables d'anticorps de camelides a chaine unique diriges contre le peptide beta-amyloide 1-42 et leurs applications pour le diagnostic et le traitement des maladies neuroagregatives
AU2003293543A1 (en) 2002-12-13 2004-07-09 Abgenix, Inc. System and method for stabilizing antibodies with histidine
US6787129B1 (en) 2003-01-13 2004-09-07 Zenitech Llc Castor polyester as gloss agents in anionic systems
PL378571A1 (pl) 2003-02-01 2006-05-02 Neuralab Limited Czynna immunizacja dla wytworzenia przeciwciał przeciw rozpuszczalnemu A-ß
EP1596809B1 (en) 2003-02-10 2010-05-26 Applied Molecular Evolution, Inc. Abeta binding molecules
CN1798575A (zh) 2003-04-04 2006-07-05 健泰科生物技术公司 高浓度抗体和蛋白制剂
EP1480041A1 (en) 2003-05-22 2004-11-24 Innogenetics N.V. Method for the prediction, diagnosis and differential diagnosis of Alzheimer's disease
PE20050627A1 (es) 2003-05-30 2005-08-10 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo
US20060182321A1 (en) 2003-07-07 2006-08-17 Agency For Science, Technology And Research Method and apparatus for extracting third ventricle information
WO2005014041A2 (en) 2003-07-24 2005-02-17 Novartis Ag Use of an amyloid beta dna vaccine for the treatment and/or prevention of amyloid diseases
WO2005026211A2 (en) 2003-09-05 2005-03-24 Eli Lilly And Company Anti-ghrelin antibodies
CA2445743A1 (en) 2003-10-08 2005-04-08 The University Of British Columbia Methods for modulating neuronal responses
UA93854C2 (ru) 2003-12-17 2011-03-25 Вайет Ллк Иммуногенный конъюгат и способ его получения
CN1934127B (zh) 2003-12-17 2015-08-19 杨森阿尔茨海默氏症免疫治疗公司 Αβ免疫原性肽载体-偶联物及其生产方法
SG190665A1 (en) 2004-07-30 2013-06-28 Rinat Neuroscience Corp Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
EA200700751A1 (ru) 2004-10-05 2008-06-30 Элан Фарма Интернэшнл Лимитед Способы и композиции для улучшения продуцирования рекомбинантного белка
WO2006047670A2 (en) 2004-10-26 2006-05-04 Wyeth Methods for assessing antibodies to neurodegenerative disease-associated antigens
WO2006066118A2 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Contextual fear test for predicting efficacy of alzheimer immunotherapeutic treatment
US20060240486A1 (en) 2004-12-15 2006-10-26 Johnson-Wood Kelly L Immunoprecipitation-based assay for predicting in vivo efficacy of beta-amyloid antibodies
PE20061401A1 (es) 2004-12-15 2006-12-23 Neuralab Ltd ANTICUERPOS Aß PARA MEJORAR LA COGNICION
US7625560B2 (en) 2004-12-15 2009-12-01 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US8916165B2 (en) 2004-12-15 2014-12-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized Aβ antibodies for use in improving cognition
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
TW200638943A (en) 2005-01-28 2006-11-16 Wyeth Corp Stabilized liquid polypeptide formulations
EP1896504B1 (en) 2005-06-17 2012-11-21 Wyeth LLC Methods of purifying fc region containing antibodies
FR2887558B1 (fr) 2005-06-28 2007-08-17 Aubert & Duval Soc Par Actions Composition d'acier inoxydable martensitique, procede de fabrication d'une piece mecanique a partir de cet acier et piece ainsi obtenue
WO2007011833A2 (en) 2005-07-18 2007-01-25 Merck & Co., Inc. Spiropiperidine beta-secretase inhibitors for the treatment of alzheimer's disease
WO2010044803A1 (en) 2008-10-17 2010-04-22 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic diseases
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
KR20100016661A (ko) 2007-04-18 2010-02-12 얀센 알츠하이머 이뮤노테라피 대뇌 아밀로이드 혈관병증의 예방 및 치료
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
AU2008345022B2 (en) * 2007-12-28 2014-11-06 Prothena Biosciences Limited Treatment and prophylaxis of amyloidosis

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ306683B6 (cs) * 2000-02-24 2017-05-03 Washington University Léčivo pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci

Also Published As

Publication number Publication date
WO2000072880A2 (en) 2000-12-07
EP2305302B1 (en) 2017-12-20
SK16982001A3 (sk) 2002-11-06
HUP0201250A2 (en) 2002-08-28
CO5170495A1 (es) 2002-06-27
CZ304876B6 (cs) 2014-12-29
CN1814287A (zh) 2006-08-09
SK287513B6 (sk) 2010-12-07
CN1359301A (zh) 2002-07-17
HUP0201250A3 (en) 2005-06-28
EP1185298B1 (en) 2009-06-24
CL2010000018A1 (es) 2010-06-04
SG143032A1 (en) 2008-06-27
EE200100626A (et) 2003-02-17
AU5303100A (en) 2000-12-18
PL200458B1 (pl) 2009-01-30
IS6154A (is) 2001-11-09
US20090297511A1 (en) 2009-12-03
JP5580504B2 (ja) 2014-08-27
EA006630B1 (ru) 2006-02-24
PL357182A1 (en) 2004-07-26
HU230550B1 (hu) 2017-02-28
GB0130969D0 (en) 2002-02-13
IL146435A0 (en) 2002-07-25
KR20090068386A (ko) 2009-06-26
GB0417096D0 (en) 2004-09-01
GB2368794B (en) 2004-10-20
TWI263503B (en) 2006-10-11
NO20015773D0 (no) 2001-11-27
US20040265308A1 (en) 2004-12-30
NO20100264L (no) 2002-01-25
MY132784A (en) 2007-10-31
MXPA01011621A (es) 2005-06-22
KR20020038585A (ko) 2002-05-23
NZ515403A (en) 2004-05-28
EP2305302A3 (en) 2012-01-04
IL187526A0 (en) 2008-03-20
BG66083B1 (bg) 2011-03-31
CN1359301B (zh) 2012-10-10
EP2108376B1 (en) 2017-03-01
ES2624908T3 (es) 2017-07-18
HK1045116A1 (en) 2002-11-15
NO337301B1 (no) 2016-03-07
HRP20010877A2 (en) 2005-04-30
NO20015773L (no) 2002-01-25
CA2370311A1 (en) 2000-12-07
KR100961485B1 (ko) 2010-06-08
PE20010191A1 (es) 2001-02-14
SG147273A1 (en) 2008-11-28
TR200103447T2 (tr) 2002-04-22
EP2108376A3 (en) 2012-04-18
EP2305302A2 (en) 2011-04-06
KR101058482B1 (ko) 2011-08-24
BG106241A (bg) 2002-08-30
ZA200109487B (en) 2003-02-17
BR0011000A (pt) 2002-02-19
IL187526A (en) 2013-08-29
HRP20010877B1 (en) 2011-02-28
BG65882B1 (bg) 2010-04-30
AR024074A1 (es) 2002-09-04
SG140456A1 (en) 2008-03-28
EA200501560A1 (ru) 2006-04-28
US7964192B1 (en) 2011-06-21
US20040219146A1 (en) 2004-11-04
JP2003517461A (ja) 2003-05-27
HRP20090510A2 (hr) 2009-12-31
ATE434444T1 (de) 2009-07-15
HK1045116B (zh) 2009-12-31
US20140341911A1 (en) 2014-11-20
US20110306756A1 (en) 2011-12-15
EA200101251A1 (ru) 2002-06-27
UA81215C2 (en) 2007-12-25
CA2370311C (en) 2014-12-02
EA021614B1 (ru) 2015-07-30
EE05671B1 (et) 2013-08-15
BG110407A (bg) 2009-11-30
JP2007269804A (ja) 2007-10-18
GB2368794A (en) 2002-05-15
EP2108376A2 (en) 2009-10-14
NO340768B1 (no) 2017-06-19
UY26182A1 (es) 2000-12-29
DE60042451D1 (de) 2009-08-06
EP1185298A2 (en) 2002-03-13
TR200202231T2 (tr) 2002-11-21
NO20160043A1 (no) 2002-01-25
DE10084643T1 (de) 2002-07-11
JP5039432B2 (ja) 2012-10-03
WO2000072880A3 (en) 2001-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2305302B1 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6905686B1 (en) Active immunization for treatment of alzheimer&#39;s disease
US6787637B1 (en) N-Terminal amyloid-β antibodies
US7575880B1 (en) Method of screening an antibody for activity in clearing an amyloid deposit
US8034348B2 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6750324B1 (en) Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US20050059591A1 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20050059802A1 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7588766B1 (en) Treatment of amyloidogenic disease
AU2005200811A1 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
AU2008203784A1 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
AU2011265382A1 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
NZ570086A (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20200526