CZ20004351A3

CZ20004351A3 - Benzimidazolová analoga pro sniľování hladiny IgE

Info

Publication number: CZ20004351A3
Application number: CZ20004351A
Authority: CZ
Inventors: Jagadish Sircar; Mark L. Richards; Michael G. Campbell; Michael W. Major
Original assignee: Avanir Pharmaceuticals
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2001-10-17
Also published as: KR20010030179A; EP1077695A2; BR9910640A; NZ508413A; JP2002516277A; UA67775C2; CN1721411A; DE69924607T2; JP2002516276A; IL139828A0; US20020010343A1; HUP0102128A3; CA2332999A1; AU754562B2; PL345560A1; CA2332989A1; EP1077700B1; AU4197899A; KR100591652B1; WO1999061013A2

Description

(5 7) Anotace:

Skupina diacylovaných analogů benzimidazolu, které potlačují IgE reakci na alergeny. Tyto sloučeniny jsou vhodné pro léčení alergie, astmatu a dalších nemocí, kde je IgE patogenní.

CZ 2000 - 4351 A3

Benzimidazolová analoga pro snižování hladiny IgE

Oblast techniky

Vynález se týká inhibitorů IgE reakce na alergeny, které jsou užitečné při léčení alergií, astmatu nebo jakýchkoli jiných chorobách, kde je IgE patogenní.

Odhadem 10 milionů obyvatel USA (asi 5 %) trpí astmatem. Náklady na léčbu jsou odhadovány na více než 6 miliard dolarů. Zhruba 25 % akutních případů astmatu vyžaduje hospitalizaci, přičemž náklady na hospitalizované pacienty (více než 1,6 miliardy dolarů) byly největšími přímými výdaji na astma. Cena předepsaných léků (1,1 miliardy dolarů), která vzrostla o 54 % vletech 1985 až 1990 byla druhým nejvyším přímým výdajem (Kelly, Pharmacotherapy 12:13S-21S (1997)).

Podle National Ambulatory Medical Care Survey je astma zodpovědné za 1 % ambulantních návštěv a za nezanedbatelnou část absence dětí ve školách. Navzdory úspěchům při zkoumání astmatu a novým lékům nemocnost a úmrtnost stoupá v USA i celosvětově (US Department of Health and Human Sevices; 1991, publikace č. 91 až 3042). Astma tedy představuje závažný zdravotní problém.

Patofyziologické procesy, které provázejí počátek astmatické reakce můžou být principielně rozděleny na dvě části, která se vyznačují bronchokonstrikcí, která způsobuje sípání, napětí na prsou a dusnost. První, ranná fáze astmatického záchvatu je nastartována alergeny, iritanty nebo fyzickou námahou. Alergeny zesíťují molekuly imunoglobulinu E (IgE) vázané k receptorům žírných buněk, které uvolní protizánětlivé látky, včetně histaminu. Fyzická námaha nebo vdechování studeného vzduchu způsobuje osmotické změny v dýchacích cestách. Druhá, pozdní fáze astmatického záchvatu se vyznačuje vnikem aktivovaných eozinofilů a jiných protizánětlivých buňek do dýchacích cest, odlupováním epithelu a přítomností velmi viskózního hlenu v dýchacích cestách. Poškození způsobené protizánětlivou reakcí spočívá tom, že dýchací cesty zůstanou primárně imunizované nebo senzitivizované tak, že i slabý impuls může způsobit příští astmatický záchvat.

Existuje mnoho léků na zmírnění astma, jejich účinnost je různá. Krátce působící P2-adrenergická agonista - terbutalin a albuterol, působící jako bronchodilatacia, jsou už dlouho široce používána. Novější P2-agonista, salmeterol a formoterol mohou zmenšit bronchokonstriktivní část pozdní fáze, ale protože nemají dostatečné protizánětlivé účinky, neovlivňují bronchiální hyperaktivitu.

Velké množství léků se zaměřuje na specifické aspekty ranné astmatického záchvatu. Například antihistaminika jako loratidin, nebo pozdní fáze inhibují rannou histaminem způsobenou zánětlivou reakci. Některé z nových antihistaminik, jako např. azelastin a ketotifen mají protizánětlivé a slabé bronchodilatační účinky, ale nebyla u nich prokázána účinnost proti astmatu. Inhibitory fosfodiesterázy, jako theofylin/xanthin oslabují pozdní zánětlivé reakce, ale nebyla u nich prokázána bronchodilatační aktivita. Anticholinergika jako ipratopium bromid, která jsou užívána v případech akutního astmatu pro inhibici bronchokonstrikce, nejsou účinná proti zánětu v ranné ani pozdní fázi, neovlivňují bronchiální hyperaktivitu, a proto se nedají použít pro chronickou terapii.

Kortikostereoidy jako budesonid jsou nejsilnější protizánětlivé látky. Inhibitory uvolnění zánětlivých mediátorů jako cromolyn a nedocromil stabilizují žírné buňky a tak inhibují pozdní zánětlivou reakci na alergen. Tyto látky, stejně jako kortikostereoidy, redukují bronchiální hyperaktivitu tím, že minimalizují senzitivizující efekt zánětu dýchacích cest. Bohužel tato protizánětlivá léčiva nezpůsobují bronchodilataci.

Několik nově vyvinutých léčiv inhibuje specifické aspekty astmatického zánětu. Například antagonisté leukotrienových receptorů (ICI-204, 219, accolate) specificky inhibují činnost leukotrienů, které se podílejí na zánětu dýchacích cest i na bronchokonstrikci.

Mnoho léčiv astmatu má hlavně utišující účinky a nebo dokonce i závažné vedlejší účinky, proto jsou velmi žádána léčiva, která terapeuticky působí nikoli na symptomy, ale na příčiny astmatu. Astma i alergie jsou závislé na dějích zprostředkovávaných IgE. Je známo, že zvýšená produkce IgE je základní příčinou alergií obecně a zvláště pak alergického astmatu (Duplantier, Cheng, Ann. Rep. Med. Chem. 29; 73 až 81 (1994)). sloučeniny, které snižují hladinu IgE tedy mohou být účinné při léčení příčin astmatu a alergie.

Žádná ze současných terapií nevyužívá odstranění nadbytky IgE. Hypotéza že snížení IgE v plazmě zmenšuje alergickou reakci byla potvrzena novými klinickými testy s chimérickou anti-IgE protilátkou CGP-51901 a rekombinačně humanizovanou monoklonální protilátkou rhuMAB-E25. Tanox Biosystems Inc., Genetech Inc. a Novartis AG spolupracují na vývoji humanizované anti-IgE protilátky (Bio World® Today, February 26, 1995, p.26), která léčí astma odstraněním nadbytku IgE. Tanox už úspěšně testoval anti-IgE protilátku GCP-51901, která prudkost a délku nasálních symptomů alergenního rhinitinu v pokusu na 155 pacientech Fáze 2 (Script #2080, Nov 24, 198, p. 1). Protilátka rhu MAB-E25 podávaná injekcí (max. dávka 300 mg každé 2 až 4 týdny podle ·· ·· · ·· · • · ··· · · · · • · · · · · · ·· · · · · · · ··· ···· ·· ··· ·· ··· potřeby) způsobila snížení počtu dní, kdy pacient potřeboval jinou akutní léčbu (antihistaminika, dekongestanty) o 50 % ve srovnání splacebem. NDA podání tohoto produktu je plánováno na rok 2000. Pozitivní výsledky testů antilgE protilátek ukazují, že terapeutická strategie zaměřená na snižování hladiny IgE je účinná.

Podstata vynálezu

Podstata vynálezu spočívá v použití skupiny příbuzných sloučenin pro léčbu zvýšené hladiny IgE. Benzimidazolové inhibitory IgE podle tohoto vynálezu jsou vyjádřeny níže uvedeným obecným vzorcem A,

kde X a Y jsou na sobě nezávislé substituenty vybrané z následující skupiny: H, alkyl, alkoxy, aryl, substituovaný aryl, hydroxy, halogen, amino, alkylamino, nitro, kyano, CF3, OCF₃, CONH2, CONHR, a NHCOR,. R je ze skupiny: H, CH₃, C₂H₅, C₃H₇, C₄H₉, CH₂Ph a CH₂C6H₄-F(p-). R, a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny: alkyl, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, vícecyklický cykloalkyl, spojené kruhové alifatické alkyly, cyklopropyl, substituovaný cyklopropyl, cyklobutyl, substituovaný cyklobutyl, cyklopentyl, substituovaný cyklopentyl, cyklohexyl, substituovaný cyklohexyl, cykloheptyl, substituovaný cykloheptyl, bicykloheptyl, bicyklooktyl, bicyklononyl, substituovaný bicykloalkynyl, adamantyl, substituovaný adamantyl a podobných. Substituenty na těchto skupinách jsou: CF₃, CH₃, OCH₃, OH, CN, COOR, COOH a podobně.

Dále podstata vynálezu spočívá ve složení směsi pro léčení alergického stavu, skládající se z výše uvedeného diacylovaného benzimidazolového inhibitoru IgE a nejméně jedné další aktivní složky, spolu s farmaceuticky přijatelným ředidlem. Další aktivní složka může být krátce působící f3₂-adrenergický agonista, jako např. terbutalin a albuterol, dlouze působící p₂-adrenergický agonista, jako např. salmeterol a formoterol, antihistaminikum, jako např. loratidin, azelastin a ketotifen, inhibitory fosfodiesterázy, ·« ·· · ·· · • · · ·· · ··· • · · · · · · • · · · ·*·· · • · · · · · · ··· ·· · · · · · · · · anticholinergíka, kortikostereoidy, inhibitory uvolňování zánětlivých mediátorů a antagonista leukotrienových receptorů.

Dále podstata vynálezu spočívá ve skupině diacylbenzimidazolových sloučenin pro léčení alergických stavů, která se skládá z následujících sloučenin I až XIV:

Tabulka 1: BENZIMIDAZOLOVÉ DERIVÁTY

	BIQQ
\Ú~n \\=o	C29H32N4O2
' %	CLOGP 6,06

,,c	BIJI
	C26H₃₀N₄O2
o	CLOGP
k/	5,99

	BIU
TxkOk	C27H32N4O2
η	CLOGP
V7	6,55

	BIÍM
	C30H30N4O2
^H η	CLOGP
vy	6,28

NH

ΒΙΜΝ

C25H22N4O2

CLOGP

4,25

o_T.	BIMP
	C₃iH₃4N₄O₂
	CLOGP
	6,84

BIMR

C₃₁H28N₄O₂

CLOGP

5,55

	11	• ·· ·· · • · · · · · · · • · · · · • · · · · · • · ♦ · · ······« ·· ·· ·	·· · • · · · • · · • · · · • · · • * · · ·
	BINM			BINN
x=x h (/«ΠΤ ý=o	C₂₅H₂₂N₄O₂		c₁₇h₁₆n₄0₂
CLOGP		CLOGP
	4,25			2,49

C₂₆H₂₈N₄O₂

BINO

CLOGP

NK

NH

BINP

C₂₃H₂₆N₄O₂

CLOGP

5,15

5,08

C₂3H₂₄N₄O₂

BINQ

CLOGP

4,27

BINR

C₃iH₃₀N₄O₂

CLOGP

3,79

BIOM

C₃₄H₃₄N₄O₂

CLOGP

t

NH

ΒΪΟΝ

C₂₆H₂₈N₄O₂

CLOGP

5,15

6,91

BIOP

C₃₂H₃₈N₄O₂

CLOGP

7,74

BIOR

C₃₂H₃₄N₄O₂

CLOGP

y	ΒΙΡΙ
θΧΧΧΓ	C₂₈H₃4N₄O₂
ο	CLOGP
33	7,11

Oy	BIPJ
χχχτ	C₂₇H₃₂N₄O₂
ο	CLOGP
	6,55

	ΒΙΡΜ
ΧΟ-^μ	C31H32N4O2
ο	CLOGP
^k---7	6,84

	ΒΪΡΝ
C₂3H26N₄O₂
0	CLOGP
	5,08

	ΒΙΡΡ
jW	C₂9H36N₄O₂
CLOGP
33	7,67

	BIPR
	c₂₉h₃₂n₄o₂
3 ^H	CLOGP
33	6,38

Ογ°	BIOJ
jW	C30H34N4O2
y	CLOGP
v	6,62

_Ογο	BIQJ
τσ-o-c ^Η ψ	C₂₇H₃₀N₄O₂
CLOGP
τ	5,75

• 44 ·*

444 4 4 4

4 4 4

4 4 4 4

4 4 4

444 4444 44

Dále podstata vynálezu spočívá ve skupině diacylbenzimidazolových sloučenin pro léčení alergických stavů, která se skládá z následujících sloučenin 1 až 3;

Dále podstata vynálezu spočívá v metodě přípravy přípravku pro léčení stavu spojeného s vysokou hladinou IgE. Sloučenina má následující vzorec A,

kde X a Y jsou na sobě nezávislé substituenty vybrané z následující skupiny: H, alkyl, alkoxy, aryl, substituovaný aryl, hydroxy, halogen, amino, alkylamino, nitro, kyano, CF3, OCF₃, CONH₂, CONHR, a NHCOR,. R je ze skupiny: H, CH₃, C₂H₅, C₃H₇, C₄H₉, CH₂Ph a CH₂C6H4-F(p-). Ri a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny: alkyl, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, vícecyklický cykloalkyl, spojené kruhové alifatické alkyly, cyklopropyl, substituovaný cyklopropyl, cyklobutyl, substituovaný cyklobutyl, cyklopentyl, substituovaný cyklopentyl, cyklohexyl, substituovaný cyklohexyl, cykloheptyl, substituovaný cykloheptyl, bicykloheptyl, bicyklooktyl, bicyklononyl, substituovaný bicykloalkynyl, adamantyl, substituovaný adamantyl. Substituenty na těchto skupinách jsou: CF₃, CH₃, OCH₃, OH, CN, COOR, COOH.

44 4

4 4 49

4 4 9

4 4 4 4

4 4 4 • 44 44 444 « ·· ·· «44« 49 • · · 4 • 4 4 4 4

4 »4 «44 4444 44

Dále podstata vynálezu spočívá v metodě léčení stavu způsobeného zvýšenou hladinou IgE u savců. Metoda spočívá v podání určitého množství přípravku dostatečného ke sníření hladiny IgE savce. Sloučenina má vzorecA,

kde X a Y jsou na sobě nezávislé substituenty vybrané z následující skupiny: H, alkyl, alkoxy, aryl, substituovaný aryl, hydroxy, halogen, amino, alkylamino, nitro, kyano, CF₃, OCF₃, CONH₂, CONHR, a NHCOR,. R je ze skupiny: H, CH₃, C₂H₅, C₃H₇, C₄H₉, CH₂Ph a CH₂C6H4-F(p-). Ri a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny: alkyl, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, vícecyklický cykloalkyl, spojené kruhové alifatické alkyly, cyklopropyl, substituovaný cyklopropyl, cyklobutyl, substituovaný cyklobutyl, cyklopentyl, substituovaný cyklopentyl, cyklohexyl, substituovaný cyklohexyl, cykloheptyl, substituovaný cykloheptyl, bicykloheptyl, bicyklooktyl, bicyklononyl, substituovaný bicykloalkynyl, adamantyl, substituovaný adamantyl. Substituenty na těchto skupinách jsou: CF₃, CH₃, OCH₃, OH, CN, COOR, COOH.

Ve variaci na výše uvedenou metodu může být podána nejméně jedna další aktivní složka spolu s výše uvedenou sloučeninou. Další aktivní složka může být kombinvána se zmíněnou sloučeninou ve farmaceuticky přijatelném rozpouštědle a poté podána savci. Další aktivní složkou může být krátce působící p₂-adrenergický agonista, jako např. terbutalin a albuterol, dlouze působící p₂-adrenergický agonista, jako např. salmeterol a formoterol, antihistaminikum, jako např. loratidin, azelastin a ketotifen, inhibitory fosfodiesterázy, anticholinergika, kortikostereoidy, inhibitory uvolňování zánětlivých mediátorů a antagonista leukotrienových receptorů.

Sločenina může být s výhodou podána v dávce od 0,01 do 100 mg na 1 kg váhy těla denně v několika dávkách a pravidelných intrvalech po minimálně dva dny.

Další dostupné možnosti vynálezu budou vysvětleny v následujícím textu.

Detailní popis výhodného provedení vynálezu

Vynález spočívá v inhibitorech syntézy nebo uvolňování IgE, ktré jsou využitelné při léčení alergie, astmatu a dalších chorob, u kterých je IgE patogenní. Zde uvedené ·

přípravky byly testovány ex vivo i in vivo. Vývoj a optimalizace klinických režimů je popsáma níže.

Ex vivo testy

Tento test začíná in vivo nástřikem antigenu a měřením sekundární reakce na protilátku in vitro. Základní protokol byl optimalizován na řadu parametrů: dávka antigenu v nástřiku a jeho délka, počet buněk pěstovaných in vitro, koncentrace antigenu pro vyvolání IgE (i jiných imunoglobulinů) reakce in vitro, dávka plodového hovězího séra (fetal bovine sérum - FBS) pro optimální IgE reakci in vitro, důležitost primárně imunizovaných CD4+T buňek a haptenové specifity B buňek a specifity ELISA testu na IgE (Marcelletti, Katz, Cellular Immunology, 135; 471 až 489 (1991)).

Užitý protokol byl adaptován na vyšší kapacitu při provádění analýz. BALB/cByj myši byly imunizovány i.p. 10 pg DNP-KLH adsorbovanými na 4 mg ledku a usmrceny po 35 dnech. Sleziny byly vyjmuty a homogenizovány v tkáňové drtičce, dvakrát promyty a udržovány vDMEM doplněném o 10 % FBS, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomicinu a 0,0005 % 2-merkaptoethanolu. Buněčné kultury sleziny obsahovaly 2 až 3 miliony buněk/ml, 0,2 ml/zdroj ve 4 exemplářích (wells in quadruplicate), 96 zdroj. Destiček (well plates) podle stanovení v přítomnosti DNP-KLH (10 ng/ml) nebo při jeho absenci. Testované sloučeniny (2 pg/ml a 50 ng/ml) byly přidány do buněčných kultur sleziny, obsahujících antigen, které byly inkubovány 8 dni při 37 °C v atmosféře 10 % CO₂.

Po osmi dnech byly změřeny hladiny imunoglobulinů ve vzorcích buněčné kultury pomocí specifického isotyp-selektivního ELISA testu podle Marcellettiho a Katze (Supra). Test byl modifikován pro větší kapacitu testování. ELISA destičky byly vytvořeny nátěrem DNP-KLH, ponechaným přes noc. Po blokování albuminem hovězího séra (bovine sérum albumine - BSA) byl alikvot vzorku každé kultury zředěn (1:4 salinem pufrovaným fosfátem (PBS) s BSA, azidem sodným a Tween 20), nanesen na ELISA destičky a inkubován přes noc ve vlhčeném boxu při 4° C. Hladiny IgE byly stanoveny sledováním následné inkubace s biotynylovaným kozím antimouse IgE (b-GAME), streptavidinem a substrátem.

Antigen-specifický IgGl byl měřen podobně, s tím rozdílem, že vzorky kultury byly zředěny 200krát a b-GAME byl nahrazen biotynylovaným kozím antimouse IgGl (b“GAMG1). IgG2a byl měřen v ELISA destičkách pokrytých DNP-KLH, vzorek kultury byl zředěn 1:20 a inkubace byla provedena s biotynylovaným kozím antimouse IgG2a (b-

-<jAMG2a).Stanovení množství každého isotypu bylo provedeno srovnáním se standartní křivkou. Hladina detekovatelnosti všech protilátek byla okolo 200 až 400 pg/ml, reaktivita s jiným typem imunoglobulinu v ELISA byla pro IgE méně než 0,001 %.

In vivo testy

Sloučeniny, které byly aktivní ex vivo byly testovány na aktivitu při snižování IgE reakce i in vivo. Myši, které byly vystaveny nízké hladině záření před imunizací nosičm vykazovaly zvýšenou IgE reakci na senzitivizaci antigenem po 7 dnech. Testované sloučeniny byly podávány těsně před a po senzitivizaci antigenem a byla měřena schopnost zmenšit IgE reakci. Byly porovnávány hladiny IgE, IgGl a IgG2a.

Samičky myší BALB/cByj byly ozářeny 250 rad 7 hodin po začátku denního světelného cyklu. Po 2 hodinách byly imunizovány i.p. pomocí 2 pgKLH v 4 mg ledku. Přípravek byl po 6 dnech podáván i.p. nebo orálně po dobu od 2 do 7 dní, jednou nebo dvakrát denně jako suspenze (150 pg na injekci) se salinem s 10 % ethanolu a 0,25 % methylcelulosy. Každou skupinu tvořilo 5 nebo 6 myší. Druhý den podávání přípravku byly podány 2 pg DNP-KLH i.p. v 4 mg ledku hned po podání přípravku. Myši byly vykrváceny 7 až 21 dní po podání DNP-KLH.

Antigen-specifické protilátky IgE, IgGl a IgG2a byly stanoveny pomocí ELISA. periorbitální krev byla odstředěna za 10 minut při 14000 rpm, vzorek byl zředěn salinem 1:5 a znovu odstředěn. Koncentrace protilátek ve vzorku byla stanovena pomocí ELISA (4 zředění, provedeno třikrát) a srovnána se standartní křivkou: anti-DNP IgE (od 1:100 do 1:800), anti-DNP IgG2a (od 1:100 do 1:800) a anti-DNP IgGl (od 1:1600 do 1:12800).

Diacylbenzimidazolové inhibitory IgE

Byly syntetizovány různé sloučeniny následujícího obecného vzorce A a byla zjišťována jejich účinnost při snižování hladiny IgE in vivo i ex vivo.

kde X a Y jsou na sobě nezávislé substituenty vybrané z následující skupiny: H, alkyl, alkoxy, aryl, substituovaný aryl, hydroxy, halogen, amino, alkylamino, nitro, kyano, CF3, • 4

a CH₂C6H₄-F(p-). Ri a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny: alkyl, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, vícecyklický cykloalkyl, spojené kruhové alifatické alkyly, cyklopropyl, substituovaný cyklopropyl, cyklobutyl, substituovaný cyklobutyl, cyklopentyl, substituovaný cyklopentyl, cyklohexyi, substituovaný cyklohexyi, cykloheptyl, substituovaný cykloheptyl, bicykloheptyl, bicyklooktyl, bicyklononyl, substituovaný bicykloalkynyl, adamantyl, substituovaný adamantyl a podobných. Substituenty na těchto skupinách jsou; CF3, CH3, OCH3, OH, CN, COOR, COOH a podobně.

Další variantou je monoacetylovaná molekula níže uvedeného obecného vzorce,

R

X

Y

(B)

O kde X je substituent vybraný z následující skupiny: H, alkyl, alkoxy, aryl, substituovaný aryl, hydroxy, halogen, amino, alkylamino, nitro, kyano, CF3, OCF3, CONH₂, CONHR, a NHCORi. Y je substituent vybraný z následující skupiny: mono-, di- a tri substituovaný H, alkyl, alkoxy, aryl, substituovaný aryl, hydroxy, halogen, amino, alkylamino, nitro, kyano, CF₃, OCF3, CONH2, CONHR, a NHCOR,.

R je ze skupiny: H, CH3, C₂H₅, C3H7, C4H9, CH₂Ph a CH₂C6H₄-F(p-). R, je vybrán ze skupiny: alkyl, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, vícecyklický cykloalkyl, spojené kruhové alifatické alkyly, cyklopropyl, substituovaný cyklopropyl, cyklobutyl, substituovaný cyklobutyl, cyklopentyl, substituovaný cyklopentyl, cyklohexyi, substituovaný cyklohexyi, cykloheptyl, substituovaný cykloheptyl, bicykloheptyl, bicyklooktyl, bicyklononyl, substituovaný bicykloalkynyl, adamantyl, substituovaný adamantyl a podobných. Substituenty na těchto skupinách jsou: CF₃, CH₃, OCH₃, OH, CN, COOR, COOH a podobně.

Syntéza kombinatorické knihovny

Diacylbenzimidazolové sloučeniny v tomto vynálezu byly připraveny následujícím postupem.

R²COCI pyridin reflux

Použité chloridy kyselin jsou uvedeny v Tabulce 1 ve sloupcích Rl a R2

Tabulka 1:

	Rl		R2
A	y~coci	A	( coci
B	COCI	B	COCI
C		C
D	Ár^C0CI	D	A-^coci
E	Jy^coci	E	/r^C0CI
F	J9-^c°c'	F	jO”^c°^ci

• · · · · • · · · · • · · · · · • · · ······· ··


Η	COCI ° Ν	G	COCI o N
I	COCI Ji	I	COCI 08
J	COCI	J	COCI
Κ	COCI ,A,^ch,	K	COCI ČC'
L	cioc^^y⁰^	L	ClOC^xyCH,
Μ	^clocy^y^OCH3	M	CIOC^/\^/OCH₃
Ν	^^COCI H	N	4y^coci H
0	jCjH °yJK^COCI H	0	°yK_-COCI H
Ρ	^.COCI f₃c^^	P	/x,C0CI f₃c^^
Q	ch₃ yy_Coci	R	ch₃ COCI
R	ClOC^/x OCH„	S	^CIOC^^ --

• · « · · · » « ·


s		s	CIOC./-.
			u_CHs
T	[>-COCI	T	[>—COCI
	Ph		Ph'
u	XX	u	XX

Syntéza sloučeniny 3; 4-nitro-l,2-fenylendiamin (10 g, 65,3 mmol) a

4-aminobenzoová (8,95 g, 65,3mmol) byly předloženy do baňky s kulatým dnem. Pomalu byl přidán fosforoxychlorid (95 ml). Reakční směs byla míchána pod refluxem, po 18 hodinách byla reakční směs ochlazena a pomalu nalita do směsi vody a ledu v Erlenmayerově baňce, za silného míchání. Odělila se zelenožlutá sraženina, která byla odfiltrována a promyta vodou. Bylo získáno 16,9 g surového produktu, ve kterém byla hmotnostní spektrometrií prokázána přítomnost sloučeniny 3 (kationt).

Syntéza sloučeniny 4: benzimidazol 3 (800 mg, 3,14 mmol) byl rozpuštěn v suchém pyridinu (5 ml) ve scintilační ampulce. Poté byl přidán příslušný chlorid kyseliny (1,1 ekvivalentu). Reakce byla provedena při 60 °C. Po 16 hodinách byla směs ochlazena na laboratorní teplotu a byla přidána destilovaná voda. Vzniklá sraženina byla odfiltrována, promyta vodou a sušena. Vodná vrstva byla extrahována 6 x 50 ml ethylacetátu, extrakt byl sušen Na2SO4, ethylacetát byl za vakua odpařen za vzniku zabarvené pevné látky. Monoacetylovaný produkt byl podle MS přítomen ve sraženině i v organické vrstvě, proto byly oba podíly spojeny a bez další úpravy podrobeny redukci.

Redukce sloučeniny 4: Surový monoacetylovaný nitro benzimidazol 4 (1,22 g, 340 mmol) byl rozpuštěn v methanolu (20 ml) s trochou THF. Bylo přidáno katalytické množství 10 % Pd-C, roztok byl odplyněn a míchán v atmosféře H2 (3,4 atm) 4 hodiny. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC. Po ukončení reakce byla reakční směs zfiltrována přes celit, odpařena za sníženého tlaku a bylo získáno 979 mg surového produktu.

9··· · · · · • · 9 · · * · «9····· ·· · · · · ·

Analýza organických sloučenin

HPLC/MS data byla získána na přístroji Gilson semi-prep HPLC s UV detektorem Gilson 170 Diodě Array a MS detektorem PE Sciex API 100LC. Pro měení HPLC byl používán také přístroj Waters 600E s UV detektorem Waters 490E. Jako eluent byl používán gradient CH₃CN (s 0,0035 % TFA) a H₂O (s 0,01 % TFA). V obou HPLC přístrojích byly používány kolony Advantage Cl8 60A 5μ 50 mm x 4,6 mm od Thomson Instrument Company.Podmínky při hmotnostní spektroskopii byly následující: přímý nástřik, electrospray ionizace a detektor PE Sciex API 100LC. Pro TLC byly používány hliníkové destičky Merck 60F-254. Flash chromatografíe byla prováděna na silikagelu Merck 60 (230 - 400 mesh) od EM Scientific.

Syntéza symetrických diamidů

Symetrické diacylbenzimidazolové sloučeniny v tomto vynálezu byly připraveny z 2-(4-aminofenyl)-5-aminobenzimidazolu, který byl získán redukcí 2-(4-nitrofenyl)-6nitrobenzimidazolu.

H

2-(4-nitrofenyl)-6-nitrobenzimidazol

Dinitrobenzimidazol byl připraven následovně: směs 4-nitrofenylendiaminu (6,4 g, 41,83 mmol) a 4-nitrobenzoové kyseliny byla rozpuštěna v POCL (250 ml) a zahřívána k refluxu po 2 hodiny. Poté byla reakční směs ochlazena, nalita na led a míchána 30 minut. Vyloučený produkt byl odfiltrován, promyt methanolem a NaIICO₃ kvůli odstranění nezreagované kyseliny a vysušen přes noc. Vzniklý hnědý pevný produkt (5,8 g) byl charakterizován electrospray MS (b.t. > 300° C).

2-(4-Aminofenyl)-5-aminobenzimidazol byl připraven z výše uvedeného dinitrobenzimidazolu (75 g). Dinitrobenzimidazol byl suspendován v THF a bylo přidáno Pd-C (10 % váhových Pd), baňka byla naplněna vodíkem a míchána pod balónkem naplněným vodíkem přes noc. TLC a MS ukázaly, že i potom byla přítomna výchozí sloučenina, reakční směs byla proto za stejných podmínek míchána přes víkend. Když byla reakce podle TLC dokončena, byla reakční směs zfíltrována přes celit, který byl poté promyt methanolem. Rozpouštědlo bylo za sníženého tlaku odpařeno. Byla získána hnědá pevná látka (0,37 g), která byla bez dalšího přečištění použita pro další reakci.

» Λ

2-(4-Aminofenyl)-5 -aminobenzimidazol

Další možnou metodou pro přípravu 2-(4-Aminofenyl)-5-aminobenzimidazolu je redukce chloridem cínatým. 2-(4-Nitrofenyl)-6-nitrobenzimidazol (8,9 g, 31 mmol) byl suspendován v koncentrované HC1, ke které byl poté přidán chlorid cínatý (42,3 g, 180 mmol). Reakční směs byla zahřívána k refluxu 5 hodin. Poté byla ochlazena na laboratorní teplotu a hydrochlorid produktu byl sražen přidáním ethanolu. Sraženina byla odfiltrována, rozpuštěna ve vodě a byl přidán koncentrovaný hydroxid amonný. Vzniklá sraženina byla odfiltrována a sušena přes noc pod vakuem. Vznikla šedá pevná látka (6,023 g, 26,9 mmol, 87%), kterábyla charakterizována elektrospray MS a HPLC (m.p. 222-227° C).

2-(4-Aminofenyl)-5-methoxybenzimidazol byl připraven z 2-(4-nitrofenyl)-5-methoxybenzimidazolu, který byl připraven takto: 1,2-diamino-4-methoxybenzen (1,26 g, 10,0 mmol) byl smíchán s 4-nitrobenzoovou kyselinou (1,67 g, 9,8 mmol) a směs byla rozpuštěna v POCI3 (10 ml) a zahřáta k refluxu po 2,5 hodiny. Poté byla reakční směs ochlazena a opatrně nalita na led. Vzniklá pevná látka byla odfiltrována, promyta NaHCCf a použita k další reakci bez dalšího přečišťování.

H

2-(4-nitrofenyl)-5-methoxybenzimidazol

2-(4-Aminofenyl)-5-methoxybenzimidazol byl připraven rozpuštěním 1 g výše zmíněného nitrobenzimidazolu v 30 % Na2S*9H2O a mícháním reakční směsi po 21 hodin při laboratorní teplotě. Potom byla reakční směs zředěna vodou a extrahována ethylacetátem. Spojené organické extrakty byly sušeny sulfidem sodným a zakoncentrovány za vakua. Produkt byl charakterizován pomocí MS.

H

2-(4-Aminofenyl)-5-methoxybenzimidazol • » » · · · · • ··*« ···· • · . . · · · ······· ·· ··· · · *

2-(4-Aminofenyl)-5,6-dichlorobenzimidazol byl připraven z 2-(4-nitrofenyl)-5,6- dichlorobenzimídazolu následujícím způsobem: l,2-diamino-4,5-dichlorbenzen (1,68 g, 10,0 mmol) a 4-nitrobenzoová kyselina (1,58 g, 9,3 mmol) byly rozpuštěny vPOCf (10 ml) a reakční směs byla zahřívána k refluxu po 2,5 hodiny. Poté byla ochlazena a nalita na led. Vzniklá pevná látka byla odfiltrována, promyta NaHCO₃ a použita k další reakci bez dalšího přečišťování.

2-(4-nitrofenyl)-5,6-dichlorobenzimidazol

2-(4-Aminofenyl)-5,6-dichlorbenzimidazol byl připraven rozpuštěním 1 g výše zmíněného nitrobenzimidazolu v 30 % Na2S*9H2O a mícháním reakční směsi po 21 hodin při laboratorní teplotě. Potom byla reakční směs zředěna vodou a extrahována ethylacetátem. Spojené organické extrakty byly sušeny sulfidem sodným a zakoncentrovány za vakua. Produkt byl charakterizován pomocí MS.

2-(4-Aminofenyl)-5,6-dichIorbenzimidazol

2-(4-Aminofenyl)-7-methylbenzimidazol byl připraven z 2-(4-nitrofenyl)-7-methylbenzimidazolu následujícím způsobem: l,2-diamino-3-methylbenzen (1,24 g, 10,0 mmol) a 4-nitrobenzoová kyselina (1,69 g, 9,8 mmol) byly rozpuštěny v POC1₃ (10 ml) a reakční směs byla zahřívána k refluxu po 2,5 hodiny. Poté byla ochlazena a nalita na led. Vzniklá pevná látka byla odfiltrována, promyta NaHCO₃ a použita k další reakci bez dalšího přečišťování.

2-(4-nitrofenyl)-7-methylbenzimidazol

2-(4-Aminofenyl)-7-methylbenzimidazol byl připraven rozpuštěním 1 g výše zmíněného nitrobenzimidazolu v 30 % Na2S*9H2O a mícháním reakční směsi po 4,5 hodin při laboratorní teplotě. Potom byla reakční směs zředěna vodou a extrahována ethylacetátem. Spojené organické extrakty byly sušeny sulfidem sodným a zakoncentrovány za vakua. Produkt byl charakterizován pomocí MS.

2-(4-Aminofenyl)-7-methyIbenzimidazol

2-(4-Aminofenyl)-6-methylbenzimidazol byl připraven z 2-(4-nitrofenyl)-6-methylbenzimidazolu následujícím způsobem; 1,2-diamino-4-methylbenzen (1,24 g, 10,0 mmol) a 4-nitrobenzoová kyselina (1,6 g, 9,9 mmol) byly rozpuštěny vPOCL (10 ml) a reakční směs byla zahřívána k refluxu po 2,5 hodiny. Poté byla ochlazena a nalita na led. Vzniklá pevná látka byla odfiltrována, promyta NaHCCb a použita k další reakci bez dalšího přečišťování.

H

2-(4-nitrofenyl)-6-methylbenzimidazol

2-(4-Aminofenyl)-6-methylbenzimidazol byl připraven rozpuštěním 1 g výše zmíněného nitrobenzimidazolu v 30 % Na₂S*9H₂O a mícháním reakční směsi po 4,5 hodin při laboratorní teplotě. Potom byla reakční směs zředěna vodou a extrahována ethylacetátem. Spojené organické extrakty byly sušeny sulfidem sodným a zakoncentrovány za vakua. Produkt byl charakterizován pomocí MS.

H

2-(4-Aminofenyl)-6-methylbenzimidazol

2-(4-Aminofenyl)-5,6-dimethylbenzimidazol byl připraven z 2-(4-nitrofenyl)-5,6-dimethylbenzimidazolu následujícím způsobem: l,2-diamino-4,5-dimethylbenzen (1,38 g, 10,1 mmol) a 4-nitrobenzoová kyselina (1,69 g, 9,9 mmol) byly rozpuštěny v POCI3 (10 ml) a reakční směs byla zahřívána k refluxu po 2,5 hodiny. Poté byla ochlazena a nalita na

led. Vzniklá pevná látka byla odfiltrována, promyta NaHCCb a použita k další reakci bez dalšího přečišťování.

H

2-(4-nitrofenyl)-5,6-dimethylbenzimidazol

2-(4-Aminofenyl)-5,6-dimethylbenzimidazol byl připraven rozpuštěním 1 g výše zmíněného nitrobenzimidazolu v 30 % Na₂S*9H₂O a mícháním reakční směsi po 4,5 hodin při laboratorní teplotě. Potom byla reakční směs zředěna vodou a extrahována ethylacetátem. Spojené organické extrakty byly sušeny sulfidem sodným a zakoncentrovány za vakua. Produkt byl charakterizován pomocí MS.

H

2-(4-Aminofenyl)-5,6-dimethylbenzimidazol

Následující symetrické diamidy byly připraveny některou z následujících metod:

Metoda A

2-(4-Aminofenyl)-6-aminobenzimidazol (1 mmol) byl suspendován v THF (5 ml), byl přidán DIEA (2,5 mmol) a směs byla ochlazena na -78° C. K ochlazené směsi byl přidán chlorid kyseliny (2,5 mmol) a směs byla ponechána přes noc při laboratorní teplotě. Poté byla do směsi přidána voda (2 ml) a byla provedena extrakce ethylacetátem. Spojené organické extrakty byly promyty NaHCC>3 (aq.) a zakoncentrovány za sníženého tlaku. Získaný produkt byl přečištěn na silikagelu (hexan/EtOAc nebo methanol/CH₂Cl₂) nebo reverzní HPFC (CH₃CN/H₂O).

Metoda B

2-(4-Aminofenyl)-6-aminobenzimidazol (1 mmol) a DMAP (kat.) byly rozpuštěny v pyridinu (5 ml). K roztoku byl přidán chlorid kyseliny (2,5 mmol) a reakční směs byla přes noc míchána při 60° C. Poté byla reakční směs ochlazena na laboratorní teplotu a vodou byl vysrážen produkt, který byl odfiltrován a promyt hexanem a NaHCCf (aq.).

• · · · • · · ···· ··

Potom byl přečištěn na silikagelu (hexan/EtOAc nebo methanol/CJECE) nebo reverzní HPLC (CH3CN/H2O).

Metoda C

2-(4-Aminofenyl)-6-aminobenzimidazol (1 mmol) byl suspendován v THF (10 ml). Potom byl přidán K2CO3 (2,5 mmol) ve vodě (0,5 ml) a směs byla ochlazena na -78° C. K vychlazené směsi byl přidán chlorid kyseliny (2,5 mmol) a směs byla ponechána přes noc při laboratorní teplotě. Potom byla přidána voda (10 ml) a provedena extrakce ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta NaHCOj a zakoncentrována za sníženého tlaku. Získaný produkt byl přečištěn na silikagelu (hexan/EtOAc nebo methanol/CH₂Cl₂) nebo reverzní HPLC (CH₃CN/H₂O).

Metoda D

Karboxylová kyselina (2,2 mmol), EDC (2,2 mmol) a DMAP (kat.) byly rozpuštěny v zahřátém pyridinu. K roztoku byl přidán 2-(4-Aminofenyl)-6•aminobenzimidazol (1 mmol) a reakční směs byla zahřívána přes noc na 60° C. Po ochlazení byla reakční směs roztřepána mezi ethylacetát a vodu. Organická vrstva byla promyta NaHCO₃, vysušena Na₂SO4 a zakoncentrován za vakua. Získaný produkt byl přečištěn na silikagelu (hexan/EtOAc nebo methanol/CH₂Cl₂) nebo reverzní HPLC (CH3CN/H2O).

Diacylbenzimidazoly

Následující struktury zahrnuté v uvedeném obecném strukturním vzorci byly připraveny a testovány na schopnost snižovat hladinu IgE.

(1) 2-(N-Cyklohexylkarbanoyl-4‘-aminofenyl)-6-(cyklohexylkarbanoylamino)benzimidazol byl připraven metodou A z 2-(4-aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,195 g, 0,87 mmol) a cyklohexylkarbonylchloridu (0,291 mmol, 0,319 g, 2,175 mmol). Vzniklý produkt (76,7 mg) byl přečištěn preparativní HPLC.

(2) Bis-t-butylacetylbenzimidazol byl připraven metodou A z 2-(4-aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,195 g, 0,87 mmol) a t-butylacetylchloridu (0,302 ml, 0,292 g, 2,175 mmol). Vzniklý produkt (42,3 mg) byl přečištěn preparativní HPLC.

(3) Bis-cyklopentylkarbonylbenzimidazol byl připraven metodou A z 2-(4~aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,195 g, 0,87 mmol) a cyklopentankarbonylchloridu (0,227 ml, 0,228 g, 2,175 mmol). Vzniklý produkt (42,3 mg) byl přečištěn preparativní HPLC.

H O (3) (4) Bis-adamantylkarbonylbenzimidazol byl připraven metodou C z 2-(4-aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,500 g, 2,23 mmol) a adamantankarbonylchloridu (1,063 g, 5,35 mmol). Vzniklý produkt byl přečištěn preparativní HPLC. Bylo získáno 100 mg produktu o 97 % čistotě.

(5) Bis-cyklopropylkarbonylbenzimidazol byl připraven metodou C z 2-(4-aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,500 g, 2,23 mmol) a cyklopropankarbonylchloridu (0,485 ml, 0,559 g, 5,35 mmol). Vzniklý produkt byl přečištěn na silikagelu (5% methanol v CH2CI2). Byl získán produkt o čistotě 94 % podle HPLC.

(6) Bis-cyklobutylkarbonylbenzimidazol byl připraven metodou C z 2-(4-aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,500 g, 2,23 mmol) a cyklobutankarbonylchloridu « 9

(0,61 Oml, 0,634 g, 5,35 mmol). Vzniklý produkt byl přečištěn na silikagelu (5% methanol v CH2CI2). Byl získán produkt o čistotě 97,4 % podle HPLC.

(7) Bis-trimethylacetylbenzimidazol byl připraven metodou C z 2-(4-aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,500 g, 2,23 mmol) a trimethylacetylchloridu (0,61 Oml, 0,634 g, 5,35 mmol). Vzniklý produkt byl přečištěn na silikagelu (5% methanol v CH2CI2). Byl získán produkt o čistotě 95 % podle HPLC.

(8) Bis-2-thiofenacetylbenzimidazol byl připraven metodou C z 2-(4-aminofenyl)••6-aminobenzimidazolu (0,500 g, 2,23 mmol) a thiofenacetylchloridu (0,660ml, 0,860 g, 5,35 mmol). Vzniklý produkt byl přečištěn na silikagelu (5% methanol VCH2CI2). Byl získán produkt o čistotě 92 % podle HPLC.

(9) Bis-cykloheptankarbonylbenzimidazol byl připraven metodou C z 2-(4~aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,500 g, 2,23 mmol) a cykoloheptankarbonylchloridu (0,61 Oml, 0,634 g, 5,35 mmol). Vzniklý produkt byl přečištěn preparativní HPLC. Byl získán produkt o čistotě 98,8 %. Cykloheptankarbonylchlorid byl připraven takto: cykloheptankarboxylová kyselina (1,37 ml, 1,42 g, lOmmol) byla předložena do suché 25 ml baňky s kulatým dnem. Poté byla reakční baňka naplněna dusíkem a stříkačkou byl přidán oxalylchlorid (7,7 ml, 2 M v CH2CI2) a jedna kapka DMF. Reakce byla míchána přes noc při laboratorní teplotě a potom zakoncentrována za vakua. Přebytek oxalylchloridu byl odstraněn pětkrát opakovaným přidáním 5 ml methylenchloridu a následným odpařením.

··· ···· ·♦

(10) Bis-(N-trifluoracetylprolin)benzimidazol byl připraven metodou A z 2-(4-aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,448 g, 2,0 mmol) a (s)-(-)-N-trifluoracetylprolinchloridu (42,0 ml, 0,1 M v CH2CI2). Vzniklý produkt byl přečištěn na silikagelu (5% methanol v CH2CI2). Byl získán produkt o čistotě 98,5 % podle HPLC.

(11) Bis-prolin benzimidazol byl syntetizován z bis-trifluoracetyl derivátu, který byl rozpuštěn v methanolu (5 ml). Potom byl přidán LiOH (0,210 g v 5 ml H2O) a reakční směs byla zahřívána na 42° C po 2 hodiny. Poté byla reakční směs extrahována 5 x 15 ml CH2CI2. Spojené organické extrakty byly zakoncentrovány za vakua. Byl získán pevný produkt o čistotě 95,6 % podle HPLC.

(Π) (12) Bis-trans-2-fenylcyklopropankarbonylbenzimidazol byl připraven metodou C z 2-(4-aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,500 g, 2,23 mmol) a trans-2-fenyl-l-cyklopropankarbonylchloridu (0,831 ml, 0,966 g, 5,35 mmol). Vzniklý produkt byl přečištěn na silikagelu (5% methanol v CH2CI2). Byl získán produkt o čistotě 95,5 % podle

HPLC.

(13) Bis-4-t-butylcyklohexylkarbonylbenzimidazol byl připraven metodou C z 2~(4-aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,425 g, 1,89 mmol) a 4-t-butylcyklohexankarbonylchloridu (0,814 g, 4,25 mmol). Vzniklý produkt byl přečištěn na silikagelu (5% methanol v CH2CI2). Byl získán produkt o čistotě 90 % podle HPLC.

(14) Bis-l-fenylcyklohexylkarbonylbenzimidazol byl připraven metodou C z 2-(4- aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,467 g, 2,08 mmol) a 1 -fenylcyklohexankarbonylchloridu (1,046 g). Vzniklý produkt byl přečištěn na silikagelu (5% methanol v CH2CI2). Byl získán produkt o čistotě 93,3 % podle HPLC.

(14) (15) Bis-trans-4-pentylcyklohexylkarbonylbenzimidazol byl syntetizován následovně: oxalylchlorid (1,07 g, 2M v CH₂C1₂) byl přidán do trans-4- pentylcyklohexankarboxylové kyseliny (0,424 g, 2,14 mmol). Poté byla přidána jedna kapka DMF a reakční směs byla ponechána 1 hodinu při laboratorní teplotě. Tato směs pak byla přidána do roztoku z 2-(4-aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,200 g, 0,89 mmol) v 2 ml pyridinu. Reakce byla potom zahřívána na 60° C přes noc. Pak byla reakční směs

4 ochlazena a vzniklá sraženina byla odfiltrována a promyta NaHCO₃ a hexanem. Vzniklý pevný produkt byl přečištěn preparativní HPLC. Výsledná čistota produktu byla nad 99 %.

(16) Bis-l-fenylcyklopropylkarbonylbenzimidazol byl připraven metodou C z 2-(4aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,530 g, 2,36 mmol) a 1 -fenylcyklopropankarbonylchloridu (0,9625 g, 5,3). Vzniklý produkt byl přečištěn na silikagelu (5% methanol v CH2O2). Byl získán produkt o čistotě 93,4 % podle HPLC.

(17) Bis-(2,2,3,3-tetramethylcyklopropyl)karbonylbenzimidazol byl syntetizován následovně: oxalylchlorid (1,07 g, 2M v CH2CI2) byl přidán do 2,2,3,3tetramethylcyklopropankarboxylové kyseliny (0,305 g, 2,14 mmol). Poté byla přidána jedna kapka DMF a reakční směs byla ponechána 1 hodinu při laboratorní teplotě. Tato směs pak byla přidána do roztoku z 2-(4-aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,200 g, 0,89 mmol) v 2 ml pyridinu. Reakce byla potom zahřívána na 60° C přes noc. Pak byla reakční směs ochlazena a vzniklá sraženina byla odfiltrována a promyta NaHCO₃ a hexanem. Vzniklý pevný produkt byl přečištěn preparativní HPLC. Výsledná čistota produktu byla nad 99 %.

(17) (18) Bis-4-methylcyklohexylkarbonylbenzimidazol byl připraven metodou D z 2(4-aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,100 g, 0,44 mmol) a 1-fenylcyklopropan-

• 9 • 9

0· karbonyl chloridu (0,138 g, 0,96). Vzniklý produkt byl přečištěn na silikagelu (5% methanol v CH2CI2). Byl získán produkt o čistotě 94,5 % podle HPLC.

(19) Bis-l-methylcyklohexylkarbonylbenzimidazol byl syntetizován následovně: oxalylchlorid (1,07 g, 2M VCH2CI2) byl přidán do l-methylcyklohexankarboxylové kyseliny (0,305 g, 2,14 mmol). Poté byla přidána jedna kapka DMF a reakční směs byla ponechána 1 hodinu při laboratorní teplotě. Tato směs pak byla přidána do roztoku z 2-(4aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,200 g, 0,89 mmol) v 2 ml pyridinu. Reakce byla potom zahřívána na 60° C přes noc. Pak byla reakční směs ochlazena a vzniklá sraženina byla odfiltrována a promyta NaHCO₃ a hexanem. Vzniklý pevný produkt byl přečištěn preparativní HPLC. Výsledná čistota produktu byla nad 99 %.

(20) Bis-bicyklo[2.2.1]heptan-2-karbonylbenzimidazol byl syntetizován následovně: oxalylchlorid (1,07 g, 2M v CH₂C1₂) byl přidán do bicyklo[2.2.1]heptankarboxylové kyseliny (0,305 g, 2,14 mmol). Poté byla přidána jedna kapka DMF a reakční směs byla ponechána 1 hodinu při laboratorní teplotě. Tato směs pak byla přidána do roztoku z 2-(4-aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,200 g, 0,89 mmol) v 2 ml pyridinu. Reakce byla potom zahřívána na 60° C přes noc. Pak byla reakční směs ochlazena a vzniklá sraženina byla odfiltrována a promyta NaHCO₃ a hexanem. Vzniklý pevný produkt byl přečištěn preparativní HPLC. Výsledná čistota produktu byla 68 %.

O

N

H (20) • « *· (21) Bis-4-methoxycyklohexankarbonylbenzimidazol byl syntetizován následovně: oxalylchlorid (1,07 g, 2M v CH2CI2) byl přidán do 4-methoxycyklohexankarboxylové kyseliny (0,338 g, 2,14 mmol). Poté byla přidána jedna kapka DMF a reakční směs byla ponechána 1 hodinu při laboratorní teplotě. Tato směs pak byla přidána do roztoku z 2-(4~aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,200 g, 0,89 mmol) v 2 ml pyridinu. Reakce byla potom zahřívána na 60° C přes noc. Pak byla reakční směs ochlazena a vzniklá sraženina byla odfiltrována a promyta NaHCO₃ a hexanem.

(22) Bis-3-thiofenacetylbenzimidazol byl syntetizován následovně: oxalylchlorid (1,07 g, 2M v CH2CI2) byl přidán do 3-thifenyloctové kyseliny (0,338 g, 2,14 mmol). Poté byla přidána jedna kapka DMF a reakční směs byla ponechána 1 hodinu při laboratorní teplotě. Tato směs pak byla přidána do roztoku z 2-(4-aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,200 g, 0,89 mmol) v 2 ml pyridinu. Reakce byla potom zahřívána na 60° C přes noc. Pak byla reakční směs ochlazena a vzniklá sraženina byla odfiltrována a promyta NaHCO₃ a hexanem.

(23) Bis-4-nipecotamidbenzimidazol byl připraven následovně: Bis-A-boc-4•'nipecotamidbenzimidazol (0,400 g) byl rozpuštěn v 1:1 TFA:CH₂CH₂ (4 ml) při -20° C. Roztok byl ponechán přes noc při laboratorní teplotě. Potom bylo za vakua odstraněno rozpouštědlo a byla přidána voda. Roztok byl zmražen na suchém ledu a lyofilizován do sucha. Boc- ochráněný benzimidazol byl syntetizován následovně: oxalylchlorid (2,82 g, 2M VCH2CI2) byl přidán do N-boc-nipecotkarboxylové kyseliny (1,293 g, 5,64 mmol). Poté byla přidána jedna kapka DMF a reakční směs byla ponechána 1 hodinu při laboratorní teplotě. Tato směs pak byla přidána do roztoku z 2-(4-aminofenyl)-6-aminobenzimidazolu (0,500 g, 2,24 mmol) v 2 ml pyridinu. Reakce byla potom zahřívána na 60° C přes noc. Pak byla reakční směs ochlazena a vzniklá sraženina byla odfiltrována a promyta NaHCCb a hexanem. Vzniklý pevný produkt byl přečištěn preparativní HPLC. Výsledná čistota produktu byla nad 99 %.

Monoacylované benzimidazolové inhibitory IgE

V následujícím textu jsou uvedeny monoacylované deriváty dříve uvedených diacylovaných inhibitorů IgE.

(1) 2-(cyklohexankarbonyl-4aminofenyl)-5-trifluormethylbenzimidazol byl syntetizován z následujících benzimidazolových meziproduktů: 2-(4-nitrofenyl)-5“trifluormethylbenzimidazol (1.1) a 2-(4-aminofenyl)-5-trifluormethylbenzimidazol (1.2).

(1.1) 2-(4-Nitrofenyl)-5-trifluormethylbenzimidazol byl připraven následujícím způsobem: l,2-diamino-4-trifluormethylbenzen (1,76 g, 10,0 mmo) byl smíchán s 4-nitrobenzoovou kyselinou (1,67 g, 9,8 mmol) a POCI3 (12 ml). Reakční směs byla zahřívána k refluxu 2,5 hodiny, ochlazena a opatrně nalita na led. Vzniklá pevná látka byla odfiltrována, promyta NaHCCb a použita k další reakci bez dalšího přečišťování.

H (1-1) (1.2) 2-(4-Aminofenyl)-5-trifluormethylbenzimidazol byl připraven z 2-(4nitrofenyl)-5-trifluormethybenzimidazolu. Surový 2-(4-Nitrofenyl)-5-trifluormethylbenzimidazol byl rozpuštěn vkonc. HCI (15 ml) a byl přidán SnC2*H2O (13,5 g, 59 mmol).Reakční směs byla zahřívána refluxu 16 hodin, potom byla ochlazena a hydrochlorid roduktu byl vysrážen ethanolem (75 ml), odfiltrován, promyt ethanolem, rozpuštěn ve vodě a neutralizován přídavkem koncentrovaného hydroxidu amonného. Volná báze byla odfiltrována a charakterizována MS.

N f=

\\ //

NH₂ (1-2) • · · * · · · • · · · · · · • · · · · · ···· · · · · (1) 2-(N-Cyklohexankarbonyl-4-amonofenyl)-5-trifluormethylbenzimidazoI byl připraven z aminu, resp. výše uvedeného 2-(4-Aminofenyl)-5trifluormethylbenzimidazolu. Amin (0,239 g, 0,86mmol), cyklohexylkarbonylchlorid (130 μΐ, 0,95 mmol) a K2CO3 (0,1213 g, 0,88 mmol) byly rozpuštěny vTHF:H₂O (5 ml, 1:1). Reakční směs byla třepána 23 hodin při laboratorní teplotě, potom byl přidán chlorid sodný a provedena extrakce do ethylacetátu. Spojené organické extrakty byly sušeny Na₂SO4 a zakoncentrovány za vakua. Získaná pevná látka byla přečištěna preparativní TLC (10 % methanolu v CH2CI2).

(2) 2-(N-Cyklohexankarbonyl-4-amonofenyl)-5-fluorbenzimidazol byl syntetizován z následujících benzimidazolových meziproduktů: 2-(4-nitrofenyl)-5-fluorbenzimidazol (2.1) a 2-(4-aminofenyl)-5-fluorbenzimidazol (2.2).

(2.1) 2-(4-Nitrofenyl)-5-fluorbenzimidazol byl připraven následujícím způsobem: 1,2-diamino-4-fluorbenzen (1,26 g, 10,0 mmo) byl smíchán s 4-nitrobenzoovou kyselinou (1,67 g, 9,8 mmol) a POCI3 (10 ml). Reakční směs byla zahřívána krefluxu 2,5 hodiny, ochlazena a opatrně nalita na led. Vzniklá pevná látka byla odfiltrována, promyta NaHCCh a použita k další reakci bez dalšího přečišťování.

H (2.1) (2.2) 2-(4-Aminofenyl)-5-fluorbenzimidazol byl připraven z výše zmíněného nitrobenzimidazolu (1 g), který byl rozpuštěn v 30 % Na₂S*9H₂O (20 ml). Roztok byl míchán 24 hodin při laboratorní teplotě, extrahován ethylacetátem a spojené organické extrakty byly zakoncentrovány za vakua. Produkt byl charakterizován MS.

(2) 2-(N-Cyklohexankarbonyl-4-aminofenyl)-5-fluorbenzimidazol: Výše zmíněný amin (0,100 g, 0,44 mmol) byl rozpuštěn v pyridinu (1 ml), potom byl přidán

cyklohexylkarbonylchlorid (63,2 μΐ). Reakční směs byla zahřívána na 60° C přes noc. Potom byla zředěna vodou (8 ml) a extrahována ethylacetátem. . Spojené organické extrakty byly sušeny Na₂SO₄ a zakoncentrovány za vakua. Získaná pevná látka byla přečištěna preparativní TLC (10 % methanolu v CH₂C1₂).

(3) 2-(N-3‘,4‘-dichlorbenzoyl-4-aminofenyl)-3,4-dimethylbenzimidazol byl připraven z následujících benzimidazolových meziproduktů: 2-(4-nitrofenyl)-4,5dimethylbenzimidazol (3.1) a 2-(4-aminofenyl)-4,5-dimethylbenzimidazol (3.2).

(3.1) : 2-(4-NitrofenyI)-4,5-dimethylbenzimidazol byl připraven následujícím způsobem: l,2-diamino-3,4-dimethylbenzen (1,236 g, 9,8 mmo) byl smíchán s 4nitrobenzoovou kyselinou (1,67 g, 9,8 mmol) a POC1₃ (10 ml). Reakční směs byla zahřívána k refluxu 2,5 hodiny, ochlazena a opatrně nalita na led. Vzniklá pevná látka byla odfiltrována, promyta NaHCO₃ a použita k další reakci bez dalšího přečišťování.

(3-1) (3.2) 2-(4-Aminofenyl)-4,5-dimethylbenzimidazol byl připraven zvýše zmíněného nitrobenzimidazolu (1 g), který byl rozpuštěn v 30 % Na₂S*9H₂O (20 ml). Roztok byl míchán 2,5 hodiny při laboratorní teplotě, zředěn vodou a extrahován ethylacetátem. Spojené organické extrakty byly sušeny Na₂SO₄ a zakoncentrovány za vakua. Produkt byl charakterizován MS.

(3) 2-(N-Cyklohexankarbony 1 -4-aminofenyl)-4,5 -dimethylbenzimidazol: V ýše zmíněný amin (3.2) (0,0954 g, 0,402 mmol) byl rozpuštěn v pyridinu (1 ml), potom byl přidán cyklohexylkarbonylchlorid (57,6 μΐ). Reakční směs byla zahřívána na 60° C přes noc. Potom byla zředěna vodou (8 ml) a extrahována ethylacetátem. . Spojené organické • ·

• · extrakty byly sušeny NaíSCU a zakoncentrovány za vakua. Získaná pevná látka byla přečištěna preparativní TLC (10 % methanolu v CH2CI2).

O (3)

Aktivita při snižování hladiny IgE

Všechny uvedené sloučeniny byly testovány na účinnost při snižování hladiny IgE in vivo i ex vivo. V obou případech byly všechny aktivní. Aktivity sloučenin (IC50) ex vivo byly v rozmezí mezi 100 pM a 1 nM. V in vivo testech byly IC50 dávky v rozmezí mezi 100 pg/kg váhy těla/den a 10 mg/kg váhy těla/den. Diacylovaná benzimidazoly byly účinnější než monoacylované.

Potlačení IgE reakce.

Aktivita látek v tomto vynálezu byla testována ex vivo a in vivo experimenty, které již byly popsány dříve. Všechny prezentované sloučeniny byly aktivní při zmenšování IgE reakce. V ex vivo experimentech sloučeniny ve skupinách I - XI způsobily 50 % inhibici při koncentracích od 1 pM do 10 μΜ. V in vivo testech byly uvedené sloučeniny účinné od koncentrací menších než 0,01 mg/kg/den do 25 mg/kg/den. Byly podávány v několika dávkách (2 - 4 za den) během dvou až sedmi po sobě jdoucích dnech. Tyto výsledky zde uvedených sloučenin jsou důkazem jejich efektivity při snižování hladiny IgE, zvětšené účinkem antigenu, a tedy i účinnosti při léčení alergií a zvláště pak astmatu.

Způsob podávání

Množství IgE inhibitoru pro léčení určité alergie nebo stavu závisí na jeho druhu, který může být určen standartními klinickými testy. Přesná dávka podávané sloučeniny závisí na vážnosti stavu a druhu podávaného podávané sloučeniny závisí na rozhodnutí lékaře a na stavu pacienta. Vhodné dávky mohou být zjištěny měřením vlivu podaného množství na hladinu IgE nebo na standartní ukazatele pulmonárních a hemodynamických změn. Dávky mohou být také s výhodou stanoveny pomocí níže uvedených protokolů pro in vivo a ex vivo testování (Hasegawa et al., J. ed. hem. 40; 395 až 407 (1997) a Ohimori et al., Int. J. Immunopharmacol. 15:573-579 (1993) pojednávají o podobných in vivo a ex vivo testech pro určování dávek naftalenových derivátů pro snižování hladiny IgE).

• ·

Vhodné dávky sloučenin se pohybují v rozmezí od 0,001 do 300 mg/kg/den (v několika dávkách). Sloučeniny je vhodné podávat jako farmaceutické přípravky perorálně, jako aerosol, intravenózně, subkutálně nebo jinak, aby bylo zajištěno systemické dávkování sloučeniny. Složení farmaceutických přípravků je běžné, podávání je vhodné provádět periodicky. Dlouhodobá terapie je vhodná v případech, kde je alergická reakce způsobena nepřetržitým vystavením se působení alergenů. Podávání jednou nebo dvakrát denně po dobu sedmi dní bylo účinné při snižování IgE reakce u zvířat jednorázově vystavených působení alergenů. Při výhodném provedení byla sloučenina podávána nejméně dva dny v pravidelných intervalech. Režim podávání také může být stanoven v závislosti na druhu alergenu, dávce frekvenci podávání, délce působení alergenu a standartních klinických ukazatelích tak, aby způsoboval optimální, snižování IgE reakce.

V jednom provedení tohoto vynálezu je IgE snižující sloučenina podávána spolu s jedním nebo více dalšími nízkomolekulárními IgE inhibitory, což způsoboje optimální snížení hladiny IgE u pacienta. Je také možné, že jedna nebo více sloučenin uvedených v tomto vynálezu v kombinaci s již známými léky léčí nejen akutní příznaky, ale i příčiny astmatu. Další možností je smíchání s jedním nebo více nízkomolekulárními IgE inhibitory a dalšími přísadami, známými jako symptomatická léčiva astmatu. Další možností je podání nízkomolekulárních inhibitorů odděleně od ostatních léků během též léčebné kůry, tak aby IgE inhibitory i utišující léky byly podány v souladu se svými nezávislými efektivními režimy.

Přestože bylo ve vynálezu detailně popsáno mnoho výhodných provedení, je možné velké množství dalších variací, metod a modifikací, které jsou zřejmé, je přitom jasné, že tyto variace , modifikace a substituce jsou stále uvnitř rámce idejí a patentových nároků uvedených v tomto vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

7/ Μϋΰ

1. Farmaceutický přípravek obsahující jednu nebo více sloučenin následujících obecných vzorců:

kde X a Y jsou na sobě nezávislé substituenty vybrané z následující skupiny: H, alkyl, alkoxy, aryl, substituovaný aryl, hydroxy, halogen, amino, alkylamino, nitro, kyano, CF₃, OCF₃, CONH₂, CONHR, a NHCOR,, kde R je ze skupiny: H, CH₃, C₂H₅, C₃H₇, C₄H₉, CH₂Ph a CH₂C₆H₄-F(p-), kde Ri a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny: alkyl, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, vícecyklický cykloalkyl, spojené kruhové alifatické alkyly, cyklopropyl, substituovaný cyklopropyl, cyklobutyl, substituovaný cyklobutyl, cyklopentyl, substituovaný cyklopentyl, cyklohexyi, substituovaný cyklohexyi, cykloheptyl, substituovaný cykloheptyl, bicykloheptyl, bicyklooktyl, bicyklononyl, substituovaný bicykloalkynyl, adamantyl a substituovaný adamantyl, kde X a Y jsou na sobě nezávislé substituenty vybrané z následující skupiny: H, alkyl, alkoxy, aryl, substituovaný aryl, hydroxy, halogen, amino, alkylamino, nitro, kyano, CF₃, OCF₃, CONH₂, CONHR, a NHCOR,, kde R je ze skupiny: H, CH₃, C2H5, C₃H₇, C4H9, CH₂Ph a CH₂C6H4-F(p-), kde Y je substituent vybraný z následující skupiny: mono-, di- a trisubstituovaný H, alkyl, alkoxy, aryl, substituovaný aryl, hydroxy, halogen, amino, alkylamino, nitro, kyano, CF₃, OCF₃, CONH₂, CONHR, a NHCOR,, a kde R, je vybrán ze skupiny: alkyl, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, vícecyklický cykloalkyl, spojené kruhové alifatické alkyly, cyklopropyl, substituovaný cyklopropyl, cyklobutyl, substituovaný cyklobutyl, cyklopentyl, substituovaný β 00 0·

0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 • 0 0 0 0

0 0 0 0

0000000 00 cyklopentyl, cyklohexyl, substituovaný cyklohexyl, cykloheptyl, substituovaný cykloheptyl, bicykloheptyl, bicyklooktyl, bicyklononyl, substituovaný bicykloalkynyl, adamantyl, substituovaný adamantyl a podobných.
2. Farmaceutický přípravek z nároku 1., kde R| a R₂ substituenty jsou ze skupiny: alkyl, aryl,: CF3, CH3, OCH3, OH, CN, COOR a COOH.
3. Farmaceutický přípravek z nároku 1. , který obsahuje sloučeninu obecného vzorce A.

4. Farmaceutický přípravek z nároku 3. , který obsahuje některou z následujících sloučenin I až XIV a sloučenin v tabulce 1:

♦ · ··

O

Tabulka 1: BENZIMIDAZOLOVE DERIVÁTY ·· ·· • · · · · • · · • · · · • · · • ···· ·· ·

i » ^p H o BIQM V BIQN C31H30N4O2 C23H24N4O2 CLOGP 6,04 CLOGP 4,27 o// 'V BIQO ,,x OO X. ' d BIQP C32H36N4O2 C₂₉H₃4N₄O2 CLOGP 6,93 CLOGP 6,86 0^ 1 Γ W, />-n v BIQQ d BIQR C29H32N4O2 C29H30N4O2 CLOGP 6,06 CLOGP 5,58 .,,0 • d BIJI _Ογο • d BIJJ C26H30N4O2 C₂5H2₈N₄O2 CLOGP 5,99 CLOGP 5,43 ,x;< • d BIU cyO XXK>d„ ' d BIU C27H32N4O2 C2₆H₃oN₄02 CLOGP 6,55 CLOGP 5,99

0γ^Δ-Ο ΒΙΙΜ ΧΡΟρ C30H30N4O2 ^Η ο CLOGP ΡΡ 6,28

ΒΙΙΟ ΧΡ-Ορ C3,H₃₆N₄O2 ^Η d CLOGP V7 7,18

ρ ΒΙΙΝ χο-Μ, ^0 C22H24N4O2 4,52 CLOGP J > ,, ΒΙΙΡ C28H34N4O2 7,11 CLOGP

BIIQ ^Η <Ρ C28H32N4O2 CLOGP V7 6,30

BIIR “W-G-c C28H30N4O2 Ο CLOGP \__y 5,82

BIJQ H /=V/_/ ⁿW^nhn-4 />—< 1 1 C27H30N4O2 CLOGP 5,75

Rhá'..... ^0 BIJN C21H22N4O2 CLOGP 3,96

• • ·· • · · • · • · · • · • · · ·· • · • · • • • ·♦ · ·· • · · • · • · · • · • ·· · Y BIMN \ H T^V^NH YJ C25H22N4O2 4,25 CLOGP

_N /=\ BINM C₂5H₂₂N₄O₂ CLOGP 4,25

BINN C_I7H,₆N₄O₂ CLOGP 2,49

BINP

C₂₃H₂6N₄O₂

CLOGP

5,08

CV BINR γ-α-ατ y ^H C₃₁H₃₀N₄O₂ CLOGP v 3,79

Y° BION Cl C₂₆H₂₈N₄O₂ y CLOGP v 5,15

• · · • · · ·

Ογ° BIPJ oJX><Xr C27H32N4O2 ο CLOGP 6,55

ΒΙΡΝ C₂₃H₂₆N₄O2 0 CLOGP 5,08

BIOJ C30H34N4O2 v CLOGP v 6,62

ΟγΟ BIQJ Xxyav ^Η ψ C27H30N4O2 CLOGP τ 5,75

0 0 0 0 0

0 0 0 0

5. Farmaceutický přípravek z nároku 1. , který obsahuje sloučeninu obecného vzorce B.
6. Farmaceutický přípravek z nároku 5. , který obsahuje sloučeninu vybranou z následujících sloučenin 1 až 3:
7. Použití farmaceutického přípravku z nároků 1 až 6 na léčení stavu spojeného s přebytkem IgE.
8. Farmaceutický přípravek z nároku 7 obsahující nejméně jednu další přísadu aktivní při potlačování aspoň jednoho syndromu spojeného se stavem vyznačujícím se přebytkem IgE.
9. Farmaceutický přípravek z nároku 8, kde je zmíněná přísada vybrána ze skupiny obsahující krátce působící p₂-adrenergická agonista, dlouze působící β₂adrenergická agonista, antihistaminika, inhibitory fosfodiesterázy, anticholinergika, kortikostereoidy, inhibitory uvolňování zánětlivých mediátorů a antagonista leukotrienových receptorů.
10. Použití farmaceutických přípravků 1 až 6 k přípravě léčiv stavů spojených s přebytkem IgE.