CZ183797A3 - Cross-linked micro-particles and their use as a therapeutic carrier - Google Patents

Description

Obiast techniky

Vynález še týká zesíťovanýčh mikročástic a jejich použití jako terapeutických nosičů.

Dosavadní stav techniky

Použití systémů mikročáStieOvých nosičů pro parenterální dodávání terapeutických a diagnostických činidel přitahuje vzrůstající pozornost. Technologie a chemie systémů mikročástic nabízí mikročástice jako nosiče pro dodávání činidel podkožně/intravenózne a intraarteriálně. “Ideální nosič” se vyznačuje několika klíčovými aspekty. Tyto zahrnují velikost, distribuci velikosti, užitečné zatížení, rychlost biodegrádace, snadnost použití, kin etiku uvolnění a dostupnou reprodukovatelnou výrobu. Jednotlivé aspekty tohoto “ideálního nosiče” byly úspěšně řešeny, zejména užitečné zatížení léčiva, rychlost biodegradače a Částečně i velikost a distribuce velikosti.

Známe nosiče byly vyráběny různými technikami, založenými převážně na rozpouštědle a emulzi. Nevýhoda těchto metod spočívá v regulaci klíčových vlastností nosiče během jednoho nebo dvou výrobních kroků. Velikost, distribuce velikosti, užitečné zatížení a rychlost biodegrádace byly ták určeny produktu v jediném dynamickém prostředí, typizovaném jednoduchým nebo dvojitým emulzriím systémem nebo technikami odpařování rozpouštědla. Jak je typické pro emulzní procesy, byl roztok léčiva, polymeru a činidla modifikujícího povrch smíchán s nerozpustným rozpouštědlem, emulzifikován, částice byly fixovány zahřátím nebo stabilizací a Směs byla čištěna odstraněním olejů nebo rozpouštědla nevhodného pro parenterální použití.

Reakční nádoba v emulzních nebo rozpouštědloodpářujících systémech je základní charakteristikou dosavadního .stavu techniky. V riádobe se morfologie mikročástic reguluje vyvažováním iňterfáciálních sil olejových a vodních komponent, interakcí rozpuštěné látky na rozhraní, rovnováhou mezi promícháváním, zahříváním a vznikem pláště a samozřejmě inkorporace aktivní látky do polymerní matrice. Takové technologie jsou však nevhodné pro farmaceutickou výrobu ve velkém měřítku, požadovanou pro parenterální Činidlo.

Téměř bez výjimky byla regulace velikosti a distribuce velikosti známých mikročástic zcela odkázána na regulaci velikosti během technik sušení rozprašováním popsanými v publikacích PGT

WO-A-9112823, WO-A-9218164 a WO-A-9408627, pro výrobu mikročástic použitelných k zobrazení kontrastního ozvěnového signálu a dalšímu potenciálnímu párentěrálriímu využití. Prudká toxicita intravenózních mikročástic je zejména spojena s kapilárním blokováním plicního oběhu, Souběžným poklesem plicního vcnózniho tlaku a ztrátou poddajnosti. Vztah mezi velikostí částic a LD toxicitou jé dobře dokumentován. Naše vlastní údaje ukazují příkrý nárůst toxicity intravenózních Částic, s průměrnou velikostí přes 6 pm, což je známá kapilární velikost v plicní tkáni pro nedefořmovatelné mikročástice.

Čím větší je průměrná velikost mikročástic, tím zřetelně širší je distribuce jejich velikosti a rozmezí velikostí mikročástic narůstá o dva řády. Pro terapeutické použití, jako čhemoémbolizace, je výhled na injekční podávání mikročásticůvéhó přípravku obsahujícího částice v rozmezí velikosti 5-100 pm v rozporu s konceptem vysoce regionálně cíleného dodávání. Na horní hranici je možnóst ucpání hlavních cév o průměru 100 pm, s doprovodným nebezpečím nekrózy velkých zasažených oblastí; ná opačném konci rozsahu je podstatné množství přípustné pro systémovou distribuci.

Mechanismus dosažení ustáleného uvolňování v mikročásticových systémech byl drive néjóbvykleji dosahován regulací eroze matrice a uvolněním aktivních složek (zapuštěných nebo pohlcených) do obklopujícího média. Účinné složky byly buď začleněny v době výroby mikročástic, nebo pohlceny matricí s následnou fixací nebo stabilizaci.

Začlenění léčiva do matrice známých mikročástic vyžaduje zahřívání v přítomnosti vody a kyslíku. To vede samozřejmě k porušení léčiva oxidativním poškozením nebo nekontrolovatelným zesíťováriím s nosičem. V případech, kdy je použita chemická stabilizace, potenciální ztráta aktivity bývá dokonce větší.

Jiný mechanismus zpomalení nebo modifikace uvolňovací rychlosti léčiva z rozpustného pólymemítio nosiče je navázání aktivní složky kóvaleňtní vazbou k rozpustnému polymeru. Obecně toto nebylo uplatňováno na systémy mikročástic, kde jsou léčiva, ligandy nebo protilátky vázány k částicovým nosičům.

Hlavní překážkou navazování aktivních složek na mikročástice je za dosavadního stavu techniky relativní hydrofobnošt mikročástic. Mnoho Chemických reakcí za vzniku nových vazeb probíhá ve vodném prostředí, proto jé téměř nemožné modifikovat hydrofobní mikročástice. Předchozí výroba hydrofilních mikročástic zahrnovala komplexní reakci v přítomnosti hydrofilního polymeru v emúlzním procesu.

Rychlost biodegradace mikročástic je určena převážně rozsahem zesíťování, Za dosavadního stavu techniky měly změny v zesíťování Škodlivý účinek na navázání léčiva a následnou schopnost vytvořit mikročástice. Pokusům měnit tento parametr a regulovat rychlost biodegradace a uvolňování léčiva byla věnována malá pozornost. Ža dosavadního Stavu techniky

Λ požadovaly mikročástice k dosažení monodisperzní suspenze ve vodném prostředí značné množství povrchově aktivních činidel nebo sonikováhí. Dokonce jíž po vytvoření měly mikročástice sklon k agloměrOvání, a byly proto složitě podávány podkožně injekční stříkačkou.

«

I

Podstata vynálezu

Tento vynález je záložen na objevu, že mikročástice typu popsaného v publikacích PCT WO-A-9112823, WO-A-9218164 a WO-A-9408627, mající dobré částicové charakteristiky, si Udržují i po termálním zasíťování své hydrofílní vlastnosti a schopnost být rekonstituovány ve vodě za vzniku monodisperzní suspenze. Funkční skupiny ve výchozí sloučenině, jako karboxýl, amin, hydroxyl nebo merkaptoskupiňa, zůstávají zachovány a jsou použitelné přó dérivatížaci.

V předkládaném vynálezu se sterilní prášek skládá z hladkých sférických mikročástic o průměru 0,1 až 50 pm, zesíťovaných látek, přičemž jsou hydrofílní mikročástice schopny rekonstituce ve vodě za vzniku monodisperzní suspenze, která navíc obsahuje fyziologicky nebo diagnoštičně aktivní složky vázaně přímo nebo nepřímo ha mikročástice prostřednictvím volných funkčních skupin (amin, hydróxyt, karboxýl nebo merkaptoskupiňa).

Tento vynález využívá techniku výroby mikročástic popsanou v PTC publikacích (viz výše). Uplatňující dokonalou regulaci velikosti, distribuce velikosti, Užitečného zatížení, rychlosti biodegradace a kinetiky uvolňování, jednoduchou v použití a vhodnou pro výrobu ve větším měřítku. Mikročástice, připravené na základě tohoto vynálezu, jsou schopny vyhovět svým aplikačním požadavkům ve všech případech při zachovaní schopnosti vytvořit modifikovaný nosič ve velkém měřítku farmaceutického upotřebeni a vždy še stejnou úrovní regulace. Vedle regulace velikosti se v jednotlivých krocích zavádí nezávislá kontrola, pro distribuci velikosti, rychlost fixace, nebo recipročně rychlost biodegradace užitečné zatížení léčiva a formulaci a zakončení. Jak býlo uvedeno v dřívějších PCT publikacích (viz výše), žadatelé disponují v plném měřítku procesem, který produkuje mikročástiče o specifických vlastnostech. Proces pracuje s farmaceutickými standardy bez přístupu cizorodých částic, které brání parenterálnímu použití mikročástic vyráběných procesy podle dosavadního stavu techniky.

Předkládaný vynález Se týká výroby mikročášticových přípravků pro intravenózní, intraarteriální a ex vivo použití, intravenózní suspenze mikročástic, při rekonstituci v ředidle, Obsahují méně než 5 % objemu mikročástic větších než 6 pm. Navíc se distribuce velikosti tvarem podobá Gaussově křivce, S 50 % mikročástic ležících v rozsahu 5 pm, 3 pm, 2 pm až 1,2 pm.

Žádaná distribuce má 80 % mikročástic v rozsahu 3 pm: (Všechny distribuce se vztahují na objem nebo hmotu).

Pro systémy větších částic, s využitím kombinace vysoce regulovaného sušení rozprašováním a následné frakčionace je možné vyrábět mikročástice dostatečné velikosti a úzké distribuce velikosti tak, že (podle intraarteriáímho podávání}, systemičké uvolňování je vyloučené a poiize cévy menší než 20 pm jsou ucpávány.

Současný vynález zahmúje zavedení aktivní složky do zásobníku pro sušení rozprašováním a následnou stabilizaci částic. Výhoda spočívá ve veliče přesné kontrole morfologie a užitečného naložení oproti dřívějším postupům.

Postup používaný u tohoto vynálezu zahrnuje uskladnění nosného materiálu a léčiva ve stavu suchého prášku s nepatrným Obsahem vody, schopným rekonstituce do původních rozpustných složek.

V předkládaném vynálezu se zesíťování používá pro regulaci rychlosti uvolnění aktivních složek. Např. stupeň zesíťování a rychlost degradace je určen před zakotvením aktivní složky. Aktivní ligand je pak připojen á vykazuje kontrolovatelný profil uvolňování určený stupněm zesíťování matrice. Toto je výhoda stálé rychlosti vylučování a není pozorován známý efekt výbuchu.

Další aspekt tohoto vynálezu je možnost ovlivnění zesíťování. Potenciální úroveň derivatizovatelných skupin a teplota i Čas nutné pro zesíťování jsou kontrolovány přídavkem aditiv, která mění tyto parametry.

Zavedení lysinu, polylysiňu, glutamátu, polyglutamátu, fenylalaninu a tyrosinu do zásobníku má vliv na zvýšehí/snížení rychlosti biodegradace finálního mikročásticóného prostředku. Přídavek těchto aditiv navíc významně zvyšuje počet potenciálních skupin, ke kterým se navazují aktivní složky nebo ligandy. Přídavek těchto aditiv dáleredukuje Čas/teplotu stabilizace mikročástic při zahřívání rozpustných mikročástic vytvořených pri sušení rozprašováním.

Předkládaný vynález poskytuje mikročástice, které jsou vhodné zejména pro směrování na definovaná místa díky úzké velikostní distribuci a které mají, díky kombinaci vhodných rysů, výjimečné použití.

Bylo objeveno, že mikročástice vyrobené popsanou technikou máji výhodnější vlastnosti než mikročástice přístupné podle dosavadního stavu techniky vzhledem ke schopnosti manipulace, derivatizace a formování mikročástic. Žadatelova technologie umožňuje výrobu mikročástic, které zachovávají podstatně sekundární strukturu, jsou hydrofilní, nepodléhají denaturaci a nejsou nerozpustné se stíněnými funkčními skupinami, jak tomu bylo za dosavadního stavu techniky.

Mikročástice:

(i) obsahují určitý počet aminových, hýdřoxylových nebo karboxylových skupin nebo jejich kombinaci pro derivatižaci (ii) jsou vysoce hydrofilní, jejich aktivní skupiny jsou ve vodném prostředí přístupné pro derivatižaci (iii) jsou zpracovatelné v suchém i mokrém stavu.za vzniku suchých finálních produktů, nevyžadují povrchově aktivní činidlo nebo sohikaci pro vznik monodisperzních suspenzí (i v) rychlost biodegradace a uvolňování aktivních složek je určena Složením a zešíťováním matrice (v) jsou ve velikostech v rozmezí.0,01-100 pm (ví) zůstávají v oběhu in vivo pro periody (60 min a více), zřetelně déle než známé hydfófobnější mikročástice a déle než lipošomy, opsonizace je potlačená, thrombogenní účinek minimalizován.

Pro intravenózní podávání je vhodná velikost mikročástic pod 4 pm, přo intraarteriální podávání 8-30 pm. Zejména u větších mikročástic je zvláštním krokem volitelná frakcionace. Tento rozsah velikosti mikročástic se vyjadřuje jako poměr interkvartilňího rozsahu ke střednímu průměru a je 0,2-O.S.

Mikročástice podle předkládaného vynálezu se dérivatizují konjugací s léčivy, ligandy, peptidy nebo proteiny přímo na nosiči s využitím karboxylové nebo aminové skupiny základních mikročástic nebo aditiv v zásobníku pro sušení rozprašováním. Konjugace se účastní glutaraldehyd, EDCI, tereftaloylchlorid, kyanogénbromid nebo reďuktivní aminace. Popřípadě se ligand, léčivo, protein.nebo péptidváží přeš biodegřadabilní hydroxykyselinové raménkó druhu popsaného v WO-A-9317713 (Rijksuňiveršitěit Gróningen), jehož obsah je zahrnut v Odkaze.

Další výhoda tohoto vynálezu je ve schopnosti převést a předvést produkt jako suchý sterilní prášek.

Mikročástice v práškové formě podle tohoto vynálezu nepotřebují povrchově aktivní činidla pro převedení do moňodisperzní suspenze nebo pro rekonstituci. Po rekonstituování neaglomerují a mohou být podávány stříkačkou.

Tento vynález popisuje s vodou mísitelný systém vyrobený z biokompatibilních složek. Mikročástice podle předkládaného vynálezu nejsou po zahřívání nerozpustné, neboť si dostatečně podrží sekundární strukturu a zůstávají vysoce hydrofilní. Důkaz zachování sekundární struktury se získal ověřením isoělektrického bodu mikročástic (PI), který je při pH 4,5 až 5 velice blízký nativnímu albuminu. Plná denaturace albuminu vede k podstatnému zvýšení PI na hodnotu 6,5 až 7.

Štěpeni proteinových mikročástic proteázami poskytuje peptidy, které při porovnání s produkty štěpení výchozího rozpustného proteinu vykazují identické HPLC profily. Kyselá hydrolýza proteinových mikročástic a výchozího proteinu poskytuje nápadně podobný obsah aminokyselin. Tyto dvě analýzy podporují pozorování, že protein v mikročásticích je převážně v nativním stavu.

Nové mikročástice jsou hydrofilní a mají schopnost cirkulovat v periodách větších než jedna hodina, poprvé je tak předkládán biokompatibilní nosičový systém vykazující prodlouženou dobu cirkulace s vysoce specifickou afinitou k ligandům. Specifita mikročástic jé určena při jejich výrobě a zajišťuje vysokou afinitu k vázaní ligandů, která je běžně spojována s chromatografickými matricemi nebo enzymy. Mikročástice také nabízejí využití ve spojení š biologickými kapalinami; např. při dětoxifikaci v extrakorporeálním systému,’ bioánálýžáčh sera nebo krve a při separaci krevních komponent před jejich aplikací do organismu.

Následující příklady ilustrují Vynález.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Tento příklad ilustruje fixaci rozpustných mikročástic za vzniku nerozpustných nebo méně rozpustných mikročástic zesíťováním obálky látky. Mikročástice jsou zesíťovány různými způsoby, zahrnujícími zahřívání nebo chemickou cestu. Upravení stupně fixace má následně za výsledek stupeň rozpustnosti mikročástice v daném prostředí. Navíc se v tomto stupni rozpuštění uvolňují jakékoliv aktivní složky vázané nebo jinak inkorporované do mikročástic. Stupeň fixace mikročástic je také ovlivněn stupněm jejich enzymatického odbourávání. Čím větší je stupeň fixace, tím je mikročástice odolnější vůči enzymatickému štěpení.

HSA mikročástice byly vyrobeny sušením rozprašováním ze zásobní směsi 150 ml 25% ethanolu obsahujícího 10,0 mg/ml HSA. Podmínky pro sušení rozprašováním použité pro výrobu mikročástic jsou Upřesněny v Tabulce 1 (viz níže).

Tábulka 1

Podmínky sušení rozprašováním	Nastavení
Vstupní teplota	220°C
Výstupní teplota počáteční	• 85,2 °C
Výstupní teplota konečná	84,0 °C
Tlak atomizace	7,5 bar
Nastavení vlhčícího válče	0,5
Rychlost podávání	3,88 g / min
Zásobní roztok	25 % ethanol 100 mg / ml HSA

Procesem sušení rozprašováním se vyrobilo 17,21 g mikročástic. Mikročástice z jedné výrobní nádoby se rozdělily na stejně velké alikvoty a fixovaly zahříváním na 175 °C po dobu 45, 55 a 75 minut. Proces fixace zahříváním učiní z rozpustných mikročástic získaných sušením rozprašováním mikročástice nerozpustné, zešíťováním některých aminokyselin v albuminové struktuře; Tři různé sady mikročástic fixovaných zahříváním byly kalibrovány ve vodném Systému za použití Multisizeru II (Coultér Electronics). Mikročástice měly průměrnou velikost 3,28 ± 0,6 pm s 90% zastoupením hmoty v rozmezí 2-5 pm.

Mikročástice fixované zahříváním 55 minut se analyzovaly, dříve než se na ně vázaly jakékoli aktivní složky, jako nosiče léčiv.

Analýza volného thiolu. Volná thiolová skupina v albuminu je velice přístupná modifikacím, a tak se používá jako měřítko stavu albuminu. Má být přítomná ve struktuře mikročástic, aby se potvrdilo, že molekula albuminu se během vytváření mikročástic nepoškodila.

Analýza volné thioiové skupiny se provedla reakcí albuminových mikročástic s DTNB, tj.’ 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoovou) kyselinou. Přítomná volná thiolová skupina reaguje s DTNB Za vzniku derivátu nitřobenZóove kyseliny, který absorbuje při 412 nm. Měřila se absórbanče suspenze mikročástic (12 mg/ml) při 412 nm. K suspenzi sé přidalo 50 pl 20%roztoku DTNB v TRIS pufru a směs se inkubovaía 10 minut při teplotě místnosti a změřila sé absorbance. Ze spočítaného rozdílu absorbancí a z molárního extinkčníhó koeficientu produktu reakce se spočítala koncentrace přítomných volných ihiolových skupin v mikročásticích. Molární poměr thiolovýčh skupin naměřený v mikročásticích byl 0,4785. To se blížilo hodnotě 0,5045 pro nativní albumin. Z malého rozdílu získaných hodnot se Usoudilo, žé thiolová skupina zůstává během vytváření mikročástic intaktní.

Mikročástice (jak rozpustné, tak nerozpustné) a nativní albumin se rozštěpily na stavební aminokyseliny hydrolýzou v plynné fázi zahříváním s koncentrovanou HCI 24 hodin na 120 °C.

Vzorky sě pak derivatizovaly přídavkem triethylaminu v 50% ethanolu a následně triethylaminem a P1TC v ethanolu. Derivatizované vzorky se analyzovaly na HPLC a aminokyseliny se detekovaly při vlnové délce 254 nm.

Tabulka 4 (na konci popisu) ukazuje výsledné aminokyselinové Složení. Nečekaně se mezi vzorky neobjevily výrazné rozdíly, pouze velmi malá ztráta aminokyselin obsahujících karboxylovou, hydroxylovou nebo amidovou Skupinu po insolúbilizaci mikročástic.

Peptidová analýza. Štěpení mikročástic a albuminu působením pepšinu se provádělo s použitím 1 ml okyseleného roztoku mikročástic nebo albuminu, ke kterému se přidalo 20 pl 1% roztoku pepsinu. Štěpení Se provádělo 24 hodin při 37 °C, poté se přidal další.podíl pepsinu a následovala další inkubace při 37 °C až do úplného rozštěpení vzorků. HPLC analýza výsledných lysátů se prováděla gradientem acetonitrilu v 0,1% TFÁ, absorbance se měřila při 214 nm.

Štěpení mikročástic a albuminu působením trypsinu se provádělo se vzorky s předem rozrušenou proteinovou strukturou (působením guanidinu-HCl, ĎTT ajódacetamidu). K těmto předpřipraveným vzorkům se přidal 0,2% trypsin a vzorky se inkubovaly při 37 °C až do úplného rozštěpení (v případě nutnosti byl přidán další podíl trypsinu). HPLC analýza lyzátů se prováděla způsobem popsaným výše.

HPLC analýzy neukázaly žádné podstatné rozdíly mezi mikročásticemi a strukturou albuminu. Toto zjištění potvrzuje podstatnou retenci sekundární a terciární struktury mikročástic po insolúbilizaci.

Vázání na FlTC. FITC (fluórescein isothiokyanát) se váže kovalentně na aminoskupiny mikročástic a představuje princip derivatizování nabitých skupin, zejména lysinových zbytků, léčivy, ktere se následně uvolňují degradací vlastní rnikroČásticové matrice.

FITC se kovalentně navázal na tri rnikroČásticové Šarže. Použil se poměr mikročástic k FITCu 15:1. K Suspendovaným mikročásticím se přidalo 12,5 mg FITCu a směs se inkubovala při 30 °C 30 minut. Nadbytek fluoresceinu se odstranil promytím mikročástic až do nepřítomnosti fluóresčeinu, t.j. dále se již nepozorovalo vymývání markéru.

Mikročástice se Štěpily proteinázóu K v koncentraci 0,4 EU/ml. Fluórescein se uvolňoval při štěpení mikročástic a měřil se odebíráním vzorků v různých Časových intervalech. Uvolněný FITC se oddělil od mikročástic centrifugací a kvantitativně se určil měřením absorbaňče. při 493 nm.

Výsledky ukázaly, že Čím jsou mikročástice méně tepelně fixovány, tím rychleji se zpočátku uvolňuje fluorescein. Avšak po 225 minutách všechny vzorky uvolnily více než 90 % fluoresceinu. Množství FITCu navázaného na různě tepelně fixované mikročástice se téměř nelišilo, jednotlivé naložení bylo 10 ± 0,5 % mol/mol pro všechny tři šarže.

Rychlosti uvolňování navázaných aktivních složek še tak řídí určením rychlosti degradace mikročástic před vlastním navázáním aktivních složek.

Mikročástice ž příkladu 1 še inkubovaly s lidskou krví 30 minut při 37 °C, aby se určilo, zda mikročástice jsou schopny Stimulovat aktivaci krevních destiček. Koncentrace mikročástic se rovnala dávce 2000 x 10⁶ částic/kg. Po 30 minutách inkubace se sérum testovalo ňa ovlivnění c· agregace krevních destiček stimulované kolagenem ADP a ařačhidonovou kyselinou. Vlivy na obecné hemostatické mechanismy se stanovily měřením ptókoagulační aktivity, částečnou dobou thromboplastinu, doba prothrombinu vznikem fragmentu 1+2 a fibrinopeptidu A, a fibrínolytická aktivita měřením doby lýze euglobulinu.

Při teto koncentraci se nepozoroval žádný důkaz nežádoucích efektů při daných experimentech. Výsledky ukazují, žč mikročástice jsou inertní a hydrofilní, na rozdíl od mikročástic vyráběných emulzními postupy.

V dalším testu se mikročástice vyrobené podle postupu z příkladu 1 sterilizovaly gama zářením ze zdroje Co⁶⁰ a dávkách 25-35 Kgray. Mikročástice se rekonstituovaly ve vodném prostředí na koncentraci 1,5 x 10’ mikřočástic/ml a podávaly zdravým dobrovolníkům mužům v dávkách 25-300 x 10⁶ mikročástic/kg še souhlasem etické komise. Mikročástice byly duté s obsahem vzduchu, což umožňovalo kontrolovat jejich průchod a stabilitu v krevním řečišti za 'J.

pomoci ultrazvukového zobrazení.

S použitím Acusonu-128, se získalo šedé 2D zobrazení pravé a levé srdeční dutiny pro monitorování oběhového času po IV dávkování. Aby se objevila opacifikace pravé i levé srdeční dutiny? je nutná určitá hladina mikročástic v komorách. Při dávkách od 25 x 10^e/kg výše, opacifikace v levé i pravé srdeční dutině trvala po dobu 1 hodiny nebo více, dokazujíc tak, že podstatné množství mikročástic zůstalo v oběhu.

Tyto údaje ukazují, že základní mikročásticoýý nosič je inertní vůči koagulačnimu mechanismu v krvi a hodí se jako nosič pro léčiva. Naproti tomu mikročástice připravené emulzními procesy ukazovaly rychlý RES příjem a poločas oběhu 10 minut a méně. Tyto mikročástice nevyžadují derivatizaci s bloky polymerů pro zvýšení poločasu v oběhu.

.1,

Tento příklad ukazuje, že aditiva se mohou přidat to zásobníku pro výrobu mikročástieověho produktu sušením rozprašováním, vzniklé mikročástice se fixují zahříváním při nižších teplotách. Aditiva, která umožňují žesíťování mikročástieověho polymeru (insolubilizaci) při nižších teplotách, mají použití když se léčiva společně suší rozprašováním a tak inkorpórují do matrice. Při použití těchto aditiv se mikročástice s citlivými aktivními složkami insolubilizují při

Příklad 2 výhodnější nižší teplotě.

K zásobníku pro sušení rozprašováním se přidalo 5mg/ml tyrosinu a vytvořily se mikročástice postupem popsaným v příkladě 1. Pro získání mikročástic se neměnily podmínky sušení rozprašováním.

Vytvořené mikročástice se fixovaly zahříváním jako prve, ale při teplotě 1Ό0 °C 55 minut, podstatně nižší než běžně 175 °Č 55 minuty při dosažení stejného žesíťování. Vyrobené mikročástice měly průměrnou velikost 3,28 ± 0,6 pm s 90 % hmoty v rozmezí 2-5 pm.

Příklad 3

Příklad 1 rozebírá výrobu mikročástic 3pm. Tento příklad ukazuje, že úpravou podmínek pro sušení rozprašováním a použitím sekundárního stupně klasifikace vznikají větší mikročástice s výbornou regulací velikosti a distribuce velikosti.

20% HSA se vysušil rozprašováním žá podmínek uvedených v Tabulce 2. Připravené mikročástice se fixovaly zahříváním na 175 °C 55 minut, deaglomerovály a třídily za použití zahnutého tryskového třídiče (viz Tabulka 3),

Prostřední tříděná frakce se jímala a refórmulovala, proces třídění odstranil většinu éxcipieritu. Výsledný volně proudící suchý prášek se charakterizoval způsobem popsaným výše. Mikročástice měly průměrnou velikost 12 pm, bez mikročástic menších ňež 6 pm, s 85 % hmoty mezi 9-18 pm.

Odstraněním mikročástic menších než 6 pm se prostřednictvím kapilárního zachycování předchází velkému krevnímu oběhu mikročástic, následujícímu po intraateriálním podávání. To má výhodu lokalizace depozitního íčku, a tak redukováni Celkového množství léku potřebného k dosažení terapeutické aktivity v požadovaném místě. To jě žádoucí zejména v případě cytotoxických látek, neboť syStemická toxicita jé hlavní příčinou škodlivých vedlejších účinků.

Tabulka 2

Podmínky sušení rozprašováním	Nastavení
Vstupní teplota	220 °C
Výstupní teplota počáteční	.89,1 °C
Výstupní teplota konečná	89,2 °C
Tlak atomizace	2,0 bar
Nastavení vlhčícího válce	.0,5
Rychlost podávání	20,1 g / min
Zásobní roztok	20%HSA

- Tabulka3

Podmínky třídění	Nastavení
Primární tah	0,6 barg
Sekundární tah	2,0 barg
Tah diťuzéru	8,0 barg

Protilátky se vázaly na povrch mikročástic. Pro detekci navázané protilátky se používal FITČIgG.

K 5 mg FITC IgG se přidalo 35 mg jodistanu sodného. Směs se inkubovala při teplotě místnosti 1 hodinu, potom se přidalo 20 mg mikročástic. Suspenze se míchala 10 minut a pak se na mikročástice navázala protilátka s přídavkem 30 mg tetrahydroboritanu sodného. Reakce probíhala 2 hodiny při teplotě místnosti, potom sé mikročástice oddělily a promyty.

Vzorek mikročástic se redukoval za uvolnění lehkých řetězců navázaných protilátek. Po odstranění 'mikročástic se jímal výsledný filtrát. Přítomnost lehkých řetězců FITC-značené protilátky ve filtrátu se měřila s použitím fliiorimetru.

Vazba mezi protilátkami a mikročásticemi se také uskutečňuje prostřednictvím tri- a tetrapeptidových ramének. Peptidy se kováléntně vážou na aktivovaný cukerný kruh protilátek s použitím jodistanového a tětrahydróboritanového postupu popsaného výše. Protilátky se poté vážou na mikročástice prostřednictvím peptidového raménka s použitím EĎCI, jak se popisuje v příkladu 6.

Příklad 4

Tento příklad ukazuje, že inkorporace aditiv do zásobníku pro sušení rozprašováním, např. HS A, mění chemické vlastnosti mikročástic vyrobených podle příkladu 1, takže se výrazně zvyšuje počet niíst pro chemickou vazbu.

Polylysin se inkorporoval do zásobního roztoku pro sušení rozprašováním v koncentraci 5 mg/ml. Postup sušení rozprašováním se prováděl podle příkladu 1. Mikročástice vyrobené z modifikovaného zásobníku měly průměrnou velikost 3,5 ± 0,3 pm š podobnými fyzikálními charakteristikami a resušpenzními vlastnostmi jako HSAmikročástice.

FITC se navázal na póiylysinové mikročástice, jak se popisuje v přikladu 1. Mikročástice še promývaly až do ztráty absorpce FITC. FITC navázaný na HSA mikročástice se ve vodné suspenzi neuvolňo val. Mikročástice se Štěpily, jak še popisuje vpnkladu 1, a změřilo sě celkově množství fluorěsceinu navázaného na mikročástice.

Rychlost uvolňování fluořešceinu při štěpení še ukázala větší než uvolňování mikročástic. Změřilo se celkové množství 20 molárních % fluořešceinu navázaného na mikročástice, byl zjištěn více než 50% nárůst oproti standardnímu složení mikročástic.

Příklad 5

Tento příklad ukazuje že aktivní látky se vážou na obálku a následně se uvolňují rychlostí závisející na degradaci vlastních mikročástic.

K roztoku 10 mg/ml methotrexatu se přidalo 25 mg karbodiimidu (EĎCI). Roztok se míchal 4 hodiny pro iniciaci a úplný průběh aktivace methotrexatu. K aktivovanému léčivu sé přidalo 50 mg HSA mikročástic vyrobených podlé příkladu 1 a směs sě míchalá 3 hodiny při teplotě místnosti. Methotrexát Se chemicky navázal ná mikročástice prostřednictvím aminových skupin albuminu. Mikročástice se oddělily á promyly, aby se odstranil nenavázaný methótrexat.

Mikročástice s navázaným méthotrexatem se charakterizovaly a stanovil se obsah léčiva. Mikročástice mely průměrnou velikost 3,2 ± 0,6 pm s 90 % hmoty mezi 2-5 pm. Analýza obsahu léčiva ukázala, že mikročástice neuvofiují léčivo během suspenzace ve vodném prostředí. Test tříměsíční stability neukázal žádné uvolnění léčiva během této doby. Při štěpení albuminových mikročástic proteinázou K se uvolňovalo léčivo, které se vázalo k omezenému počtu aminokyselin á malých peptidu.

f.

Doxorubicin sekonjugoval s mikročásticemi vyrobenými podle příkladu 1, v přítomnosti

Přiklaď 6 karbodiimidu, 3 mg doxorubicinu, 6 mg EDCI a 100 mg mikročástic sě suspendovalo v destilované vodě při pH 6,6 a 37 °Č po dobu 20 hodin za stálého míchání, resuspehdovalo a formulovalo.

Mikročástice s doxořubieinem Se analyzovaly na obsah léčiva a charakterizovaly. Výsledky neukázaly žádnou změnu mikročástic během konjugace s léčivem. Zatížení léčivém Se stanovilo na vzorku enzymaticky štěpených .mikročástic pomocí HPLC analýzy. Naměřilo se zatížení 2 % a léčivo se navázalo na limitovaný počet aminokyselin nebo krátkých peptidů.

Již dříve se ukázala aktivita doxorubicinu vázaného na polymerní nosiče v tumorech vykazujících résištenci vůči multiléČivovému přístupu:

Příklad 7

Mikročástice vyrobené podle příkladu 1 se derivatižovaly 2'-deoxy-5-fiuorouridinem (FudR). Léčivo se aktivovalo působením sukčinanhydridu.

K Ó.2M fosfátovému pufru piři pH 8,3 se přidalo 40 mg FUdR. K tomuto roztoku sepřidalo 200 mg sukčinanhydridu a reakčni směs se míchala 2 hodiny pri 30 °Č, pH 8,3 se udržovalo s použitím IMNaOH Po změně pH reakčni směsi na 6,5 se přidalo 0,5 g mikročástic.

¹ Suspenze se míchala 10 minut, pak se přidal EDCI a N-hydroxysukcinimid v poměru 15:1, reakce probíhala při teplotě místnosti. Po 24 hodinách se mikročástice oddělily a promyty, přítomnost FUdR vázaného na mikročástice se potvrdila pomocí HPLC analýzy. Kyselá hydrolýza mikročástic š ňávázariýrií léčivém še’prováděla'v systému ASTĚD spoužrtím 1% ŤFA, následnéuvólnění FUdR se sledovalo pn 269 nm. 15% W/w FUdR se navázal na mikročástice prostřednictvím vazby hydrolyzovatelné v kyselém prostředí.

Cytotoxická aktivita konjugátů mikročástic s léčivem v příkladech 5 až 7 se měřila in vitro. Použila še HSN buněčná linie. To je chemicky indukovaný krysí střevní sarkom, který produkuje jatěrní tumory v animálním modelu s vaskulániím vzorem podobným lidským kolořektálním jatemím metastázám. Úhyn buněk se měřil nepřímo s použitím MTT. To je redukováno v aktivních miťochondriích na barevný metabolit formazan. HSN buňky se inkubovaly v multikomůrkóvých miskách, ke kterým se přidaly kontrolní dávky léčiva nebo lysátu mikročástic s navázaným léčivem. Po různých expozičních Časech se do komůrek přidalo MTT a změřila se koncentrace formazanu jako indikace buněčné smrti. Test se kalibroval pro tuto buněčnou linii proti řadě známých počtů buněk.

Všechna tři léčiva (methotrexat, 5-FUdR, a doxofubicin) měla podobné křivky závislosti na dávkách pro přirozené léčivo i pro lysat mikročástic s navázaným léčivem, indikující podobnost eytótoxické aktivity. Maximální redukce v buněčné aktivitě pro všechna třiléčiva a lysáty byla 80 %. Pro 5-FÚdR a methotrexat, nejštrmější Část křivky závislosti na dávkách byla od l pg/mldo 0,1 pg/ml, pro doxorubicin od 0.1 pg/ml, v rámci rozsahu séra in vivo. Kontrolní lysáty nedérivatizovaných mikročástic nevykazovaly žádnóu čytotoxickůú aktivitu.

Příklad 8

Tento příklad ilustruje vazbu aktivní látky ně přímo ha stěnu mikročástice, ale prostřednictvím degradábiíní vazby nebo raménka. To umožňuje lepší kontrolu navázání i uvolňovaní aktivní látky.

S použitím technologie popsané v WO-9317713 pro navazování léčiv ha rozpustné nosiče, se na mikročástice navázal, s využitím raménka kyseliny mléčné, ňaproxen. K suspenzi 10 mmol L-mlěČné kyseliny v dimethylformamidu se přidalo 20 mmol triethylaminu a 10 mmol pentamethylbenzylchloridu (PMB). Směs se zahřívala až do rozpuštění všech komponent, pak še nechala při teplotě místnosti. Po inkubaci roztoku přes noc se přidal nadbytek uhličitanu sodného a preeipitoyaňý ester, PMB-ester kyseliny L-mléčné, se oddělil, promyl a vysušil.

K roztoku Obsahujícímu 10 mmol naproxenu, PMB-esteru kyseliny L-mléčné a

4-dimethylaminopyndinu, se přidalo 11 mmol roztoku dicyklohexylkarbodiimidu. Reakční směs se míchala při 25 °C a monitoroval se vznik naproxenového produktu. Po úplném proběhnutí reakce se naproxenový derivát kyseliny L-mléčně oddělil, promyl a vysušil.

PMB chrániči skupina se odstranila reakcí naproxenového derivátu s anisolem a trifluoroctovou kyselinou při teplotě místnosti 2 minuty. Nadbytek činidla se odstranil ve vakuu a odparek se promyl. Okyselení promytého odparku poskytlo naproxenový derivát kyseliny L-mléčné, který se extrahoval, promyl a sušil ve vakuu při 50 °Č.

Naproxenový derivát kyseliny L-mléčné sé aktivoval reakcí s karbodiimidem v poměru 1:1, následovanou reakcí s 1 mmolem N-hydroxysukcinimidu. Aktivovaný NHS-haproxenový derivát kyseliny L-mléčné se přidal k HSA mikročásticím v poměru 5:1 v borátovém pufru. Výsledný produkt sě oddělil a vysušil.

Vysušené naproxeňové mikročástice se formulovaly za vzniku volně tekutého prášku, s průměrnou velikostí mikročástic 3,5 ± 0,6 pm. 90 % Hmoty mikročástic bylo v rozmezí 2 až 5 pm.

Analýza produktu se provedla pomocí kapilární zonové elektroforézy (Beckman, UK). Ta ukázala přítomnost léčiva na mikročásticích. Uvolňování léčiva s použitím estéráz a následná analýza uvolněného naproxenu.se. prováděla s použitím systému ASTED připojeného na Gilson HPLC (Anachem, UK). Ukázalo se, že léčivo zůstalo intaktní a ve své nativní.formě.

Příklad 9

Výroba mikročástic sušením rozprašováním umožňuje regulovat mnoho faset procesu a finální charakteristiku mikročástic. Povrchová charakteristika výsledných mikročástic se ovlivní zavedením ligandů pro enzymy nebo receptory na obálku mikročástice. V tomto příkladě je zvýšen počet argininových zbytků, což je využito k navázání TPA.

S použitím postupu popsaného v příkladě 1 a 5, se k zásobníku pro sušení rozprašováním přidal polyarginin, Za stejných podmínek jako v příkladě 1 se vyrobily mikročástice. Mikročástice měly průměrnou velikost 3,31 ± 0,6 pm a 90 % hmoty bylo mezi 2 až 5 pm.

K 100 mg mikročástic se přidal roztok obsahující 250 pg TPA. Suspenze se míchala 2 hodiny, potom se mikročástice oddělily a krátce promyly. Koncentrace TPA zůstávajícího v reakční směsi se změřila pomočí RP-HPLC po redukci peptidů inkubací v 20mM ĎTT při 37 °C 30 minut v přítomnosti 8M močoviny. Analýza fragmentů se prováděla s použitím gradientu 10-40% acetonitrilu ve vodě a 0,1% TFA za 60 minut.

Mikročástice s navázaným TPA se analyzovaly ňa přítomnost TPA s použitím testu lýze krevní sraženiny. Fibrinová sraženina vznikla spojením fibrinógenu, thrombinu a TPA-mikročástic. Ke sraženině se pak přidal plasminogen a skleněná perlička se přidala na povrch pro určení konce testu, lýze sraženiny. Propadnutí skleněné perličky skrz lyžovanou sraženinu ukázalo, že TPA navázané na mikročástice je stále aktivní.

Množství TPA navázaného ňa mikročástice se určilo s pomocí modifikovaného fibrinovéhó testu. K mikrotitrové komůrce v misce se přidal tenký agarosový gel obsahující fibrinogen a thrombin. Kč gelu se přidalo 20 μΐ suspenze TPA-mikročástic a plasminogen. Po 30 minutách se miska prómýlá, redukce gelového zákalu se určila pomocí mikrotitrového čtecího zařízení při 340 nm. Koncentrace TPA přítomného na mikročásticích se určila pomocí příslušných TPA standardů. Výsledky ukázaly, že na mikročástice se navázalo 15 až 20 % TPA.

TPA-mikročástice mají využití jako deposita thrombolytického činidla pro administraci v době angiografie, podobně jako v WO-A-9408627, jako deposita echokontrastního činidla, s výhodou lokalizace zásobníku TPA v myokardu.

Průmyslová využitelnost

Technika výroby mikročástic podle tohoto vynálezu uplatňuje dokonalou regulaci ?

.. . . Ί velikosti, distribuce velikosti, užitečného zatížení, rychlosti biodegradace a kinetiky uvolňování, jednoduchou v použití a vhodnou pro výrobu ve větším měřítku. Mikročástice, připravené na základě tohoto vynálezu, jsou schopny vyhovět svým aplikačním požadavkům ve všech případech při zachování schopnosti vytvořit modifikovaný nosič ve velkém měřítku farmaceutického upotřebení.

Tabulka 4. Aminokyselinové složení přirozeného albuminu a mikročástic

Aminokyselina	HSA(n = 5)	Rozpustné mikročástice (n = 5)	Nerozpustně mikročástice (n = 7)
Kyselina aspartová	50,188 ±2,73	57,99 ±4,13	59,23 ±4,81
Kyselina glutamová	79,31 ±5,44	80,47 ±2,26	85,70 ±4,04
Šeřin	23,21 ±1,39	23,2 ±1,23	20,65 ±2,44
.Glycin	14,54 ±0,71	15,33 ±0,38	14,93 ± l/)7
Histidín	17,34 ±1,06	17,65 ±1,01	16,42 ±0,85
Threonin	26,99 ± 1,34	27,23 ±1,56	28,39 ±2,38
Alanin	63,83 ± 1,34	61,45 ±0,96	62,69 ± 1,86
Arginin	25, í 8 ±0,95	24,39 ±1,02.....	23,15 '± 1,55
Prolin	28,36 ±1,17	27,45 ±2,03	25,20 ±3,05
Tyrošin	18,37 ±0,71	18,02 ±0,42	16,13 ±1,38
Valin	35,54 ±1,49	35,07 ±1,03	37,59 ± 4,53
Methionin	7,99 ±0,5	7,68 ±0,42	6,24 ± 1,16
Isoleucín	6,42 ±0,54	6,64 ± 0,57	8,96 ±1,78
Leucin	63,22 ± 3,48	62,13 ±3,14	59,28 ±4,38
Fcnylalanin	32,00 ±2,73	30,45 ±2,13	30,48 ± 1,92
Lysin	56,185 ±2,50	53,45 ±1,62	51,68 ±3,67

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sterilní prášek, vyznačuj í c í set í m, že obsahuje hladké sférické mikročástice, 0,1 až 50 pm v průměru, ze zesíťovanýčh látek, mikročástice jsou hydrofilní a schopné rekonstituce ve vodě za vzniku monodisperzní suspenze, které navíc zahrnují fyziologicky nebo diagnosticky aktivní komponenty vázáné přímo nebo nepřímo na mikročástice prostřednictvím jejich volných funkčních Skupin.
2. 2. Sterilní prášek podle nároku 1, v y z n a č u jící se tím, že látkou je aminokyselina, polyamihokyselina nebo jiný polypeptid.
3. 3. Sterilní prášek podle nároku 1 nebo nároku 2, vyznač u j ící se t í rn, že obsahuje další vodou rozpustné látky, které usnadňují enzymatickou biodegíadaci.
4. 4, Sterilní prášek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 3, v y z n a č u j í c í se t í m, že aktivní komponentou je léčivo, chemické raménko, ligand pro enzym nebo receptor, nebo protilátka.
5. 5.

   Sterilní prášek podle kteréhokoliv z předchozích hářóků 1 až 4, v y z n a č u j ící s e t í m, že je vodou rozpustný a obsahuje zmíněné skupiny a získá se ze zmíněného materiálu (i) sušením rozprašováním a zesíťováním, takže zmíněné skupiny jsou získány ve volně formě a (ii) navázáním aktivní složky na zesíťovaný materiál prostřednictvím zmíněných skupin.
6. 6. Sterilní prášékpodle nároku 5, vy z n a ču j í c í s e t í m_{ že krok (i) zahrnuje sušení rozprašováním roztoku vodou rozpustné látky a zesíťování vysušené látky za horka v přítomnosti méně než 4 % vlhkosti.
7. 7. Stérilní prášek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 6, vyznačující s é t í m, že funkční skupiny jsou amin, hydroxyl, karboxyl nebo meřkaptoskupina.
8. 8. Sterilní prásek podle nároku 7, v y z n a č u j i c í s e t í m, že funkční skupiny jsou amin, hydroxyl nebo karboxyl.
9. 9. Sterilní prášek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 8, v y z n a č u j í c í se t í m, že částice mají poměr interkvartilního rozsahu k průměrnému průměru 0,2 az 0,5.

   1Ó. Sterilní prášek podle nároku 9, vy z na č uj í č í se t í m, že 95 % částic jě menších než 6 pm a 80 % částic je vrozmezí i až 6 pm.
10. 11. Sterilní prášék podle nároku 9, v y z nač ují c í s e t í m, že 90 % částic je menších než 20 pm a méně rtež 5 % objemu je menších než 6pm.
11. 12. Suspenze mikročástic podle definice z kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 11, v y z n a č u j í c í setí m, že je vhodná pro parenterální podávání.

    ’
12. 13’ Suspenzemikročástičpodle nároku 12, v y z nač u j í c í s e t í m, že mikročástice podle nároku 10 jsou pro intravenózní podávání.
13. 14. Suspenze mikročástic podle nároku 12, vyznačují cí se tí m, že mikročástice podle nároku 11 jsou pro intraarteriálňí podávání.
14. 15. Sterilní prášek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 11, vy z na č u j ící se t í m, že akti vní složkou jě cytotoxická látka.
15. 16. Použití doxorubicinu pro přípravu léčiva zahrnujícího sterilní prášek podle nároku 15 pro léčení tumorů vykazujících resistenči vůči multiléčivověmu přístupu.