CS230889B1 - Production method of alpha amylase enzyme - Google Patents

Abstract

Spósob produkcie enzýmu alfa amylázy. Vynález sa týká oboru mikrobiológie, chemie a biochémie sacharidov, potravinárskej a farmaceutickej chémie. Očelom vynálezu je získanie nového enzýmu alfa amylázy schopnej hydrolyticky štěpit alfa-l,4-glukány škrobu na maltózové oligosacharidy s vysokým zastúpením maltózy i maltotriózy. Uvedeného účelu sa dosiahne pomocou mikroskopickej huby Blaštobotrys proliferans z rodu Blastobotrys Klopotek, četade Moniliaceae, rodu Moniiiales, triody Deuteromycates, kultivovanej na vhodných živných pódach. Enzým alfa amylázu možno získat o poměrně vysokej špecifickej aktivitě až 4,0 nkat/mg proteinu a vhodných vlastnostiach predovšetkým na vysoké zastúpenie maltózy a maltotrózy v škrobovom hydrolyzáte. Vynález má výužitie v mikrobiologii, biochemii a chemii sacharidov, potravinárskom a farmaceutickom priemysle.A method of producing alpha amylase enzyme. The invention relates to the field of microbiology, chemistry and carbohydrate biochemistry, food and pharmaceutical chemistry. It is an object of the present invention to provide a novel enzyme alpha amylases capable of cleaving hydrolytically alpha-1,4-glucans starch to maltose high-maltose oligosaccharides maltotriosis. This purpose is achieved by using microscopic fungi Blaštobotrys proliferans from the genus Blastobotrys Klopotek, readings Moniliaceae, Moniiiales, triodes Deuteromycates, cultivated on suitable nutrients soils. Alpha amylase enzyme can be obtained fairly high specific activity of up to 4.0 nkat / mg protein and appropriate properties especially the high proportion of maltose and maltotrose in starch hydrolyzate. The invention has utility in microbiology, biochemistry and carbohydrate chemistry, food pharmaceutical industry.

Description

(54) Sposob produkcie enzýmu alfa amylázy(54) Method of alpha amylase enzyme production

Spósob produkcie enzýmu alfa amylázy.Method of alpha amylase enzyme production.

Vynález sa týká oboru mikrobiológie, chemie a biochémie sacharidov, potravinárskej a farmaceutickej chémie.The invention relates to the fields of microbiology, chemistry and biochemistry of carbohydrates, food and pharmaceutical chemistry.

Očelom vynálezu je získanie nového enzýmu alfa amylázy schopnej hydrolyticky štěpit alfa-l,4-glukány škrobu na maltózové oligosacharidy s vysokým zastúpením maltózy i maltotriózy.It is an object of the present invention to provide a novel alpha amylase enzyme capable of hydrolytically cleaving alpha-1,4-starch starch to maltose oligosaccharides with a high proportion of both maltose and maltotriose.

Uvedeného účelu sa dosiahne pomocou mikroskopickej huby Blaštobotrys proliferans z rodu Blastobotrys Klopotek, četade Moniliaceae, rodu Moniiiales, triody Deuteromycates, kultivovanej na vhodných živných pódach.This purpose is achieved by the microscopic fungus Blatobotrys proliferans of the genus Blastobotrys Klopotek, family Moniliaceae, genus Moniiiales, triodes Deuteromycates, cultivated on suitable nutrient platforms.

Enzým alfa amylázu možno získat o poměrně vysokej špecifickej aktivitě až 4,0 nkat/mg proteinu a vhodných vlastnostiach predovšetkým na vysoké zastúpenie maltózy a maltotrózy v škrobovom hydrolyzáte.The alpha amylase enzyme can be obtained with a relatively high specific activity of up to 4.0 nkat / mg protein and having suitable properties, in particular for a high proportion of maltose and maltotrose in the starch hydrolyzate.

Vynález má výužitie v mikrobiologii, biochemii a chemii sacharidov, potravinárskom a farmaceutickom priemysle.The invention has utility in the microbiology, biochemistry and carbohydrate chemistry, food and pharmaceutical industries.

Vynález sa týká spósobu produkcie enzýmu alfa amylázy (alfa-l,4-glukán glukánotíydroláza EC 3.2.1.1) pomocou mikroskopické] huby Blastobotrys proliferans kultiváciou na vhodných pódach.The present invention relates to a method for producing the enzyme alpha amylase (alpha-1,4-glucan glucanothioidrolase EC 3.2.1.1) by means of the microscopic fungus Blastobotrys proliferans by cultivation on suitable platforms.

Pre priemyselnú produkciu. alfa-amylázy sa používajú najčastejšie následovně mikroorganizmy: Bacillus subtilis, Bacillus amyloliqueficiens, Streptomyces aureofaciens, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae a pod.For industrial production. The most commonly used alpha-amylases are the following microorganisms: Bacillus subtilis, Bacillus amyloliqueficiens, Streptomyces aureofaciens, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae and the like.

Sú však aj iné mikroorganizmy, u ktorých doteraz neholá známá schopnost produkovat alfa amylázu. Pomocou gélovej metody (A. O. č. 18Θ059) testovania mlkroorganizmov na alfa amylolytickú aktivitu sme zistili výrazná produkciu alfa amylolytickej aktivity mikroskopickou hubou piastobotrys proliferans.There are, however, other microorganisms in which the known ability to produce alpha amylase is not yet impaired. Using gel method (A.O. No. 18-059) testing of microorganisms for alpha amylolytic activity we found significant production of alpha amylolytic activity by microscopic fungus piastobotrys proliferans.

Blastobotrys proliferans je novopopísaný druh rodu Blastobotrys Klopotek čelade Moniliaceae rodu Moniliales, triedy Deuteromycetes [Marvanová L.: Two new Blastobotrys species. Transactions of the British Mycological Society 66, 217 (1976) ] izolovaný z para orechov (Bertholletia excelsa) z poškodeného jadra. O produkcii hydroláz polysacharidov uvedeným druhom Blastobotrys proliferans nie je zatial nič známe.Blastobotrys proliferans is a newly described species of the genus Blastobotrys Klopotek family Moniliaceae of the genus Moniliales, class Deuteromycetes [Marvanová L .: Two new Blastobotrys species. Transactions of the British Mycological Society 66, 217 (1976)] isolated from borrel (Bertholletia excelsa) from a damaged core. The production of polysaccharide hydrolase by said Blastobotrys proliferans is not yet known.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že kultiváciqu kmeňa Blastobotrys proliferans CCMF-493, deponovaný ako CBS 522-75 v Holandsku a ATCC 34 216 v zbierke typových kultúr USA na živnej pode obsahujúcej 1->4)-α-D-glukán ako induktor enzýmu pri teplote 37 °C a hodnotě pH 4,8 po dobu 48 až 120 hodin produkuje enzým alfa amylázu, ktorý sa získá v surovom stave odpařením rastovej pódy připadne v zuštachtenom stave zrážanim síranom amonným, alebo organickými rozpúšťadlami, s výhodou etanolu a acetonu.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is based on the cultivation of a strain of Blastobotrys proliferans CCMF-493 deposited as CBS 522-75 in the Netherlands and ATCC 34 216 in a collection of US type cultures on nutrient media containing 1-> 4) -α-D-glucan as an enzyme inducer at a temperature of 37 ° C and a pH of 4.8 for 48 to 120 hours, the enzyme alpha amylase, which is obtained in the raw state by evaporation of the growth soil, is optionally treated by precipitation with ammonium sulfate or organic solvents, preferably ethanol and acetone.

K ďalšej purifikácii nového enzýmu možno použiť například afinitnej metody.For example, an affinity method can be used to further purify the new enzyme.

Uvedený kmeň Blastobotrys proliferans představuje alternativně využitie v procesoch produkcie alfa amylázy, například sacharifikácie polysacharidov škrobu. Použitie takto získanej alfa amylázy, predovšetkým v čistom stave, je vhodné pri výrobě alternatívnych sladidiel, a to s ohtadom na vysoké zastúpenie maltózy a maltotriózy v enzymatickom hydrolyzáte (až 55 %). Táto skutočnosť zvýhodňuje využitie enzýmového produktu tam, kde vysoký obsah glukózy v hydrolyzáte nie je želaný (dietná strava pre fenylketonurikov, bombonársky sirup a pod.). Výhodné zloženie hydrolyzátu předurčuje enzymatická hydrolýzu pomocou alfa amylázy Blastobotrys proliferans k príprave vzácných oligosacharldov maltózového typu. Na druhej straně výhodou je skutočnosť, že nový preparát obsahuje aj alfa glukozidázu (alfa-glukozld glukohydroláza EC 3.2.1.20] a možno preto neprečistený enzým využiť k sacharifikácii (l->4)-«-D-glukánov škrobu až na glukózu.Said strain Blastobotrys proliferans is alternatively used in alpha amylase production processes, for example saccharification of starch polysaccharides. The use of the alpha amylase thus obtained, especially in the pure state, is suitable in the production of alternative sweeteners, with a view to the high proportion of maltose and maltotriose in the enzymatic hydrolyzate (up to 55%). This favors the use of the enzyme product where a high glucose content in the hydrolyzate is not desired (dietary diet for phenylketonurics, bombon syrup, etc.). The preferred hydrolyzate composition predetermines enzymatic hydrolysis by Blastobotrys proliferans alpha amylase to prepare rare maltose-type oligosaccharides. On the other hand, the advantage is that the new preparation also contains alpha glucosidase (alpha-glucoside glucohydrolase EC 3.2.1.20) and therefore the unpurified enzyme can be used to saccharify (1-> 4) -? - D-glucans of starch to glucose.

Příklad 1Example 1

Blastobotrys proliferans CCMF-493 sa pomnoží na rastovej pode Obsahujúcej 2 g gélu připraveného sietovaním amylázy (A. O. čís. 186 059) ponořeného do polovice výšky do Yaest Nitrogen Base rastovej pode (Oxoid), pH 4,8, 0,6 g/100 ml a kultivuje sa povrchovo po dobu 48 hodin pri teplote 37 °C, kedy dochádza k stekuteniu gélu. Nahromaděná biomasa (0,07 g) sa použije k fermentácii na pode obsahujúcej 22 g kukuřičného výluhu a 2 g zemiakového škrobu a 0,5 g KH2PO4 na 1 liter vody (pH 4,8) po dobu 72 hodin. Po 72. hodinách sa biomasa Blastobotrys proliferans odfiltruje a surový enzým alfa amyláza sa získá odpařením fermentačnej pódy na vákuovej odparke (celková aktivita 1,8 nkat/1 1, specifická aktivita 2,6 nkat/1 mg proteinu).Blastobotrys proliferans CCMF-493 is propagated on a growth pod containing 2 g of gel prepared by cross-linking amylase (AO # 186 059) into a Yaest Nitrogen Base growth pod (Oxoid), pH 4.8, 0.6 g / 100 ml and cultured superficially for 48 hours at 37 [deg.] C., where the gel spills. The accumulated biomass (0.07 g) was used for the fermentation on a pod containing 22 g of corn steep liquor and 2 g of potato starch and 0.5 g of KH2PO4 per liter of water (pH 4.8) for 72 hours. After 72 hours, the Blastobotrys proliferans biomass is filtered off and the crude alpha amylase enzyme is obtained by evaporation of the fermentation broth on a vacuum evaporator (total activity 1.8 nkat / L, specific activity 2.6 nkat / 1 mg protein).

Příklad 2Example 2

Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom, že ako fermentačná póda sa použijú gluténové vypalky (18 %), 3 g škrobu a 0,5 g KH2PO4 v 1 1 vody (pH 4,8), pričom fermentácia běží po dobu 120 hodin. Surový enzým alfa amyláza má celkovú aktivitu 2,2 ^kat/1 1 a Špecifickú aktivitu 3,5 nkat/1 mg proteinu.The procedure of Example 1 was followed except that gluten (18%), 3 g of starch and 0.5 g of KH 2 PO 4 in 1 L of water (pH 4.8) were used as the fermentation stage, with the fermentation running for 120 hours. The crude alpha amylase enzyme has a total activity of 2.2 µ cat / L and a specific activity of 3.5 µ cat / l mg protein.

Příklad 3Example 3

Postup podfa příkladu 1 s tým rozdielom, že získaná fermentačná póda sa spracováva srážaním etanolom v objemových pomeroch etanol ku fermentačnej póde 2 : 1. Získaný precipiitát po presušení sa spracováva afinitnou metodou (A. O. č. 157 955) a zušfachtená alfa amyláza má aktivitu 1,6 ,ukat a specifická aktivitu 4,0 nkat/mg, pričom neobsahuje viac ako 0,05 nkat a-glukozidázovej aktivity.The procedure of Example 1, except that the fermentation stage obtained is treated with ethanol precipitation in a volume ratio of ethanol to fermentation broth of 2: 1. 6, ukat and a specific activity of 4.0 nkat / mg, containing no more than 0.05 nkat of α-glucosidase activity.

Příklad 4Example 4

Postup podfa příkladu 3 s tým rozdielom, že k zrážaniu enzýmu sa použije aceton. Získaná zušlachtená alfa amyláza má aktivitu tak, ako je uvedené v příklade 3.The procedure of Example 3, except that acetone was used to precipitate the enzyme. The obtained humanized alpha amylase has activity as shown in Example 3.

P r í k 1 a d 5Example 5

Postup podfa příkladu 3 s tým rozdielom, že k zrážaniu sa rpoužije síran amonný o stupni saturácie 0,7. Získaná zušlachtená alfa amyláza má aktivitu a špecifickú aktivitu tak, ako je uvedené v příklade 3.The process of Example 3, except that an ammonium sulfate having a degree of saturation of 0.7 was used for precipitation. The obtained humanized alpha amylase has activity and specific activity as described in Example 3.

Vynález má využitie jednak pri príprave alfa amylázy osobitných vlastností pre základný výskům, príprave vzácných cukrov, resp. príprave zmesných cukrov pre potravinářské a farmaceutické účely.The invention has utility both in the preparation of alpha amylase of special properties for basic processes, in the preparation of rare sugars, respectively. preparation of mixed sugars for food and pharmaceutical purposes.

Claims (1)

PREDMETSUBJECT Sposob produkcie enzýmu alfa amylázy pomocou mikroskopické] huby Blastobotrys proliferans, vyznačený tým, že sa kultivuje kmeň Blastobotrys proliferans CCMF-493 na živnej pode obsahujúcej (l-*4 j-a-D-glukán ako induktor enzýmu pri teplote 37 °C a hodnotě pH 4,8 po dobu 48 až 120 hodin a envynAlezu zým alfa amylázá sa získává v surovom stave odpařením rastovej pddy, připadne v prečistenom stave zrážaním síranom amonným, alebo organickými rozpúšťadlami, s výhodou etanolom alebo acetónom a v čistom stave použitím afinitnej metody.Method for producing alpha amylase enzyme by microscopic fungi Blastobotrys proliferans, characterized by culturing the strain Blastobotrys proliferans CCMF-493 on a culture medium containing (1-4 * D-glucan as enzyme inducer at 37 ° C and pH 4.8) for 48 to 120 hours and the enzyme amylase is recovered in the crude state by evaporation of the growth soil, optionally in a purified state by precipitation with ammonium sulfate or organic solvents, preferably ethanol or acetone, and in a pure state using an affinity method.