CS197080B1 - Mixture for the photometric determination of activities of the alcoholdehydrogenasis in the biologic material - Google Patents

Abstract

Vynález se týká směsi chemických sloučenin k fotometrickému stanoveni aktivity enzymu alkoholdéhydrogenasy v biologickém materiáluThe invention relates to a mixture of chemical compounds for photometric determination of enzyme activity alcohol dehydrogenases in biological material

Description

Vynález se týká směsi chemických sloučenin k fotometrickému stanoveni aktivity enzymu alkoholdéhydrogenasy v biologickém materiálu.The invention relates to a mixture of chemical compounds for the photometric determination of the activity of an alcohol dehydrogenase enzyme in a biological material.

Měření enzymových aktivit v biologickém materiálu je cennou diagnostickou pomůckou v humánní i veterinární medicíně. Většinou se sleduje zvýšená aktivita v krevním seru, když se za patologického stavu dostává určitý enzym do kreve z rozpadnuvších se buněk nemocné tkáně. Použitelní diagnostické závěry poskytuje většinou teprve poměr změřených aktivit dvou i více enzymů. Je poměrně málo takových enzymů, u nichž by odchylka úrovně aktivity od normálních hodnot specificky indikovala určitý fyziologický stav nebo intenzitu a lokalizaci patologického procesu. Právě stanovení aktivity alkoholdéhydrogenasy v krevním seru by mohlo poměrné selektivně vypovídat o poškození jaterní tkáně, protože jaterni buňky obsahují alkoholdéhydrogenasy mnohonásobně více než některé jiné orgány. Protože i mozková tkáň tento enzxm obsahuje, mohlo by stanovení aktivity alkoholdehydrogenasy v mozkomíšním moku indikovat některé patologické procesy nejvyšší úrovně nervové soustavy.Measurement of enzyme activities in biological material is a valuable diagnostic tool in human and veterinary medicine. Mostly, increased activity in blood serum is monitored when a pathologic condition enters a certain enzyme into the blood from disintegrating cells of diseased tissue. Usable diagnostic conclusions are usually only provided by the ratio of measured activities of two or more enzymes. There are relatively few such enzymes in which a deviation in the level of activity from normal values would specifically indicate a particular physiological state or intensity and location of the pathological process. Determination of the activity of alcohol dehydrogenase in blood serum could proportionally indicate damage to liver tissue, because liver cells contain alcohol dehydrogenases many times more than some other organs. Since brain tissue also contains this enzyme, the determination of alcohol dehydrogenase activity in cerebrospinal fluid could indicate some pathological processes of the highest nervous system level.

Běžné fotometrické techniky stanovení alkoholdéhydrogenasy, založené na přírůstku nebo úbytku absorbance redukovaného koenzymu při 340 nM nejsou dost citlivé pro nízké úrovně aktivit, které nalézáme v biologickém materiálu za normálních podmínek. CitlivějšíConventional photometric techniques for the determination of alcohol dehydrogenase based on the increase or decrease in absorbance of the reduced coenzyme at 340 nM are not sensitive enough for the low levels of activity found in biological material under normal conditions. More sensitive

107 Π7«107 Π7 «

187080 fluorometrické metody, schopné zachytit! i velmi malé aktivity jsou nepoužitelné v biologickém materiálu bez pracných a ztrátových operací, protože jsou rušeny mnoha doprovodnými součástmi biologických tekutin·187080 fluorometric methods, capable of capturing! even very small activities are useless in biological material without laborious and lossy operations because they are disturbed by many accompanying components of biological fluids ·

Uvedené nevýhody odstraňuje směs k fotometrickému stanovení aktivity alkoholdehydrogenasy podle našeho vynálezu které sestává z alkoholického substrátu, tvořeného primárním nebo sekundárním alkoholem například etanolem, butanolem, cyklohexanolem nebo furylalkoholem v koncentraci 10~^ až 10^-¼, z koenzymu, kterým je nikotlnamid-adenindinukleotid v koncentraci ÍO^-^ až 10^-¾ v ůstrojném vodním roztoku o pH 7 až 11 a z arylnitrososloučeniny obecného vzorce ,ho ° koncentraci 10 až 10“^!, kde A je fenyl nebo naftyl,These drawbacks are overcome by the composition for the photometric determination of the alcohol dehydrogenase activity of our invention, which consists of an alcoholic substrate consisting of a primary or secondary alcohol such as ethanol, butanol, cyclohexanol or furyl alcohol at a concentration of 10 -4 to 10 ^- ¼, from the coenzyme a concentration of 10 ^- 10 to 10 ^- 3 in an aqueous solution of pH 7 to 11 and of an aryl nitroso compound of the general formula 10 to 10 - 10, where A is phenyl or naphthyl,

R^ a Rg jsou alkyly o jednom až čtyřech uhlících a která obsahuje popřípadě v meta-poloze k N0-skupině - CH^, - OCH^ nebo halogen, přičemž k odlišeni neenzymové reakce obsahuje —/i směs inhibitor alkoholdehydrogenasy do koncentrace 10 až 10 M.R 4 and R 8 are alkyl of one to four carbons and optionally contains meta-position to the NO-group -CH 2, -OCH 2 or halogen, wherein the distillation of the non-enzymatic reaction comprises a mixture of an alcohol dehydrogenase inhibitor up to a concentration of 10 to 10 M.

Tato směs, smíchána se aerem, mozkomišním mokem, nebo s extraktem tkáně a podobně umožňuje změřeni nízkých aktivit alkoholdehydrogenasy v těchto tekutinách bez jejich předběžného zpracováni a to tak, že rychlost poklesu zbarveni nitrosloučeniny, měřená fotometrem, tuto aktivitu přímo určuje.This mixture, mixed with air, cerebrospinal fluid, or tissue extract, and the like, allows the measurement of low alcohol dehydrogenase activity in these fluids without pretreatment, so that the rate of decrease of the nitro compound's color, measured by a photometer, directly determines this activity.

Složky navrhované směsi umožňuji spřažení dvou reakci katalysovaných alkoholdehydrogenasou tak, že redukovaná forma koenzymu vznikající při oxydaci alkoholu enzymem se využívá k enzymové redukci silně zbarvémé nitrosloučeniny, která se tím mění na bezbarvý produkt.The components of the proposed mixture allow coupling of the two reactions catalysed by alcohol dehydrogenase such that the reduced form of the coenzyme produced by the oxidation of alcohol by the enzyme is used for the enzymatic reduction of the strongly colored nitro compound, thereby turning it into a colorless product.

Použití směsi podle vynálezu osvětlují dále uvedené příklady:The following examples illustrate the use of the composition of the invention:

Příklad 1Example 1

Ke dvěma mililitrům směsi, která je 2 mM n-butanolem, 0,1 mM nikotinamidadenindinukleotidem a 50 uM p-mitrosodlethylanilinem ve fosfátovém pufru o pH 8,5 v kyvetě spektrofotometru se vmíchá 0,5 ml krevního sera a při vlnové délce 440 mm se za teploty 25 °C 2 až J minuty leduje úbytek žlutého zbarveni, který se registruje automatickým zapisovačem. K zastavení enzymové reakce se pak do kyvety přidá 20 ul nasyceného vodného roztoku inhibitoru, kterým je pyrazol a v reakční kyvetě se delší 2 minuty registruje intenzita zbarvení: klesá-li dále, je to způsobeno neenzymovou redukcí nitrososloučeniny vlivem balastnich látek ve zkoumaném vzorku.To two milliliters of a mixture of 2 mM n-butanol, 0.1 mM nicotinamide adenine dinucleotide and 50 µM p-mitrosodlethylaniline in phosphate buffer pH 8.5 in a spectrophotometer cuvette, 0.5 ml of blood serum is mixed and at a wavelength of 440 mm. at 25 [deg.] C. for 2 to J minutes, there is a decrease in yellow color, which is registered with an automatic recorder. To stop the enzyme reaction, 20 µl of a saturated aqueous inhibitor solution, pyrazole, is then added to the cuvette and the color intensity is registered in the reaction cuvette for 2 minutes: if it decreases further, this is due to non-enzymatic reduction of the nitroso compound.

Z počáteční rychlosti úbytku žlutého zbarvení, určené podle tečny ke křivce v počátku záznamu, snížení o případnou rychlost neenzymové reakce, se vypočte aktivita enzymu v libovolných konvenčních jednotkách nebo (použitím molárního absorbčního koeficientu ni4 —1 —1 trososloučeniny, který je 3,5.10 cm M ) v mezinárodních jednotkách či v kataleoh.The enzyme activity in any conventional units or (using a molar absorption coefficient ni4-1-1 troso compound, which is 3.5.10 cm) is calculated from the initial rate of yellow color loss, determined by the tangent to the curve at the beginning of the recording, reduced by any non-enzymatic reaction rate. M) in international units or in katalah.

Přiklad 2Example 2

Připraví se dvě dvoumililitrové porce fosfátového pufru o pH 7,0 s nikotinamidadenindinuklsotidem v koncentraci 50 uM, cyklohexanolem v koncentraci 10 mM a s p-nitrosodimethylanilinem v koncentraci 20 um. Do prvé porce, jako slepého vzorku se přidá 0,1 mlTwo 2 ml portions of phosphate buffer pH 7.0 are prepared with 50 µM nicotinamide adenine dinucleotide, 10 mM cyclohexanol and 20 µm p-nitrosodimethylaniline. Add 0.1 ml to the first portion as a blank

187 OM187 OM

2M vodného roztoku isobutyramidu. Pak sa k oběma porcím směsi přidá po 0,5 ml zkoumaného krevního sera. Po přesně 20 minutách inkubace při 25 °C se i do druhé porce směsi přidá 0,1 ml 2M vodného roztoku isobutyramidu, čímž se zde přeruŠi enzymová reakce, která byla v prvním vzorku zablokovány až od počátku. Změřený rozdíl absorbanoí obou vzorků při 450 nm je úměrný aktivitě alkoholdehydrogenasy, jejíž číselná hodnota se vypočte analogicky jako v příkladě 1.2M aqueous isobutyramide solution. 0.5 ml of the blood serum to be examined is then added to both portions of the mixture. After exactly 20 minutes of incubation at 25 ° C, 0.1 ml of a 2M aqueous isobutyramide solution was added to the second portion of the mixture, thereby interrupting the enzyme reaction that had been blocked from the beginning in the first sample. The measured difference in absorbance of the two samples at 450 nm is proportional to the activity of the alcohol dehydrogenase, the numerical value of which is calculated analogously to Example 1.

PŘEDMĚT VYNÁLEZUSUBJECT OF THE INVENTION

Claims (1)

PŘEDMĚT VYNÁLEZUSUBJECT OF THE INVENTION Směs k fotometrickému stanoveni aktivity alkoholdehydrogenasy v biologickém materiálu, vyznačená tím, že sestává z alkoholického substrátu tvořeného primárním nebo sekundárním alkoholem, například etanoiem, butanolem, cyklohexanolem v koncentraci 10^-^ až 10^-1M, z koenzymu, kterým je nikotinamidadenindinukleotid v koncetraci 10^-^ až 10^-¾ v ústrojném vodním roztoku o pH ? až 11 a z arylnitrososloučeniny o koncentraci 10^-6 až 10^-¾ obecného vzorce (Κχ^^.Α.No, kde A je fenyl nebo naftyl, R-^ a Rg jsou alkyly o jednom až čtyřech uhlících, a která obsahuje popřípadě v meta-poloze k NO-skupině -CHj, - OCHj nebo halogen, přičemž k odlišení neenzymo.vé reakce obsahuje směs inhibitor alkoholdehydrogenasy do koncentrace 10^-4 až 10^-1M.The mixture for photometric determination of alcohol dehydrogenase activity in biological material, characterized in that the substrate consists of an alcohol formed by the primary or secondary alcohol, for example ethanol class, butanol, cyclohexanol concentration of 10 ^- to 10 @ ^-1 M, a coenzyme, nicotinamide adenine dinucleotide in which the concentration of 10 ^- ^ to 10 ^- ¾ in aqueous pH solution? arylnitrososloučeniny to 11 and a concentration of 10 ^-6 to 10 ^- ¾ of formula (Κχ ^^. Α.No, wherein A is phenyl or naphthyl, R ^ and Rg are alkyl of one to four carbons and which optionally contains meta position to the NO-group -CH 3, -CH 3, or halogen, wherein the mixture comprises an alcohol dehydrogenase inhibitor to a concentration of 10 ^-4 to 10 ^-1 M to distinguish the non-enzymatic reaction.