CS195254B2

CS195254B2 - Method of producing tri-p-toluensulphonate s-adenosyl-l-methionine

Info

Publication number: CS195254B2
Application number: CS735374A
Authority: CS
Inventors: Alberto Fiecchi
Original assignee: Bio Research S A S
Priority date: 1972-08-02
Filing date: 1973-07-26
Publication date: 1980-01-31
Also published as: DE2336401C3; DK131868C; JPS4992215A; NO137941B; NL7310706A; AU5868073A; SU646915A3; IE37913L; YU36037B; IL42764A; MX4544E; DE2336401A1; NL152864B; FI52466B; PL87381B1; AU474015B2; AT341684B; RO63451A; ES417377A1; SE400085B

Description

Vynález se týká způsobu výroby nové, velmi stálé soli S-adenosil-L-methioninu (SAM), přičemž tento způsob je velmi jednoduchý, hospodárný a lze jej provádět i v průmyslovém měřítku. Způsobem podle vynálezu se získají nové farmaceutické přípravky, které obsahují SAM jako účinnou látku a jsou vhodné k použití k velmi různým indikacím v lidském lékařství.

SAM je přírodní látka, která se nachází vé všech živých organismech od bakterií přes rostliny, od jednoduchých buněk a jednobuněčných organismů až k vyšším savcům včetně člověka. Nedávno byla zjištěna struktura této látky. Sloučeninu lze vyjádřit obecným vzorcem.

kde

X znamená aniont.

V živých organismech se SAM tvoří působením enzymu (S-adenosilmethioninsynthetázy nebo S-adenosiltransferázy) v cytoplasmě, přičemž se vychází z methioninu, který je přiváděn živnými látkami nebo z ATP, který je přítomen jako energetická reserva v každé živé buňce.

Již delší čas je známo, že SAM je produkt základního významu ve velkém počtu biologických reakcí, a to zejména enzymatických transmethylací, a proto má tento produkt základní význam v biochemii jako reaktivní látka.

Způsob výroby této látky a její uchovávání je však spojeno s velikými obtížemi, pro tože 'látka je velmi nestálá při . teplotě místnosti nebo při vyšší teplotě.

Byly proto činěny pokusy stabilizovat SAM tak, aby bylo možno tuto látku používat v biologickém výzkumu, a to zejména výrobou solí, které by byly stálé při běžných podmínkách teploty a vlhkosti.

Tímto způsobem byl vyroben chlorid a síran této sloučeniny, tyto látky jsou však vhodné pro použití jako složky biochemických reakcí pouze po krátkou dobu, protože při jejich uchovávání v suchém stavu je jejich stálost omezena a lze je vyrobit jednorázově pouze v malých množstvích a tedy nikoli v průmyslovém měřítku.

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že lze vyrobit novou sůl SAM, která je neomezeně stálá pokud jde o čas a teplotu okolí a kte rou lze vyrobit v průmyslovém měřítku velmi hospodárně, přičemž tato sůl má . vysokou léčebnou účinnost v celé řadě' použití v lidském lékařství, bez korelace mezi těmito obory.

Nová sůl, kterou lze vyrobit způsobem podle vynálezu je sůl SAM s kyselinou p-toluensulfonovou se sumárním vzorcem

SAM+CHkCgHíSOs- . 2CH3C6H4SO3H což po zkrácení lze vyjádřit jako

SAM. O21H23S3O9.

Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby tri-p-toluensulfonátu S-adenosyl-L-methioninu obecného vzorce nh₂

W , - ,

Ch-oh-chvyznačující se tím, že se k vodnému roztoku s obsahem S-adenosyl-L-methioninu přidá kyselina p-toluensulfonová v molárním poměru k S-adenosyl-L-methioninu 3 až 10, s výhodou 6, načež se vodný roztok zahustí při teplotě místnosti ve vakuu nebo se lyofilizuje na 2/20 až 4/20, s výhodou 3/20 původního objemu a sůl se vysráží přidáním organického rozpouštědla, rozpustného ve vodě, a to methylalkoholu, ethylalkoholu, propylalkoholu, isopropylalkoholu, acetonu nebo methylethylketonu.

Vysoká účinnost tohoto postupu a tím i velký technický pokrok, dosahovaný způsobem podle vynálezu . je zřejmý z následující tabulky v níž je uvedena stálost sloučenin SAM při 25 °C v suchém stavu. Srovnávány jsou dvě nejstálejší dosud známé soli SAM, tj. síran a chlorid s nově připravovaným triparatoluensulfonátem. Uvedená čísla znamenají procento SAM, které ' zbývá po uvedeném . čase.

Tabulka 1 dní 180 dní

360 dní 540 dní anion chlorid síran tri-p-toluensulfonát

65—

91,761,0

98,592,2

84,2 80,1

Způsob výroby nové soli podle . vynálezu se provádí v následujících stupních:

Na kvasinky (Saccharomyces Cerevisiae, Torulopsis utilis, Candida utilis atd) obohacené SAM se působí methioninem za vhodných podmínek (Schlenk, Enzymologia 29, 283 /1965/) a methyl nebo ethylacetátem při teplotě místnosti, čímž se buňky rozruší a 100 % SAM, které -bylo přítomno v buňkách přejde do roztoku.

Zfiltrovaný vodný roztok se pak absorbuje na sloupec slabé kationtoměničové pryskyřice v kyselé formě.

Nečistoty se odstraní promytím vodou a pak kyselinou octovou 2,5 M.

Provádí se selektivní eluce SAM vodným roztokem kyseliny p-toluensulfonové.

Přebytek kyseliny p-toluensulfonové se neutralizuje působením silné nebo slabé aniontoměničové pryskyřice v OH“-formě tak dlouho, až mojární poměr kyseliny p-toluensulfonové k SAM má velikost v rozmezí 3 až 10, s výhodou 6.

Eluát se' koncentruje ve vakuu při teplotě místnosti nebo se roztok lyofilizuje na konečný objem ' o velikosti 2 až 4/20 počátečního objemu, s výhodou 3/26.

Ke koncentrátu se přidá organické rozpouštědlo mísitelné s vodou, například ethylalkohol, propylalkohol, isopropylalkohol, aceton, methylethylketon, apod., čímž dojde к vysrážení soli SAM. C21H23S3O9, v čistém stavu.

Při provádění způsobu podle vynálezu se užije množství acetátu v rozmezí 1/20 až 1/5, s výhodou 1/10 hmotnosti buněk (mokrá hmotnost), působením octanu trvá 30 minut až 2 hodiny, s výhodou 1 hodinu.

Je třeba se zmínit o tom, že rozrušení kvasinkových buněk organickými rozpouštědly je daleko výhodnější než běžný způsob, který se provádí kyselinou chloristou, kyselinou mravenčí nebo kyselinou octovou při teplotě 60 °C, protože způsob podle vynálezu nevyžaduje použití vyšších teplot, které mají nepříznivý vliv na stálost SAM, a to zejména při pH, které vzniká za přítomnosti kyselin, použitých к rozrušení buněk. Mimoto nepřítomnost silných kyselin v roztoku umožňuje v následujícím stupni použití malých objemů slabé kationtoměničové pryskyřice a tím umožňuje použití běžných zařízení bez nebezpečí jejich koroze.

Mimoto dochází tímto způsobem к denaturaci bílkovin, což umožňuje snadné odfiltrování buněčných zbytků.

Absorpce se s výhodou provádí při použití sloupce slabé kationtoměničové pryskyřice, například pryskyřice IRC-50 v H⁺-formě.

Selektivní eluci u způsobu podle vynálezu je možno provádět při použití roztoku kyseliny p-toluensulfonové ve vodě v koncentraci až 1 mol kyseliny.

Toto provedení má opět oproti původním způsobům výroby velké výhody.

К neutralizaci přebytku kyseliny p-toluensulfonové se používá zejména některých iontoměničů, například přípravků Amberlite IRA 900 nebo Amberlite IR 45. Konečný po-. měr kyseliny p-toluensulfonové a SAM je kritickou veličinou vzhledem ke vzniku optimálních podmínek, protože v následujícím stupni se provádí vysrážení SAM-p-toluensulfonátu kvantitativním způsobem a anorganický kationt pak zůstává v roztoku spolu s malým množstvím nečistot, které mohou být přítomny.

Způsob výroby SAM. C21H23S3O9 podle vynálezu má v tomto výhodném provedení velmi dobré výsledky při provádění v průmyslovém měřítku.

Je možno provést ještě některé modifikace způsobu podle vynálezu s velmi dobrými výsledky. Některé z nich jsou dále uvedeny, další budou zřejmé odborníkům.

Je především zřejmé, že SAM-tri-p-toluensulfonát je možno vysrážet z jakéhokoli vodného roztoku, který obsahuje SAM. Tento roztok může například pocházet z enzymatických syntéz nebo chemických syntéz SAM, nebo může jít o vodný roztok některé ze solí SAM, které jsou rozpustné ve vodě. V každém z těchto příkladů se však získá méně čistý produkt s nižším výtěžkem.

Další možná modifikace způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že se SAM absorbuje na sloupec slabé kationtoměničové pryskyřice a vymývání se provádí vodným roztokem kyseliny solné nebo kyseliny sírové místo přímo vodným roztokem kyseliny p-toluensulfonové. Chloridové a síranové anionty se z eluátu odstraní vhodným způsobem, například aniontoměničovou pryskyřicí, načež se přidá množství kyseliny p-toluensulfonové, které se propočítá stejně jako při přímém srážení, čímž dojde к vysrážení příslušného tri-p-toluensulfonátu.

Jiná modifikace může spočívat v tom, že se vysráží chlorid nebo síran nečistého vzorku SAM z eluátu po částečném odstranění přebytku kyseliny odpařením nebo působením vhodné zásady. Takto získaný síran nebo chlorid se znovu rozpustí ve vodě a po odstranění jednoho z těchto aniontů se přidá kyselina p-toluensulfonová ve svrchu uvedeném poměru, čímž dojde к vysrážení tri-p-toluensulfonátu SAM.

Při eluci SAM lze užít i jiných silných kyselin, nezíská se tím však žádná podstatná výhoda.

V následujících příkladech je osvětlen způsob výroby nové soli podle vynálezu při použití výhodného způsobu a některých jeho modifikací. Tyto příklady slouží pouze к osvětlení vynálezu, nikoli к jeho omezení.

Příklad 1

К 90 kg kvasnic, které byly obohaceny SAM až na koncentraci 5,5 g/kg způsobem podle Schlenka (Enzymologia 29, 283/1965/) se přidá při teplotě místnosti 9 litrů ethylacetátu. Směs se důkladně míchá 1 hodinu, načež se zředí 40 kg vody, zfiltruje se a po promytí se získá 140 litrů roztoku, který obsahuje SAM v koncentraci 3,55 g/litr, což je 99,5 % původního množství SAM ve výchozím materiálu.

litrů takto získaného roztoku se podrobí absorbci na 1 litr pryskyřice Amberlite IRC 50 v H⁺-formě, načež se provádí eluce:

a) vodou,

b) 0,025 N kyselinou octovou, : с) 1 M roztokem kyseliny p-toluensulfonové.

Frakce bohatá na prakticky čistý SAM (stanoveno chromatografií na tenké vrstvě způsobem uvedeným v Anal. Biochim. 4, 16 až 28 /1971/) mají celkový objem přibližně 1,8 litru a obsahují 85 % produktu, který byl původně nanesen na vrchol iontoměničového sloupce.

Tento roztok se smísí s 1,7 litru pryskyřice Amberlite IRA 900 v OH~-formě.

Po filtraci a promytí pryskyřice vodou se získá roztok, který obsahuje 2,2 % kyseliny p-toluensulfonové a 0,85 % SAM.

Roztok se koncentruje ve vakuu při teplotě místnosti na objem 600 ml, načež se přidá aceton á · tím dojde k vysrážení . bílé práškovité mikrokrystalické soli, která nemá žádný zápach, je hygroskopická a velmi rozpustná ve vodě (více než 25 %) za vzniku bezbarvého roztoku. Sůl je málo rozpustná v methanolu nebo ethanolu a nerozpustná v acetonu, methylethylketonu, · chloroformu, vyšších alkoholech a benzenu.

Stejného výsledku lze dosáhnout koncentrací vodného roztoku na 400 až 800 ml s následným použitím methylalkoholu, ethylalkoholu, propylalkoholu, isopropylalkoholu nebo methylethylketonu místo acetonu.

Při analýze ·· soli · bylo dosaženo následujících výsledků:

46,9 % C, 5,3 % H, 9,2 % N,

13,8 % S.

Pro · C36H46N6O14S4 (915,1) byly zjištěny tyto výsledky: .

47,,2% C, 5,15 · % H, 9,18% N,

14,00 . % . S.

Nalezeno: \ p-toluensulfonová kyselina 55,8 % . SAM 42,5 %o p-toluensulfonová kyselina 56,4 %

SAM 43,6%'

Vypočítáno: Hmotnostní úbytek při sušení 12 . .hodin. ' při teplotě místnosti ve vakuu nad kysličníkem fosforečným je 1,5 až 2 %.

Vlhkost, stanovená podle K. Fischera je·

1,5 až 2'%.. · .... V UV .spektru má nová sloučenina, · získaná způsobem podle vynálezu, absorbční · maximum při 256 nm, E 15,600 (v 6 N kyselině · sírové), při 260 nm E = 16 300 (při pH .7).

Všechny tyto údaje jsou v souladu s .obecným vzorcem ..

Nová sloučenina byla dále · identifikována enzymatickým způsobem, který · je založen na enzymatické methylaci nikotinamidu nebo . kyseliny guanidinoctové působením SAM (G. L. Cahtoni, J. Biol. Chem. 189, 745 /1951/, ibid. · 204, 403 /1953/, G. De La Hoba, · G. A. Jamieson, S. H. Mudd, Η. H. Richards, J. A. C. · .S. · 81, 3975/1959/).

Příklad · 2 kg kvasnic se zpracuje stejně jako v příkladu 1 a po · · rozrušení· buněk še získá

13,8 litrů roztoku s · obsahem 3,60 · g SAM/litr, což je 99 % SAM, přítomného původně ' ve zpracovávaném materiálu. Tento roztok se absorbuje na 1 · litr pryskyřice · IRC 50. · v H+-formě a: vymývání · se provádí vodou, 0,025 N roztokem kyseliny octové a pak 4 N roztokem kyseliny solné. Frakce bohaté na čistý SAM mají objem přibližně 0,8 litrů a obsahují · 87 ·% produktu, který byl původně nanesen na vrchol sloupce. Tyto frakce se slijí a odpaří do sucha při teplotě 40 °C ve vakuu. Pak se přidává voda do dosažení · 5% roztoku SAM, přičemž se roztok udržuje na teplotě 0 dc. Přidá se Dowex 50 v OH “-formě tak dlouho, až vzorek roztoku již neobsahuje chloridové ionty.

Pryskyřice se oddělí filtrací, načež se přidá· 110 g kyseliny · p-toluensulfonové a roztok se koncentruje · · na objem 600 ml. Pak · se přidává methylalkohol do úplného vysráženíproduktu. Po oddělení filtrací a po usušení, se získá · tri-p-toluensulfonát SAM, · který má tytéž vlastnosti· jako produkt, získaný · způsobem · podle · příkladu · 1. .

Příklad 3 ' 13,8· litrů roztoku · SAM se získá · po· rozrušení kvasinkových · buněk stejným. ' způsobem jako v příkladu 2. Koncentrace · roztoku · · je 3,60 · · g · -.SAM/litr. · · Tento roztok · - se absorbuje na 1 litr pryskyřice· Amberlite IRC 50 · v H+-formě a eluce se· provádí postupně vodou, 0,025 M roztokem kyseliny octové a · nakonec· 1 · N roztokem kyseliny sírové.

Frakce, které obsahují· největší množství SAM mají objem přibližně 1,8 litru a obsahují 86'% produktu, původně ' naneseného· · na vrchol sloupce. Tyto frakce se· smísí · · při teplotě 0 °C se suspenzí hydroxidu barnatého a tento hydroxid se přidává tak dlouho; až roztok · ijž neobsahuje síranové ionty.

Síran barnatý se oddělí filtrací a promyje, načež se k roztoku přidá 108 g kyseliny p-toluensulfonové a směs se dále zpracovává stejným' · způsobem jako· v příkladu 2, čímž se získá tri-p-toluensulfonát SAM, který' má ty též vlastnosti jako produkt získaný způsobem podle příkladu 1.

Příkladů

13,8 litrů roztoku s obsahem 43,3 g SAM se adsorbuje na sloupec iontoměničové pryskyřice a vymývá se stejně jako v příkladu 2 vodným roztokem kyseliny solné, frakce bohaté na SAM se odpaří do sucha ve vakuu při teplotě 40 °C.

Potom se přidává voda až к získání 10% roztoku chloridu, který se vysráží přidáním acetonu. Takto získaná sůl obsahuje následující množství jednotlivých látek:

chloridy 16,86 %

SAM 78,85 % №0 4,2 '% g této soli se rozpustí ve 200 ml vody a chloridové ionty se odstraní při teplotě 0 °C přidáním pryskyřice Dowex 50 v OH-formě. К roztoku se přidá 19,7 g kyseliny p-toluensulfonové, směs se zahustí na objem 80 ml ve vakuu při teplotě 40 °C, načež se přidá aceton, čímž se vysráží tri-p-toluensulfonát SAM, který má tytéž vlastnosti jako produkt z příkladu 1.

Příklad 5

13,8 litrů roztoku s obsahem 3,60 g SAM/ /litr, který byl získán způsobem podle příkladu 3 se absorbuje na sloupec Amberlitu IRC 50 v H⁺-formě.

Frakce, bohaté na SAM se smísí s uhličitanem barnatým tak dlouho, až molární koncentrace síranových iontů je stejná jako koncentrace SAM. Roztok se zfiltruje a filtrát se zahustí na objem 500 ml. Acetonem se vysráží sůl s následujícím obsahem jednotlivých látek:

síranové ionty 38,2 %

SAM 58,9%

H2O 5 % g takto získané soli se rozpustí ve 120 mililitrech vody a smísí s pryskyřicí Amberlite IRA 900 v OH -formě až do odstranění síranových iontů.

Pryskyřice se oddělí filtrací a přidá se 13,7 g kyseliny p-toluensulfonové, směs se koncentruje na objem 60 ml, načež se přidá aceton к vysrážení p-toluensulfonátu SAM, který má vlastnosti produktu z příkladu 1.

Příklad 6 g jodidu SAM s obsahem 600 mg SAM se rozpustí v 10 ml vody a smísí s pryskyřicí Dowex 50 v OH-formě při teplotě 0 °C až do odstranění jodidových iontů.

Pryskyřice se oddělí filtrací, načež se přidá 1,5 g kyseliny p-toluensulfonové a směs se koncentruje na objem 6 ml. Působením a cetonu se vysráží tri-p-toluensulfonát SAM, jehož vlastnosti jsou stejné jako vlastnosti produktu, získaného způsobem podle příkladu 1.

Několik let je známo, že SAM je v biochemických reakcích jediným specifickým donorem methylových skupin v živých organismech při přenosu této skupiny. Jde o základní reakce při výměně látek, a to při výměně tuků, látek bílkovinné povahy i glycidové povahy.

Jako příklad se uvádí některé důležitější transmethylační reakce, závislé na přítomnosti SAM:

a) N-transmethylace:

adenin, carnitin, carnosin, creatin, 2,6-diamonopurin, adrenalin, guanin, hordenin, N’-nikotinamid, nikotin, fosfatidylcholin, ricinin;

b) O-transmethylace:

N-acetylserotonin, dopamin, epinin, d-adrenalin, 1-adrenalin, cholesterol, ergosterol, 1-noradrenalin, pektin, ubichinon;

c) S-transmethylace: 2,3-dimerkaptopropanol, H2S, methionin, methylmerkaptan, kyseliny S-merkaptopropionová, S-merkaptoethanol, thiopyrimidon, thiouracil,

d) C-transmethylace: cytosin, thymin.

To znamená vzhledem к lidskému organismu, že SAM působí v následujících metabolických pochodech: biosyntéza cholinu, biosyntéza fosfatidylcholinu, účinnost enzymů, které vyžadují přítomnost skupin SH, metabolismus kateocholaminů, metabolismus biogenních centroencefalických aminů, metabolismus serotoninu, metabolismus histaminu, metabolismus vitamínu B12 a kyseliny listové, metabolismus kreatinu, metabolismus myosinu, metabolismus histonů, metabolismus RNA, metabolismus DNA, metabolismus bílkovinných látek, metabolismus některých hormonů s jádrem cyklopentan perhydrofenanthrenovým, z nichž hlavní jsou estrogeny, metabilismus triglyceridů.

Je rovněž delší dobu známo, že SAM, který je demethylován enzymy, které přenášejí methylovou skupinu se mění na S-adenosylhomocystein (SAO), který je nepřímým donorem skupin SH a tím je důležitý pro metabolismus všech sloučenin, které vyžadují tyto skupiny pro svou biologickou účinnost. Zvláště důležitými sloučeninami jsou v tomto směru bioenzymy a aminokyseliny, které obsahují síru.

SAO je v organismu podrobován dekarboxylaci a takto dekarboxylovaný produkt je základním dárcem aminopropylové skupiny, takže je nezbytným, podle současných biochemických znalostí, к biosyntéze polyaminu.

Tento proces je katalyzován různými enzymy, z nichž specifickým enzymem je aminopropyltransferáza.

Z toho co bylo uvedeno vyplývá, žé je zná mo, že SAM je v lidském organismu v ' úzkém spojení se všemi biochemickými reakcemi, které se -týkají:

A — transmethylace (specifické získávání skupiny- CH3)

B — transsulfidace (specifické získávání skupiny SH]

C — transaminopropylace (specifické získávání aminopropylové skupiny).

Je zřejmé, že v důsledku své důležitosti může mít SAM léčebný účinek při léčbě pathologických stavů, které jsou spojeny s nedostatkem nebo poruchou organismu vzhledem ke svrchu uvedeným sloučeninám.

Nestálost SAM - a nedostupnost stálých solí této sloučeniny však až dosud vylučovalo použití produktu pro jakýkoli farmakologický nebo klinický zkušební postup a tím také nemohlo dojít k praktickému využití derivátů SAM v lidském lékařství. Nyní lze připravit stálou sůl SAM způsobem podle vynálezu, a to tri-p-toluensulfonát SAM. Jde o sůl, která má stálost téměř neomezenou při teplotě místnosti. Z tohoto důvodu bylo možno provést systematický farmakologický a klinický výzkum této sloučeniny, který vedl k objevu léčebných vlastností nové soli podle vynálezu. Tyto vlastnosti byly velmi překvapující- co do své kvality i co' do intenzity svého účinku. Z velkého množství farmakologických a klinických údajů, které byly o tomto produktu získány, se uvádí jenom některé, aby bylo zcela zřejmé, jaké základní vlastnosti má nový produkt podle vynálezu a jaké hlavní užití v lidském lékařství může mít.

Toxicita

Tri-p-toluensulfonát SAM, vyrobený způsobem podle vynálezu nemá prakticky žádnou akutní- toxicitu, chronickou toxicitu, místní nesnášenlivost nebo druhotné průvodní jevy.

DL50 - pro krysu a myš Je vyšší než 5 g/kg živé hmotnosti.

Zkoušky na snášenlivost a na chronickou toxicitu byly prováděny na krysách kmenů Wistar a Sprague-Dowley tak, že těmto zvířatům bylo 12 měsíců podáváno 2 až 10 mg této látky/kg živé hmotnosti a den. Na konci této doby různé orgány těchto zvířat neprokazovaly žádné pathologické změny.

Pokusy na možný vznik nádorového bujení byly prováděny na králících a na krysách. Ani po podávání vysokých dávek sloučenin, které přibližně lOkrát převyšovaly nejvyšší léčebnou dávku nedošlo ani ke vzniku nádorového bujení ani ke vzniku malformací na zárodcích nebo mláďatech pokusných zvířat.

Při pokuse na přežívajících tkáňových kulturách lidských lymfocytů a myších jaterních buněk nedošlo až do koncentrace 0,1 až 0,2 mg/ml k Žádným změnám blastogenního indexu pro tyto buňky.

Při nitrožilním -podání - v - dávkách ' až 20 mg/kg živé hmotnosti nevzniká horečka při pokusech na králících.

Při nitrožilním podání u králíků a u koček do dávky 40 mg/kg nedochází ke změnám tepenného tlaku v krkavici ani ke změnám frekvence- srdečního rytmu a dýchacího rytmu ani ke změnám elektrokardiogramu.

Místní snášenlivost - při nitrosvalové injekci je výborná i po opakovaném podání v době 15 až 20 dní stejně jako při nitrožilním podání do žíly na okraji 'králičího ucha.

U lidí byly pokusy prováděny na mladých zdravých dobrovolnících obojího pohlaví. Podáváno bylo nitrožilně 10 - až - 500 mg sloučeniny podle vynálezu. Průměrná hmotnost dobrovolníků byla 70 kg. Při rychlém - podání této látky byl zároveň zaznamenáván maximální a minimální krevní tlak, tep a rychlost ýdchání 1, 5, 15, 20, 30 a 60 minut po podání a - pak 2, - 3, 6, 8, 10, 12 a - 24 hodin po podání, přičemž nebyly - zaznamenány žádné odchylky od - normálních hodnot.

Ani - na elektrokardiogramu nebyly, zaznamenány žádné změny intervalu pQ,- úseku ST ani žádné extrasystoly nebo - jiné změny 30 vteřin, 1, 2, 3, 5, 10 a 20 - -minut po podání látky.

V krvetvorných - orgánech ani v játerních nebo v ledvinových buňkách nebyly získány žádné změny, které by znamenaly - statisticky významnou odchylku od normálního stavu.

Farmakologlcké vlastnosti

Aby bylo zřejmé, jak je tri-p-toluensulfonát Sam rozdělován - ve, - tkáních bylo užito produktu, který byl značen 14c - (1,66.10⁶s~¹/milimol) na methylové skupině. Tento produkt byl podáván morčatům v dávkách 3,7.104 s^_1/g hmotnosti.

Po 15 minutách po podání bylo možno zjistit zřetelnou radioaktivitu histoautoradiograficky v mozku, míše, játrech, plicích, ledvinách, nadledvinkách, - ve štítné žláze a v celé zažívací soustavě.

Z toho bylo vyvozováno, že nová sůl vyrobená způsobem podle vynálezu snadno prochází - hematoencefalickou barierou a vnáší methylovou skupinu do tkání, které obsahují enzym methyltransferázu. Jinak řečeno, nová sloučenina, vyrobená způsobem podle vynálezu se selektivně hromadí ve všech orgánech, které patří k - systému methyltransferázy.

To bylo prokázáno také následujícími farmakologickými zkouškami. Byla provedena celá řada farmakologických testů na krysách, přičemž bylo zjištěno, že nové látky podle vynálezu mají podstatný ochranný účinek při ztučnění jater, kterého bylo dosaženo dietou podle Handlera, která obsahuje příliš velké množství tuků a bílkovin, u ztučnění jater, které je vyvoláno akutní otravou alkoholem a -jinými toxickými látkami. V těchto případech postačí - podat 10 mg účinné látky na kg živé váhy. - Z mor195254 fohistochemlckého i analytického hlediska inhibuje S-adenosilmethionin, hromadění tukovitých látek až na úroveň, která je pro játra toxická. U experimentálně vyvolané zvýšené krevní hladiny tuků u krys, například přípravkem Triton S snižuje tri-p-toluensulfonát SAM tuto hladinu v dávkách 10 mg/kg daleko více, než jiné látky, dosud používané ke snížení hladiny tuků v krvi.

U kuřat, u nichž byla vyvolána skleróza potravou bohatou na cholesterol a fruktózu, bylo možno parenterálním podáním sloučeniny podle vynálezu v dávkách 10 mg/kg živé hmotnosti snížit hladinu cholesterolu v krvi a příznivě ovlivnit poškození, zjištěná v břišní a hrudní aortě. Snížena byla i poškození malých cév na spodině mozku.

Pokud jde o metabolismus fosfolipidů, byl u nekompenzované sklerózy u myší zjištěn experimentálně zvýšený obsah fosfatidylcholinu v játrech. Malé zvýšení této. látky. bylo rovněž zjištěno u experimentálních poškození, která byla vyvolána poruchou poměru /í-lipoproteinů a α-lipoproteinů. V obou těchto případech bylo možno tyto poruchy upravit podáváním sloučeniny podle vynálezu.

Zé všech těchto pokusů jasně vyplývá léčebný účinek tri-p-toluensulfonátu SAM při poruchách metabolismu lipidů.

Další série pokusů byly prováděny na krysách. Tyto pokusy prokázaly, že podáváním tri-p-toluensulfonátu SAM v dávkách 2 mg/kg vyvolává nahromadění zásob glykogenu v jádrech i ve svalové tkáni, což bylo možno prokázat histochemicky i kvantitativně. U pokusně vyvolané cukrovky aloxanem bylo podstatně sníženo množství inzulínu, nutné к návratu hodnot krevního cukru na normální hodnoty po podání tri-p-toluensulfonátu SAM v dávkách 5 mg/kg.

Tato série pokusů prokázala zřetelný účinek sloučeniny podle vynálezu na metabolismus glycidů.

V. další sérii pokusů byly užity krysy, u nichž byla předběžně vyvolána hypodisproteinemie. Těmto, krysám byl podáván tri-p-toluensulfonát SAM v dávkách 10 mg/kg hmotnosti. Bylo zjištěno, že v těchto dávkách sloučenina podle vynálezu zajišťuje návrat hladin krevních bílkovin na normální hodnoty, zejména dochází к podstatnému zvýšení hladiny albuminu a z toho vyplývá, že jde o vysoký anabolický účinek na bílkoviny.

Tato série pokusů prokazuje léčebný účinek nové sloučeniny vyrobené způsobem podle vynálezu na poruchy metabolismu bílkovin.

Klinické zkoušky

Vzhledem к údajům, které byly získány na základě farmakologických pokusů byly klinické zkoušky orientovány na poruchy, které se primárně nebo sekundárně týkají zejména těchto oborů:

— metabolismus lipidů — metabolismus glycidů — metabolismus bílkovinných látek — metabolismus, katecholaminů a bio- genních aminů — Z testů, které byly prováděny klinicky na několika stech lidí, jimž byl podáván tri-p-toluensulfonát SAM ve velmi různých dávkách bylo zjištěno, že nová sloučenina, vyrobená způsobem podle vynálezu způsobuje rychlý pokles tuků v játrech u ztučnění jater různého původu, přičemž tento léčebný účinek je možno prokázat odebráním vzorku tkáně na konci léčby a po 60 dnech od skončení léčby.

Při podávání této sloučeniny rovněž dochází к podstatnému poklesu při vysokých hodnotách celkového cholesterolu v krevním oběhu, к poklesu hladiny triglyceridů v krvi a dochází také к normalizaci chybného poměru /Mipoproteidů a α-lipoproteidů u osob s nekompenzovanou poruchou hladiny těchto tukovitých látek.

Jde tedy o účinek, který je možno vyjádřit jako snížení krevní hladiny cholesterolu a tukovitých látek. Tento účinek lze prokázat i v nízkých dávkách, například 5 až 10 mg, přičemž účinek je úměrný velikosti dávky.

Souběžné pokusy jasně prokázaly, že svrchu uvedený účinek na hladinu cholesterolu a lipidů se dostavuje i u lidí, u nichž nebylo předchozí léčbou obvyklým způsobem ani příslušnými dietními opatřeními dosáhnout nápravy.

U jasné arteriosklerózy s klinickými příznaky psychickými i se změnami nálad, s poruchami jasnosti vědomí a se sklerózou mozkových cév i s fenomény malé hladiny kyslíku v mozku bylo možno dosáhnout podáním, tri-p-toluensulfonátu SAM nitrosvalově nebo v těžších případech nitrožilně nebo pomalou kapací infuzí v dávkách 20 až 40 mg příznivé změny těchto symptomů. Zejména bylo možno napravit stavy, v nichž docházelo ke sníženému obsahu kyslíku v mozkové tkáni, takže se opět dostavily funkce, spojené s nutností dostatečného zásobení kyslíku v mozkové tkáni. Toto zlepšení bylo velmi rychlé a statisticky významné.

U syndromů po mozkové mrtvici bylo možno rychleji dosáhnout klinického zlepšení, což pravděpodobně souvisí s antitrombotickou účinností, kterou bylo možno prokázat v laboratorních podmínkách 1 na živých organismech..

Pokud jde o antitrombotickou účinnost sloučeniny, vyrobené způsobem podle vynálezu, byla prováděna celá řada pokusů laboratorních i pokusů na živých organismech. Pokusy na klinickém materiálu, například na krevní plazmě bohaté na destičky, prokázaly, že sloučenina podle vynálezu působí proti shlukování krevních destiček při různém rozmezí dávky. Například 0,8 miligramů sloučeniny podle vynálezu stačí

19S2S4

1β statisticky významně zabránit shlukování destiček, které je způsobeno. 40 mmoly ADP. Křivka shlukování destiček po . podání 4 mlkromolů ' ADP je podstatně změněna při současném podání 2 mg sloučeniny podle vynálezu na kg váhy kapací infuzí. Prakticky byla prokázána léčebná účinnost tri-p-. -toluensulfonátu SAM' v těchto· případech:

a) prevence a léčba trombózy, zejména v koronárních a mozkových cévách,

b) profylaxe trombóz, zejména u některých typů chirurgických operací jako gynekologických a porodnických.

— Sloučenina podle vynálezu byla podána řadě osob nemocných cukrovkou. Zároveň byly podávány malé dávky inzulínu v rozmezí 5 až 10 mg denně. Při nitrosvalovém nebo nitrožilním podání byl zjištěn zřetelný vzestup účinnosti inzulínu a tím i snížení zvýšené hladiny cukru, po úpravě dávky bylo tedy možno snížit trvale dávky inzulínu.

— Byly rovněž. prováděny pokusy na stovkách osob, které trpěly sekundárním snížením ' krevní hladiny bílkovinných . látek a poruchami složení krevních bílkovin. Šlo o . chronické nebo akutní hepatopatie, precirrhotické a cirrhotické stavy, 'špatné vstřebávání apod. Byly podávány dávky 50 až 200 mg tri-p-toluensulfonátu SAM denně nitrosvalovou nebo · nitróžilní.injekcí podle vážnosti případu. Bylo dosaženo statisticky významného vzestupu krevní hladiny bílkovin, zejména vzestupu podílu albuminu a tendence k normalizaci změněného poměru jednotlivých ' složek bílkovin v krvi. Tyto výsledky byly prokazovány elektroforézou krevního . séra. Jde o anabolický účinek (bílkoviny), který byl často sledován i podstatným zlepšením subjektivní. symptomatológie při objektivním zhoršení celkového · stavu nemocného.

— Zvláště překvapujících výsledků bylo dosaženo při klinickém podávání · nové enzymatické soli podle vynálezu tam, kde příznaky nemoci byly jasně spojeny se změnami výměny látek biogenních aminů, například u těchto stavů:

a) 'patologické příznaky neuropsychlatric- kého původu, '

b) Parkinsonova nemoc · a Parkinsonismus různého původu,

c) poruchy spánkového rytmu, zejména poruchy poměru mezi spánkem a bděním.

Pokud jde o poruchy a), byly získány výsledky na velkém množství nemocných, ' na nichž byly prováděny testy podle Hamiltona a Wittenberga. Tyto · testy jasně prokázaly, že podání dávek 50 až 20 mg SAL denně 20 až 40 dní způsobí podstatný ústup 'dvou hlavních příznaků, které jsou považovány za důležité pro diagnózu deprese.

V případě b) tj. při . léčbě Parkinsonovy nemoci a parkinsonismu bylo 'zjištěno, že

1. podání SAM v dávce. 10 až 40 mg denně nitrosvalově nebo nitrožilně podle vážnosti případu ve spojení s obvyklou léčbou přípravkem Levodopa působí statisticky .významné zlepšení poruch hybnosti . i tuhosti svalů ve srovnání s nemocnými, kteří byly léčeni pouze přípravkem Levodopa. Příznivě je ovlivněn rovněž třes, který v žádném případě nelze ovlivnit samotným přípravkem Levodopa,

2. podání sloučeniny podle vynálezu zřetelně zlepšuje psychické . poruchy, závislé na přípravku Levodopa, zejména deprese a psychické podráždění,

3. podání sloučeniny podle vynálezu brání · vzniku vedlejších příznaků, které jsou vyvolány přípravkem Levodopa na . různých orgánech, zejména zvracení, sklon · k zvracení, nechuť k jídlu, ' nízký krevní · tlak, bolesti hlavy, snížená potlvost a nespavost.

V případě c), tj. při poruchách ' spánkového rytmu je sloučenina podle vynálezu schopna v dávkách ' 5 ' až 10 . mg podstatně zlepšit tento stav zavedením fyziologického usínání ' bez potřeby používání barbiturátů nebo ' jiných látek, které tlumí činnost mozkové kůry a mozkových center.

Z toho co bylo uvedeno je zřejmé, že sloučenina, vyrobená způsobem podle vynálezu má ' neočekávaně široké použití v různých oborech lékařství, a to v oborech zvláštní důležitosti jako léčba hepatopatií, změněné hladiny lipidů v krvi, arteriosklerózy, psychiatrických poruch depresivního typu a neurologického typu, přičemž je pravděpodobná možnost ' použití ještě v dalších oborech lékařství.

Sloučenina podle vynálezu se s výhodou podává nitrosvalově nebo nitrožilně.

Dále jsou uvedeny farmaceutické přípravky, které byly ' široce experimentálně používány:

Lyofilizované ampule

SAM-tti-p-toluensulfonát5 mg

SAM-tti-p-toluёnsulfonát10 mg

S A^--t^í^^-^-^-^(^^^<^nsulf onát20 mg

SAM-tti-p-toluensulfonát 30 , mg

Ampule pro intermuskulární použití s obsahem rozpustidel

SAM-tri-p-toluensulfonát mg bezvodý střední fosfo-	5	10	20	30
rečnan sodný	8	16	32	48
bezvodý kyselý fosforečnan sodný	—	—	0,7	1,3
Lidbcaine HC1	10	¹⁰	20	20
redestilovaná apyrogenní voda do ml	2	2	3	3

Ampule pro nltrožilní použití s obsahem rozpustidla

SAM-tri-p-toluensulfonát mg5 bezvodý střední fosforečnan sodný8 bezvodý kyselý fosforečnan sodný0,13 redestilovaná apyrogenní voda do ml2

Další formy podání mohou být:

a) čípky

b) kapaliny pro podání do spojivkového vaku a do nosu

c) kapaliny ve formě aerosolu

d) kapaliny pro místní podání.

V těchto přípravcích je účinná látka ob10 20 30

3248

0,25 0,91,3

33 sažena v běžných farmaceutických nosičích (Slíváno Casadio „Tecnologia farmaceutica” — Ed. it. Ed. Cisalpino — Milán, 1960).

Závěrem lze říci, že léčebná dávka tri-p-toluensulfonátu SAM je v rozmezí 5 až 200 miligramů denně podle typu a závažnosti léčebného onemocnění.

Claims

PREDMET VYNALEZU

1. Způsob výroby tri-p-toluensulfonátu S-adenosyl-L-methioninu obecného vzorce vyznačující se tím, Že se к vodnému roztoku s obsahem S-adenosyl-L-methioninu přidá kyselina p-toluensulfonová v molárním poměru к S-adenosyl-L-methioninu 3 až 10, s výhodou 6, načež se vodný roztok zahustí při teplotě místnosti ve vakuu nebo se lyofilizuje na 2/20 až 4/20, s výhodou 3/20 původního objemu a sůl se vysráží přidáním organického rozpouštědla, rozpustného ve vodě, typu methylalkoholu, ethylalkoholu, propylalkoholu, isopropylalkoholu, acetonu nebo methylethylketonu.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky užije roztoku

S-adenosyl-L-methioninu získaného rozrušením kvasinkových buněk, obohacených ethylacetátem nebo methylacetátem S-adenósyl-L-methioninu při teplotě místnosti.