CN85101341A - 高纯度蛋白质的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

一种基本上纯净的非糖基化人类白细胞介素-2蛋白质，其具有的特异活性不低于10⁴单位/毫克，它是这样获取的，即培养一种带有一个DNA的转化体，该DNA带有一个编码人类白细胞介素-2的碱基序列，从而造成在培养肉汁中生产和积累人类白细胞介素-2，将这样获取的含有人类白细胞介素-2的液体通过包括有一个疏水性柱层析在内的提纯过程。

Description

高纯度蛋白质的制备及其应用

本发明是一种人白细胞介素-2及一种应用遗传工程学技术制备的方法

白细胞介素-2（也称为T细胞因子，简称为IL-2），是用同种异体抗原或外源凝集素刺激T细胞而产生的一种淋巴因子。〔科学science，193，1007（1976）;免疫学评论Immunological    Reviews，51，257（1980）〕。IL-2可使该细胞在体外生长，并重新获得它们的生物功能，因而有利于T细胞的长期培养。另外，据报道IL-2可促进胸腺细胞的促细胞***素的活性，促使裸鼠脾细胞产生T细胞依赖抗原（T细胞取代因子），或促进杀伤细胞的分化和增殖〔免疫学杂志The    Journal    OF    Immunology，123，2928（1979）;免疫学评论Immunological    Reviews，51，257（1980）〕。

由于IL-2的应用已经使杀伤T细胞，辅助T细胞及自然杀伤细胞克隆化。〔自然Natural，268，154（1977），免疫学杂志The    Journal    OF    Immunology，130，981（1983）〕。除了直接用于T细胞或自然杀伤细胞克隆化外，IL-2还可用于选择某种抗原的特异性活的杀伤T细胞。例如在体外杀伤T细胞可以识别肿瘤抗原，并破坏肿瘤细胞。将IL-2诱导产生的特异性肿瘤杀伤细胞注射到动物体内，则可能抑制和防止肿瘤的生长〔免疫学杂志The    Journal    OF    Immunology，125，1904（1980）〕。此外，IL-2还可以诱导IFN-Y的产生〔免疫学杂志-The    Journal    OF    Immunology，130，1784（1983）〕以及活化自然杀伤细胞〔免疫学杂志The    Journal    OF    Immunology，130，1970（1983）〕。

上述实验资料提示IL-2是一种有前途的抗肿瘤因子。已知IL-2在缺乏胸腺细胞功能的裸鼠体内可使辅助T细胞的功能得以恢复〔欧州免疫学杂志European    Jourual    OF    Immunology，10，719（1980）〕或恢复抗肿瘤细胞的杀伤T细胞的产生。〔自然Nature，284，278（1980）〕，因此IL-2对治疗免疫损伤疾病是很有前途的。

大规模生产IL-2的方法迄今尚未成功。由于缺乏纯的IL-2，临床应用受到阻碍。人们急切盼望着能研制出一种简便、廉价、大规模生产高纯度IL-2的新技术。

塔尼格其（Taniguchi）等人以人T细胞白血病细胞株Jurkat作为原材料或起始物分离到IL-2mRNA。通过使用IL-2mRNA克隆了人IL-2基因。据报道，由此可推断出人IL-2蛋白的氨基酸序列，并可在cos-7细胞中表达了这个基因〔自然Nature302，305（1983）〕。以后莱特（Later）等人报告说人类脾细胞诱导的IL-2基因已经被克隆，并可在大肠杆菌Escherichia    coli中表达〔核酸研究Nucleic    Acids    Resarch，11，4307（1983）〕。然而到目前为止IL-2样物质的存在也仅是在TCGF活性测定的基础上而进行判断的。还没有报告说经过人IL-2的DNA密码的转录而产生的人IL-2蛋白被提纯成纯净的形式。

本发明人已经研制出一种新技术，即利用基因控制方法对人IL-2进行克隆化，从而得到真正纯净的非糖基化的IL-2蛋白。由于使重组的DNA分子进入宿主并在其中表达人IL-2基因，而建立了生产真正纯净的、非糖基化的，人IL-2蛋白的方法并完成了目前的发明。

本发明提供了真正纯净的非糖基化的人IL-2蛋白以及生产上述人IL-2蛋白的方法，它包括培养一种带有DNA的转化物，该DNA带有编码人IL-2的碱基序列，以及从培养液中提取该蛋白。

本实验中所用的，编码人IL-2的DNA，是由图2中1-133密码子规定的，如DNA（Ⅰ），该DNA（1）碱基序列在5′端可具有ATG或如图2中描述的S1-S20密码子所代表的信号序列，在3′端可能是TAA、TGA或TAG，更可能是TGA。

DNA（1）倾向于连接在启动子的下方，例如色氨酸起动因子，rec    A起动因子或λPL起动因子。更可能的是色氨酸起动因子和λPL起动因子。按照本发明，编码人IL-2的mRNA是从用刀豆球蛋白A刺激的人外周白细胞培养中分离到的。例如单链cDNA是用逆转录酶合成的，然后再合成双链DNA，随后将双链DNA***到质体中，重新化合的质体可用于如大肠杆菌或芽胞杆菌属的枯草杆菌的转化，含有cDNA    A的质体已被克隆。用这种方法可以产生编码人IL-2的双股DNA，本发明中所使用的编码IL-2的mRNA可用欣优曼HINUMA等人的方法得到。〔生化和生理研究通讯Biochemical    and    Biophscal    Research    Communications，109，363（1982）〕，以由此得到的人IL-2的m    RNA作为模板加入已知的逆转录酶来合成cDNA，然后再将cDNA转化成双股DNA。〔曼纽尔泰斯等人，细胞Cell，8，163（1981），兰德H等人，核酸研究Nucleic    Acids    Research，9，2251（1981）〕。用dG-dc同聚物连接法在限制性核酸内切酶切开的位置即PSTI将双股DNA***到PBR322质体中。〔尼尔森，NelsonTS酶学方法Methods    in    Enzymology，68，41（1970）〕。此外，一个与人IL-2的部分氨基酸序列相应的低聚核苷酸可通过化学合成得到，然后以32p标记。用它作为示踪物，按照已知的克隆杂交技术在抗四环素或抗氨苄青霉素的转化物中挑选出所期待的克隆。〔格兰斯特恩Grunstein，M和霍格尼斯Hogness，D、S，Proc    Natl    Acad    Sci    USA    72    3961（1975）;阿尔文Alwine，J、C等人，酶学方法Methods    in    Enzymology，68，220（1979）〕。按照马克西姆·吉尔伯特（Maxam-Eilbert）的方法即上述的克隆杂交法，选择出单一的克隆并分析DNA的基本序列，从而证实了人IL-2基因的存在。〔马克西姆Maxam·A·M等人，Proc·Natl·Acad·sci，USA，74，560（1977）〕。或采用噬菌体M13的二核苷酸合成链测定法〔美星Messing·G等人，核酸研究Nucleic    Acids    Research。9，309（1981）〕。然后从所选择的克隆中挑出完整的或部分的人IL-2基因，在适宜的起动因子和SD〔Shine和Dalgarno）序列的下方***到质粒中，再放入一定的宿主中。

在起动因子中色氨酸起动因子比较合适，而大肠杆菌（E·Coli）则适于作为宿主（例如294株，DHI株·N4    830株）。据报道E·Coli    294株〔贝克曼（Beckman）等人Proc·Natl    Acad·Sci    USA，73，4179（1976）〕E.Coli    DHI〔赛尔森Selson    M.E等人，自然Nature    217    1110（1968）〕和E.Coli.N4830〔细胞Cell，25，713（1981）〕是合适的宿主。

用已知的方法将宿主的DNA进行转化〔科恩Cohen.S.N等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110（1972）〕被转化的宿主在已知的培养液中培养，例如含葡萄糖和凱氏氨基酸〔Casamino〕的M9培养液〔米勒Miller    J分子遗传学试验Experiments    in    Molecular    Genetics，431-433页（Cold    Spring    Harbor实验室，纽约1972）〕。当使用色氨酸起动因子时可加入3-β-吲哚丙烯酸脂来加强起动因子的作用。培养通常是在15～43℃，10～30小时，最好为18～24小时，根据需要进行通气或搅拌。

如果使用λPL起动因子，转化物的培养，则适于在相对低一点的温度约30-36℃下进行，接着在37-42℃的条件下，使转化物中的阻遏物灭活，并有效地进行编码人IL-2的DNA的表达。

由此得到的人IL-2可用IL-2依赖细胞系进行分析。已知IL-2可以促进大鼠小鼠和其它IL-2依赖细胞的生长，正如可促进人IL-2依赖细胞生长一样。〔免疫评论Immunological    Reviews，51，257（1980）〕。因此，不仅人的IL-2依赖细胞系，而且小鼠、大鼠的IL-2依赖细胞系都可用于分析实验。〔免疫杂志Journal    oF    Immunology    130，981和988（1983）〕。由此得到的IL-2可用来维持所需的IL-2依赖细胞系的生长。

特别是鼠的IL-2依赖细胞系通过传代培养可以稳定的维持很长一段时间，从而得到有价值的研究结果。

培养后，本发明采用已知的方法从培养的    细胞中提取人IL-2蛋白，将细胞悬浮于蛋白变性剂如胍的无机酸盐溶液（盐酸、硝酸、硫酸）之一中，再将悬液于低温下搅拌，然后离心，从而得到含有IL-2的上清液，或将其悬浮于缓冲液中，用超声波破碎，溶菌酶处理或冻溶后融解并离心，得到含有IL-2的上清液。其它任何可提取IL-2的方法也都可使用。

可以采用各种适当分离提纯方法从上述的上清液中提取IL-2蛋白并进行纯化。已知的分离提纯方法包括：利用溶解度的不同进行提取，如盐析法、溶剂沉淀法;利用分子量的不同进行提取，如透析法、超滤法、凝胶过滤法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法;利用电荷不同，例如离子交换层析;利用特异性亲和力的不同，如亲和层析法;利用疏水性的不同，如反向高效液相色层析;利用等电点不同，如等电点聚焦电泳法。由于人IL-2蛋白具有较高的疏水性，因此使用疏水性柱层析，特别是反向高效液相色层析可提纯该蛋白。

例如，从带有编码人IL-2的基因的E.Coli培养中得到的细胞可悬浮于溶液中，最好是含有蛋白变性剂的缓冲液中，如胍盐酸盐（2M-8M，最好为6M-8M），将悬液搅拌，最好放于0-5℃搅拌0.5-3小时，然后离心，如此收集的上清液如果合适，用超滤器或类似仪器进行浓缩。如若发现沉淀可通过离心除去，上清液用＝乙胺乙基纤维素装的阳离子交换柱层析提取，〔DE    52纤维素（华特曼Whatnan    Gt英国）〕，这样就可收集到具有IL-2活性的部分。

使用超滤装置进行浓缩后，再将活性部分通过装有N，N′-亚甲基偶联丙烯酰葡聚糖凝胶如Sephacryl    S-200（瑞典药厂Pharmacia    Sweden）或其它类似物质的柱进行过滤。收集到的活性部分再经过高效液相色层析。按照这种方法就可以得非糖基化的人IL-2蛋白。

如采用反向高效液相色层析时选用烷基化（C1-18）硅烷包裹的树脂效果最好。作为洗涤脱剂C1-6低烷醇（如乙醇丙醇）或乙晴较为适宜。洗脱剂的PH为1.5-8，最好为1.5-4。洗脱速率为0.1-100毫升/分钟，最好是0.5-10毫升/分钟。

按上述方法提取的人IL-2蛋白可用冷冻干燥制成粉末。在冷冻干燥时，可加入稳定剂如山梨醇、甘露糖醇、右旋葡萄糖、麦芽糖、甘油或人血清白蛋白。

在测定IL-2活性时可利用放射性标记法。IL-2依赖鼠细胞可吸收放射性胸腺嘧啶核苷，通过测定其放射性而计算出IL-2蛋白的活性。按照本发明得到的人IL-2蛋白的特异性活性单位不少于1×10⁴单位/毫克，以大约为2×10⁴单位/毫克-4×10⁴单位/毫克的为较好。

这里提到的IL-2活性单位可按下列方法计算。将IL-2样品加到含有鼠细胞的培养液中，鼠细胞的生长取决于IL-2的浓度，整个混合液在37℃5%二氧化碳浓度下培养过夜。该细胞的生长可用标记的胸腺嘧啶核成进行测定，为了测定标本中IL-2的活性单位需用标准的IL-2（1单位/毫升）作为比较。通过标本和标准单位的IL-2的比率可计算出标本中IL-2的活性单位。

IL-2依赖鼠细胞系的细胞（NKC3）〔辛纽曼Hinuma等人，生理生化研究通讯Biochem Biophys Res Commun，109，363（1982）〕可以在含20%小牛血清的RPMI1640培养液中在37℃5%Co2浓度中进行传代培养。用不含牛血清的1640培养液洗两次，再将细胞悬浮于含20%小牛血清的1640培养液中继续培养，细胞数大约为6×10⁵细胞/毫升。

在96孔平底微量培养板上的第一排孔中各加一滴（50μl）IL-2的标本，再用含20%小牛血清的1640培养液进行倍比稀释，直至第十二排。每孔再加入50微升NKC3细胞悬液，然后37℃5%Co2浓度下培养24小时。培养20小时后，每孔加入一微居氚标记胸腺嘧啶核苷，继续培养4小时后将细胞放入细胞收集器中（Flow    USA），用液体闪烁计数器测定氚标记的胸腺嘧啶核苷的含量。在测定含有IL-2蛋白的标本时要对标准的IL-2标本进行与含有IL-2样品分析相同的步骤，才能计算出所测标本的活性单位，并测定胸腺嘧啶氚标记吸收。计算方法可参照免疫学杂志120    2027（1978）介绍的概率法计算。在标准的IL-2标本稀释系列中，最大吸收率为100%，然后再计算每一稀释度的吸收百分率，并将得到的数值标在概率曲线纸上。通过图解可确定吸收率为50%的稀释因子。用含有10%小牛血清，40微克/毫升刀豆球蛋白A和15毫微克/毫升12-氧-14酰波醇-13-乙酸（TPA）的RPMT1640培养液在37℃5%Co2浓度下培养人外周血淋巴细胞，经过48小时后在上清培养液中IL-2的活性被确定为1单位/毫升。

标本中IL-2的浓度（U/ml）可用下列公式计算：

(标本的稀释系数（50%吸收率）)/(标准IL-2标本的稀释系数（50%吸收率）)

正像上述检测方法确定的，从人类外周血获得的天然IL-2具有20，000～70，000l/mg（单位/毫克）的特异性活性。天然IL-2的活性与现在发明的非糖基化的人类IL-2蛋白质的活性几乎相等。

按照这个发明，非糖基化的人类IL-2蛋白质更为好的是含有氨基酸序列的多肽（Ⅱ），见图3，在X点上是蛋氨酸（Met）或氢。根据该发明生产的人类IL-2蛋白质具有以下特征：

1）在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳内，非糖基化人类IL-2是均质的，通过电泳确定，分子量为15，000±1，000道尔顿。

2）在氨基酸（链）的氨基末端，含有丙氨酸或甲硫氨基酸。

3）在氨基酸序列的羧基末端，含有苏氨酸。

4）促进T-细胞或天然杀伤细胞的生长并同时维持他们的功能。

根据发明生产的人类IL-2蛋白质在

属细胞溶解实验中所反应阴性，〔黑莫斯塔斯Haemostasis7、183（1978）〕并且杂蛋白质和热原物质的含量很低，因此能够安全地应用，如制成注射剂等等。

根据目前发明而获得的非糖基化人类IL-2蛋白质有促进正常T-细胞或自然杀伤细胞生长而同时又维持他们功能的能力。本发明的IL-2蛋白质可用于T细胞在体外的长期传代培养或自然杀伤细胞或用在它们的克隆化中。因此，在测量人类IL-2活性时，可利用该技能。

此外，人类IL-2蛋白质的发明，使得选择性地增加特异性抗原的杀伤T细胞或自然杀伤细胞成为可能。杀伤T细胞可识别和破坏肿瘤抗原。在体外，不论敏感性的抗原存在与否，自然杀伤细胞都具有杀伤肿瘤细胞的能力。当与上述的杀伤细胞同时接种到活的生物体内时，本发明的IL-2可增加杀伤T细胞的抗肿瘤作用。因此，上述的IL-2对于肿瘤的预防或治疗是有用的，或是对于温血哺乳动物（如：小鼠、老鼠（耗子）、兔子、狗、猫、猪、马、羊、牛、人）的各种免疫缺陷疾病的治疗是有用的。

本发明的人类IL-2蛋白质是一个高度纯化的产品，对人来说，它几乎没有抗原性，毒性也很低。

为了预防和***，本发明的人类IL-2能够作为一种药品被应用，或是经过肠道外的途径，或是以口服的形式，例如：适当的与已知的媒介物混合或稀释制备成注射剂或胶束。如上所述，这些药品制剂能够单独应用，也能与体外培养的杀伤T细胞或自然杀伤细胞联合使用。

本发明的人类IL-2蛋白质基本上具有像天然人类IL-2一样的生物学活性，因此能像上述的自然IL-2以相同的方式使用。本发明的IL-2的应答细胞受体的解离常数非常小，以致于在大多数病例中，非常小的剂量就足以了。

为了使T细胞在体外能够生长，把本发明的人类IL-2以大约0.01～1单位/毫升的浓度加入到培养基内，浓度范围最好在0.1～0.5单位/毫升。

以在体外培养T细胞为例，以0.1～0.5单位/每毫升的浓度，把本发明的IL-2蛋白质加入到细胞悬液中，该细胞悬液是从人类外周血获得的T细胞（1×10⁶细胞/毫升）与淋巴细胞混合培养3天，而获得的对特异抗原敏感的T细胞与B细胞，在含有20%的小牛血清的RPMI1640培养液中增加X线照射进行转化。培养持续约1个月，在此期间，约每隔一周换一次培养液。

以下展现出的样本，即是大肠杆菌DHI/PTF4，已存放在大阪发酵所（IFO），存放的号码是IFO-14299，并且也存放在发酵研究所，工业科学技术代理处，日本国际工业贸易部（FRI），登记号码是FERM、BP-628，存放在布达佩斯条约之下。

在本发明的说明书，附图中，当以缩写代表碱基、氨基酸时，都是按照国际理论和应用化学联合会（IUPAC）-国际生物联合会（IUB）委员会的规定及有关该领域的生物学的术语或贯例的。如表1，在这里设及到了光学异构现象，除了其它方面的特殊说明外，所提到的氨基酸是以左旋（L）形式（存在）。

表1

DNA：Deoxyribonucleic    acid    脱氧核糖核酸

cDNA：Complementary    deoxyribo    nucleic    acid互补脱氧核糖核酸

A：Adenine    腺嘌呤

T：Thymine    胸腺嘧啶

G：Guanine    鸟嘌呤

C：Cytosine    胞嘧啶

RNA：Rlbonucleic    acid    核糖核酸

mRNA：Messenger    ribonucleic    acid

信息核糖核酸

dATP：Deoxyadenosine    triphosphate

脱氧三磷酸腺苷

dTTP：Deoxythymidine    triphosphate

脱氧三磷酸胸

dGTP：Deoxyguanosine    triphosphate

脱氧三磷酸鸟苷

dCTP：Deoxycytidine    triphosphate

脱氧三磷酸胞苷

ATP：Adenosine    triphosphate

三磷酸腺苷

EDTA：Ethylenediaminete    triphosphate    acid

乙二胺四乙酸

SDS：Sodium    dodecyl    Sul    fate

十二烷基硫酸钠盐

Gly：Glycine    甘氨酸

Ala：Alanine    丙氨酸

Val：Valine    缬氨酸

Leu：Leu    Cine    亮氨酸

Ile：Isoleucine    异亮氨酸

Ser：Serine    丝氨酸

Thr：Threomine    苏氨酸

Cys：Cysteine    胱氨酸

1/2    Cys：Half    Cystine    半胱氨酸

Met：Methionine    蛋氨酸

Glu：Glutamic    acid    谷氨酸

Asp：Aspartic    acid    天冬氨酸

Lys：Lysine    赖氨酸

Arg：Arginine    精氨酸

His    Histidine    组氨酸

Phe：Phenylalamine    苯丙氨酸

Tyr：Tyrosine    酪氨酸

Pro：Proline    脯氨酸

Asn：Asparagine    天冬酰胺

Gln：Glutamine    谷氨酰胺

图1和图2分别说明由参考例1（Ⅶ）获得的质粒PILOT    135-8内切酶图谱（说明信号肽的部分编码，说明IL-2的部分编码）和上述质粒的初级结构（碱基序列）。图3显示的为本发明的，非糖基化的氨基酸序列，在X点上，是蛋氨酸或是一个氢原子。图4说明了参考例2给出的质粒PTF    4的表达制造图解。图5说明做的十二烷基硫酸钠盐（SDS）一聚丙烯酰胺凝胶板电泳，在例1（V）、（1）和（2）中，图6说明在例1（V）（6），讲到的胰酶消化肽的图谱。图7和图8说明本发明的人类IL-2蛋白质分别通过NKC    3细胞系和人类细胞系吸收标记的胸腺嘧啶的作用。如例1（V）（7）所揭示的那样。图9说明在例1（V）（7）内长期传代培养的NKC3细胞系的结果。

图10和11，说明参考例4所给出的表达质粒PTF    1和PTB    285的制造图解。

参考例1

（Ⅰ）分离编码人类IL-2的mRNA

来源于人类外周血的淋巴细胞，培养在含有10%的小牛血清，12氧14烷佛波醇-13乙酸（TPA）（15毫微克/毫微升，15ng/nl）和刀豆球蛋白A（40微克/毫升、ng/ml）的RPMI1640培养基内，温度为37℃，从而引起IL-2的产生。孵育24小时以后，在含有5M硫氰胍，5%巯基乙醇、50mM三羟甲基氨基甲烷、盐酸（Tris HCl）（pH7.6）和10mM乙二胺四乙酸（EDTA）的一种溶液内，把1×10¹⁰人类淋巴细胞放入含有上述溶液的Teflon匀浆器中使其破碎并变性，然后加入4%的十二酰甲基甘氨酸钠，匀浆后的混合物被放置到6毫升（ml）5.7M氯化铯溶液（5.7M氯化铯、1M EDTA）中，用Beckman Sw 28离心机以24，000转/分，在15℃离心48小时，得到RNA沉淀。该沉淀再溶解在0.25%的十二酰甲基甘氨酸钠内并用乙醇沉淀，得到10mg（毫克）的RNA。该RNA在一寡（dT）纤维素柱中，在高浓度盐溶液内〔0.5M氯化钠（NaCl）10mM Tris HCl PH7.6，1mM EDTA、0.3%SDS）吸附。再用低盐溶液（10mM Tris HCl PH7.6mM EDTA 0.3% SDS）洗提，得到300微克（μg）含有聚A的mRNA。该mRNA进一步用乙醇沉淀，然后再溶解在0.2ml溶液内（10mM Tris HCl PH7.6，2mM EDTA 0.3% SDS），65℃处理2分钟，经10～35%的蔗糖梯度密度离心（使用Beckmem SW 28转子，在20℃ 25，000转/分，21小时）分为22个部分。每个部分注入到爪蟾属laevis的***内，便可测量这样合成的蛋白质中的IL-2活性。发现NOs 11-15部分（沉降系数85-15S）具有IL-2活性，在这些部分里，大约含有25μg（微克）的IL-2信息核糖核酸（mRNA）。

（Ⅱ）单链脱氧核糖核酸（DNA）的合成。

用上述获得的信息核糖核酸（mRNA）和逆转录酶合成单链互补脱氧核糖核酸（cDNA）是在100微升的反应溶液里（5微克的mRNA，50μg的oliogo（dT），100单位的逆转录酶，1mM的脱氧三磷酸腺苷（dATP），1mM脱氧三磷酸胞苷（dCTP）1mMe脱氧三磷酸鸟苷（dGTP），1mM脱氧三磷酸胸苷（dTTP）8mM氯化镁MgCl₂50mM氯化钾KCl 10mM二硫苏糖醇（DTT）、50mM三羟甲基氨基甲烷盐Tris，PH8.3）在42℃，持续1小时的条件下完成的，再用苯酚去除蛋白质並用0.1N的氢氧化钠处理在70℃，20分钟以分解RNA。

（Ⅲ）双链DNA的合成

在以上（Ⅱ）获得的单链互补DNA，在50微升的反应溶液里（除了缺乏mRNA和oligo（dT）与上述（Ⅱ）阶段的反应溶液相同），在42℃持续2小时合成编码IL-2的双链DNA，详见马尼塔斯Maniatis等。

（Ⅳ）dc末端的增加

在50微升反应溶液内（双链DNA、0.1M醋酸钠盐、PH4.5、0.25M NaCl 1.5mM的硫酸锌，60单位SI核酸酶），用核酸酶SI处理由第三步来的双链DNA条件为室温30分钟，再用苯酚去除蛋白质和用乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA在50微升的反应溶液（双链DNA，0.14M卡可基酸钾，0.3M Tris（碱性）PH7.6，2mM二硫苏糖醇，1mM CoCl₂，0.15mM三磷酸脱氧胞苷，30单位的终端转移酶）内，用终端转移酶处理，37℃，3分钟，从而引起双链DNA的延伸，在两条链的两个3′末端约有15个脱氧胞嘧啶。以上一系列的反应，得到300毫微克（ng）含有脱氧胞嘧啶链的双链DNA。

（Ⅴ）大肠杆菌质粒的裂解和dc末端的增加

在50微升反应溶液内（10μg上述DNA，50mM NaCl，6mM Tris HCl、PH7.4 6mM MgCl₂，6mM2-巯基乙醇，100微克（μg）/毫升（ml）小牛血清，20单位的PstI）用限制性内切酶处理，10微克的大肠杆菌质粒PBR 322 DNA 37℃，3小时，从而裂解了一个在质粒PBR 322 DNA上的PstI识别位点，接着用苯酚去除蛋白质，对在50微升反应溶液内（10微克DNA、0.14M卡可基酸钾、0.3M Tris（碱性）PH7.6、2mM二硫苏糖醇，1mM CoCl₂，0.15M三磷酸鸟嘌呤和30单位的终端转移酶）37℃，用终端转移酶对所述的DNA处理30分钟，延伸裂解的质粒PBR 322 DNA，在它的两个3′末端都增加了约17个脱氧鸟嘌呤。

（Ⅵ）cDNA的对合及大肠杆菌的转化

以上（Ⅳ）内获得的编码IL-2的DNA（0.1μg）和（Ⅴ）内所得的0.5μg（微克）的DNA质粒，在含有0.1M氯化钠，50mM    Tris、HCl、PH7.6和1mM    EDTA的溶液中，65℃热处理2分钟后，接着在45℃处理2小时，使它们对合以后逐渐冷却，根据埃尼（Enea）等人的方法IJ，M01分子生物学杂志Biot.96.495（1975）〕，该产物用于大肠杆菌MM294的转化。

（Ⅶ）分离含有互补脱氧核糖核酸（cDNA）的质粒

按照这种方法，大约分离到20，000抗四环素的转化物。每一个DNAs固定在一个硝酸纤维素滤器上。在IL-2氨基酸序列的基础上，由坦科奇（Taniguchi）等人报告的〔自然，Nature，302，305（1983）〕，该互补寡核苷酸的碱基顺序（5′AAA，CAT、CTT、CAG、TGT³和^5′ACA、TTC、ATG、TGT、GAA³）分别与氨基酸NOs 74-78（赖-组-亮-谷氨酰胺-胱氨酸）及氨基酸NOs，122-126（苏-苯丙-蛋-胱氨酸-谷氨酸）相对应，互补寡核苷酸是用Phosphotriester方法〔科瑞等人Crea    R，et    al    Proc、Natl、Acad、Sci    USA    75，5765（1978）〕化学合成的。

这些寡核苷酸在50微升的反应溶液内（0.20微克的寡核苷酸、50mM Tris、HCl、PH8.0、10mM MgCl₂、10mM2-巯基乙醇、50微居（μci）的γ-³²P ATP（三磷酸腺苷）、3个单位的T₄多核苷酸激酶）处理，37℃1小时，使其被³²P在5′末端标记，按照劳恩（Laun）等人的方法〔核酸研究Nucleic Acids Res，9，6103（1981）〕用这些标记的寡核苷酸作为探针，与上述固定硝酸纤维素滤膜上的DNAs对合。与上述两个标记的寡核苷酸探针有反应的4个转化物便可通过自动放射法检测。采用伯恩贝-多里，碱性（Birnboim-Doly alkali）方法〔伯恩贝-多里Birnboim.H.C Doly、J.核酸研究Nucleic Acids Res 7，1513（1979）〕，从这些转化物的每一个细胞分离质粒DNA，然后用限制性内切酶在Pst1位置切除质粒DNA上的***体。在分离的质粒中，挑选了一个含有最长的编码IL-2的***体的质粒，称为PILOT 135-8，图1表示了该质粒的限制性内切酶的图谱。

***在该PILOT    135-8的cDNA的初级结构（碱基序列），通过2脱氧核苷酸方法和马克斯-吉尔伯特（Maxam-Gilbert）方法确定了，所确定的初级结构见图2，由这个碱基序列确定的肽，由153个氨基酸组成，首先合成起始信号（NOs、64-66、ATG）另一方面，N-末端的20个氨基酸被认为是组成一个信号肽。以上初级结构说明PILOT    135-8具有编码人类IL-2蛋白质的碱基序列。这一事实说明，把由（Ⅳ）得到的编码IL-2的基因***到适当的表达质粒内，则能导致产生IL-2蛋白质。

参考例2

从参考例1中得到的Pilot 135-8质粒用Hgial限制性内切酶切开，由此得到的含有IL-2基因的1294个碱基对的DNA碎片，含有一个IL-2基因，再采用T₄DNA多聚酶处理，与ClaI连接于CGATA ATG GCA连接起来，它含有丙氨酸密码子GCA和蛋氨酸的密码子ATG，连接后的产物用ClaI和PstI处理，接着在ClaI-PstI的位置上***PtrP 771，由此得到的质粒被命名为PTF₄（图4）。

参考例3

E.Coli，DH1可用参考例2中得到的PTF₄质粒进行转化，其方法与科恩Cohen等人的方法一致，〔Proc，Natl Acad，Sci USA 69，2110，（1972）〕，从而得到带有上述质粒的转化物。

例1

E.Coli、DH1/PTF4（在参考例3中获得）被接种到PH7.0含有1%Bacto胰蛋白胨（美国Difco实验室），0.5%    Bacto酵母提取液（美国Difco实验室）0.5%氯化钠和7ng/ml四环素的培养液中，然后放入250毫升的爱伦美氏烧瓶中，在转鼓上37℃过夜，再将培养液放入5升的发酵桶内，桶内装有2.5升的M9培养液，其中含有0.5%酪蛋白氨基酸，0.5%葡萄糖和7μg/ml四环素，然后通气搅拌培养4小时，温度为37℃，加入3-β吲哚丙烯酸（25μg/ml）后，再继续培养4小时，最后将达2.5升培养液离心，得到的细胞放于-80℃冰冻保存。

（Ⅱ）从例1中得到的冰冻细胞（12.1克）悬浮于100ml的提取液中，（PH7.0），该提取液含有7M盐酸胍和0.1M    Tris、HCl，将悬浮液在4℃搅拌1小时，将溶胞物离心，28000xg20分钟，最后得到93ml上清液。

（Ⅲ）对从例1（Ⅰ）中得到的大肠杆菌（E.Coli）DH1/PTF4细胞转化物中提取IL-2，分别使用了不同的提取方法以比较各自的提取效率。

在溶菌酶-EDTA方法中，取例Ⅰ（Ⅰ）得到2克大肠杆菌DH1/DTF4细胞，与16毫升PH7.0溶液混合，该液含有0.1M    Tris-HCl，10m    M    EDTA及250毫克/升溶菌酶，上述混合液于4℃下搅拌1小时，随后放37℃搅拌5分钟，溶胞物再经28，000xg离心20分钟。

在超声处理方法中，取从例1（Ⅰ）得到的2克细胞，放于16毫升PH7.0、含有0.1M    Tris-HDl溶液中，然后将悬浮液于0℃进行超声处理5分钟;溶胞物再行28，000xg离心20分钟。

在盐酸胍方法中取来自例1（Ⅰ）的2克细胞，与16毫升PH7.0溶液混合，该液含有0.1M    Tris-HCl及2M、4M或7M的胍-HCl，上述混合液于4℃下搅拌1小时，溶胞物再经28，000xg离心20分钟，所得的上清液用于蛋白浓度及IL-2活性的测定，其结果总结如表2：

表2：IL-2的提取

Gu.HCl：盐酸胍

（Ⅳ）在例1（Ⅱ）中所得到的上清液对（PH8.5）0.01M    Tris-HCl缓冲液透析，然后再行19，000xg离心10分钟，收取透析清液94毫升，此液用于DE52（DEAE-纤维素）柱该柱体积为50毫升吸附蛋白质，该柱事先用0.01M    Tris-HCl（PH8.5）缓冲液平衡，以线性梯度的氯化钠（0-0.15M氯化钠，1升）洗脱蛋白质，具有IL-2活性的部分（53毫升）用YM-5滤膜（美国、Amicon    J）浓缩至4.8毫升，然后，进行葡聚糖凝胶S-200（瑞典Pharmacia    J）柱的凝胶过滤（柱体积500毫升）。使用PH8.0、0.1M    Tris-HCl-1M氯化钠缓冲液平衡。如此得到的活性部分（28毫升），再用YM-S滤膜浓缩至2.5毫升。此浓缩物进而经超微孔RPSC柱（美国Altex    J）吸附及高效液相色谱分析。在高效液相色谱分析中，以三氟醋酸-乙腈***作为流动相。

使用条件：

柱：超微孔RPSC（4.6×75毫米）;

柱温度：30℃

溶剂A：0.1%三氟醋酸-99.9%水;

溶剂B：0.1%三氟醋酸-99.9%乙腈;

洗脱次序：0分钟（68%A+32%B）-25分钟（55%A+45%B）-35分钟（45%A+55%B）-45分钟（30%A+70%B）-48分钟（100%B）;

洗脱速率：0.8毫升/分钟;

检测波长：230nm

活性部分的收集时间大约在第39分钟。由此得到10毫升溶液，其中含有0.53毫克非糖基化人IL-2蛋白质〔特异活性：30，000单位/毫克;起始物质的活性复元：30.6%，纯蛋白质99%（使用光密度计对SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行测定）。

上述溶液经冷冻干燥，得到白色粉末。该粉末具有26，000单位/毫克的特异活性。

（Ⅴ）在例Ⅰ（Ⅳ）得到的人IL-2蛋白质从如下性质进行检测：

1.同质性：

据Laemmli方法（自然杂志、Nature。227、680、1970）对SPS-聚丙烯酰胺凝胶电泳用考马斯亮兰染色，人的IL-2蛋白质仅显示单一条带（图5），其条带位置在还原或不还原情况下不改变。

2.分子量：

以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果为基础，计算人IL-2蛋白质分子量大约为15，000道个顿（图5）。

3.氨基酸组分：

20微克人IL-2蛋白质放于玻璃试管内进行水解，加入沸腾的含有4%巯基乙酸的盐酸，真空密封管口，将试管置于110℃条件下反应24小时，48小时或72小时进行水解。水解后打开试管封口，减压抽去盐酸，其剩余物用0.02N盐酸再次溶解，对此用835型Hitachi氨基酸分析仪进行氨基酸分析。

对胱氨酸和半胱氨酸的测定，系使用Hirs的方法（酶学方法，Methods    In    EnzymolⅡ、197、（1967）〕将人IL-2蛋白质用过甲酸氧化，随后在恒沸盐酸中减压24小时进行水解。其水解产物用氨基酸分析仪进行磺基丙氨酸测定。分析结果见表3，其数值系水解24小时，48小时，72小时各所得三个数值的平均值。而丝氨酸苏氨酸由推断水解起始时间测知。

表3

氨基酸    摩尔%

天冬氨酸/天冬酰胺    8.8

苏氨酸    9.3

丝氨酸    5.7

谷氨酸/谷氨酰胺    13.7

脯氨酸    3.4

甘氨酸    1.7

丙氨酸    3.8

1/2半胱氨酸    2.3

缬氨酸    3.1

蛋氨酸    3.7

异亮氨酸    6.3

亮氨酸    16.3

酪氨酸    2.3

苯丙氨酸    4.5

赖氨酸    8.3

组氨酸    2.5

精氨酸    3.1

色氨酸    1.1

4.N-末端氨基酸顺序：

取34微克人IL-2蛋白质，以自动的Edman降解方法，用气相蛋白顺序分析仪（470A型，应用生物分析厂、美国）进行N-末端氨基酸顺序分析。

选用Micropak-SP柱（美国、VarianT）以高压液相层析分析鉴定苯基乙内酰硫脲-氨基酸（PTH-氨基酸）

表4显示了每步骤检出的PTH-氨基酸或其他酸：

表4

步骤    测出的PTH-氨基酸

1    丙氨酸

蛋氨酸

2    脯氨酸

丙氨酸

3    苏氨酸

脯氨酸

4    丝氨酸

苏氨酸

5    丝氨酸

6    丝氨酸

7    苏氨酸

8    赖氨酸

9    赖氨酸

10    苏氨酸

11    谷氨酰胺

12    亮氨酸

13    谷氨酰胺

14    亮氨酸

15    谷氨酸

16 Y^＊

17    亮氨酸

18    亮氨酸

19    亮氨酸

20    天冬氨酸

^＊尚未鉴定

5.C-未端氨基酸：

取33微克人IL-2蛋白质加入到玻璃试管中，加入不含水的肼0.05毫升，将试管真空封口，于100℃加热6小时，进行肼降解。获得的肼降解物冷冻干燥，然后再溶于蒸馏水中。此溶液再加入苯甲醛，于室温下搅拌混合1小时后离心。取液层冷冻干燥，用Hitachi835型氨基酸分析仪，进行氨基酸分析。只有苏氨酸被测定。

6.胰蛋白多肽图谱：

取15微克人IL-2蛋白质，放于含有0.4微克胰蛋白的120微升，0.02M碳酸氢钠液中，37℃酶解18小时。然后加入5微升-巯基乙醇，37℃再反应2小时。然后加1%三氟醋酸75微升中止反应。

该反应混合物的高压液相色层析按照如下方法进行，洗脱情况见图6，

柱：超微粒-辛基型（5微米、4.6×250毫米，美国AlTeXJ）

柱温度：30℃

流动相：

溶液A：0.02%三氟醋酸-99.98%水;

溶液B：0.02%三氟醋酸-99.98%乙腈;

0分钟（95%溶液A+5%溶液B）;

45分钟（30%溶液A+70%溶液B）;

流速：1.0毫升/分钟

检测：使用荧光胺（美国RocheT）的荧光方法（生物化学分析Analytical    Biochem    67、438（1975）〕。

7.对本发明非糖基化人IL-2蛋白质的IL-2依赖细胞系的活性分析，是依据生物化学、生物生理学研究通讯109，363（1982）中，描述的一个方法分析表明，在小鼠IL-2蛋白依赖细胞系（NKC₃图7）该IL-2蛋白有促进摄取氚标记的胸腺嘧啶的活性。人IL-2依赖细胞系活性亦相同（参见图8）。

而且发现将该IL-2蛋白质以0.5单位/毫升的浓度溶于20%FCS加RPMI-1640培养基中，其中悬浮2×10⁵个细胞/毫升的NKC₃细胞系。于37℃5%的CO₂环境下，在Linbro Multi皿（美国，Flow）上连续传代，同时间隔2或3天计数反复成活的细胞，並再悬浮培养于新鲜培养基中。可以见到该IL-2蛋白质具有维持NKC₃细胞系长时期生长的活性。说明见图9。

例2（注射剂制备）

应用CM-Toyopearl（日本，Toyo    SodaT）柱，对在例1（Ⅳ）中得到的含有非糖基化人IL-2蛋白质溶液进行吸附，该柱用0.025M醋酸铵缓冲液（PH5.0）平衡。在无菌条件下进行吸附，随后使用含有0.15M氯化钠的上述缓冲液作洗脱。该洗脱液加入适量的0.15M氯化钠稀释，接着加入HSA使浓度为0.5%，再经滤膜（0.22微米孔径）过滤。无菌分装1毫升滤液于小瓶中，冷冻干燥。注射时每瓶人IL-2制剂加入1毫升蒸馏水溶解使用。

参考例4

从参考例1中得到的PILOT 135-8质粒用Hgi AI限制性内切酶断开，得到的1294bp DNA片断，用T₄DNA聚合酶处理产生平端，再用T₄DNA连接酶同ECO RI连接子d TGCCATGAA-TTCATGGCA连接。

如上得到的DNA经Eco    RI酶解，将获得附加有转译起动密码ATG和人IL-2基因的DNA片断。

该DNA片断，用T₄DNA连接酶***到在Eco RI-Pst I位点已被酶解的Ptrp 781中（核酸研究，Nucleic Acids    Research，11    3077（1983）〕，这样所得到的表达质粒PTE1，在启动子的下方具有一个转译起始密码子及一个人类IL-2基因（图10）。

PTF    1质粒用Stu    1限制性内切酶断开，並同Bam    HI连接子连接。这个质粒DNA用Bam    HI和Eco    RI限制性内切酶处理，随后***PTB281中。PTB281在Eco    RI-Bam    HI位点有λPL启动子。上述得到的表达质粒称为PTB285（图11）。

参考例5

用参考例4得到的PTB285质粒转化大肠杆菌N4830，依据Cohen等人的方法（参看上文）进行，将得到一个转化物（大肠杆菌N4830/PTB285），它携带该质粒。

例3

从参考例5中得到的大肠杆菌N4830/PTB285接种于50毫升液体培养基中（PH7.0）。此培养基含有1%细菌用胰蛋白胨（美国，Difco实验室）、0.5%氯化钠和7微克/毫升四环素，共装入250毫升锥形烧瓶中，上摇床，35℃过夜。然后将培养基移入5升的发酵瓶内，瓶内装入2.5升M9培养液。该培养液含有0.5%酪蛋白氨基酸，0.5%葡萄糖以及7微克/毫升四环素。将上述培养物放于35℃通风及摇动条件下孵育4小时，然后以42℃再培养3小时。最后，从2.5升液体培养基中离心收集细胞，置-80℃冰冻保存。

按照例1方法对上述细胞进行提取和纯化，将从上述的大肠杆菌N4830/PTB285细胞中得到具有同例1（Ⅴ）中一样性能的高纯度人IL-2蛋白质。

Claims (9)

1、一种生产基本上纯净的非糖基化的人类白细胞介素-2蛋白质的方法，所说的人类白细胞介素-2蛋白质的特异活性不低于10⁴单位/毫克，其特征在于，它包括培养一种带有一种DNA的转化物，该DNA带有一个编码人类白细胞介素-2的碱基序列，从而造成在生长的细胞中生产和积累人类白细胞介素-2，用一种蛋白质变性剂的溶液从该细胞中提取人类白细胞介素-2，将这样所获取的含有人类白细胞介素-2的液体通过一个包括疏水性柱层析的提纯过程而纯化。

2、一种根据权项1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：

X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln

Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn

Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met

Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu

Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro

Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe

His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val

Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met

Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe

Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser

Thr  Leu  Thr

其中的X是甲硫氨酸或是氢。

3、一种根据权项1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白质为冷冻干燥形式的。

4、一种根据权项1所述的方法，其特征在于，其中所述的人类白细胞介素-2是用一种浓度为2至8摩尔的胍盐酸溶提取的。

5、一种根据权项1所述的方法，其特征在于，其中所述的疏水性柱层析是一种使用反相柱的高效液相层析。

6、一种根据权项5所述的方法，其特征在于，在进行层析时，所用的洗脱液的PH值为1.5至8。

7、一种根据权项5所述的方法，其特征在于，在进行层析时，流速为0.1至100毫升/每分钟。

8、一种生产含有基本上纯净的非糖基化人类白细胞介素-2蛋白质的药用组合物的方法，所说的人类白细胞介素-2蛋白质的特异活性不低于10⁴单位/毫克，其特征在于，将所述的蛋白质与药理上相容载体，赋形剂或稀释剂等相互混合。

9、一种根据权项8所述的方法，其特征在于，所述的组合物是冷冻干燥形式的。

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