CN111676261A - 一种高纯度重组白介素-2的制备工艺 - Google Patents

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CN111676261A CN202010592543.2A CN202010592543A CN111676261A CN 111676261 A CN111676261 A CN 111676261A CN 202010592543 A CN202010592543 A CN 202010592543A CN 111676261 A CN111676261 A CN 111676261A
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朱文瑾
李浛民
陈平
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Abstract

本发明涉及一种高纯度重组白介素‑2的制备工艺，属于生物医药技术领域。本发明高纯度重组白介素‑2的制备工艺包括如下步骤：以大肠杆菌基因重组形成白介素‑2发酵液，从白介素‑2发酵液提取包涵体，将包涵体裂解，并进行复性处理，得到白介素‑2复性液；将白介素‑2复性液加入到疏水高效液相色谱柱进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为粗纯产物将粗纯产物加入到反相高效液相色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为精纯产物；将精纯产物加入到弱阴离子高效液色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为高纯度重组白介素‑2；本发明的方法制得高纯度重组白介素‑2回收率高、活性高、纯度高。

Description

一种高纯度重组白介素-2的制备工艺
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种高纯度重组白介素-2的制备工艺。
背景技术
IL-2主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞(特别是CD4+T细胞)产生，为一种糖蛋白，具有广泛生物活性，能使T细胞在试管内长期存活。随着研究的不断深入，尤其是1983年基因工程(重组)IL-2的问世，使得IL-2的研究取得了更大的进展。人们发现IL-2除了作用于T细胞外，还可作用于多种免疫效应细胞，包括B细胞，巨噬细胞，NK细胞。IL-2可刺激能产生抗体的B细胞增殖并能诱导产生新型的杀伤细胞即淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，故IL-2成为调控免疫应答的重要因子，具有抗病毒，抗肿瘤及改善和提高机体免疫功能的作用。可提高人体对病毒，细菌，原虫等感染的免疫应答，清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。还可以增进抗体和白介素-2的分泌，可刺激产生IFN-γ和TNF-α，β；促进Th的增殖和激活；活化中性粒细胞；刺激NK和肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)增殖。目前，IL-2已被应用于***，免疫缺陷和感染性疾病，并取得了显著的效果。
目前市售的lL-2主要以重组人白介素-2为主，以基因工程菌为基础，利用生物发酵法配合大规模的分离纯化技术，最终得到高纯度的重组人白介素-2蛋白质。由于重组蛋白质主要是经过发酵表达所得，发酵液中的成分往往很复杂，有活细胞、死细胞、细胞外产物、细胞内释放物、残余的底物等物质，因此要从如此复杂的环境中得到目的蛋白质，同时又要保持蛋白质的生物学活性，其分离纯化工作相对比较复杂。现有的分离纯化需要将包涵体溶解、复性，然后进行多步膜分离、层析，往往具有步骤繁杂、回收率相对较低等缺点。基因工程菌所表达的重组白介素-2通常以包涵体的形式存在，需要将其变性裂解、纯化再复性，在复性过程中二硫键易发生错配，导致白介素-2活性下降。变性裂解过程中往往需要使用变性剂，在后续工艺中如不去除，在产品进一步进行浓缩时，必然会影响产品活性。
且由于IL-2易被内毒素污染，限制了其治疗应用。内毒素又名脂多糖、类脂A、热源，是革兰氏阴性细菌(GNB)的细胞壁外壁层上的特有结构，其细胞壁外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成，当细菌死亡时溶解或用人工方法破坏菌细胞后会释放大量内毒素，一个大肠杆菌细胞内约含有200万个LPS分子。内毒素的热稳定性极高，在250℃干热下长达1h才会被分解。内毒素对pH值变化也不敏感，但高浓度的酸或碱可使之失活。内毒素分子由于具有磷酸基团而带负电荷，因此理论上可以用带正电荷的吸附剂来去除，如采用阴离子交换色谱来去除内毒素。然而，实际上这种结合效果不佳。其原因一方面是天然存在的内毒素分子上所携带的磷酸基团(负电荷)已经被阳电荷的离子(Ca2+，Mg2+，Na+，K+等)或多胺(尸胺、精胺、亚精胺、乙醇胺)等中和；另一方面，在自然界中内毒素并不以单一分子存在，而是以相对分子质量不等的集聚体存在，内毒素分子与本身所携带的负电荷参与了聚合体的形成，很少有游离的负电荷暴露在集聚体外表；再者，溶液中往往还存在有其他带负电荷的物质，导致内毒素难以完全分离，如二乙基胺乙基(DEAE)阴离子交换介质仅适于从碱性蛋白质中去除内毒素。因此，在溶液中去除内毒素污染或消除内毒素便成了生物研究中的一个难题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种回收率高、活性高、纯度高的高纯度重组白介素-2的制备工艺。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：
一种高纯度重组白介素-2的制备工艺，所述高纯度重组白介素-2的制备工艺包括如下步骤：
S1、制备白介素-2复性液：以大肠杆菌基因重组形成白介素-2发酵液，从白介素-2发酵液提取包涵体，将包涵体裂解，并进行复性处理，得到白介素-2复性液；
S2、粗纯处理：将白介素-2复性液加入到疏水高效液相色谱柱进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为粗纯产物；
S3、精纯处理：将粗纯产物加入到反相高效液相色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为精纯产物；
S4、终纯处理：将精纯产物加入到弱阴离子高效液色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为高纯度重组白介素-2。
本发明通过三步分离纯化处理，有效去除了重组白介素-2发酵液中的核酸、杂蛋白、内毒素等杂质，去除效率高，最终可获得高纯度的白介素-2产品。其中粗纯处理采用疏水高效液相色谱柱进行，可有效去除发酵液中的核酸等物质，精纯处理采用反相高效液相色谱柱进行，可有效去除其中的杂蛋白、IL-2聚合体及同分异构体等与IL-2极性有较小差异的杂质，终纯处理采用弱阴离子高效液色谱柱中进行，可有效去除内毒素，提高产品的使用安全性。
作为优选，步骤S1所述提取包涵体的方法为对重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用40～60mmol/L、PH8.5～9.0的PBS缓冲液进行洗涤；
所述包涵体裂解在裂解剂中进行，所述裂解剂包括以下组分：0.8～1.2wt％十二烷基硫酸钠(SDS)、8～13mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、40～60mmol/L PB缓冲液，所述PB缓冲液的PH为7.0～8.0；
所述复性处理的方法为：先采用0.8～1.2wt％十二烷基硫酸钠(SDS)将包涵体裂解液稀释至蛋白浓度不超过4mg/ml，然后加入复性剂搅拌稀释至包涵体裂解液中的蛋白浓度为0.1～0.2mg/ml，且SDS浓度至0.05～0.06wt％。
作为优选，所述包涵体裂解的时间为5～7h。
作为优选，所述复性剂为40～60mmol/L的PB缓冲液，PH为7.0～8.0。
采用大肠杆菌基因工程菌生产IL-2时，由于IL-2存在于大肠杆菌工程菌的细胞内层膜，且其疏水性很强，IL-2基因在工程菌大肠杆菌中表达时，因大肠杆菌为原核表达***，没有翻译后加工和修饰，IL-2在细胞内积累而形成不溶性的蛋白质聚合物，即包涵体，因此IL-2通常以包含体的形式存在于大肠杆菌工程菌细胞内。包涵体的外形为球形，为0.5～1μm的折光小体，包涵体中大部分(占50％以上)是克隆表达的产物，这些产物的一级结构是正确的，但没有经过正确折叠形成天然的高级结构，因此没有生物学活性。包涵体经过溶解复性才能得到具有生物学活性的蛋白。包涵体的相对硬度比较大，一般条件下不溶于水，在有如盐酸胍、尿素等较强的变性剂存在的条件下能够发生溶解，此时的蛋白质自身的高级结构被打开，以变性状态存在，这给IL-2的分离纯化带来了较大的困难。因此在进行分离纯化时，首先要破碎菌体，提取包涵体，然后进行复性和分离纯化。
本发明的裂解剂中SDS能够有效打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构，使多肽伸展，DTT作为还原剂可以打开包涵体蛋白质中所有二硫键，从而使包涵体充***解，形成多肽链。
SDS既是包涵体的裂解剂(即蛋白质的变性剂)也是IL-2的助溶剂，IL-2分子与SDS充分结合形成带负电荷的IL-2-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了IL-2分子原有的电荷量，消除了不同IL-2分子之间原有的电荷差异，从而增加了IL-2的溶解性。
本发明通过在复性处理过程中，先添加SDS对包涵体裂解液进行稀释到特定浓度(不超过4mg/ml)，从而在进一步添加复性剂时，将包涵体裂解液中的蛋白浓度和SDS浓度同时控制在特定范围内，以保证复性过程中IL-2不会聚合；如复性处理后包涵体裂解液中的蛋白浓度高于0.2mg/ml范围内，或SDS浓度低于0.05wt％时，均会导致IL-2复性过程中易聚合。
作为优选，步骤S2所述疏水高效液相色谱柱的填料以硅胶为基质，表面键合疏水性基团，所述疏水性基团为苯基基团。
作为优选，所述疏水高效液相色谱柱的柱尺寸为：直径40mm×L500mm。
作为优选，所述疏水高效液相色谱柱的填料的颗粒度为4～6μm。
本发明采用键合有苯基基团的硅胶基质色谱填料对重组白介素-2进行吸附，苯基基团疏水作用强，对重组白介素-2具有优异的吸附性能。本发明在粗纯步骤中，利用复性液中各组分的极性的不同，采用疏水高效液相色谱柱并优选键合有苯基基团的疏水填料对其进行有效分离，有效去除复性液中的大分子核酸物质等及影响下步分离的复性液中的缓冲盐类及SDS，从而获得具有较高浓度和较高纯度的重组白介素-2。
作为优选，步骤S2所述洗脱包括采用洗脱液Ⅰ进行第一次洗脱，然后采用洗脱液Ⅱ进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的流出液即为粗纯产物，所述洗脱液Ⅰ包括以下组分：8～12v％乙醇、1.8～2.2mo1/L脲素、0.07～0.13v％三氟乙酸(TFA)，所述洗脱液Ⅱ包括以下组分：30～50v％乙醇，0.07～0.13v％三氟乙酸(TFA)。
本发明采用两次洗脱的方式对吸附后有白介素-2的填料进行洗脱，其中第一次洗脱的洗脱液Ⅰ中添加有脲素，并匹配较低含量的乙醇，其目的是减弱SDS与填料的吸附作用，从而洗去吸附在填料上的SDS，并保留白介素-2，第一次洗脱的流出液经Lowry法检测，未检出蛋白含量，从而避免了残留在填料表面的SDS增加白介素-2在填料的保留强度，导致白介素-2的解离效果下降，进而降低白介素-2的回收率，同时去除了白介素-2中的SDS，避免了过高SDS浓度(超过0.1％)会影响白介素-2活性的稳定。
作为优选，步骤S3所述反相高效液相色谱柱的填料以硅胶为基质，表面键合C4基团。
本发明通过采用反相高效液相色谱柱、并优选表面键合C4基团的硅胶填料对粗纯处理后的白介素-2进行精纯处理，从而有去除了粗纯产物中的杂蛋白、IL-2聚合体及同分异构体等与IL-2极性有较小差异的杂质，进一步提高了白介素-2产物的纯度及单位质量内IL-2产品的比活性。
本发明的精纯处理采用表面键合有C4基团的硅胶填料，而不采用键合C8或C18的硅胶填料，是由于C4基团保留IL-2的强度较弱，使用较低溶度的有机溶剂洗脱液即可将IL-2从填料上洗脱，从而不会影响IL-2的活性；C8或C18则对IL-2保留过强，需要高浓度的有机溶剂洗脱液才能够将IL-2从填料上洗脱；而高浓度有机溶剂洗脱液会损害IL-2的活性，不利于IL-2的活性稳定。
本发明的粗纯产物中含有乙醇和TFA等组分，其pH值在2～3，在该pH范围内、且含有乙醇(乙醇可作为助溶剂)的情况下，IL-2可溶，因此可直接加入到反相高效液相色谱柱中进行精纯处理，以除去其中的杂蛋白、IL-2聚合体及同分异构体等杂质。
作为优选，所述反相高效液相色谱柱的柱尺寸为：直径40mm×L500mm。
作为优选，所述反相高效液相色谱柱的填料的颗粒度为4～6μm。
本发明通过将反相高效液相色谱柱的填料粒度限定在较小的范围内，提高了填料的表面面积，从而提升了截量。
作为优选，步骤S3所述洗脱包括采用A液进行初步洗脱，随后增加B液并逐渐提高B液用量/A液用量的比例进行梯度洗脱，所述A液为8～12v％乙醇和0.08～0.12v％三氟乙酸的混合，所述B液为40～60v％乙醇和0.08～0.12v％三氟乙酸的混合。
作为优选，步骤S3所述初步洗脱的时间为第0～60min梯度洗脱的时间为第60～180min，所述洗脱的流速均为25-35ml/min。
作为优选，步骤S4所述将精纯产物加入到弱阴离子高效液色谱柱中进行吸附和洗脱前还有在精纯产物中添加助溶剂十二烷基硫酸钠(SDS)、并调节PH至7.0～7.5，然后添加氯化钠的步骤。
作为优选，所述助溶剂十二烷基硫酸钠(SDS)的加入量为精纯产物的0.03～0.07wt％；所述氯化钠在精纯产物中的浓度为0.8～1.2mol/L。
作为优选，所述调节pH至7.0～7.5之后还有透析的步骤，所述透析液的组分及其含量为：8～12mmol/L、PH为7.0～7.5的Tris-HCl缓冲液，0.03～0.07wt％SDS。
在粗纯和精纯处理步骤中会引入了乙醇，如不去除会减弱弱阴离子高效液相色谱柱对IL-2和内毒素的吸附功能，因此本发明采用透析的方法将乙醇除去。
作为优选，步骤S4所述阴离子高效液相色谱柱采用DEAE阴离子交换填料。
本发明优选DEAE阴离子交换填料作为吸附填料，其在本发明的吸附环境条件下对IL-2和内毒素均有较好的吸附性能，并且在洗脱时采用不同的试剂能将IL-2和内毒素分别洗脱。
作为优选，步骤S4所述DEAE阴离子交换填料的粒度为4～6μm。
本发明通过将填料粒度限定在较小的范围内，提高了填料的表面面积，从而提升了对IL-2和内毒素的截量。
作为优选，步骤S4所述弱阴离子高效液相色谱柱的柱尺寸为直径40mm×L250mm。
作为优选，步骤S4所述洗脱包括采用平衡液对弱阴离子高效液相色谱柱进行第一次洗脱，所述平衡液中含有浓度为0.8～1.2mol/L的氯化钠，然后采用Tris-HCL缓冲液进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的流出液，即为高纯度重组白介素-2。
作为优选，所述平衡液包括的组分及其含量如下，
Tris-HCl缓冲液：8～12mmol/L，PH为7.0～7.5，
NaCl：0.8～1.2mol/L。
本发明通过采用DEAE阴离子交换填料同时吸附IL-2样品中的IL-2和内毒素，为了提高IL-2的溶解性，在IL-2样品中添加有助溶剂SDS，会附带有SDS，然后采用平衡液洗去SDS，再采用Tris缓冲液解离IL-2，从而将内毒素和IL-2分离开，获得具有低内毒素的IL-2产品。在获得具有低内毒素的IL-2产品后，对色谱柱进行再生处理，从而使得色谱柱可循环使用。
本发明的粗纯产物中含有乙醇和TFA等组分，其pH值在2-3，在该pH条件下，IL-2的处于等电点以下(IL-2的等电点约为6.5)，无法被DEAE阴离子交换填料吸附，因此需要先将粗纯产物的pH调节至中性偏碱性，使得内毒素和IL-2均能被DEAE阴离子交换填料吸附。
IL-2疏水性强，在中性或偏碱性水性溶液中会聚合沉淀，不易溶解，IL-2浓度越高越容易沉淀。本发明在重组白介素-2样品Ⅰ中添加SDS，IL-2分子与SDS充分结合形成带负电荷的IL-2-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过IL-2分子原有的电荷量，消除了不同IL-2分子之间原有的电荷差异，从而增加了IL-2在弱碱性条件下的溶解性，也增加了IL-2在阴离子填料上的吸附，同时也增加了在含NaCl条件下内毒素在阴离子填料的保留强度。如不添加SDS，本申请的IL-2难以溶解并进行下一步骤。
另外，本发明上样吸附前在重组白介素-2样品中加入0.8～1.2mol/L氯化钠，氯化钠是离子化合物，带正电荷的钠离子能有效减弱带负电荷的SDS与DEAE阴离子填料表面发生强吸附，避免SDS优先占用吸附面积，导致IL-2吸附量下降，同时避免了因SDS与填料吸附后累积解离后高浓度的SDS随IL-2一同洗脱出来，影响IL-2活性的稳定，同时也避免了SDS在填料的残留增加IL-2在填料的保留强度，从而影响IL-2的回收率。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过三步分离纯化处理，有效去除了重组白介素-2发酵液中的核酸、杂蛋白、内毒素等杂质，去除效率高，最终可获得高纯度的白介素-2产品；
(2)本发明通过采用疏水高效液相色谱柱粗纯处理进行，可有效去除重组白介素-2发酵液中的核酸等物质；
(3)本发明通过采用反相高效液相色谱柱精纯处理进行，可有效去除重组白介素-2发酵液中的杂蛋白、IL-2聚合体及同分异构体等与IL-2极性有较小差异的杂质；
(4)本发明通过采用弱阴离子高效液色谱柱进行终纯处理，可有效去除重组白介素-2发酵液中的内毒素，提高产品的使用安全性；
(5)本发明通过在粗纯和终纯处理中优选辅助试剂，有效去除了助溶剂的影响，保证了白介素-2的回收率。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
本实施例中高纯度重组白介素-2的制备如下：
(1)制备白介素-2复性液：以大肠杆菌基因重组形成白介素-2发酵液，对重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用5mmol/L、PH9.0的PBS缓冲液进行洗涤，获得包涵体；在洗涤好的包涵体中加入裂解剂(裂解剂的组分为：1.0wt％SDS，10mmol/L DTT，50mmol/L、PH7.5的PB缓冲液)，裂解处理6h，获得包涵体裂解液；然后采用1.0wt％SDS将包涵体裂解液稀释至蛋白浓度不超过3mg/ml，再加入50mmol/L、PH为7.5的PB缓冲液，搅拌稀释至包涵体裂解液中的蛋白浓度为0.2mg/ml，且SDS浓度至0.05wt％，得到白介素-2复性液。
(2)粗纯处理：将白介素-2复性液加入到疏水高效液相色谱柱进行吸附，疏水高效液相色谱柱采用颗粒度5μm、硅胶基质、表面键合苯基基团的填料，柱尺寸为直径40mm×L500mm；然后采用洗脱液Ⅰ进行第一次洗脱，洗脱液Ⅰ的组分为：10v％乙醇、2mo1/L脲素、0.1v％TFA，再采用洗脱液Ⅱ进行第二次洗脱，洗脱液Ⅱ的组分为：40％乙醇，0.1％TFA，收集第二次洗脱的流出液即为粗纯产物。
(3)精纯处理：将粗纯产物加入到反相高效液相色谱柱中进行吸附，反相高效液相色谱柱采用颗粒度5μm、硅胶基质、表面键合C4基团的填料，柱尺寸为直径40mm×L500mm；然后在第0～60min采用A液进行初步洗脱，随后在第60～180min增加B液并逐渐提高B液用量/A液用量的比例进行梯度洗脱，洗脱的流速均为25-35ml/min，A液组分为10v％乙醇、0.1v％TFA，B液组分为50v％乙醇、0.1v％TFA。
(4)终纯处理：在精纯产物中添加0.05wt％的助溶剂SDS、调节PH至7.5，并进行透析(透析液的组分为：10mmol/L、PH7.5的Tris-HCl缓冲液，0.05wt％SDS)；在获得的透析液中添加氯化钠至其浓度为1.0mol/L，然后加入到阴离子高效液相色谱柱中进行吸附，阴离子高效液相色谱柱采用粒度为5μm的DEAE阴离子交换填料，柱尺寸为直径40mm×L250mm；吸附后采用采用平衡液对阴离子高效液相色谱柱进行第一次洗脱，平衡液的组分为：PH7.5、10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，1.0mol/L NaCl；再采用PH7.5的Tris-HCL缓冲液进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的流出液，即为高纯度重组白介素-2。
实施例2
本实施例中高纯度重组白介素-2的制备如下：
(1)制备白介素-2复性液：以大肠杆菌基因重组形成白介素-2发酵液，对重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用40mmol/L、PH9.0的PBS缓冲液进行洗涤，获得包涵体；在洗涤好的包涵体中加入裂解剂(裂解剂的组分为，1.2wt％SDS，13mmol/L DTT，60mmol/L、PH8.0的PB缓冲液)，裂解处理5h，获得包涵体裂解液；然后采用1.2wt％SDS将包涵体裂解液稀释至蛋白浓度4mg/ml，再加入40mmol/L、PH为7.0-8.0的PB缓冲液，搅拌稀释至包涵体裂解液中的蛋白浓度为0.19mg/ml，且SDS浓度至0.05wt％，得到白介素-2复性液；
(2)粗纯处理：将白介素-2复性液加入到疏水高效液相色谱柱进行吸附，疏水高效液相色谱柱采用颗粒度5μm、硅胶基质、表面键合苯基基团的填料，柱尺寸为直径40mm×L500mm；然后采用洗脱液Ⅰ进行第一次洗脱，洗脱液Ⅰ的组分为：8v％乙醇、1.5mo1/L脲素、0.07v％TFA，再采用洗脱液Ⅱ进行第二次洗脱，洗脱液Ⅱ的组分为：30v％乙醇，0.07v％TFA，收集第二次洗脱的流出液即为粗纯产物。
(3)精纯处理：将粗纯产物加入到反相高效液相色谱柱中进行吸附，反相高效液相色谱柱采用颗粒度5μm、硅胶基质、表面键合C4基团的填料，柱尺寸为直径40mm×L500mm；然后在第0～60min采用A液进行初步洗脱，随后在第60～180min增加B液并逐渐提高B液用量/A液用量的比例进行梯度洗脱，洗脱的流速均为25-35ml/min，A液组分为8v％乙醇、0.12v％TFA，B液组分为40v％乙醇、0.12v％TFA。
(4)终纯处理：在精纯产物中添加0.07wt％的助溶剂SDS、并调节PH至7.3，并进行透析(透析液的组分为：12mmol/L、PH7.3的Tris-HCl缓冲液，0.07wt％SDS)；在获得的透析液中添加氯化钠至其浓度为1.2mol/L，然后加入到阴离子高效液相色谱柱中进行吸附，阴离子高效液相色谱柱采用粒度为5μm的DEAE阴离子交换填料，柱尺寸为直径40mm×L250mm；吸附后采用采用平衡液对阴离子高效液相色谱柱进行第一次洗脱，平衡液的组分为：PH7.3、12mmol/L的Tris-HCl缓冲液，1.2mol/L NaCl；再采用PH7.3的Tris-HCL缓冲液进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的流出液，即为高纯度重组白介素-2。
实施例3
本实施例中高纯度重组白介素-2的制备如下：
(1)制备白介素-2复性液：以大肠杆菌基因重组形成白介素-2发酵液，对重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用45mmol/L、PH8.5的PBS缓冲液进行洗涤，获得包涵体；在洗涤好的包涵体中加入裂解剂(裂解剂的组分为，1.1wt％SDS，12mmol/L DTT，55mmol/L、PH8.0的PB缓冲液)，裂解处理6h，获得包涵体裂解液；然后采用1.1wt％SDS将包涵体裂解液稀释至蛋白浓度3mg/ml，再加入55mmol/L、PH为8.0的PB缓冲液，搅拌稀释至包涵体裂解液中的蛋白浓度为0.18mg/ml，且SDS浓度至0.06wt％，得到白介素-2复性液；
(2)粗纯处理：将白介素-2复性液加入到疏水高效液相色谱柱进行吸附，疏水高效液相色谱柱采用颗粒度5μm、硅胶基质、表面键合苯基基团的填料，柱尺寸为直径40mm×L500mm；然后采用洗脱液Ⅰ进行第一次洗脱，洗脱液Ⅰ的组分为：9v％乙醇、2.2mo1/L脲素、0.11v％TFA，再采用洗脱液Ⅱ进行第二次洗脱，洗脱液Ⅱ的组分为：43v％乙醇，0.11v％TFA，收集第二次洗脱的流出液即为粗纯产物。
(3)精纯处理：将粗纯产物加入到反相高效液相色谱柱中进行吸附，反相高效液相色谱柱采用颗粒度5μm、硅胶基质、表面键合C4基团的填料，柱尺寸为直径40mm×L500mm；然后在第0～60min采用A液进行初步洗脱，随后在第60～180min增加B液并逐渐提高B液用量/A液用量的比例进行梯度洗脱，洗脱的流速均为25-35ml/min，A液组分为9v％乙醇、0.11v％TFA，B液组分为53v％乙醇、0.09v％TFA。
(4)终纯处理：在精纯产物中添加0.06wt％的助溶剂SDS、并调节PH至7.4，并进行透析(透析液的组分为：9mmol/L、PH7.4的Tris-HCl缓冲液，0.06wt％SDS)；在获得的透析液中添加氯化钠至其浓度为1.1mol/L，然后加入到阴离子高效液相色谱柱中进行吸附，阴离子高效液相色谱柱采用粒度为5μm的DEAE阴离子交换填料，柱尺寸为直径40mm×L250mm；吸附后采用采用平衡液对阴离子高效液相色谱柱进行第一次洗脱，平衡液的组分为：PH7.4、9mmol/L的Tris-HCl缓冲液，1.1mol/L NaCl；再采用PH7.4的Tris-HCL缓冲液进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的流出液，即为高纯度重组白介素-2。
实施例4
本实施例中高纯度重组白介素-2的制备如下：
(1)制备白介素-2复性液：以大肠杆菌基因重组形成白介素-2发酵液，对重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用60mmol/L、PH9.0的PBS缓冲液进行洗涤，获得包涵体；在洗涤好的包涵体中加入裂解剂(裂解剂的组分为，0.8wt％SDS，8mmol/L DTT，40mmol/L、PH7.5的PB缓冲液)，裂解处理7h，获得包涵体裂解液；然后采用0.8wt％SDS将包涵体裂解液稀释至蛋白浓度2mg/ml，然后加入60mmol/L、PH为7.5的PB缓冲液，搅拌稀释至包涵体裂解液中的蛋白浓度为0.15mg/ml，且SDS浓度至0.05wt％，得到白介素-2复性液；
(2)粗纯处理：将白介素-2复性液加入到疏水高效液相色谱柱进行吸附，疏水高效液相色谱柱采用颗粒度5μm、硅胶基质、表面键合苯基基团的填料，柱尺寸为直径40mm×L500mm；然后采用洗脱液Ⅰ进行第一次洗脱，洗脱液Ⅰ的组分为：12v％乙醇、2.5mo1/L脲素、0.13v％TFA，再采用洗脱液Ⅱ进行第二次洗脱，洗脱液Ⅱ的组分为：50v％乙醇，0.13v％TFA，收集第二次洗脱的流出液即为粗纯产物。
(3)精纯处理：将粗纯产物加入到反相高效液相色谱柱中进行吸附，反相高效液相色谱柱采用颗粒度5μm、硅胶基质、表面键合C4基团的填料，柱尺寸为直径40mm×L500mm；然后在第0～60min采用A液进行初步洗脱，随后在第60～180min增加B液并逐渐提高B液用量/A液用量的比例进行梯度洗脱，洗脱的流速均为25-35ml/min，A液组分为12v％乙醇、0.08v％TFA，B液组分为60v％乙醇、0.08v％TFA。
(4)终纯处理：在精纯产物中添加0.03wt％的助溶剂SDS、并调节PH至7.5，并进行透析(透析液的组分为：8mmol/L、PH7.5的Tris-HCl缓冲液，0.03wt％SDS)；在获得的透析液中添加氯化钠至其浓度为0.8mol/L，然后加入到阴离子高效液相色谱柱中进行吸附，阴离子高效液相色谱柱采用粒度为5μm的DEAE阴离子交换填料，柱尺寸为直径40mm×L250mm；吸附后采用采用平衡液对阴离子高效液相色谱柱进行第一次洗脱，平衡液的组分为：PH7.5、8mmol/L的Tris-HCl缓冲液，0.8mol/L NaCl；再采用PH7.5的Tris-HCL缓冲液进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的流出液，即为高纯度重组白介素-2。
对比例1
采用键合有丁基基团的硅胶填料进行粗纯处理，填料量及柱子大小增加50％，其他与实施例1相同。
对比例2
粗纯处理中第一次洗脱不添加脲素，其他与实施例1相同。
对比例3
采用键合C8基团的硅胶填料进行精纯处理，其他与实施例1相同。
对比例4
采用键合C18基团的硅胶填料进行精纯处理，其他与实施例1相同。
对比例5
终纯处理中精纯产物中不加氯化钠，直接通过弱阴离子高效液相色谱柱进行吸附，其他与实施例1相同。
对比例6
终纯处理中精纯产物中加氯化钠至其浓度为0.7mol/L，其他与实施例1相同。
对比例7
采用凝胶渗透法去除重组白介素-2样品Ⅰ中的内毒素，具体为将重组白介素-2样品Ⅰ加入到凝胶S200柱中进行分离，柱尺寸为直径50mm×L1200mm，进样体积50ml，进样量不大于200mg，流动相为10％乙腈+0.01％TFA，分离流速为120ml/hr。
将本发明实施例1～4、对比例1～2中制得的粗纯产物的特征进行比较，比较结果如表1所示。其中比活采用CTLL-2依赖细胞株/MTT比色法进行测定，蛋白含量采用Lowry微量法进行测定，蛋白回收率＝粗纯产物的总蛋白含量/复性液中总蛋白含量×100％，粗纯产物中白介素-2纯度的测定采用SDS-PAGE电泳法进行。
表1：实施例1～4、对比例1～2中粗纯产物特征的比较
Figure BDA0002556219550000161
由对比例1和实施例1比较可知采用其它疏水基团对白介素-2进行吸附，在填料量增加50％的情况下，才能将与实施例1相同的复性液蛋白量吸附完全，使白介素-2的回收率不至明显降低，明显增加了成本，表明本发明使用的键合苯基基团的硅胶填料对白介素-2有明显优异的吸附性能。
由对比例2和实施例l的比较可知，第一次洗脱不添加脲素，粗纯产物中白介素-2的回收率有明显下降，这是因为残留在填料表面的SDS增加了白介素-2在填料的保留强度，在不增加洗脱液Ⅱ中溶剂浓度的情况下，解离效果会下降，从而降低白介素-2的回收率。
精纯处理采用对比例3的C8硅胶填料或对比例4的C18硅胶填料，采用与实施例1相同浓度的A液和B液难以将白介素-2洗脱下来，流出液中仅能检测出微量蛋白。
将本发明实施例1～4、对比例5～7中制得的高纯度重组白介素-2样品的特征进行比较，比较结果如表2所示。其中内毒素含量采用鲎试剂进行检测，实施例1～4、对比例5～7中的高纯度重组白介素-2样品内毒含量结果为100万IU重组白介素-2中内毒素含量，对比例7中的内毒素含量为10万IU重组白介素-2中内毒素含量，回收率＝进样总蛋白量/高纯度重组白介素-2中总蛋白量×100％，纯度采用SDS-PAGE电泳和HpLC-C18两种方法进行检测。
表2：实施例1～4、对比例5～7中高纯度重组白介素-2特征的比较
Figure BDA0002556219550000171
由表2可知，本发明制得的去除内毒素的重组白介素-2样品，检测结果显示制得的100万IU重组白介素-2中的内毒素含量小于0.25EU，优于国家标准要求的分装剂量内毒素小于10EU/ml，且优于其他方法，如对比例1中采用凝胶渗透法，其内毒素去除效果最高只能达到10万IU小于鲎试剂0.25EU，且离速度慢，进样量受限，最大5mg/ml的白介素-2浓度只能上柱体积的2-5％。同时，本申请的方法具有较高的白介素-2回收率，可大于95％。本发明通过三步纯化工艺最终获得了高质量的白介素-2产品，其各质量指标优于国家标准，SDS-PAGE电泳检测和HpLC-C18检测纯度可达98％以上。
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种高纯度重组白介素-2的制备工艺，其特征在于，所述高纯度重组白介素-2的制备工艺包括如下步骤：
S1、制备白介素-2复性液：以大肠杆菌基因重组形成白介素-2发酵液，从白介素-2发酵液提取包涵体，将包涵体裂解，并进行复性处理，得到白介素-2复性液；
S2、粗纯处理：将白介素-2复性液加入到疏水高效液相色谱柱进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为粗纯产物；
S3、精纯处理：将粗纯产物加入到反相高效液相色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为精纯产物；
S4、终纯处理：将精纯产物加入到弱阴离子高效液色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为高纯度重组白介素-2。
2.根据权利要求1所述的高纯度重组白介素-2的制备工艺，其特征在于，步骤S1所述提取包涵体的方法为对重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用40～60mmol/L、PH8.5～9.0的PBS缓冲液进行洗涤；
所述包涵体裂解在裂解剂中进行，所述裂解剂包括以下组分：0.8～1.2wt％十二烷基硫酸钠(SDS)、8～13mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、40～60mmol/L PB缓冲液，所述PB缓冲液的PH为7.0～8.0；
所述复性处理的方法为：先采用0.8～1.2wt％十二烷基硫酸钠(SDS)将包涵体裂解液稀释至蛋白浓度不超过4mg/ml，然后加入复性剂搅拌稀释至包涵体裂解液中的蛋白浓度为0.1～0.2mg/ml，且十二烷基硫酸钠(SDS)浓度至0.05～0.06wt％。
3.根据权利要求1所述的高纯度重组白介素-2的制备工艺，其特征在于，步骤S2所述疏水高效液相色谱柱的填料以硅胶为基质，表面键合疏水性基团，所述疏水性基团为苯基基团。
4.根据权利要求1所述的高纯度重组白介素-2的制备工艺，其特征在于，步骤S2所述洗脱包括采用洗脱液Ⅰ进行第一次洗脱，然后采用洗脱液Ⅱ进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的流出液即为粗纯产物，所述洗脱液Ⅰ包括以下组分：8～12v％乙醇、1.8～2.2mo1/L脲素、0.07～0.13v％三氟乙酸(TFA)，所述洗脱液Ⅱ包括以下组分：30～50v％乙醇，0.07～0.13v％三氟乙酸(TFA)。
5.根据权利要求1所述的高纯度重组白介素-2的制备工艺，其特征在于，步骤S3所述反相高效液相色谱柱的填料以硅胶为基质，表面键合C4基团。
6.根据权利要求1所述的高纯度重组白介素-2的制备工艺，其特征在于，步骤S3所述洗脱包括采用A液进行初步洗脱，随后增加B液并逐渐提高B液用量/A液用量的比例进行梯度洗脱，所述A液为8～12v％乙醇和0.08～0.12v％三氟乙酸的混合，所述B液为40～60v％乙醇和0.08～0.12v％三氟乙酸的混合。
7.根据权利要求1所述的高纯度重组白介素-2的制备工艺，其特征在于，步骤S4所述将精纯产物加入到弱阴离子高效液色谱柱中进行吸附和洗脱前还有在精纯产物中添加助溶剂十二烷基硫酸钠(SDS)、并调节PH至7.0～7.5，然后添加氯化钠的步骤。
8.根据权利要求1所述的高纯度重组白介素-2的制备工艺，其特征在于，步骤S4所述阴离子高效液相色谱柱采用DEAE阴离子交换填料。
9.根据权利要求8所述的高纯度重组白介素-2的制备工艺，其特征在于，步骤S4所述洗脱包括采用平衡液对弱阴离子高效液相色谱柱进行第一次洗脱，所述平衡液中含有浓度为0.8～1.2mol/L的氯化钠，然后采用Tris-HCL缓冲液进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的流出液，即为高纯度重组白介素-2。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112250753A (zh) * 2020-10-28 2021-01-22 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 一种游离吸附浓缩重组表皮生长因子的方法
CN118001176A (zh) * 2024-04-09 2024-05-10 山东泉港药业有限公司 重组人白介素2（i）的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4569790A (en) * 1984-03-28 1986-02-11 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions
CN85101341A (zh) * 1983-11-28 1987-01-31 武田药品工业株式会社 高纯度蛋白质的制备及其应用
US5162507A (en) * 1987-05-11 1992-11-10 Cetus Corporation Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms
CN1098109A (zh) * 1993-07-28 1995-02-01 军事医学科学院基础医学研究所 高级结构纯人重组白细胞介素-2的精制工艺
CN1228475A (zh) * 1998-03-06 1999-09-15 上海华晨生物技术研究所 新型重组人白细胞介素2的制备方法及其表达载体和工程菌
CN104292325A (zh) * 2014-07-28 2015-01-21 哈德逊（天津）生物技术有限责任公司 一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的方法及试剂
CN109721652A (zh) * 2019-01-24 2019-05-07 江苏金丝利药业股份有限公司 一种提高重组人白介素-2（rhIL-2）产率的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN85101341A (zh) * 1983-11-28 1987-01-31 武田药品工业株式会社 高纯度蛋白质的制备及其应用
US4569790A (en) * 1984-03-28 1986-02-11 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions
US5162507A (en) * 1987-05-11 1992-11-10 Cetus Corporation Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms
CN1098109A (zh) * 1993-07-28 1995-02-01 军事医学科学院基础医学研究所 高级结构纯人重组白细胞介素-2的精制工艺
CN1228475A (zh) * 1998-03-06 1999-09-15 上海华晨生物技术研究所 新型重组人白细胞介素2的制备方法及其表达载体和工程菌
CN104292325A (zh) * 2014-07-28 2015-01-21 哈德逊（天津）生物技术有限责任公司 一种从包涵体中制备可溶性白介素重组蛋白的方法及试剂
CN109721652A (zh) * 2019-01-24 2019-05-07 江苏金丝利药业股份有限公司 一种提高重组人白介素-2（rhIL-2）产率的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
余兰兰等: "《现代生化分离技术及应用研究》", 31 December 2011, 吉林大学出版社 *
汪世龙等: "《蛋白质化学》", 31 August 2012, 同济大学出版社 *
熊振平等: "《酶工程》", 30 September 1989, 化学工业出版社 *
王睿: "《免疫学实验技术原理与应用》", 31 March 2019, 北京理工大学出版社 *
程牛亮等: "重组人白细胞介素-2的纯化研究", 《山西医学院学报》 *
虞冠华等: "大肠杆菌表达的重组白细胞介素-2的初步纯化", 《生物化学杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112250753A (zh) * 2020-10-28 2021-01-22 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 一种游离吸附浓缩重组表皮生长因子的方法
CN118001176A (zh) * 2024-04-09 2024-05-10 山东泉港药业有限公司 重组人白介素2（i）的应用

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