CN85100412A - 用嗜热放线菌生产固定化葡萄糖异构酶的方法及其用于高果糖浆的生产方法 - Google Patents

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Abstract

用嗜热放线菌生产固定化葡萄糖异构酶的方法 及其用于高果糖浆的生产方法是一种制酶及酶法制 糖方法。该菌发酵条件粗放，较高温不易污染，酶活 350单位/毫升，胞外酶占总酶90％。用离子交换树脂 挂酶，酶活8,000～10,000单位/克(干)，总酶回收率 65～70％，用酶法葡萄糖制得42％高果糖浆转化比 为1∶3000。

Description

本发明是关于葡萄糖异构酶生产方法，特别是关于固定化葡萄糖异构酶的生产方法及其用于生产高果糖浆的方法。
酶法是使葡萄糖转化为果糖的重要方法。以前国内曾采用过液酶进行转化，但是其产品质量差、成本高，无法进行工业化生产。目前国内外普遍采用的是固定化酶进行异构化转化，也就是使酶附着在一个不溶于水的固相载体上，形成固相酶，然后进行异构化转化。《特许公报》昭49-42555及50-17560介绍了一种先用嗜热链霉菌Streptomyces    YT-№6生产葡萄糖异构酶，然后将培养液过滤，离心分离后收集到的菌体进行自溶等处理，得到酶液，再使酶挂到载体上进行异构化的方法。该方法由于产生的酶多是胞内酶，因此需要一套破坏细胞壁释出酶的工艺及设备，并且此方法转化比较低，1∶2000左右，因此其工艺较复杂，设备要求低，产率也较低。
本发明的目的是改进固定化葡萄糖异构酶的生产方法及其用于生产高果糖浆的方法，简化工艺，减少设备，增加产率。
本发明的方法为：采用嗜热放线菌Streptomyces    M    1033（其寄存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心寄存号为CGMCC№.0032）生产葡萄糖异构酶，此酶中胞外酶占总酶量的90%。
甲、所说明菌其培养特征为：
（1）察氏培养基：生长良好，气丝从乳白色到深灰色，基丝由白到黄褐色不形成可溶性色素。
（2）淀粉琼脂：生长良好，气丝由白色到灰色，基丝由乳白色到浅黄色不形成可溶性色素。
（3）马铃薯浸汁：生长良好，气丝由白色到灰褐色，基丝由金黄色到浅褐色，不形成可溶性色素。
（4）马铃薯块：生长一般，气丝由白到浅灰色。
（5）葡糖天冬素琼脂：生长良好，气丝由白色到灰色，基丝由乳白色到浅黄色，不形成可溶性色素。
（6）葡糖旦白胨琼脂：生长良好，气丝由白到浅灰色，基内菌丝由白色到浅褐色，不形成可溶性色素。
乙、所说明菌的形态特征为：
45～50℃在高氏1号培养基上，生长良好，培养3天，气丝由白色到灰色，培养3～5天，产生灰色胞子。菌落为园形，似伞状，表面呈粉状，胞子丝形状为：弯曲至形成螺旋。胞子形状为：园形、椭园形。
丙、所说明菌的生理生化特征为：
（1）明胶培养基：生长一般，液化明胶能力较弱。
（2）牛奶培养基：生长一般，对牛奶的凝固胨化能力较差。
（3）淀粉水解琼脂：生长良好，能利用淀粉，气生菌丝从白到灰白色，无可溶性色素形成。
（4）酪氨酸琼脂：生长困难，少数菌落，气丝由白到灰褐色，不形成可溶性色素，酪氨酸酶为阴性。
（5）碳源利用：能够很好地利用淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、甘露醇、肌醇。很难利用棉子糖。
均-态葡萄糖异构酶的某些性质：清发酵液经（NH4）2SO4淀沉透析脱盐，DEAE-Sephadex A50柱和Sephadex G150柱提纯，得均-态葡萄糖异构酶，园盘电泳为一个区带。
酶蛋白组成为：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸等。比酶活为180.86单位/mg米氏常数Km为0.56M。此酶不但能将D-葡糖和D-果糖相互可逆转化，也可将D-木糖和D-木酮糖，D-核糖和D-核酮糖相互可逆转化。
所说的菌首先在含有淀粉1～3%，KNO30.05～0.4%，MgSO40.01～0.1%，NaCl0.01～0.1%，K2HPO40.01～0.01%，FeSO40.001～0.005%的培养基上高温35℃～55℃（范围比实施例大一些）培养，其次再把上面得到的菌放入含麸夫3～8%，豆饼0.5～2%，MgSO40.05～0.2%，K2HPO40.05～0.2%，CoCl20.005～0.05%的培养基上通气1∶0.1～1∶0.5高温35～50℃培养种子。第三，把种子放入发酵罐内，用含有麸皮3～8%，豆饼0.5～2%，MgSO40.05～0.2%，K2HPO40.05～0.2%，CoCl20.005～0.05%的培养基上通气1∶0.1～1∶1高温35～50℃发酵。第四步把前一步得到的发酵液过滤，得到清发酵液。第五步使清发酵液中的酶固定在载体上，特别是采用大孔强碱性苯乙烯系季胺基阴离子交换树脂为载体吸附清发酵液中的酶，则得到了固定化葡萄糖异构酶。
使用所说的固定化酶接触葡萄糖，则其部分被转化为果糖。
本发明的优点是不用进行胞内酶释出处理等工序，因此简化了工艺，减少了设备，并且转化比高。
说明书附图是本发明方法的具体工艺流程方框图。
异构酶菌经育种、发酵、压滤、挂酶后即得到固定化异构酶。然后把固相酶装入柱状转化器，使葡萄糖通过转化柱进入收集罐，载体树脂经一段时间使用后，还可再生，重新挂酶使用。
下面的例子用于说明本发明，是本发明的最佳实施例，其工艺流程请参看附图。
第一步：用所说的异构酶菌在斜面培养基上培养。培养基成分为：淀粉2%、硝酸钾0.1%，硫酸镁0.05%，氯化钠0.05%，磷酸氢二钾0.05%，硫酸亚铁0.001%，温度45～50℃，培养5～7天。
第二步：把所说的异构酶菌放入种子罐中，在培养基上育种。培养基的成分为麸皮4%，豆饼1%，硫酸镁0.1%，磷酸氢二钾0.1%，氯化钴0.024%，温度40～42℃，通气量1∶0.2～0.4，时间18小时。
第三步：把种子放入发酵罐，用上一步同样的培养基及条件发酵65小时，所得发酵液的酶活为350单位/毫升。
第四步：把上一步所得发酵液不加助滤剂在40m2板框过滤机上过滤，每1m3发酵液过滤2～6小时，得清发酵液，其酶活占总酶活的90%。
第五步：用大孔强碱性苯乙烯系季胺基阴离子交换树脂直接吸附清滤液中的异构酶，形成固定化葡萄糖异构酶。
由此所得的异构酶，其酶活可达8，000～10，000单位/g（干），总酶的回收率可达65～70%。
用此固相酶装入指定管内形成柱状转化器，再在基质酶法葡萄糖液DE95%以上，电阻率5，000～50，000Ωcm，浓度30～50%，温度55～65℃的条件下，使此葡萄糖溶液通过转化器，则有42%的葡萄糖转化为果糖，酶的转化比为1∶3，000再经离子交换和真空浓缩后可得71%的干物质。
补正    85100412
文件名称    页    行    补正前    补正后
说明书    1    7    …昭49-42555    …昭49-42555
及50-17560…    及昭50-17560…
1    倒7    设备要求低，产率也较    设备要求多，产率也较
低。    低。

Claims (3)

1、用嗜热放线菌生产固定化葡萄糖异构酶的方法：
第一步：把嗜热放线菌放在含有淀粉、硝酸钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸亚铁的培养基上高温培养。
第二步：把前一步得到的嗜热放线菌放在含有麸皮、豆饼、硫酸镁、磷酸氢二钾、氯化钴的培养基上通气高温培养种子。
第三步：把种子放入发酵罐内，用含有麸皮、豆饼、硫酸镁、磷酸氢二钾、氯化钴的培养基上通气高温发酵。
第四步：把前一步得到的发酵液过滤，得清发酵液。
第五步：使清发酵液中的酶固定在载体上。
其特征在于所说的嗜热放线菌是寄存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心寄存号为CGMCC№·0032的嗜热放线菌StreptomycesM1033。
甲、所说明菌其培养特征为：
(1)察氏培养基：生长良好，气丝从乳白色到深灰色，基丝由白到黄褐色，不形成可溶性色素。
(2)淀粉琼脂：生长良好，气丝由白色到灰色，基丝由乳白色到浅黄色，不形成可溶性色素。
(3)马铃薯浸汁：生长良好，气丝由白色到灰褐色，基丝由金黄色到浅褐色，不形成可溶性色素。
(4)马铃薯块：生长一般，气丝由白到浅灰色。
(5)葡糖天冬素琼脂：生长良好，气丝由白色到灰色，基丝由乳白色到黄色，不形成可溶性色素。
(6)葡糖蛋白胨琼脂：生长良好，气丝白到浅灰色，基内菌丝由白色到浅褐色，不形成可溶性色素。
乙、所说明菌的形态特征为：
45°～50℃在高氏1号培养基上生长良好，培养3天，气丝由白色到灰色，培养3～5天，产生灰色胞子。菌落为园形，似伞状，表面呈粉状，胞子丝形状为：弯曲至形成螺旋，胞子形状为：园形、椭园形。
丙、所说明菌的生理生化特征为：
(1)明胶培养基：生长一般，液化明胶能力较弱。
(2)牛奶培养基：生长一般，对牛奶的凝固胨化能力较差。
(3)淀粉水解琼脂：生长良好，能利用淀粉，气生菌丝从白到灰白色，无可溶性色素形成。
(4)酪氨酸琼脂：生长困难，少数菌落，气丝由白到灰褐色，不形成可溶性色素，酪氨酸酶为阴性。
(5)碳源利用：能够很好地利用淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、甘露糖、肌糖。很难利用棉子糖。
均一态葡萄糖异构酶的某些性质：清发酵液经(NH4)2SO4沉淀透析脱盐，DEAE-Sephadex A50柱和Sephadex G150柱提纯，得均一态葡萄糖异构糖，园盘电泳为一个区带。
酶蛋白组成为：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸等。比酶活为180·86单位/mg，米氏常数Km为0·56M。此酶不但能将D-葡糖和D-果糖相互可逆转化，也可将D-木糖和D-木酮糖，D-核糖和D-核酮糖相互可逆转化。
2、按照权利要求1所说的方法其特征在于以大孔强碱性苯乙烯系季胺基阴离子交换树脂为载体，吸附清发酵液中的酶，形成固定化葡萄糖异构酶。
3、按照权利要求1和2所说的方法，其特征在于所生产出的固定化葡萄糖异构酶生产高果糖糖浆的方法。
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