CN207445274U - 一种人工肝反应器及循环灌注式生物人工肝支持*** - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种人工肝反应器，其包括一输入总管；一输出总管；以及一个或者多个并联或串联的细胞培养瓶，所述细胞培养瓶连接在所述输入总管和所述输出总管之间，各个所述细胞培养瓶底部两侧分别配设有输入管和输出管，各所述输入管上分别设有蠕动泵；所述细胞培养瓶内设有隔离网，所述隔离网与所述细胞培养瓶底部之间装填有具有吸附功能的填充物，所述隔离网上面装载有片状载体，所述片状载体上贴附有肝细胞。所述蠕动泵和所述片状载体的设置可有效提高所述人工肝反应器的细胞载量、有效交换面积以及代谢交换效率。本实用新型还公开了一种包括所述的人工肝反应器的循环灌注式生物人工肝支持***。
Description
技术领域
本实用新型属于生物医学技术领域，具体涉及一种液气交互式生物人工肝反应器，还涉及含有所述人工肝反应器的循环灌注式生物人工肝支持***。
背景技术
肝脏是机体最重要的生命器官之一，具有复杂的结构和多种生理功能。然而肝功能衰竭严重影响着人们的健康。肝脏移植是从根本上治疗终末期肝病与肝功能衰竭的较好方法，但是由于受到供体肝脏匮乏、异种移植失败、费用高昂和需要长期使用免疫抑制剂等限制，仍有相当大一部分的患者不能进行肝脏移植。因此，肝脏疾病治疗急需寻求新的方法。对生物人工肝的研究是近年来有关肝功能衰竭治疗方式的热门课题，为肝病的治疗带来了新的希望，而生物人工肝***对肝功能衰竭治疗效果最有影响的关键部分是其中的生物反应器。
生物人工肝是利用生物反应器中肝细胞的部分功能，在对肝衰竭患者血浆中的毒性物质进行生物转化的同时，将多种生物活性物质分泌释放入患者的血液中，以改善维持患者内稳态的平衡。
理论上，生物反应器的理想要求是：能容纳承载足够的肝细胞、肝细胞与反应器内的液体有充分相互接触和物质交换的时间、肝细胞在反应器内部分布均匀、生物相容性与安全性好、并且能够保障肝细胞的存活及功能。
目前研究及应用于生物人工肝***的生物反应器主要由以下4种：中空纤维生物反应器、平板单层生物反应器、灌注床或支架生物反应器和包被悬浮生物反应器。然而以上几种生物反应器在生物人工肝***中的运用都存在着一定的缺陷。例如细胞载量少、有效交换面积小、细胞分布不均、代谢交换效率低下等问题。
实用新型内容
因此，针对现有技术中生物反应器的细胞载量少、有效交换面积小、细胞分布不均、代谢交换效率低下等技术问题，本实用新型的目的是提供一种细胞载量高、有效交换面积大、细胞分布均匀、代谢交换效率高的人工肝反应器。
本实用新型的人工肝反应器包括：
一输入总管，用于与上游的培养基或血浆管道连接；
一输出总管，用于与下游的回收管道或血浆管道连接；以及
一个或者多个并联或串联的细胞培养瓶，所述细胞培养瓶连接在所述输入总管和所述输出总管之间，各个所述细胞培养瓶底部两侧分别配设有输入管和输出管，所述输入管和所述输出管用于连接所述输入总管、各个所述细胞培养瓶和所述输出总管，各所述输入管上分别设有蠕动泵；所述细胞培养瓶内设有隔离网，所述隔离网与所述细胞培养瓶底部之间装填有具有吸附功能的填充物，所述隔离网上面装载有片状载体，所述片状载体上贴附有肝细胞。
所述细胞培养瓶只有一个时，所述输入管与所述输入总管接通，所述输出管与所述输出总管接通。所述细胞培养瓶为并联的多个时，各所述输入管分别与所述输入总管接通，各所述输出管分别与所述输出总管接通。所述细胞培养瓶为串联的多个时，最上游的细胞培养瓶的输入管与所述输入总管接通，相邻上游的细胞培养瓶的输出管与下游的细胞培养瓶的输入管接通，最下游的细胞培养瓶的输出管与所述输出总管接通。
本实用新型的一些较佳实施例中，所述细胞培养瓶数量为2～4个且并联连接，各所述输入管汇集与所述输入总管接通，各所述输出管汇集与所述输出总管接通，各所述输入管上和/或所述输出总管上设有流量控制阀；各所述蠕动泵和所述流量控制阀由一个集成电路控制器连接分别控制。
所述输入管上设置蠕动泵和流量控制阀，所述输出总管上设置流量控制阀，可控制整个人工肝反应器形成灌流式***，而通过集成电路控制器进行调节，可实现细胞培养瓶中液体上下连续或间歇缓慢升降，使细胞培养瓶中的液体和气体交替与所述片状载体和肝细胞充分接触。
较佳的，所述片状载体为由聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET，化学式为COC6H4COOCH2CH2O)亲水纤维交织形成的平面结构或对开夹角的“V”型结构，所述片状载体表面和内部具有空隙，所述片状载体厚度为0.1～0.5mm，所述片状载体长和宽为 3～10mm。
较佳的，所述细胞培养瓶的瓶盖设有0.1～0.3微米的空气过滤器，优选0.22微米的高效空气过滤器(HEPA)；所述细胞培养瓶与所述输入管和所述输出管连接处设有0.1～0.3 微米优选0.22微米的滤膜。
较佳的，所述细胞培养瓶的瓶盖上或所述细胞培养瓶侧壁上设有一个采样端口。
较佳的，所述片状载体上的细胞量为1×108～1×109个肝细胞/1g片状载体。
较佳的，所述细胞培养瓶工作体积为0.5～10L，每个所述细胞培养瓶的片状载体装载量为5～100g。
所述的人工肝反应器的可由一下步骤制备：
(a)肝细胞接种，将片状载体浸泡在pH7.4的PBS溶液中进行水化24～72h，然后将水化后的片状载体在10～200μg/mL的胶原蛋白中室温包被30min～2h，吸去多余液体，用PBS或无血清培养基清洗3～4次，然后与肝细胞和培养基混合，混合比例为在106～108个肝细胞/1g片状载体/100mL培养基的比例上，摇动培养30min～2h使肝细胞贴附在片状载体上完成接种；
(b)液气交互式培养，将步骤(a)接种后的片状载体和培养基加入组装好的人工肝反应器的各个细胞培养瓶中，封好瓶盖并将输入总管入口和输出总管出口密封，打开集成电路控制器，使蠕动泵带动培养基进行上下缓慢升降运动，在37℃，5％CO2环境中进行培养，通过检测片状载体上的细胞量，待细胞量达到108-109个肝细胞/1g片状载体时即制备成人工肝反应器。
较佳的，步骤(a)中，肝细胞、片状载体和培养基混合比例为107～108个肝细胞/1g片状载体/100mL培养基。
本实用新型的另一目的在于提供一种循环灌注式生物人工肝支持***，其包括所述的人工肝反应器，还包括分别与所述人工肝反应器联通的血细胞-血浆分离器、血浆透析器、气体输入器、调节液输入器、恒温加热器，以及控制该***各部分的中心控制器。其中血细胞-血浆分离器、血浆透析器、气体输入器、调节液输入器、恒温加热器均为现有生物人工肝***常用的设备。
所述的气体输入器包括氧气输入装置、二氧化碳输入装置和空气输入装置。
所述的中心控制器包括蠕动泵控制模块、流量控制模块、气体输入控制模块、调节液输入控制模块、恒温控制模块和检测模块。其中，蠕动泵控制模块用于通过集成电路控制器控制蠕动泵的工作，流量控制模块用于通过集成电路控制器控制流量控制阀的工作，气体输入控制模块用于控制气体输入器的工作，调节液输入控制模块用于控制调节液输入器的工作，恒温控制模块用于控制恒温加热器的工作，检测模块用于监测***状态并将检测信号反馈其他控制模块。
所述循环灌注式生物人工肝支持***的工作原理是，患者的动脉血由血液入口进入血细胞-血浆分离器，在内部中空纤维的半透膜作用下，血浆从血液中分离出来建立血浆循环。血细胞被浓缩，形成浓缩血细胞，最后在血液出口处血浆循环和浓缩血细胞汇合，重新形成血液回输人体。在上述循环中，有毒物质会被半透膜透析到血浆中，而所述人工肝反应器正好接入血浆循环中，经细胞培养瓶内的物理吸附解毒和肝细胞解毒及生物转化后，血浆中的有毒物质减少，肝细胞合成的物质增多，最后解毒后的血浆和血细胞混合成血液回输人体。
本实用新型的有益效果：
1、本实用新型的人工肝反应器的积极进步效果在于，一方面所述片状载体由PET亲水纤维交织形成，表面和内部有空隙，结合倾角设计可使肝细胞三维生长，同时所述片状载体表面具有空隙可提供足够的表面积(大于2500cm2/g)供肝细胞生长，整个反应器的面积与体积比可达180/cm2，通过液体和气体交替与肝细胞接触，可以让肝细胞更充分的接触空气和培养基；而且所述片状载体具有均一稳定的尺寸，保证肝细胞培养时的均一性，支持细胞量的测量。另一方面，所述蠕动泵的设置，可使细胞培养瓶内的培养基呈升降式运动，培养基上升混合时，可形成微小的旋涡，让肝细胞更充分的接触养分。综上，本实用新型的人工肝反应器可使肝细胞更充分的接触空气和培养基，避免了以往的各种生物反应器所不得不面对的细胞载量少、有效交换面积小、细胞分布不均、代谢交换效率低下、难以再生循环利用等问题，可使肝细胞长时间保持存活和良好的功能状态，培养的肝细胞数量可大大增加至109肝细胞/1g片状载体；另外，将肝细胞接种在片状载体上方便细胞的转移和装载，解决了肝细胞直接培养在生物反应器中而导致肝细胞生长不均、生长不良以及难以观察肝细胞生长情况的问题。
2、相比于现有的生物反应器，本实用新型的人工肝反应器及其制备方法的实用性更高。具体来说，所述人工肝反应器所需空间小，大大降低物力人力成本；能提供更大的细胞生长表面积，为培养平板(180cm2)的100倍，能得到更高的细胞量和产物表达量；易于放大，可以将多个本实用新型的细胞培养瓶通过并联或串联，从而倍数扩增培养的细胞量，实现线性放大；本实用新型利用了液气交互式原理来培养细胞，从而达到低剪切力，无泡沫，无氧传质限制，既不损伤肝细胞，又有利于保护肝细胞的性状和功能；便于无菌操作，减少了污染或感染的危险；便于运输和装配。使用时只需将培养液更换成生物人工肝循环液，一步实现肝细胞扩增到生物人工肝的应用，方便、高效、安全。
3、本实用新型的循环灌注式生物人工肝支持***使用简便且解毒效率高。将装载肝细胞的反应器连接在常规的血细胞-血浆分离器上，连接方式可靠且简便；培养瓶底部有一个由隔离网与瓶上部载体分开的空间，可装填装载具有高效吸附作用的填充物，能够去除许多大分子毒素；肝细胞仅与血浆相接触，而不直接与血液接触，生物安全性好；可将多个本实用新型的液气交互式生物人工肝反应器的细胞培养瓶并联或串联，提高了人工肝的解毒效率；本实用新型的液气交互式生物人工肝反应器既可以是一个细胞培养装置，又可以是生物人工肝支持***的关键模块，只需换液便可实现切换。
附图说明
图1为本实用新型人工肝反应器的示意图；
图2为本实用新型人工肝反应器的细胞培养瓶的示意图；
图3为本实用新型人工肝反应器细胞培养前后的照片；
图4为本实用新型循环灌注式生物人工肝支持***中的示意图。
附图标记
集成电路控制器1、反应器生物模块2、输入总管3、输出总管4、瓶盖5、通风过滤器6、采样端口7、胆红素吸附树脂8、输入管9、和输出管10、片状载体11、血细胞- 血浆分离器12、人工肝反应器13、血液流入管14、血浆流入管15、血浆输出管16、血液输出管17、血浆循环18、血液循环19。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本实用新型作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本实用新型而非用于限定本实用新型的范围。
实施例1 人工肝反应器
图1所示为本实用新型一较佳实施例的人工肝反应器，其包括集成电路控制器1和反应器生物模块2。
反应器生物模块2一侧设有输入总管3，另一侧设有输出总管4，输入总管3和输出总管4之间并联设置有三个1000mL的细胞培养瓶(分别为A、B、C)。如图2所示，细胞培养瓶顶部的瓶盖5设有0.22微米的通风过滤器6；细胞培养瓶侧壁上有一个2X3cm 的采样端口7；细胞培养瓶内设有隔离网，隔离网与瓶底之间为隔离区，隔离区内装填有胆红素吸附树脂8；细胞培养瓶底部两侧分别设有输入管9和输出管10，细胞培养瓶A、 B、C的输入管9汇集与输入总管3接通，输出管10汇集与输出总管4接通，三根输入管9上分别设有蠕动泵(分别为a、b、c)，输出总管4上设有流量控制阀d，蠕动泵a、 b、c和流量控制阀d由集成电路控制器1连接分别控制。细胞培养瓶内于隔离网上面装载有10g片状载体11，片状载体11为100％PET亲水材质(购自新加坡ESCO公司)。片状载体11上贴附有肝细胞，细胞量为109个肝细胞/1g片状载体。
其中，蠕动泵a、b、c和流量控制阀d可控制整个人工肝反应器形成灌流式***，而通过集成电路控制器1进行调节，可实现细胞培养瓶中液体上下连续或间歇缓慢升降，使细胞培养瓶中的液体和气体交替与片状载体和肝细胞充分接触。片状载体11表面具有空隙可提供足够的表面积(大于2500cm2/g)供肝细胞生长，整个反应器的面积与体积比可达180/cm2，有效交换面积大大提高，而且片状载体11尺寸均一可使肝细胞均匀分布，细胞量可达109个肝细胞/1g片状载体，避免了以往的各种生物反应器所不得不面对的细胞载量少、有效交换面积小、细胞分布不均、代谢交换效率低下、难以再生循环利用等问题。另外，将肝细胞接种在片状载体11上方便细胞的转移和装载，通过采样端口7可便采样观察肝细胞生长情况，解决了肝细胞直接培养在生物反应器中而导致肝细胞生长不均、生长不良以及难以观察肝细胞生长情况的问题。
实施例2实施例1人工肝反应器的制备
(a)肝细胞接种，将片状载体浸泡在pH7.4的PBS溶液(Sigma公司购买)中进行水化24～72h，然后将水化后的片状载体在10～200μg/mL的胶原蛋白中室温包被30min～2h，吸去多余液体，用PBS或无血清培养基清洗3～4次，然后与肝细胞(HepG2/C3A细胞， ATCC购买)和培养基(DMEM培养基，ATCC购买)混合，混合比例为在106～108个肝细胞/1g片状载体/100mL培养基的比例上，摇动培养30min～2h使肝细胞贴附在片状载体上完成接种；
(b)液气交互式培养，将步骤(a)接种后的片状载体和培养基加入组装好的人工肝反应器的各个细胞培养瓶中，封好瓶盖5并将输入总管3入口和输出总管4出口密封，打开集成电路控制器1，使蠕动泵带动培养基进行上下缓慢升降运动，在37℃，5％CO2环境中进行培养，通过检测片状载体上的细胞量，待细胞量达到108-109个肝细胞/1g片状载体时即制备成人工肝反应器。
(c)待细胞量达到109个肝细胞/1g片状载体时，维持培养3天，每天同一时间检测培养瓶中培养液的葡萄糖含量，经过换算反应器细胞增殖稳定后每个细胞的葡萄糖代谢率为1±0.45ng/24h。随机抽取培养瓶中的片状载体，使用结晶紫进行细胞染色，光镜下观察载体和细胞形态，结果如图3所示。图中A为未培养细胞时片状载体100X光学显微镜照片，图中B为培养细胞时细胞连同片状载体100X光学显微镜照片，箭头所指为细胞团，从形态上可见细胞在反应器中实现高密度的三维生长接近肝细胞在体内的生长方式。
实施例3循环灌注式生物人工肝支持***
如图4所示，循环灌注式生物人工肝支持***包括常规的血细胞-血浆分离器12和本实用新型的人工肝反应器13。血细胞-血浆分离器12的血浆循环出口端与人工肝反应器13的输入总管3相连接，人工肝反应器13的输出总管4再接回血浆循环，构成循环回路。
较佳的，该***中还包括血浆透析器、气体输入器、调节液输入器、恒温加热器，以及控制该***各部分的中心控制器。
血细胞-血浆分离器、血浆透析器、气体输入器、调节液输入器、恒温加热器均为现有生物人工肝***常用的设备。
气体输入器包括氧气输入装置、二氧化碳输入装置和空气输入装置。
中心控制器包括蠕动泵控制模块、流量控制模块、气体输入控制模块、调节液输入控制模块、恒温控制模块和检测模块。蠕动泵控制模块用于通过集成电路控制器控制蠕动泵的工作，流量控制模块用于通过集成电路控制器控制流量控制阀的工作，气体输入控制模块用于控制气体输入器的工作，调节液输入控制模块用于控制调节液输入器的工作，恒温控制模块用于控制恒温加热器的工作，检测模块用于监测***状态并将检测信号反馈其他控制模块。
实际应用时，肝衰竭患者的血液从血液流入管14进入血细胞-血浆分离器12，分成浓缩血细胞(下行)和带有有毒物质的血浆，血浆通过血浆流入管15进入人工肝反应器 13，分别经过细胞培养瓶A、B、C进行解毒，经胆红素吸附树脂8的物理吸附解毒以及肝细胞解毒及生物转化后，血浆中的有毒物质减少，肝细胞合成的物质增多。最后由血浆输出管16将解毒后的血浆输出与浓缩血细胞重新混合成血液，由血液输出管17回输人体。在该***中建立了相互独立的血浆循环18和血液循环19，提高了有毒物质的祛除效率，防止反应器中的细胞混入血细胞提高安全性。
以上已对本实用新型创造的较佳实施例进行了具体说明，但本实用新型创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本实用新型创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.一种人工肝反应器，其特征在于，其包括：
一输入总管，用于与上游的培养基或血浆管道连接；
一输出总管，用于与下游的回收管道或血浆管道连接；以及
一个或者多个并联或串联的细胞培养瓶，所述细胞培养瓶连接在所述输入总管和所述输出总管之间，各个所述细胞培养瓶底部两侧分别配设有输入管和输出管，所述输入管和所述输出管用于连接所述输入总管、各个所述细胞培养瓶和所述输出总管，各所述输入管上分别设有蠕动泵；所述细胞培养瓶内设有隔离网，所述隔离网与所述细胞培养瓶底部之间装填有具有吸附功能的填充物，所述隔离网上面装载有片状载体，所述片状载体上贴附有肝细胞。
2.如权利要求1所述的人工肝反应器，其特征在于，所述细胞培养瓶数量为2～4个且并联连接，各所述输入管汇集与所述输入总管接通，各所述输出管汇集与所述输出总管接通，各所述输入管上和/或所述输出总管上设有流量控制阀；各所述蠕动泵和所述流量控制阀由一个集成电路控制器连接分别控制。
3.如权利要求1所述的人工肝反应器，其特征在于，所述片状载体为由聚对苯二甲酸乙二醇酯亲水纤维交织形成的平面结构或对开夹角的“V”型结构，所述片状载体表面和内部具有空隙，所述片状载体厚度为0.1～0.5mm，所述片状载体长和宽为3～10mm。
4.如权利要求1所述的人工肝反应器，其特征在于，所述细胞培养瓶的瓶盖设有0.1～0.3微米的空气过滤器，所述细胞培养瓶与所述输入管和所述输出管连接处设有0.1～0.3微米的滤膜。
5.如权利要求1所述的人工肝反应器，其特征在于，所述细胞培养瓶的瓶盖上或所述细胞培养瓶侧壁上设有一个采样端口。
6.如权利要求1所述的人工肝反应器，其特征在于，所述片状载体上的细胞量为1×108～1×109个肝细胞/1g片状载体。
7.如权利要求1所述的人工肝反应器，其特征在于，所述细胞培养瓶工作体积为0.5～10L，每个所述细胞培养瓶的片状载体装载量为5～100g。
8.一种循环灌注式生物人工肝支持***，其特征在于，其包括如权利要求1～7任一项所述的人工肝反应器，还包括分别与所述人工肝反应器联通的血细胞-血浆分离器、血浆透析器、气体输入器、调节液输入器、恒温加热器，以及控制该***各部分的中心控制器。
9.如权利要求8所述的循环灌注式生物人工肝支持***，其特征在于：所述的气体输入器包括氧气输入装置、二氧化碳输入装置和空气输入装置。
10.如权利要求8所述的循环灌注式生物人工肝支持***，其特征在于：所述的中心控制器包括蠕动泵控制模块、流量控制模块、气体输入控制模块、调节液输入控制模块、恒温控制模块和检测模块。
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| CN111040949A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-04-21 | 中国人民解放军联勤保障部队第九四0医院 | 串联式批量生产大段组织工程骨的灌注式生物反应器 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GR01 | Patent grant | ||
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Shanghai Selvie Medical Technology Co., Ltd. Assignor: SHANGHAI SAILIWEI BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Contract record no.: X2019310000001 Denomination of utility model: Formula bioartificial liver support system is filled in artificial liver reactor and circulation Granted publication date: 20180605 License type: Common License Record date: 20190813 |