CN108060081A - 一种多层平板灌注式生物反应器 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物反应器技术领域，具体为一种多层平板灌注式生物反应器，包括灌注腔体和设置在灌注腔体内的由多层平板构成的培养机构，所述的灌注腔体上设有培养液进液管以及培养液排液管，所述的灌注腔体分隔为培养腔和缓冲腔，所述的培养机构设置在培养腔内，所述的培养液进液管的出口延伸到缓冲腔的中部以下，所述的缓冲腔的上部与培养腔连通。本发明的目的在于提供一种可用于细胞大规模体外培养，为细胞培养提供更均匀的流场剪切力环境的生物反应器。
Description
技术领域
本发明涉及生物反应器技术领域，更具体地，涉及一种多层平板灌注式生物反应器。
背景技术
生物反应器是用于模拟生物体为细胞生长提供合适的营养物质、物理环境和化学环境的体外装置。生物反应器在药物生产、组织工程和再生医学中显示了极大的应用潜力。
生物反应器中培养液的流动可以使培养液中的物质分布更均匀，方便反应器中的细胞获取营养物质并排出代谢废物。目前生物反应器种类很多，按照培养液的流动方式可以分为混合式生物反应器和灌注式生物反应器，其中灌注式生物反应器具有流场稳定，传质效率高等优点，受到了越来越多的关注。灌注式生物反应器按照构型不同又可分为中空纤维反应器、流化床反应器和多层平板反应器等。其中，多层平板灌注式生物反应器使用平行排列的多层平板作为细胞载体，培养液在平板之间流动，并通过导流孔汇聚到反应器出口或者流入下一层平板，目前已经应用于生物人工肝和干细胞体外培养等多种临床实验。
中国专利ZL 201310197609.8公开了一种双层循环***的灌注式生物反应器及其应用方法，包括培养罐、设于培养罐外部的外层循环***、设于培养罐内部的内层循环***和气体加注***；解决细胞在培养过程中对培养液循环流动的矛盾需求问题，并能有效提高培养液中氧的溶解度及其分布的均匀度，有利于培养液中废气的排出，并能有效消除气泡进入细胞培养区域。
研究表明，反应器中流场剪切力对细胞的生长有巨大影响，适当的剪切力环境可以提高细胞活性或促进细胞分化，过大的剪切力环境会抑制细胞活性甚至引起细胞凋亡。灌注式生物反应器在灌注入口处流速较高，往往存在高剪切力区。另外，气泡破裂时也会产生较大的剪切力，不利于细胞的生长。现有的多层平板生物反应器将培养液直接灌注到多层平板结构中，容易造成剪切力分布不均，不利于细胞生长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多层平板灌注式生物反应器，该反应器克服多层现有多层平板灌注式生物反应器在灌注入口处存在的高剪切力，可用于细胞大规模体外培养，为细胞培养提供更均匀的流场剪切力环境。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种多层平板灌注式生物反应器，包括灌注腔体和设置在灌注腔体内的由多层平板构成的培养机构，所述的灌注腔体上设有培养液进液管以及培养液排液管，所述的灌注腔体分隔为培养腔和缓冲腔，所述的培养机构设置在培养腔内，所述的培养液进液管的出口延伸到缓冲腔的中部以下，所述的缓冲腔的上部与培养腔连通。
在上述的多层平板灌注式生物反应器中，所述的灌注腔体上设有与大气连通的导管。
在上述的多层平板灌注式生物反应器中，所述的培养机构包括中心导流管以及以可开合的方式配合的第一固定架和第二固定架，所述的第一固定架上由上而下以可拆卸的方式固定有多个第一培养平板，所述的第二固定架上由上而下以可拆卸的方式固定有多个与第一培养平板对应的第二培养平板，所述的第一培养平板上设有第一凹部，所述的第二培养平板上设有第二凹部；
当第一固定架与第二固定架闭合时，第一培养平板的第一凹部和第二培养平板的第二凹部形成与中心导流管配合的环；
所述的中心导流管上设有与培养腔连通的通孔，所述的培养液排液管连接在中心导流管的底端。
在上述的多层平板灌注式生物反应器中，所述的第一固定架的一端和第二固定架的一端铰接连接。
在上述的多层平板灌注式生物反应器中，所述的第一固定架上设有用于卡合第一培养平板的第一卡合部，所述的第二固定架上设有用于卡合第二培养平板的第二卡合部；所述的中心导流管设有用于与第一凹部和第二凹部卡接配合的第三卡合部。
在上述的多层平板灌注式生物反应器中，所述的第一培养平板和第二培养平板为半圆形。
在上述的多层平板灌注式生物反应器中，所述的第一固定架的另一端和第二固定架的另一端通过卡接齿条固定连接。
在上述的多层平板灌注式生物反应器中，还包括观测机构，所述的观测机构设置在灌注腔体上且位于培养机构正上方。
在上述的多层平板灌注式生物反应器中，所述的观测机构包括设置在灌注腔体上的水密观察窗和以可拆卸的方式设置在水密观察窗上方的成像装置；所述的成像装置上设有辅助光源。
在上述的多层平板灌注式生物反应器中，所述的培养机构的多层平板为高透光材质的多层平板。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的多层平板生物反应器灌注腔体引入了缓冲腔，消除了由于培养液灌注引起的高剪切力对细胞的不良影响，为细胞的生长提供良好的微环境，有利于细胞黏附、生长。本发明的培养机构考虑了细胞收获时生物反应器中细胞载体的拆卸效率较低的情况，通过引入以可开合的方式配合的第一固定架和第二固定架，大大提高了了拆卸效率，缩短了细胞平板载体暴露在外界的时间，从而减小了过程中样品受污染的概率。本发明所述的观测机构能够实时观察培养平板上的细胞生长状态，从而为细胞收获等操作的时机选择提供依据，而且所述成像装置可随时安装和取出，方便随时消毒及更换设备。
附图说明
图1为本发明的实施例1的剖视图；
图2为本发明的实施例1的培养机构的立体图；
图3为本发明的实施例1的培养机构的立体展开图；
图4为本发明的实施例1的观测机构的剖视图；
图5为本发明的实施例1的局部剖视图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
请参阅图1-5，一种多层平板灌注式生物反应器，包括灌注腔体1和设置在灌注腔体1内的由多层平板构成的培养机构2，所述的灌注腔体1上设有培养液进液管11以及培养液排液管12，所述的灌注腔体1分隔为培养腔13和缓冲腔14，所述的培养机构2设置在培养腔13内，所述的培养液进液管11的出口延伸到缓冲腔14的中部以下，所述的缓冲腔14的上部与培养腔13连通，所述的灌注腔体1上设有与大气连通的导管。
在使用过程中，培养液流体经过培养液进液管11注入到缓冲腔14的中部或下部，经过缓冲腔14缓冲后，流体剪切力变弱，进入到培养腔13中，利于细胞的活性保持和细胞分化。
经过试验证实：将多层平板洗净后安装到平板支架上构成培养机构2，将多层平板结构的培养机构2放入75％酒精溶液中浸泡后取出置于紫外线环境下风干。将反应器外壳洗净后放入高压灭菌锅中灭菌，并在超净台上将多层平板结构的培养机构2组装到反应器中，反应器整体置于5％CO2，37℃细胞培养箱中。取人骨髓间充质干细胞置于培养瓶中培养至1000万细胞，将细胞消化后制成细胞悬浮液，并通过蠕动泵泵入反应器中。静置24小时，待细胞粘附到平板上之后，将反应器通过硅胶管连接到BioBundles发酵罐中进行培养液参数调节和循环灌注。培养10天后，通过所述观察装置实时观察细胞形态，细胞达到80％融合，在超净台上将多层平板取出，计数发现细胞数量达到12000万，实现了干细胞的体外快速扩增。作为对照，使用无缓冲腔的反应器腔体做干细胞体外扩增实验，使用相同的培养机构2并注入等量干细胞悬液。培养10天后，取出平板进行细胞计数，细胞数量达到8200万。这说明缓冲腔可以有效减少流场环境对细胞生长的不利影响，促进细胞在体外的快速扩增。
在本实施例中，所述的培养机构2包括中心导流管21以及以可开合的方式配合的第一固定架22和第二固定架23，所述的第一固定架22上由上而下以可拆卸的方式固定有多个第一培养平板24，所述的第二固定架23上由上而下以可拆卸的方式固定有多个与第一培养平板24对应的第二培养平板25，所述的第一培养平板24上设有第一凹部26，所述的第二培养平板25上设有第二凹部27；
当第一固定架22与第二固定架23闭合时，第一培养平板24的第一凹部26和第二培养平板25的第二凹部27形成与中心导流管21配合的环；
所述的中心导流管21上设有与培养腔13连通的通孔28，所述的培养液排液管12连接在中心导流管21的底端。
在实际应用中，第一固定架22和第二固定架23的形状不做过多限制，优选为半圆柱形；第一培养平板24和第二培养平板25的形状也可以不做过多限制，一般情况下半圆环形的第一培养平板24对应的第二培养平板25更为优选，但是选择为其他形状如半椭圆环形、半中空矩形柱形等。
在细胞体外扩增应用中，当细胞长满后需要取出细胞载体进行下一步操作。现有的多层平板生物反应器按照平板层数顺序逐层进行安装和拆卸，拆卸效率较低，从而增大了细胞受到污染的风险。
因此本实施例的以可开合的方式配合的第一固定架22和第二固定架23、可拆卸的方式固定有多个第一培养平板24和第二培养平板25，能够实现第一固定架22和第二固定架23，提高第一培养平板24和第二培养平板25的取放速度，这对于细胞成活率和细胞活性的继续保持是非常重要的。
在本实施例中，所述的第一固定架22的一端和第二固定架23的一端铰接连接。在实际应用中，以可开合的方式配合的第一固定架22和第二固定架23也可以选择其他方式进行连接，比如两端均卡接等。
优选地，所述的第一固定架22上设有用于卡合第一培养平板24的第一卡合部29，所述的第二固定架23上设有用于卡合第二培养平板25的第二卡合部20；所述的中心导流管21设有用于与第一凹部26和第二凹部27卡接配合的第三卡合部200。第一卡合部29和第三卡合部200配合实现了第一培养平板24在使用时的稳定固定；第二卡合部20和第三卡合部200配合实现了第二培养平板25在使用时的稳定固定。
更为优选地，所述的第一固定架22的另一端和第二固定架23的另一端通过卡接齿条201固定连接。
在本实施例中，还包括观测机构3，所述的观测机构3设置在灌注腔体1上且位于培养机构2正上方，所述的观测机构3包括设置在灌注腔体1上的水密观察窗31和以可拆卸的方式设置在水密观察窗31上方的成像装置32；所述的成像装置32上设有辅助光源33。更为具体来说，成像装置32由工业相机、高度调节器、放大倍数调节器、物镜组成，辅助光源33一般选择为LED光源，辅助光源33设置在物镜的下方。该物镜为普通光学显微物镜或相差显微物镜，放大倍数0.5-5.0x。该工业相机为1000万高分辨率摄像机，通过USB或者VGA等通用视频接口进行图像传输。
本实施例的水密观察窗31和成像装置32的配合使利于拆卸成像装置32且不会造成细菌污染。水密观察窗31由观察窗上盖、连接器、舱壁、透明玻璃片和观察窗下盖组成，除玻璃片外上述各零件均使用316L不锈钢制成，各零件通过螺纹和硅胶O圈实现水密连接，并通过同样的方式固定到灌注腔体1上部。水密观察窗31整体高度112mm，内径46mm，外径50mm，其下方正对着多层平板结构的培养机构2。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (10)
1.一种多层平板灌注式生物反应器，包括灌注腔体和设置在灌注腔体内的由多层平板构成的培养机构，所述的灌注腔体上设有培养液进液管以及培养液排液管，其特征在于，所述的灌注腔体分隔为培养腔和缓冲腔，所述的培养机构设置在培养腔内，所述的培养液进液管的出口延伸到缓冲腔的中部以下，所述的缓冲腔的上部与培养腔连通。
2.根据权利要求1所述的多层平板灌注式生物反应器，其特征在于，所述的灌注腔体上设有与大气连通的导管。
3.根据权利要求1所述的多层平板灌注式生物反应器，其特征在于，所述的培养机构包括中心导流管以及以可开合的方式配合的第一固定架和第二固定架，所述的第一固定架上由上而下以可拆卸的方式固定有多个第一培养平板，所述的第二固定架上由上而下以可拆卸的方式固定有多个与第一培养平板对应的第二培养平板，所述的第一培养平板上设有第一凹部，所述的第二培养平板上设有第二凹部；
当第一固定架与第二固定架闭合时，第一培养平板的第一凹部和第二培养平板的第二凹部形成与中心导流管配合的环；
所述的中心导流管上设有与培养腔连通的通孔，所述的培养液排液管连接在中心导流管的底端。
4.根据权利要求3所述的多层平板灌注式生物反应器，其特征在于，所述的第一固定架的一端和第二固定架的一端铰接连接。
5.根据权利要求3所述的多层平板灌注式生物反应器，其特征在于，所述的第一固定架上设有用于卡合第一培养平板的第一卡合部，所述的第二固定架上设有用于卡合第二培养平板的第二卡合部；所述的中心导流管设有用于与第一凹部和第二凹部卡接配合的第三卡合部。
6.根据权利要求3-5任一所述的多层平板灌注式生物反应器，其特征在于，所述的第一培养平板和第二培养平板为半圆形。
7.根据权利要求4所述的多层平板灌注式生物反应器，其特征在于，所述的第一固定架的另一端和第二固定架的另一端通过卡接齿条固定连接。
8.根据权利要求1所述的多层平板灌注式生物反应器，其特征在于，还包括观测机构，所述的观测机构设置在灌注腔体上且位于培养机构正上方。
9.根据权利要求8所述的多层平板灌注式生物反应器，其特征在于，所述的观测机构包括设置在灌注腔体上的水密观察窗和以可拆卸的方式设置在水密观察窗上方的成像装置；所述的成像装置上设有辅助光源。
10.根据权利要求9所述的多层平板灌注式生物反应器，其特征在于，所述的培养机构的多层平板为高透光材质的多层平板。
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