CN206248668U - 呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物胶体金双联检测卡 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物胶体金双联检测卡，包括壳体，所述壳体上设有加样孔和观察窗，壳体内设有胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括底板，所述底板上依次衔接有样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫；所述的包被膜上设有一条呋喃唑酮代谢物‑载体蛋白偶联物检测线T1、一条呋喃它酮代谢物‑载体蛋白偶联物检测线T2和一条羊抗兔二抗质控线C，该三条线平行排列。本实用新型提供的呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物胶体金双联检测卡，具有检测时间短、稳定性好、操作简单、无需其他仪器和专业的人员，结果判断直观可靠，适合用于基层和现场大批量标本的检测。

Description

呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物胶体金双联检测卡

技术领域

本实用新型涉及呋喃类药物代谢物的检测领域，尤其涉及一种检测鱼肉、虾肉中呋喃唑酮代谢物和呋喃它酮代谢物的胶体金检测卡。

背景技术

呋喃唑酮和呋喃它酮为硝基呋喃类药物中最具代表性的两种，具有较强的抗菌效果，是一类光谱的抗菌药物。两类药物对大多数的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌菌有一定的抗菌效果。由于两类药物价格便宜，抗菌效果好，因此在畜禽及水产养殖应用上非常广泛。两类药物在生物体内代谢速度快，但是呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)呋喃它酮代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮与组织蛋白结合成为长期稳定的结合态。呋喃唑酮代谢物具有较大毒性，能诱导机体基因突变、畸胎、癌症，因此引起了人们的高度重视，许多国家已经限制或禁止动物源性食品过程中使用硝基呋喃类药物。欧盟于2007年将所有的硝基呋喃类药物列为违禁药物。我国农业部于2002年第193号公告中规定动物源性食品中不得检出硝基呋喃类药物代谢物，2003年又将水产品硝基呋喃代谢物纳入残留监控计划。

目前用于检测呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物的方法主要有液相色谱法、液相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法、酶联免疫法等。这些分析方法多集中在对单个呋喃类药物代谢物的检测上，如中国实用新型专利CN104374910A“一种硝基呋喃类药物代谢物的检测试剂盒及检测方法”，一种胶体金卡或试剂盒只检测相应的一种硝基呋喃类代谢物。而对多个呋喃类药物代谢物同时检测的方法较少，这些检测方法需要昂贵的仪器，分析速度慢且需要专业人员操作完成。本实用新型将检测呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物的胶体金检测卡合并为单一卡条，且样本的前处理方法相同可实现一次样本处理同时来检测这两种硝基呋喃代谢物，比现有方法更简便实用。

实用新型内容

本实用新型的目的是提供一种呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物胶体金双联检测卡，具有检测时间短、稳定性好、操作简单、无需其他仪器和专业的人员，结果判断直观可靠，适合用于基层和现场大批量标本的检测。

为实现上述目的，本实用新型提供一种呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物胶体金双联检测卡，包括壳体，所述壳体上设有加样孔和观察窗，壳体内设有胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括底板，所述底板上依次衔接有样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫；所述的包被膜上设有一条呋喃唑酮代谢物-载体蛋白偶联物检测线T1、一条呋喃它酮代谢物-载体蛋白偶联物检测线T2和一条羊抗兔二抗质控线C，该三条线平行排列。

作为本实用新型的进一步改进，所述包被膜两端分别与吸水垫和胶体金垫相互交叠连接，所述样品垫压贴在胶体金垫上。

作为本实用新型的更进一步改进，所述胶体金垫包括呋喃唑酮金标垫和呋喃它酮金标垫，所述呋喃唑酮金标垫和呋喃它酮金标垫相互交叠连接。

作为本实用新型的更进一步改进，所述样品垫为玻璃纤维样品垫。

作为本实用新型的更进一步改进，所述底板为PVC板。

作为本实用新型的更进一步改进，所述包被膜为硝酸纤维素膜。

有益效果

与现有技术相比，本实用新型的呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物胶体金双联检测卡具有以下优点：

1、灵敏度高；其以胶体金标记经过亲和纯化的兔多抗，经过亲和纯化的多抗亲和力高特异性好，而且胶体金标记效果好，该胶体金双联检测卡的检测灵敏度为1ppb；

2、操作简便；使用该胶体金双联检测卡时对组织样本的处理方法是统一的，吸取处理后的样本提取液60-80ul，然后加入检测卡的加样孔中，3-5min后观察结果；

3、显示检测结果形象、直观、准确；检测卡以两条检测线T1和T2是否显色作为阴性和阳性的标记，以质控线C的有无判断检测卡是否失效；当检测卡检测线T1和T2处均不显色、质控线C显色时，表示检测样本中呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物含量高于或等于检测卡灵敏度；当检测卡的检测线T1处不显色、检测线T2处和质控线C处显色时，则表示呋喃唑酮代谢物含量高于或等于检测卡的检测灵敏度，而呋喃它酮代谢物的含量低于检测卡的灵敏度；当检测线T1和质控线C处显色、T2处不显色时，则表示呋喃它酮代谢物的含量高于或等于检测卡的灵敏度而呋喃唑酮代谢物的含量低于检测卡的灵敏度；当检测卡的质控线C处不显色时，检测线无论T1和T2处是否显色都表示检测卡失效；

4、成本低，易于基层推广；使用该胶体金双联检测卡，无需配置昂贵的仪器设备和专业人员。

通过以下的描述并结合附图，本实用新型将变得更加清晰，这些附图用于解释本实用新型的实施例。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物胶体金双联检测卡的结构布置图；

图2为检测卡判定结果为呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物含量高于或等于检测卡灵敏度的示意图；

图3为检测卡判定结果为呋喃唑酮代谢物含量高于或等于检测卡的检测灵敏度，而呋喃它酮代谢物的含量低于检测卡的灵敏度的示意图；

图4为检测卡判定结果为呋喃它酮代谢物的含量高于或等于检测卡的灵敏度，而呋喃唑酮代谢物的含量低于检测卡的灵敏度的示意图；

图5为检测卡判定结果为检测卡失效的示意图。

图中，壳体1；壳体盖11；加样孔2；观察窗3；底板4；样品垫5；胶体金垫6；呋喃唑酮金标垫61；呋喃它酮金标垫62；包被膜7；吸水垫8；呋喃唑酮代谢物-载体蛋白偶联物检测线T1；呋喃它酮代谢物-载体蛋白偶联物检测线T2；羊抗鼠二抗质控线C。

具体实施方式

现在参考附图描述本实用新型的实施例。

实施例

本实用新型的具体实施方式如图1所示，一种呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物胶体金双联检测卡，包括壳体1，壳体1上设有加样孔2和观察窗3，壳体1内设有胶体金试纸条，胶体金试纸条包括底板4，底板4上依次衔接有样品垫5、胶体金垫6、包被膜7和吸水垫8；包被膜7上设有一条呋喃唑酮代谢物-载体蛋白偶联物检测线T1、一条呋喃它酮代谢物-载体蛋白偶联物检测线T2和一条羊抗兔二抗质控线C，该三条线平行排列。壳体1上设有壳体盖11。观察窗3一侧标有T1字样、T2字样和C字样。呋喃唑酮代谢物-载体蛋白偶联物检测线T1与T1字样对应；呋喃它酮代谢物-载体蛋白偶联物检测线T2与T2字样对应；羊抗鼠二抗质控线C为质控线，其与C字样对应。

包被膜7两端分别与吸水垫8和胶体金垫6相互交叠连接，样品垫5压贴在胶体金垫6上。

胶体金垫6包括呋喃唑酮金标垫61和呋喃它酮金标垫62，呋喃唑酮金标垫61和呋喃它酮金标垫62相互交叠连接。所述的样品垫5为玻璃纤维样品垫；底板4为PVC板；包被膜7为硝酸纤维素膜。

检测卡中所用材料的制备方法如下：

1、呋喃唑酮免疫源的制备

第一步：取2-硝基-5-羟基苯甲醛1.67g溶8mL DMF，加入2.6g K₂CO₃，60℃反应0.5小时，然后加入2g的4-溴丁酸乙酯，继续反应6小时；反应完毕，加入50mL蒸馏水，用200mL乙酸乙酯萃取；弃水层，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥后旋干即得第一步产物；

第二步：取第一步产物1.5g，加入2mL甲醇，再加入10mL 2mol/L的NaOH，室温反应12小时，反应完毕后，用2mol/L的HCl调pH为5左右，析出沉淀，即得第二步产物；

第三步：取第二部产物0.25g，AOZ 0.2g分别溶于甲醇，两者混合后室温反应8小时，反应完成后旋干甲醇即得做为免疫原的半抗原；

第四步：半抗原与BSA载体蛋白的偶联。

取上步所得半抗原40mg，用1mL DMF溶解，加入20mg EDC和10mg NHS，室温反应4小时，为A液；取KLH 60mg溶于10mLPBS为B液；将反应完成后的A液逐滴加入B液中，室温条件下反应8小时。反应完成后，装入透析袋进行透析。

2、呋喃唑酮代谢物-载体蛋白偶联物的制备

取制备免疫源时得到的半抗原40mg，用1mL DMF溶解，加入20mg EDC和10mg NHS，室温反应4小时，为A液；取BSA60mg溶于10mLPBS为B液；将反应完成后的A液逐滴加入B液中，室温条件下反应8小时；反应完成后，装入透析袋进行透析。

3、呋喃它酮免疫源的制备

第一步：取2-硝基-5-羟基苯甲醛1.67g溶于8mL DMF，加入2.6gK₂CO₃，60℃反应0.5小时，然后加入2g的4-溴丁酸乙酯，继续反应6小时；反应完毕，加入50mL蒸馏水，用200mL乙酸乙酯萃取；弃水层，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥后旋干即得第一步产物；

第二步：取第一步产物1.5g，加入2mL甲醇，再加入10mL 2mol/L的NaOH，室温反应12小时，反应完毕后，用2mol/L的HCl调pH为5左右，析出沉淀，即得第二步产物；

第三步：取第二部产物0.25g，AMOZ 0.2g分别溶于甲醇，两者混合后室温反应8小时，反应完成后旋干甲醇即得做为免疫原的半抗原；

第四步：半抗原与BSA载体蛋白的偶联。

取上步所得半抗原40mg，用1mL DMF溶解，加入20mg EDC和10mg NHS，室温反应4小时，为A液；取KLH 60mg溶于10mLPBS为B液；将反应完成后的A液逐滴加入B液中，室温条件下反应8小时。反应完成后，装入透析袋进行透析。

4、呋喃它酮代谢物-载体蛋白偶联物

取制备免疫源时得到的半抗原40mg，用1mL DMF溶解，加入20mg EDC和10mg NHS，室温反应4小时，为A液；取BSA60mg溶10mL PBS为B液；将反应完成后的A液逐滴加入B液中，室温条件下反应8小时。反应完成后，装入透析袋进行透析。

5、呋喃唑酮多克隆抗体的制备

取1mg/ml的免疫源1mg与等量的弗氏完全佐剂混合后充分乳化后在新西兰大白兔背部脊柱两侧多点皮下注射。两周后加强免疫一次，取1mg/ml的免疫源1mg与等量的弗氏不完全佐剂混合后充分乳化后在新西兰大白兔背部脊柱两侧多点皮下注射。第一次加强免疫2周后第二次加强免疫免疫方法和第一次加强免疫时相同。第二次加强免疫2周后进行冲击免疫，取1mg/ml的免疫原500ul新西兰大白兔耳缘静脉注射。冲击免疫后第4天进行心脏采血。

6、呋喃它酮多克隆抗体的制备

取1mg/ml的免疫源1mg与等量的弗氏完全佐剂混合后充分乳化后在新西兰大白兔背部脊柱两侧多点皮下注射。两周后加强免疫一次，取1mg/ml的免疫源1mg与等量的弗氏不完全佐剂混合后充分乳化后在新西兰大白兔背部脊柱两侧多点皮下注射。第一次加强免疫2周后第二次加强免疫免疫方法和第一次加强免疫时相同。第二次加强免疫2周后进行冲击免疫，取1mg/ml的免疫原500ul新西兰大白兔耳缘静脉注射。冲击免疫后第4天进行心脏采血。

7、羊抗兔多克隆抗体的制备

以兔源抗体为免疫源免疫山羊得到羊抗兔二抗。

8、兔多抗-胶体金复合物的制备

1)胶体金的制备

洗干净的300ml三角瓶中加100ml超纯水置恒温加热磁力搅拌器上加热至沸腾，加入1ml1％的氯金酸溶液，重新沸腾后再加入1.6ml二水柠檬酸三钠，继续加热至沸腾后15min停止加热，恢复至室温后加入超纯水恢复至原体积。4℃保存备用。

2)兔多抗胶体金的标记

兔抗呋喃唑酮代谢物多抗胶体金复合物的制备

胶体金溶液在磁力搅拌器的搅拌下用0.1mol/L的碳酸钾把胶体金溶液的pH调至8.5。按每毫升胶体金溶液中加入6微克的量加入兔抗呋喃唑酮代谢物多抗。室温搅拌50min后加入10％的BSA溶液至终浓度为1％，室温下继续搅拌50min。搅拌停止后4℃以4000r/min的转速离心20min,收集离心管底部沉淀，上层胶体金溶液4℃以8500r/min的转速离心30min，收集离心管底部沉淀，弃上清。两次收集的胶体金沉淀用复溶液按照标记时胶体金溶液体积的1/16复溶。4℃保存备用。复溶液为20mM pH为7.4的PB缓冲液，其中BSA含量为0.5％，吐温-20为0.3％，PVP40为1％。

兔抗呋喃它酮代谢物多抗胶体金复合物的制备

胶体金溶液在磁力搅拌器的搅拌下用0.1mol/L的碳酸钾把胶体金溶液的pH调至9.0。按每毫升胶体金溶液中加入5微克的量加入兔抗呋喃它酮代谢物多抗。室温搅拌50min后加入10％的BSA溶液至终浓度为1％，室温下继续搅拌50min。搅拌停止后4℃以4000r/min的转速离心20min,收集离心管底部沉淀，上层胶体金溶液4℃以8500r/min的转速离心30min，收集离心管底部沉淀，弃上清。两次收集的胶体金沉淀用复溶液按照标记时胶体金溶液体积的1/16复溶。4℃保存备用。复溶液为20mM pH为7.4的PB缓冲液，其中BSA含量为0.5％，吐温-20为0.3％，PVP-40为1％

9、金标垫的制备

胶体呋喃唑酮金标垫的制备：将制备好的兔抗呋喃唑酮代谢物多抗胶体金复合物以1.4ul/cm的喷金量喷涂于玻璃纤维上，37℃鼓风干燥箱箱中干燥3h后干燥密封保存。

胶体呋喃它酮金标垫的制备：将制备好的兔抗呋喃它酮代谢物多抗胶体金复合物以1.6ul/cm的喷金量喷涂于玻璃纤维上，37℃鼓风干燥箱箱中干燥3h后干燥密封保存。

10、检测线质控线的包被

用0.02mol/L pH为7.4的PB溶液稀释呋喃唑酮代谢物-载体蛋白偶联物至浓度0.5mg/ml，按0.08ul/cm的量划于硝酸纤维素膜上。用0.02mol/L pH为7.4的PB溶液稀释呋喃它酮代谢物-载体蛋白偶联物至浓度0.4mg/ml，按0.08ul/cm的量划于硝酸纤维素膜上。用0.01mol/L pH为7.4的PBS溶液稀释羊抗兔IgG至0.5mg/ml按1ul/cm的量划于硝酸纤维素膜上。三条线之间的间隔为6-7mm。包被后的膜于37℃鼓风干燥箱中烘干过夜后干燥密封保存备用。

11、样品垫的制备

将玻璃纤维至于样品垫处理液中浸泡5min后，于37℃的鼓风干燥箱中干燥后密封保存备用。样品垫处理液为0.2mol/L pH为8.0的PBS溶液，其中BSA的含量为0.1％，酪蛋白含量为0.5％，曲拉通-100的含量为0.3％，PVP-40的含量为1.5％。

12、胶体金检测卡的组装

将制备好的样品垫5、呋喃唑酮金标垫61、呋喃它酮金标垫62、硝酸纤维素膜和吸水垫8依次粘贴在PVC底板4上。用裁切机将其斩切成宽度为3mm宽的胶体金试纸条，胶体金试纸条装在壳体1中，壳体盖11扣在壳体1上面。组装好的检测卡放于有干燥剂的铝箔袋中密封保存。

检测卡的使用

1)组织样本的处理。3g已均质好的组织样本于50ml离心管中，加入6ml去离子水、750ul 1M盐酸和300ul衍生化试剂，震荡混合2min，置于60℃水浴锅内水浴30min。加入7.5ml 0.1M磷酸氢二甲、600ul 1M氢氧化钠和10ml乙酸乙酯，震荡混合1min，4000r/min离心10min。取5ml上层液于玻璃管内，于56℃氮气流或空气流下吹干。加入1ml正己烷，将残余物完全溶解，再加入0.3ml样本稀释液，震荡混匀30s，4000r/min离心5min,洗去上层液体。

2)取出胶体金检测卡放置在平整的桌面上，吸取60ul下层液加入加样空中，3-5min后判读结果。

结果判读

1)如图2所示，当检测卡检测线T1和T2处均不显色、质控线C显色时，表示检测样本中呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物含量高于或等于检测卡灵敏度；

2)如图3所示，当检测卡的检测线T1处不显色、检测线T2处和质控线C处显色时，则表示呋喃唑酮代谢物含量高于或等于检测卡的检测灵敏度，而呋喃它酮代谢物的含量低于检测卡的灵敏度；

3)如图4所示，当检测线T1和质控线C处显色、T2处不显色时，则表示呋喃它酮代谢物的含量高于或等于检测卡的灵敏度而呋喃唑酮代谢物的含量低于检测卡的灵敏度；

4)如图5所示，当检测卡的质控线C处不显色时，检测线无论T1和T2处是否显色都表示检测卡失效。

以上结合最佳实施例对本实用新型进行了描述，但本实用新型并不局限于以上揭示的实施例，而应当涵盖各种根据本实用新型的本质进行的修改、等效组合。

Claims (6)

1.一种呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物胶体金双联检测卡，包括壳体(1)，所述壳体(1)上设有加样孔(2)和观察窗(3)，壳体(1)内设有胶体金试纸条，其特征在于,所述胶体金试纸条包括底板(4)，所述底板(4)上依次衔接有样品垫(5)、胶体金垫(6)、包被膜(7)和吸水垫(8)；所述的包被膜(7)上设有一条呋喃唑酮代谢物-载体蛋白偶联物检测线T1、一条呋喃它酮代谢物-载体蛋白偶联物检测线T2和一条羊抗兔二抗质控线C，该三条线平行排列。

2.根据权利要求1所述的一种呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物胶体金双联检测卡，其特征在于，所述包被膜(7)两端分别与吸水垫(8)和胶体金垫(6)相互交叠连接，所述样品垫(5)压贴在胶体金垫(6)上。

3.根据权利要求1所述的一种呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物胶体金双联检测卡，其特征在于，所述胶体金垫(6)包括呋喃唑酮金标垫(61)和呋喃它酮金标垫(62)，所述呋喃唑酮金标垫(61)和呋喃它酮金标垫(62)相互交叠连接。

4.根据权利要求1所述的一种呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物胶体金双联检测卡，其特征在于，所述样品垫(5)为玻璃纤维样品垫。

5.根据权利要求1所述的一种呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物胶体金双联检测卡，其特征在于，所述底板(4)为PVC板。

6.根据权利要求1所述的一种呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物胶体金双联检测卡，其特征在于，所述包被膜(7)为硝酸纤维素膜。