CN204719054U - 同时检测黄曲霉毒素m1和三聚氰胺的快速检测卡 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种能同时检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的快速检测卡，本实用新型利用胶体金免疫层析技术，黄曲霉毒素M1单克隆抗体和三聚氰胺单克隆抗体分别标记在胶体金颗粒表面，将标记的胶体金免疫复合物按1:1比例混合，均匀涂布在金标结合垫上，实现一次性同时检测两种物质的目的。黄曲霉毒素M1和三聚氰胺快速检测卡，由外部的塑料卡壳和置于内部的胶体金试纸条组成。胶体金试纸条由样品垫，金标结合垫，NC膜，底板，吸水纸组成，上塑料卡壳上设有加样孔和观察窗，下塑料卡壳上设有用来固定胶体金试纸条的定位槽。本实用新型检测卡具有检测速度快，操作简洁，成本低，重复性好，适用性强的特点。能同时测定样本中的黄曲霉毒素M1和三聚氰胺，大大提高了检测效率，并且降低了检测成本。

Description

同时检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的快速检测卡

技术领域

本实用新型属于快速检测试剂领域，具体为一种同时检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的快速检测卡。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉（aspergillus flavus）、寄生曲霉（a.parasiticus）产生的次生代谢产物，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类毒素。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物，黄曲霉毒素（Aflatoxins）主要包括B1，B2，G1，G2，M1，M2等十几种类型。其中黄曲霉毒素M1是哺乳类动物摄入被黄曲霉毒素B1污染的饲料或食品后，在体内通过羟基化作用转化成的。黄曲霉毒素M1危害主要表现在致癌性和致突变性，对人及动物肝脏组织有破坏作用，可导致肝癌甚至死亡。在畜牧业中，如果奶牛食用了被黄曲霉污染的饲料，大部分黄曲霉毒素会在奶牛体内代谢为黄曲霉毒素M1，并继续存在于牛乳汁中，被人食用产生危害，尤其是对婴儿的危害更大。我国（GB 2761-2011）规定乳及乳制品中黄曲霉毒素M1限量标准为0.5ug/Kg。

三聚氰胺（Melamine），俗称密胺、蛋白精，它是白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水（3.1g/L常温），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等，不溶于丙酮、醚类、对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。自三鹿奶粉事件后，我国加强了对乳及乳制品中三聚氰胺的监测，制定了三聚氰胺在食品中的限量标准，婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/Kg，液态奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/Kg。

黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的检测方案主要有高效液相色谱法，气相色谱-质谱联用，液相色谱-质普联用，荧光测定，酶联免疫试剂盒等，这些方法对仪器设备、操作技能等的要求很高，并且检测时间长，价格昂贵，操作复杂，不能满足食品企业对于检测快速、高效、简便的要求。并且我国奶牛养殖业规模化程度相对不高，奶企需从散户或者小规模养殖企业收奶，此时，有一款能够适合于现场快速检测的产品十分必要。

现有技术中有单独检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的检测卡，但须分别检测，造成检测重复、耗时、浪费原料，本实用新型可同时测定样本中的黄曲霉毒素M1和三聚氰胺，简便、快速、节约成本。

发明内容

本实用新型的目的在于开发一种能够同时检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的产品，以便能够同时检测液态奶及奶制品中的黄曲霉毒素M1和三聚氰胺。

为实现上述目的，本实用新型采用以下技术方案：

黄曲霉毒素M1和三聚氰胺快速检测卡，由上下两块塑料卡壳和置于内部的胶体金试纸条组成。胶体金试纸条由样品垫（1），金标结合垫（2），NC膜（3），底板（4），吸水纸（5）组成，所述金标结合垫、NC膜、吸水纸以水平方向顺序相接固定在底板下方，金标结合垫、NC膜、吸水纸相邻部分各有1-2mm的重叠区域，上述金标结合垫上粘有样品垫。上塑料卡壳上设有加样孔（9）和观察窗（10），并且下塑料壳上设有用来固定胶体金试纸条的定位槽。

所述NC膜上从样品垫方向到吸水纸方向，依次设有检测线1（7）、检测线2（6）和质控线（8）。所述检测线1（7）包被的是牛血清白蛋白偶联的黄曲霉毒素M1结合物，检测线2（6）包被的是牛血清白蛋白偶联的三聚氰胺结合物，质控线（8）包被的是羊抗鼠二抗。

所述的金标结合垫上标记有黄曲霉毒素M1的单克隆抗体和三聚氰胺的单克隆抗体。

所述的底板为聚氯乙烯材料，所述的NC膜为硝酸纤维素膜，所述金标结合垫和样品垫为无纺布，吸水纸为滤纸。

本实用新型的有益效果为：

1. 多项检测。本实用新型检测卡可以同时检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的含量。

2. 灵敏度高。本实用新型检测卡黄曲霉毒素M1检测限最低可达0.5ug/Kg，三聚氰胺的最低检测限可达1mg/Kg，能够满足国标对乳制品中这两类物质的限量要求，适合各奶企和养殖户的应用。

3. 操作简便、检测快速。本实用新型检测卡检测液态奶中的黄曲霉毒素M1和三聚氰胺时无需稀释直接点样，在3-5分钟内完成2个项目的检测，大大提高了检测效率，检测奶粉只需将奶粉用纯水溶解后检测，操作简便，无需特殊培训，普通工人均可操作。

4. 降低成本、节约资源。本检测卡一张卡可同时检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺，节约了研制、生产和用户的成本。

附图说明：

图1为本实用新型检测卡中胶体金试纸条的侧面结构示意图。其中1为样品垫，2为金标结合垫，3为NC膜，4为底板，5为吸水纸，6为检测线2，7为检测线1，8为质控线。

图2为本实用新型检测卡俯视图，9为加样孔，10为观察窗。

图3为本实用新型检测结果判定示意图。

具体实施方式：

下面结合附图对本实用新型的实施例作详细说明：本实施例以本实用新型技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但具体的实施例仅用于解释本实用新型，而不用于限制本实用新型。

本实例先用2%的柠檬酸三钠溶液制备30nm的胶体金溶液，将黄曲霉毒素M1和三聚氰胺单克隆抗体分别标记在胶体金上，之后将标记好的两种胶体金免疫复合物按1:1比例混合均匀，再喷金标垫。 黄曲霉毒素M1-BSA偶联物、三聚氰胺-BSA偶联物，羊抗鼠多克隆抗体分别包被至检测线1（7）、2（6）、质控线（8），然后组装胶体金试纸条，室温干燥保存备用。

实施例：

1.筛选原料

筛选灵敏度合适的黄曲霉毒素M1单克隆抗体、三聚氰胺单克隆抗体、黄曲霉毒素M1-BSA偶联物、三聚氰胺-BSA偶联物，以及确定抗原、抗体的组合情况。

2.胶体金的制备

将0.01%氯金酸溶液加热煮沸，之后迅速加入2%的柠檬酸三钠1mL；

溶液的颜色由浅蓝色变为深蓝，继续加热出现樱桃红色，继续加热10min；出现透明的樱桃红色，停止加热，继续搅拌至室温。这样就制备了30nm的胶体金溶液。用电镜镜检制备胶体金溶液的质量，确保制备的金颗粒大小一致、均匀，颗粒直径在30nm左右。

3.制备金标结合垫

取1 mL胶体金溶液，向其中加入适量0.2M碳酸钾溶液，震荡混匀，测定 pH将pH值调节为7.5左右；加入1mg/mL的黄曲霉毒素单克隆抗体5uL然后混匀，于振荡器上振荡30 min；再加入10 uL的20%BSA，混匀，振荡10 min；于离心机中10000 rpm，离心10 min，轻轻吸除上清；用1mL洗涤液重悬胶体金沉淀，用移液器轻轻吸打几次；于离心机中10000 rpm，离心10 min，轻轻吸除上清；再洗涤一次，离心，去除上清；

用同样的方法将三聚氰胺单克隆抗体标记在胶体金颗粒表面，然后将两种胶体金免疫复合物按1:1的比例混合，再用复溶液稀释，使稀释后的胶体金免疫复合物在530nm处OD（吸光度）值为1.0-1.5；在无纺布上点样，均匀涂布，形成胶金垫，真空冻干3小时。

4.包被

分别将0.7mg/mL和1.0mg/mL的黄曲霉毒素M1-BSA偶联物和三聚氰胺-BSA偶联物划在硝酸纤维素膜的检测线（T线）上，将1.5mg/mL羊抗鼠多克隆抗体划在质控线（C线）上。然后将硝酸纤维素膜置于烘箱中37℃干燥3小时。

5.试纸条组装

    将制备好的金标结合垫和包被好的硝酸纤维素膜按图1组装，将以上粘贴好的试纸条板，用切条机进行切条，条宽设为4mm，然后将切好的试纸条装入塑料卡壳中，将组装好的检测卡，装入铝箔袋同时放入干燥剂密封保存。

6.试纸条的使用及结果判读

检测前，先将样本和检测卡置于室温下平衡1小时。

然后把检测卡平放，将样品滴入到检测卡的加样孔中，加入3-4滴样本，由于毛细效应，液体向上层析，与固定在T线、C线上的抗原和二抗结合而被截留，显色。5min后 ，根据T1、T2、C线的显色情况判定阴阳性结果（附图3）。C线与T1线、T2线均出现红色指示线，结果为阴性，表明样本中黄曲霉毒素M1的含量小于0.5ug/L，三聚氰胺的含量小于1mg/L。C线与T1线出现红色指示线，T2线不显色，结果为三聚氰胺为阳性，表明样本中的黄曲霉毒素M1的含量小于0.5ug/L，三聚氰胺含量大于1mg/L。C线与T2线出现红色指示线， T1线不显色，结果为黄曲霉毒素M1为阳性，表明样本中的黄曲霉毒素M1含量大于0.5ug/L，三聚氰胺的含量小于1mg/L。C线出现红色指示线，T1、T2线不显色，结果为黄曲霉毒素M1和三聚氰胺均为阳性，表明样本中黄曲霉毒素M1含量大于0.5ug/L，三聚氰胺含量大于1mg/L。C线不出线，表明检测卡失效。

实施例可直接检测样品中的黄曲霉毒素M1和三聚氰胺，使用方法不需要特殊专业培训，操作方便、快速，5min即可获得结果，可达到快速、简便、及时检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的目的。

Claims (4)

1.同时检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的快速检测卡，其特征在于检测卡由塑料卡壳和置于其中的胶体金试纸条组成，试纸条是由样品垫、金标结合垫、NC膜和吸水滤纸依次顺序相接黏贴在底板上组成，塑料卡壳正面设有加样孔和观察窗，金标结合垫上均匀涂布了标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体和三聚氰胺单克隆抗体的胶体金颗粒，而硝酸纤维素膜上，包被了偶联BSA的M1抗原和偶联BSA的三聚氰胺抗原，固定于两条检测线即T线上，羊抗鼠二抗固定于质控线即C线上。

2.根据权利要求1所述的同时检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的快速检测卡其特征在于，底板为聚乙烯材料，NC膜为硝酸纤维素膜，样品垫和金标结合垫为无纺布，吸水纸为滤纸。

3.根据权利要求1所述的同时检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的快速检测卡其特征在于，胶体金的粒径在30nm左右，胶体金颗粒上标记的黄曲霉毒素M1单克隆抗体的浓度为5ug/ml，三聚氰胺单克隆抗体的浓度为5ug/ml，胶体金免疫复合物均匀涂布在无纺布上，形成金标结合垫，真空冷冻干燥3h。

4.根据权利要求1所述的同时检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的快速检测卡其特征在于，硝酸纤维素膜上包被偶联BSA的M1抗原浓度为0.7mg/ml，偶联BSA的三聚氰胺抗原浓度为1.0mg/ml，羊抗鼠二抗的浓度为1.5mg/ml。