CN201984071U

CN201984071U - 一种重要发热病原抗体快速筛查的蛋白悬浮芯片***

Info

Publication number: CN201984071U
Application number: CN2010206284752U
Authority: CN
Inventors: 王静; 杨永莉; 徐宝梁; 杨宇
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2010-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2020-11-24

Abstract

本实用新型公开了一种用于重要发热病原抗体快速筛查蛋白悬浮芯片***包括：芯片基体、加液***、悬浮芯片检测仪和计算机，芯片基体内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有若干个编码微球，编码微球上包被有相应的捕获抗原，加液***依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗，荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的颜色，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。悬浮芯片技术利用微球在溶液中反应，利用激光检测技术，提高了样品检测的准确性和重复性，具有操作简便、重复性好等特点。

Description

一种重要发热病原抗体快速筛查的蛋白悬浮芯片***

技术领域

本实用新型涉及同时检测几种重要发热病原抗体的检测如结核抗体、流感抗体、禽流感抗体、鼠疫抗体、SARS抗体这几种抗体的蛋白悬浮芯片***。

背景技术

2003年全球SARS流行、亚洲各国频频爆发的禽流感、登革热、中缅边境的恶性疟疾、此起彼伏的脑炎、流感、又进入活跃期的鼠疫、美国的西尼罗热、非洲的埃博拉出血热等，引起民众对传染病的广泛恐惧。世界卫生组织2002年关于传染病的分析报告中指出，全世界每小时有1500人死于传染病。而发热是传染病最常见最为突出的临床症状之一。目前已知能引起发热的物质有许多种，但与发热最相关的是生物源的，如结核分枝杆菌、流感病毒、禽流感病、鼠疫菌、SARS、毒炭疽杆菌、登革病毒、西尼罗病毒、肺炎衣原体、支原体感染等。由于每一个感染者都是一个快速流动、难以控制的传染源，实施快速检测，及时、快速鉴别病原是传染病防控早发现、早预警、早处置的基础和前提。目前病原的快速检测技术发展很快，针对不同的生物标识物分别发展了不同的快速检测方法。如检测核酸的各类PCR、原位杂交、DNA芯片、NASBA等技术，检测蛋白质等抗原、抗体物质的ELISA、免疫层析技术、蛋白芯片技术等，都具有各自的特点。针对病原核酸的PCR等快速检测技术需依赖仪器的基因扩增和电泳过程，也依赖操作人员的技术水平，难以满足口岸现场简便快速筛查需要。一般的方法主要检测单种病原或传染病，面对一个发热患者，难以实现多病因的同时筛查。快速筛查是早期识别传染病的关键，传染病的快速检测技术水平不仅关系人民的生命健康，也关系着中国的检疫水平在国际上的可信程度和声誉，影响着我国对外的人员交流活动和国家的国际形象，也影响着能否控制传染病的传入传出避免外事纠纷。因此，快速检测技术的提高是传染病防控工作非常重要的环节，加强快速检测技术应用基础研究刻不容缓，具有非常重要的意义：既是提高我国卫生检疫防疫整体工作水平和质量的需要，又维护我国公共卫生安全的需要。

悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片(liquid array，liquid chip)，是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.5μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道，检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。

与以往的技术相比，当今发展的生物芯片技术可以实现把几种发热病原一次性联合检测的目的，目前产生的悬浮芯片技术还是生物芯片的一种，它除了可以检测多种病原以外，还具有比ELISA反应更加充分的液相环境，且具有省时省力，特异性强，灵敏度高，并且无创伤的优点。因此研制和开发一种重要发热病原快速筛查***对我国出入境人员的快速检测其有无携带传染病原的监测有重要的研究意义。

实用新型内容

本实用新型的目的在于为人们提供一种重要发热病原抗体快速筛查的蛋白悬浮芯片***，该芯片***包括：芯片基体、加液***、悬浮芯片检测仪和计算机，其中，芯片基体内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有027号、031号、032号、033号、043号、044号编码微球，各种编码微球上分别包被有相应的捕获抗原，加液***依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗、荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，反应后的溶液吸入到微细管检测通道中，以使得每个编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的荧光信号，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。

进一步，所述相关缓冲溶液包括用于所述待测抗体稀释的样品稀释液、稀释所述编码微球所用的微球稀释液、稀释所述生物素标记的二抗所用的抗体稀释液、每个反应之后洗涤编码微球所用的微球清洗液、SA-PE稀释液、检测缓冲液。

进一步，结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白抗原作为捕获抗原来包被所述027号编码微球，流感NP蛋白抗原作为捕获抗原来包被所述031号编码微球，LAM抗原作为捕获抗原来包被所述033号编码微球，禽流感H5抗原作为捕获抗原来包被所述032号编码微球，鼠疫菌F1抗原作为捕获抗原来包被所述043号编码微球，SARS-CoV N蛋白抗原作为捕获抗原来包被所述044号编码微球。

进一步，所述待测抗体为血清样品。

进一步，所述生物素标记的二抗优选为Biotin-羊抗兔和/或Biotin-羊抗人IgG。

进一步，所述荧光信号检测物为链亲和素-藻红蛋白。

进一步，所述芯片基体为96孔滤板或者微量离心管。

进一步，所述检测激光包括用激发所述编码微球基质中的颜色、识别编码微球分类编码以确定检测项目的红色激光，用于激发并识别待测分子的颜色信号、记录信号强弱以检测所述待测抗体的含量的绿色激光。

经过大量试验和深入的研究，对同步筛查结核分枝杆菌抗体、流感病毒抗体、禽流感病毒抗体、鼠疫杆菌抗体、SARS病毒抗体的蛋白悬浮芯片制备及其检测条件作了实质性的改进和创新，其具有下列优点：

1、抗原包被量的改进

抗原的包被量是成功检测的关键，本实用新型对包被微球的抗原包被量进行实质性优化使血清样本的检测效果非常良好，并且包被悬浮芯片所需的抗原包被量很低，本实用新型的抗原包被量为0.01～250μg/1.25×10⁶个微球，即0.004～1000ng/5000个微球/测试，而传统免疫学ELISA方法的包被量为1μg/测试。

2、生物素标记的改进

通常，标记抗体需要使用过量的生物素。理论上讲，在检测过程中，过量的生物素因未标记上抗体而不被微球上结合捕获抗体的抗体连接，清洗时被抽滤掉，不会与随后加入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际检测过程中，偶尔遇到过检测信号可能过高的现象，出现假阳性，因此建议生物素标记抗体后，尽量去除多余的生物素。以标记2mg/mL的IgG(分子量150,000)1mL溶液为例，需加入10mM生物素溶液约27μL。

3、检测的灵敏度

本实用新型一种重要发热病原抗体快速筛查的蛋白悬浮芯片***检测结核抗体的灵敏度为1.5815ng/mL；检测流感抗体灵敏度为968.8ng/mL；检测禽流感病毒抗体灵敏度为69.4ng/mL；检测鼠疫杆菌抗体灵敏度为6.29475ng/mL；检测SARS病毒抗体灵敏度为15.5265ng/mL。

4、方法的特异性

本实用新型通过选用结核分枝杆菌的38KD蛋白、16KD蛋白、LAM抗原，流感NP蛋白、禽流感H5抗原、鼠疫菌F1抗原、SARS-CoV N蛋白为包被抗原，分别以兔抗结核抗体、鼠抗流感NP IgG、鼠抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、兔抗SARS IgG为待测抗体，以生物素化的羊抗兔IgG/羊抗鼠IgG为捕获抗体。本研究试验证明：各对应的抗原特异性的与对应抗体结合，不与其它抗体发生交叉反应，说明本方法具有良好的特异性。

5、样品的检测能力

本实用新型评价了蛋白悬浮芯片方法对人血清的检测能力。通过对人血清的检测，初步证实了该方法在检测人血清中结核分枝杆菌抗体、流感病毒抗体、禽流感病毒抗体、鼠疫杆菌抗体、SARS病毒抗体的实用性。

附图说明

图1为本实用新型结构示意图；

图2为蛋白悬浮芯片***检测多种病原抗体示意图；

图3为蛋白悬浮芯片***检测兔抗结核抗体剂量-反应标准曲线图；

图4为蛋白悬浮芯片***检测鼠抗流感NP剂量-反应标准曲线图；

图5为蛋白悬浮芯片***检测鼠抗禽流感H5N1抗体剂量-反应标准曲线图；

图6为蛋白悬浮芯片***检测兔抗鼠疫F1抗体剂量-反应标准曲线图；

图7为蛋白悬浮芯片***检测兔抗SarsN13抗体剂量-反应标准曲线图。

具体实施方式

如图1至图7所示，本实用新型一种重要发热病原抗体快速筛查的蛋白悬浮芯片***，包括芯片基体1、加液***2、悬浮芯片检测仪3和计算机4，其中，芯片基体1为96孔滤板或者微量离心管，其内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有若干种编码微球，各种编码微球上包被有相应的捕获抗原，编码微球包括027号编码微球、031号编码微球、032号编码微球、033号编码微球、043号编码微球、044号编码微球，其中，结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白抗原作为捕获抗原来包被27号羧基微球，流感NP蛋白抗原作为捕获抗原来包被31号羧基微球，LAM抗原作为捕获抗原来包被33号编码微球，禽流感H5抗原作为捕获抗原来包被32号编码微球，鼠疫菌F1抗原作为捕获抗原来包被43号编码微球，SARS-CoV N蛋白抗原作为捕获抗原来包被44号编码微球。

结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白、LAM抗原，流感NP蛋白、禽流感H5抗原、鼠疫菌F1抗原、SARS-CoV N蛋白用于捕获待检测血清样品中的待测抗体。例如：如果样品中有结核抗体，结核抗体与编码微球上的结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白结合，再加入带有生物素标记的二抗，形成编码微球-结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白-结核抗体-二抗-生物素复合物，最后加入链亲和素-藻红蛋白，链亲和素与生物素结合，形成编码微球-结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白-结核抗体-二抗-生物素复-链亲和素-藻红蛋白复合物，通过悬浮芯片检测仪对藻红蛋白荧光信号的检测来达到对血清样品中结核抗体的检测，如果血清样品中没有结核抗体，包被有结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白的编码微球不会与后面加入的生物素标记的二抗、链亲和素-藻红蛋白结合，最后通过悬浮芯片检测仪器进行检测时无荧光信号或应该信号非常弱。

同理：如果样品中有流感抗体，流感抗体与编码微球上的流感NP蛋白结合，再加入带有生物素标记的二抗，形成编码微球-流感NP蛋白-流感抗体-二抗-生物素复合物，最后加入链亲和素-藻红蛋白，链亲和素与生物素结合，形成编码微球-流感NP蛋白-流感抗体-二抗-生物素-链亲和素-藻红蛋白复合物，通过悬浮芯片检测仪对藻红蛋白荧光信号的检测来达到对血清样品中流感抗体的检测，如果血清样品中没有土拉抗体，包被有流感NP蛋白的编码微球不会与后面加入的生物素标记的二抗、链亲和素-藻红蛋白结合，最后通过悬浮芯片检测仪器进行检测时无荧光信号或应该信号非常弱。

如果样品中有禽流感抗体，禽流感抗体与编码微球上的禽流感H5蛋白结合，再加入带有生物素标记的二抗，形成编码微球-禽流感H5蛋白-禽流感抗体-二抗-生物素复合物，最后加入链亲和素-藻红蛋白，链亲和素与生物素结合，形成编码微球-禽流感H5蛋白-禽流感抗体-二抗-生物素-链亲和素-藻红蛋白复合物，通过悬浮芯片检测仪对藻红蛋白荧光信号的检测来达到对血清样品中禽流感抗体的检测，如果血清样品中没有禽流感抗体，包被有禽流感H5蛋白的编码微球不会与后面加入的生物素标记的二抗、链亲和素-藻红蛋白结合，最后通过悬浮芯片检测仪器进行检测时无荧光信号或应该信号非常弱。

如果样品中有鼠疫抗体，鼠疫抗体与编码微球上的鼠疫F1蛋白结合，再加入带有生物素标记的二抗，形成编码微球-鼠疫F1蛋白-鼠疫抗体-二抗-生物素复合物，最后加入链亲和素-藻红蛋白，链亲和素与生物素结合，形成编码微球-鼠疫F1蛋白-鼠疫抗体-二抗-生物素-链亲和素-藻红蛋白复合物，通过悬浮芯片检测仪对藻红蛋白荧光信号的检测来达到对血清样品中登革热抗体的检测，如果血清样品中没有鼠疫抗体，包被有鼠疫F1蛋白的编码微球不会与后面加入的生物素标记的二抗-链亲和素-藻红蛋白结合，最后通过悬浮芯片检测仪器进行检测时无荧光信号或应该信号非常弱。

如果样品中有SARS抗体，SARS-CoV N抗体与编码微球上的SARS-CoV N蛋白结合，再加入带有生物素标记的二抗，形成编码微球-SARS-CoV N蛋白-SARS抗体-二抗-生物素复合物，最后加入链亲和素-藻红蛋白，链亲和素与生物素结合，形成编码微球-SARS-CoV N蛋白-SARS抗体-二抗/SPA-生物素-链亲和素-藻红蛋白复合物，通过悬浮芯片检测仪对藻红蛋白荧光信号的检测来达到对血清样品中SARS抗体的检测，如果血清样品中没有SARS抗体，包被有SARS-CoV N蛋白的编码微球不会与后面加入的生物素标记的二抗、链亲和素-藻红蛋白结合，最后通过悬浮芯片检测仪器进行检测时无荧光信号或应该信号非常弱。

上述芯片***中，编码微球在微球稀释液，待测抗体在样品稀释液中，生物素标记的二抗在抗体稀释液中，荧光信号检测物在SA-PE稀释液中，悬浮芯片检测仪检测时编码微球复合物在检测缓冲液中，每步结合之后均用微球清洗液洗涤微球，使得没有结合的物质清除体系。

悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.6μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。悬浮芯片技术由于利用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。

本实用新型一种重要发热病原抗体快速筛查的蛋白悬浮芯片***，通过下面的具体实施方式作进一步说明，但本实用新型不以任何方式受该实施例的限定。

一、材料

1.蛋白悬浮芯片的相关缓冲液：

(1)PBS缓冲液(pH7.4)：NaCl 137mmol/L；KCl 2.7mmol/L；Na₂HPO₄10mmol/L；KH₂PO₄ 2mmol/L。用800mL蒸馏水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄。用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。分装后在15psi(1.05kg/cm²)高压蒸汽20分钟，或过滤除菌，保存于室温。

(2)微球清洗液：PBS(pH7.4)，0.05％TWEEN-20。

(3)微球活化缓冲液100mM NaH₂PO₄：3g NaH₂PO₄，5N NaOH 1.5mL，定容于250mL，pH 6.2。

(4)微球包被缓冲液0.05M MES，pH 5.0：2.44g MES，5N NaOH0.15mL，定容于250mL。

(5)微球保存液PBS-TBN：PBS，0.1％BSA，0.02％TWEEN，0.05％叠氮化物，pH 7.4。

(6)微球封闭液PBS-BN：PBS，1％BSA，0.05％叠氮化物，pH7.4。

(7)检测缓冲液：PBS，1％BSA，pH7.4。

(8)抗体稀释液PBS，pH7.4。。

(9)微球稀释液：PBS，1％BSA，pH7.4。

(10)样品稀释液PVX：PBS，0.5％PVA，0.8％PVP；

(11)SA-PE稀释液：PBS(pH7.4)，1％BSA。

2.抗原与抗体

本实用新型所使用的抗原为结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白、LAM抗原，流感NP蛋白、鼠疫菌F1抗原、SARS-CoV N蛋白可购自事医学科学研究院微生物研究所，禽流感H5蛋白可购自中国农科院哈尔滨兽医研究所。

本实用新型所使用检测抗体为兔抗土拉IgG，可购自中国检验检疫科学研究院，兔抗登革热2型抗体可购自军事医学科学研究院微生物研究所，检测二抗为生物素化羊抗兔IgG和生物素化羊抗人IgG，所述的羊抗兔IgG可购自北京鼎国生物技术公司。

二、待测样品的制备

1、目标分析物样品的制备

目标分析物为兔抗结核抗体、鼠抗流感NP IgG、鼠抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、兔抗SARS IgG为待测抗体，以生物素化的羊抗兔IgG/羊抗鼠IgG为捕获抗体。

将待分析的抗体用样品稀释液以4倍倍比系列稀释为不同浓度样品，以绘制样品检测剂量-反应的标准曲线，其中几个样品浓度低于检测的敏感度，高浓度样品应使编码微球的结合位点处于饱和状态。

2、人血清样本的处理

将人血清样本用样品稀释1∶10稀释，例如人血清样本5μL加样品稀释液50μL混匀后，作为待检样品进行悬浮芯片方法的检测。

实施例1：一种重要发热病原抗体快速筛查的蛋白悬浮芯片的制备

1.分别取27，31，32，33，43，44号编码微球，用漩涡振荡器振荡微球悬液，时间30s，超声30秒，使微球混合均匀；

2.分别取上述各编码微球1.25×106个到1.5mL离心管中，10000g～14000g离心4min，小心吸出上清并弃去；

3.加入100μL的珠球洗涤缓冲液(PBS，pH7.4，0.05％TWEEN-20)悬浮微球，震荡30秒，超声30秒，10000g～14000g离心4min，小心吸出上清并弃去；

4.加入80μL的珠球活化缓冲液(3g NaH₂PO₄，5N NaOH40drops/250mL H₂O)，用漩涡振荡器振荡微球悬液；

5.加入10μL新鲜配置的EDC(50mg/mL)，紧接着加入10μL新鲜配置的Sulfo-NHS(50mg/mL)，高速震荡30秒后用铝箔包裹，在室温震摇20min；

6.加入150μL的PBS(pH7.4)，震荡10秒后，10000g～14000g离心4min，小心吸出上清并弃去；

7.重复上步骤一次；

8.加入100μL的PBS(pH7.4)悬浮编码微球，中速震荡30秒后，超声15秒；

9.分别取抗原：结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白、流感NP蛋白、LAM抗原、禽流感H5抗原、鼠疫菌F1抗原、SARS-CoV N蛋白1-10μg加入到活化后的编码微球中，用PBS(pH7.4)定溶至500μL；

10.铝箔包裹在室温震摇2h，10000g～14000g离心4min，小心吸出上清，弃去；

11.用500μL的PBS(pH7.4)洗一次，10000g～14000g离心4min，小心吸出上清，弃去；

12.加入250μL的封闭缓冲液(PBS(pH7.4)，1％BSA，0.05％Azide)悬浮编码微球，中速震荡15秒，用铝箔包裹，在室温震摇30min，10000g～14000g离心4min，小心吸出上清，弃去；

13.加入500μL的储备缓冲液(PBS(pH7.4)，0.1％BSA，0.02％TWEEN，0.05％叠氮化物)洗涤编码微球，10000g～16000g离心6min，小心吸出上清，弃去；

14.最后用150μL的储备缓冲液悬浮编码微球，即得结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白与27号羧基微球形成偶联体，流感NP蛋白与31号羧基微球形成偶联体，LAM抗原与33号羧基微球形成偶联体，禽流感H5抗原与32号羧基微球形成偶联体，鼠疫菌F1抗原与43号羧基微球形成偶联体，SARS-CoV N蛋白与44号羧基微球形成偶联体；

15.吸取适量微球，稀释后，用血球计数板在荧光显微镜下计数，换算出每种微球的浓度；

16.把偶联号得微球放在4℃避光保存，一般每种抗原偶联体的微球单独保存，使用时，依据检测项目选择混合。

实施例2：样品的蛋白悬浮芯片检测：

采用间接法的免疫学检测模式，检测过程中全部反应均在96孔滤板上进行。

1.每孔加入150μL检测缓冲液预湿孔，用真空泵抽滤；

2.每孔加入50μL含相应编码微球的工作溶液，洗液洗涤并用真空泵抽滤两次；

3.加入50μL稀释的检测样品，混匀后室温避光震摇30min，洗液洗涤并抽滤三次；

4.加入50μL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化二抗，混匀后室温避光震摇30min，洗液100μL洗涤3次，并真空泵抽滤；

5.加入50μL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10min。洗液100μL洗涤3次，并真空泵抽滤；

6.加入125μL的检测缓冲液，经振荡使小球重悬均匀；

7.用Bio-Plex悬浮芯片***读取FMI数值并分析数据。

实施例3：蛋白悬浮芯片***对不同浓度兔抗TB IgG的检测

1.各抗原与不同编码微球偶联，具体操作方法如实施例1，得到不同抗原与编码微球的偶联体；

2.取包被有抗原结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27号羧基微球偶联体，禽流感H5抗原的32号羧基微球偶联体，鼠疫菌F1抗原的43号羧基微球偶联体，SARS-CoV N蛋白的44号羧基微球偶联体，各3500个，加入同一离心管中，加微球稀释液至总体积50μL作为多重微球体系的检测工作溶液；

3.将兔抗TB IgG用样品稀释液做4倍梯度稀释作为检测的样品，兔抗TB IgG的浓度分别是：0.147ng/ml、0.588ng/ml、2.354ng/ml、9.418ng/ml、37.672ng/ml、150.687ng/ml、602.75ng/ml、2.411μg/ml；

4.具体的检测操作步骤如实施例2；

5.各微球检测兔抗TB的得到的MFI值见下表1，蛋白悬浮芯片体系检测兔抗TB的标准曲线：

FI＝2.32671+(5582.99-2.32671)/[1+(Conc/331.934)^-1.42723]^0.78545

检测灵敏度为1.5815ng/ml。

表1 蛋白悬浮芯片体系检测兔抗TB的MFI值

实施例4：蛋白悬浮芯片***对不同浓度鼠抗流感NP抗体的检测

1.各抗原与不同编码微球偶联，具体操作方法如实施例1；得到不同抗原与编码微球的偶联体；

2.取包被有抗原结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27号羧基微球偶联体，流感NP蛋白的31号羧基微球偶联体，鼠疫菌F1抗原的43号羧基微球偶联体，SARS-CoV N蛋白的44号羧基微球偶联体，各3500个，加入同一离心管中，加微球稀释液至总体积50μL作为多重微球体系的检测工作溶液；

3.将鼠抗流感NP抗体用样品稀释液做4倍梯度稀释作为检测的样品，鼠抗流感NP抗体的浓度分别是：3.052ng/ml、12.207ng/ml、48.828ng/ml、195.312ng/ml、781.25ng/ml、3125ng/ml、12500ng/ml、50000ng/ml；

4.具体的检测操作步骤如实施例2；

5.各微球检测鼠抗流感NP抗体得到的MFI值见下表2，蛋白悬浮芯片体系检测鼠抗禽流感NP的标准曲线：

FI＝20.3844+(583.981-20.3844)/[1+(Conc/6113.06)^-2.38124]^0.349701

灵敏度为968.8ng/ml。

表2 蛋白悬浮芯片体系检测鼠抗禽流感NP的MFI值

实施例5：蛋白悬浮芯片体系对不同浓度鼠抗禽流感H5N1抗体的检测

3.将鼠抗禽流感H5N1抗体用样品稀释液做4倍梯度稀释作为检测的样品，鼠抗禽流感H5N1抗体的浓度分别是：0.305ng/ml、1.221ng/ml、4.883ng/ml、19.531ng/ml、78.125ng/ml、312.5ng/ml、1250.0ng/ml、5000.0ng/ml、20000ng/ml；

4.具体的检测操作步骤如实施例2；

5.各微球检测检测鼠抗禽流感H5N1抗体的MFI值见下表3，多重体系微球检测鼠抗禽流感H5N1的标准曲线：

FI＝11.2281+(1516.12-11.2281)/[1+(Conc/628.306)^-1.0296]^1.06526

灵敏度为69.4ng/ml。

表3 蛋白悬浮芯片体系检测鼠抗禽流感H5N1的MFI值

实施例6：蛋白悬浮芯片***对不同浓度兔抗鼠疫F1抗体的检测

3.将兔抗鼠疫F1抗体的用样品稀释液做4倍梯度稀释作为检测的样品，兔抗鼠疫F1抗体的浓度分别是：0.305ng/ml、1.221ng/ml、4.883ng/ml、19.531ng/ml、78.125ng/ml、312.5ng/ml、1250.0ng/ml、5000.0ng/ml、20000.0ng/ml、80000.0ng/ml；

4.具体的检测操作步骤如实施例2；

5.各微球检测检测兔抗鼠疫F1抗体的MFI值见下表4，蛋白悬浮芯片体系检测兔抗鼠疫F1抗体浓度的标准曲线：

FI＝4.423+(4130.55-4.423)/(1+(Conc/1853.93)^-0.986615)

灵敏度为6.29475ng/ml。

表4 蛋白悬浮芯片体系检测兔抗鼠疫F1抗体的MFI值

实施例7：蛋白悬浮芯片体系检对不同浓度兔抗SarsN13抗体的检测

3.将兔抗SarsN13抗体的用样品稀释液做4倍梯度稀释作为检测的样品，兔抗SarsN13抗体的浓度分别是：0.034ng/ml、0.137ng/ml、0.549ng/ml、2.197ng/ml、8.789ng/ml、35.156ng/ml、140.625ng/ml、562.5ng/ml、2250.0ng/ml；

4.具体的检测操作步骤如实施例2；

5.各微球检测检测兔抗SarsN13抗体的MFI值见下表5，蛋白悬浮芯片体系检测兔抗SarsN13抗体浓度的标准曲线：

FI＝8.9686+(2204.42-8.9686)/((1+(Conc/287.286)^-1.2352))^1.10117

灵敏度为15.5265ng/ml。

表5 蛋白悬浮芯片体系检测兔抗SarsN13的MFI值

实施例8：本发明所述重要发热病原抗体快速筛查的蛋白悬浮芯片***在检测人血清中结核抗体的应用。

1.取结核LAM抗原与33号编码微球偶联，具体操作方法如实施例1；得到LAM抗原与33号编码微球的偶联体；

2.将被诊断为结核病人的35份血清和53份正常健康人血清分别用样品稀释液做1∶10倍梯稀释；

3.取96孔滤板，在每孔加入150μL检测缓冲液预湿孔，用真空泵抽滤；

4.每孔加入50μL含3500个包被有LAM抗原的33号编码微球的工作溶液，洗液洗涤并用真空泵抽滤两次；

5.加入50μL稀释的检测样品，混匀后室温避光震摇30min，洗液洗涤并抽滤三次；

6.加入50μL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化羊抗人IgG，混匀后室温避光震摇30min，洗液100μL洗涤3次，并真空泵抽滤；

7.加入50μL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10min。洗液100μL洗涤3次，并真空泵抽滤；

8.加入125μL的检测缓冲液，经振荡使小球重悬均匀；

9.用Bio-Plex悬浮芯片***进行检测；

10.同样的血清样本用于市售ELISA试剂盒检测。

检测结果见表6、7，由此可见由lam抗原检测的结核抗体的检测灵敏度为68.57％、特异度为83.02％、准确度为77.27％；ELISA试剂盒检测血清中结核抗体的检测灵敏度为62.86％、特异度为94.34％、准确度为81.82％，lam抗原包被的微球用悬浮芯片检测结核抗体的灵敏度比市售ELISA法的灵敏度高，检测率也较高。

表6 lam抗原检测人血清样本中结核抗体的检测结果

表7 EILSA试剂盒检测人血清中结核抗体的检测结果

实施例9：本发明所述重要发热病原抗体快速筛查的蛋白悬浮芯片***在检测人血清中结核抗体、禽流感抗体、鼠疫抗体、SARS抗体的应用。

3.将94份人血清分别用样品稀释液做1∶10倍梯稀释；

4.取96孔滤板，在每孔加入150μL检测缓冲液预湿孔，用真空泵抽滤；

5.每孔加入50μL上述步骤2中的工作溶液，洗液洗涤并用真空泵抽滤两次；

6.加入50μL稀释的检测样品，混匀后室温避光震摇30min，洗液洗涤并抽滤三次；

7.加入50μL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化羊抗人IgG，混匀后室温避光震摇30min，洗液100μL洗涤3次，并真空泵抽滤；

8.加入50μL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10min。洗液100μL洗涤3次，并真空泵抽滤；

9.加入125μL的检测缓冲液，经振荡使小球重悬均匀；

10.用Bio-Plex悬浮芯片***进行检测。

结果判定：单个检测项目中94个人检测荧光值MFI的平均值与3倍的94个人检测荧光值MFI的标准差的和作为该检测项目的cutoff值，如果检测的MFI值＞cutoff值为阳性，反之为阴性。检测结果见下表8。

表8 多重微球体系检测人血清结果

检测项目	血清例数	cutoff值(MFI)	阳性例数	阳性率
					结核抗体	94	1322.94	18	20.0％
禽流感抗体	94	2286	7	8.0％
					鼠疫抗体	94	632.35	5	6.0％
SARS抗体	94	3123.355	8	9.0％

Claims

1.一种重要发热病原抗体快速筛查的蛋白悬浮芯片***，其特征在于，该芯片***包括：芯片基体、加液***、悬浮芯片检测仪和计算机，其中，芯片基体内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有027号、031号、032号、033号、043号、044号编码微球，各种编码微球上分别包被有相应的捕获抗原，加液***依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗、荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，反应后的溶液吸入到微细管检测通道中，以使得每个编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的荧光信号，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。

2.如权利要求1所述的蛋白悬浮芯片***，其特征在于，所述相关缓冲溶液包括用于所述待测抗体稀释的样品稀释液、稀释所述编码微球所用的微球稀释液、稀释所述生物素标记的二抗所用的抗体稀释液、每个反应之后洗涤编码微球所用的微球清洗液、SA-PE稀释液、检测缓冲液。

3.如权利要求2所述的蛋白悬浮芯片***，其特征在于，结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白抗原作为捕获抗原来包被所述027号编码微球，流感NP蛋白抗原作为捕获抗原来包被所述031号编码微球，LAM抗原作为捕获抗原来包被所述033号编码微球，禽流感H5抗原作为捕获抗原来包被所述032号编码微球，鼠疫菌F1抗原作为捕获抗原来包被所述043号编码微球，SARS-CoV N蛋白抗原作为捕获抗原来包被所述044号编码微球。

4.如权利要求2所述的蛋白悬浮芯片***，其特征在于，所述待测抗体为血清样品。

5.如权利要求2所述的蛋白悬浮芯片***，其特征在于，所述生物素标记的二抗优选为Biotin-羊抗兔IgG和/或Biotin-羊抗人IgG。

6.如权利要求2所述的蛋白悬浮芯片***，其特征在于，所述荧光信号检测物为链亲和素-藻红蛋白。

7.如权利要求2所述的蛋白悬浮芯片***，其特征在于，所述芯片基体为96孔滤板或者微量离心管。

8.如权利要求2所述的蛋白悬浮芯片***，其特征在于，所述检测激光包括用激发所述编码微球基质中的颜色、识别编码微球分类编码以确定检测项目的红色激光，用于激发并识别待测分子的颜色信号、记录信号强弱以检测所述待测抗体的含量的绿色激光。