CN1982474A - 用于sars冠状病毒检测与分型的基因芯片、方法及试剂盒 - Google Patents
用于sars冠状病毒检测与分型的基因芯片、方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于SARS冠状病毒检测与分型的基因芯片及其检测分型的方法和检测分型试剂盒。其中，该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针含有从一种或多种株型的SARS冠状病毒的s基因序列中选取的含有s基因突变位点的DNA片段以及选自SARS冠状病毒s基因保守序列的DNA片段；利用设计的引物将待检测样品cDNA进行PCR扩增并用上述基因芯片进行杂交，根据每一个检测位点不同探针的荧光比值来确定核苷酸的种类进而对检测的SARS样品进行分型。本发明将基因芯片技术引入SARS的检测和分型领域，提供了一种操作简便，准确性高，重复性强的检测方法，无论对于该病毒的检测还是流行病学研究都具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，涉及一种基因芯片(或称DNA微阵列)及其使用方法和一种试剂盒，特别涉及一种用于SARS冠状病毒检测与分型的基因芯片及其检测分型方法和检测分型试剂盒。
背景技术
非典型性肺炎引起的急性呼吸窘迫综合症(severe acute respiratorysyndrome，SARS)是一种可导致患者死亡的严重病症。这种疾病首先于2002年11月在中国的广东省被发现，截止到2003年9月，全世界已有8436人感染这种疾病，其中812人死亡，死亡率将近10％。2003年4月16日世界卫生组织(WHO)宣布SARS的病源是一种以前从未在人类中发现过的冠状病毒家族的一员。目前，SARS病毒的序列已破译，证明它是一种全新的冠状病毒。虽然在动物体内会导致严重的疾病，但在SARS冠状病毒被发现以前，以往发现的冠状病毒对人类的危害是很小的。
目前检测SARS冠状病毒的主要方法包括：荧光PCR技术(ZL专利号：03117040.4)，免疫印迹法(申请号：03126893.5)，病毒的培养与分离(virus isolation by cell culture)，反转录PCR(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)，免疫荧光法(申请号：03124299.5)及酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)等等。这些方法只能够对SARS冠状病毒进行检测，无法通过分型对其流行性进行预测。
已有研究表明介导SARS冠状病毒与宿主细胞相互识别并进入宿主细胞的一个重要因子是该病毒s基因编码的一种刺突蛋白(spike protein)(Cellular entry of the SARS ocronavirus，Trends in Microbiology，Vol.12No.10 October 2004)。有人将从不同病人身体和从果子狸身体分离到的SARS冠状病毒的s基因的序列进行比较，发现虽然在整体上s基因非常保守，但是不同毒株在某些核苷酸位点上有所区别。特别是通过从人和从果子狸体内分离到的SARS冠状病毒的s基因进行比较可以看出，这种区别更加明显。通过观察某些引起了大流行的毒株的s基因的序列，发现在特定的位点上发生了核苷酸的突变，从而造成氨基酸的改变；而从果子狸体内分离到的毒株在相应的位点上则没有发生核苷酸的突变，也就没有造成氨基酸的改变。并且这种差别与毒株的传染性或流行性有关。(MolecularEvolution Analysis and Geographic Investigation of Severe，Journal ofVirology，Sept.2005，p.11 892-11900)
另外，从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的分析检测技术建立了起来，并随着人类基因组计划的开展逐步发展起来。该技术综合运用了分子生物学技术，集成电路制造技术，计算机技术，半导体技术，共聚焦激光扫描技术，荧光标记技术，使检测过程具有敏感性高，特异性强，大规模集成化，自动化，操作简便快捷，效率高等特点，受到科研人员的青睐，并在基因表达相关研究和生物制药研究等方面得到普遍应用。因此，如果将基因芯片技术用于基因序列中单碱基突变的检测，不仅可以大大简化技术平台，而且有望实现高准确性，高灵敏度，高通量，可重复性强等优点。
综上所述，可以针对Molecular Evolution Analysis and GeographicInvestigation of Severe这篇文章中提到的SARS冠状病毒的s基因内的25个突变位点设计制备基因芯片用于对SARS冠状病毒进行检测与分型。通过对SARS冠状病毒进行分型研究，可以找出SARS冠状病毒在基因水平上与其流行性的相关性，为SARS的流行病学研究和传染性非典型肺炎的预防与控制提供有益的指导。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种用于SARS冠状病毒检测与分型的基因芯片，以补充现有检测技术可以检测SARS冠状病毒但是无法对其进行分型和流行性预测的不足。
本发明的另一目的是提供一种利用上述基因芯片进行简便、快捷、高效的检测与分型SARS冠状病毒的方法。
本发明的再一目的是提供一种至少包括基因芯片和PCR扩增引物的用于检测与分型SARS冠状病毒的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种用于SARS冠状病毒检测与分型的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其中该基因芯片上的寡核苷酸探针含有从一种或多种株型的SARS冠状病毒的s基因序列中选取的含有s基因突变位点的DNA片段以及选自SARS冠状病毒s基因保守序列的DNA片段。
在本发明的较佳实施例中，上述s基因突变位点在SARS冠状病毒基因组中的位置包含在以下位置中：21721、21907、22219-22222、22517-22522、22570、22874-22875、22906、22927-22928-22930、22951、23316-23317、23330、23485、23719、23785、23823、23952、24730、24978和22172。
在本发明的较佳实施例中，上述从一种或多种株型的SARS冠状病毒的s基因序列中选取的含有s基因突变位点的DNA片段选自具有SEQ IDNO：1-NO：106所示的核苷酸序列的DNA片段。
在本发明的较佳实施例中，上述选自SARS冠状病毒s基因保守序列的DNA片段具有如SEQ ID NO：107和NO：108所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种用于SARS冠状病毒检测与分型的方法，包括以下步骤：
(1)根据SARS冠状病毒s基因的保守区设计并制备出用于PCR扩增的引物；
(2)制备待测样品的cDNA；
(3)使用步骤(1)所述的引物对步骤(2)中所述的cDNA进行PCR扩增；
(4)将扩增产物与上述用于SARS冠状病毒检测与分型的基因芯片进行杂交；
(5)用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。
在本发明的较佳实施例中，上述步骤(1)中根据SARS冠状病毒s基因的保守区设计的引物选择具有如SEQ ID NO：109-NO：116所示的核苷酸序列的DNA片段。
本发明还提供了一种用于SARS冠状病毒检测与分型的试剂盒，其至少包括基因芯片，其包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其中，寡核苷酸探针含有从一种或多种株型的SARS冠状病毒的s基因序列中选取的含有s基因突变位点的DNA片段以及选自SARS冠状病毒s基因保守序列的DNA片段。
在本发明的一实施例中，该试剂盒还包括PCR扩增引物，该PCR扩增引物为根据SARS冠状病毒s基因的保守区设计的选自具有如SEQ IDNO：109-NO：116所示的核苷酸序列的DNA片段。
在本发明的一实施例中，该试剂盒还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件GenePix Pro 6.0。
综上所述，本发明在s基因的保守区域设计探针来进行SARS冠状病毒的检测；对不同的突变位点设计特异性的探针，通过基因芯片的杂交结果对待检毒株进行分型并可对其流行性进行预测。
本发明将基因芯片技术引入SARS的检测和分型领域，填补了芯片对SARS分型的空白，提供了一种操作简便，准确性高，重复性强的全新检测方法，无论对于该病毒的检测还是流行病学研究都具有重要意义。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
附图说明
图1为本发明的基因芯片的一个实施例的外形示意图。
图2a、2b及2c分别为图1中I、II及III区域的探针排布示意图。
图3a和3b分别为阳性样品和阴性样品与本发明一较佳实施例的基因芯片杂交后的扫描结果图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明的用于SARS冠状病毒检测与分型的基因芯片及其检测与分型的方法，特举以下较佳实施例加以说明，这些实施例是为了说明而不是以任何形式限制本发明。
实施例一寡核苷酸探针的制备
1.序列比对：利用多序列比对软件clustalx对38株不同SARS冠状病毒的s基因的序列进行比对，得出27个s基因中的突变位点。根据突变位点的数目将它们区分为4种类型：分别是原型(没有发生突变)，低致病型(2-7个位点发生突变)，高致病型(17-25个位点发生突变)和流行型(27个位点发生突变)。
2.设计探针：利用Primer5生物学软件针对25个突变位点(另外两个位点由于发生突变后没有造成氨基酸的改变，故不作为检测对象)设计出106条用于分型的寡核苷酸探针，同时在s基因的保守区中设计出两条用于检测SARS冠状病毒的探针。上述108条寡核苷酸探针详见表1。
表1.用于SARS冠状病毒分型和检测的寡核苷酸探针
| SEQ ID | 探针编号 | 探针序列 | 待检位点在基因组的位置 |
| NO：1 | S001 | 5-CGTTTGGCAACCCT-3 | 21721正意链 |
| NO：2 | S002 | 3-GCAAACCGTTGGGA-5 | 21721反意链 |
| NO：3 | S003 | 5-TACGTTTGACAACCCT-3 | 21721正意链 |
| NO：4 | S004 | 3-ATGCAAACTGTTGGGA-5 | 21721反意链 |
| NO：5 | S005 | 5-TTTCTTTGCTGTTTCTA-3 | 21907正意链 |
| NO：6 | S006 | 3-AAAGAAACGACAAAGAT-5 | 21907反意链 |
| NO：7 | S007 | 5-TTTCTTTGTTGTTTCTAA-3 | 21907正意链 |
| NO：8 | S008 | 3-AAAGAAACAACAAAGATT-5 | 21907反意链 |
| NO：9 | S009 | 5-CTCAAGACATTTGGG-3 | 22219-22222正意链 |
| NO：10 | S010 | 3-GAGTTCTGTAAACCC-5 | 22219-22222反意链 |
| NO：11 | S011 | 5-TCAAGGCATTTGGG-3 | 22219-22222正意链 |
| NO：12 | S012 | 3-AAGTTCCGTAAACC-5 | 22219-22222反意链 |
| NO：13 | S013 | 5-CTCAAGGCACTTGG-3 | 22219-22222正意链 |
| NO：14 | S014 | 3-GAGTTCCGTGAACCCCG-5 | 22219-22222反意链 |
| NO：15 | S015 | 5-TCAAGACACTTGGGG-3 | 22219-22222正意链 |
| NO：16 | S016 | 3-AGTTCTGTGAACCCC-5 | 22219-22222反意链 |
| NO：17 | S017 | 5-GGAGAGAAAAAAAATTTC-3 | 22517-22522正意链 |
| NO：18 | S018 | 3-CCTCTCTTTTTTTTAAAG-5 | 22517-22522反意链 |
| NO：19 | S019 | 5-GAGAGGAAAAAAATTTC-3 | 22517-22522正意链 |
| NO：20 | S020 | 3-CTCTCCTTTTTTTAAAG-5 | 22517-22522反意链 |
| NO：21 | S021 | 5-GAGAGGAAAAGAATTTC-3 | 22517-22522正意链 |
| NO：22 | S022 | 3-CTCTCCTTTTCTTAAAG-5 | 22517-22522反意链 |
| NO：23 | S023 | 5-GGAGAGAAAAAGAATTT-3 | 22517-22522正意链 |
| NO：24 | S024 | 3-CCTCTCTTTTTCTTAAA-5 | 22517-22522反意链 |
| NO：25 | S025 | 5-CTCAACATTTTTTTCAAC-3 | 22570正意链 |
| NO：26 | S026 | 3-GAGTTGTAAAAAAAGTTG-5 | 22570反意链 |
| NO：27 | S027 | 5-CTCAACATCTTTTTCAAC-3 | 22570正意链 |
| NO：28 | S028 | 3-GAGTTGTAGAAAAAGTTG-5 | 22570反意链 |
| NO：29 | S029 | 5-CTTTCTCCCCTGATGG-3 | 22874-22875正意链 |
| NO：30 | S030 | 3-GAAAGAGGGGACTACC-5 | 22874-22875反意链 |
| NO：31 | S031 | 5-CTTTCTCTCCTGATGG-3 | 22874-22875正意链 |
| NO：32 | S032 | 3-GAAAGAGAGGACTACC-5 | 22874-22875反意链 |
| NO：33 | S033 | 5-CCTTTCTCTTCTGATGG-3 | 22874-22875正意链 |
| NO：34 | S034 | 3-CGAAAGAGAAGACTACC-5 | 22874-22875反意链 |
| NO：35 | S035 | 5-CTTTCTCCTCTGATGG-3 | 22874-22875正意链 |
| NO：36 | S036 | 3-GAAAGAGGAGACTACC-5 | 22874-22875反意链 |
| NO：37 | S037 | 5-CACCTGCTCTTAATTG-3 | 22906正意链 |
| NO：38 | S038 | 3-GTGGACGAGAATTAAC-5 | 22906反意链 |
| NO：39 | S039 | 5-CACCTGCTCCTAATTG-3 | 22906正意链 |
| NO：40 | S040 | 3-GTGGACGAGGATTAAC-5 | 22906反意链 |
| NO：41 | S041 | 5-CCATTAAATGATTATGG-3 | 22927-22928-22930正意链 |
| NO：42 | S042 | 3-GGTAATTTACTAATACC-5 | 22927-22928-22930反意链 |
| NO：43 | S043 | 5-CCATTAAGTGATTATGG-3 | 22927-22928-22930正意链 |
| NO：44 | S044 | 3-GGTAATTCACTAATACC-5 | 22927-22928-22930反意链 |
| NO：45 | S045 | 5-CCATTAAAAGATTATGG-3 | 22927-22928-22930正意链 |
| NO：46 | S046 | 3-GGTAATTTTCTAATACC-5 | 22927-22928-22930反意链 |
| NO：47 | S047 | 5-CCATTAAAAGGTTATGG-3 | 22927-22928-22930正意链 |
| NO：48 | S048 | 3-GGTAATTTTCCAATACC-5 | 22927-22928-22930反意链 |
| NO：49 | S049 | 5-CCATTAAATGGTTATGG-3 | 22927-22928-22930正意链 |
| NO：50 | S050 | 3-GGTAATTTACCAATACC-5 | 22927-22928-22930反意链 |
| NO：51 | S051 | 5-CCATTAAGAGATTATGG-3 | 22927-22928-22930正意链 |
| NO：52 | S052 | 3-CGGTAATTCTCTAATACC-5 | 22927-22928-22930反意链 |
| NO：53 | S053 | 5-CCATTAAGAGGTTATGG-3 | 22927-22928-22930正意链 |
| NO：54 | S054 | 3-GGTAATTCTCCAATACC-5 | 22927-22928-22930反意链 |
| NO：55 | S055 | 5-CCATTAAGTGGTTATGG-3 | 22927-22928-22930正意链 |
| NO：56 | S056 | 3-GGTAATTCACCAATACC-5 | 22927-22928-22930反意链 |
| NO：57 | S057 | 5-ACCACTACTGGCATTG-3 | 22951正意链 |
| NO：58 | S058 | 3-TGGTGATGACCGTAAC-5 | 22951反意链 |
| NO：59 | S059 | 5-ACCACTAGTGGCATTG-3 | 22951正意链 |
| NO：60 | S060 | 3-TGGTGATCACCGTAAC-5 | 22951反意链 |
| NO：61 | S061 | 5-TTCTACAGCAATTCATG-3 | 23316-23317正意链 |
| NO：62 | S062 | 3-AAGATGTCGTTAAGTAC-5 | 23316-23317反意链 |
| NO：63 | S063 | 5-TCTACAGTAATTCATGC-3 | 23316-23317正意链 |
| NO：64 | S064 | 3-AGATGTCATTAAGTACG-5 | 23316-23317反意链 |
| NO：65 | S065 | 5-TTTCTACATCAATTCATG-3 | 23316-23317正意链 |
| NO：66 | S066 | 3-AAAGATGTAGTTAAGTAC-5 | 23316-23317反意链 |
| NO：67 | S067 | 5-TTCTACATTAATTCATGC-3 | 23316-23317正意链 |
| NO：68 | S068 | 3-AAGATGTAATTAAGTACG-5 | 23316-23317反意链 |
| NO：69 | S069 | 5-CATGCAGATCAACTCAC-3 | 23330正意链 |
| NO：70 | S070 | 3-GTACGTCTAGTTGAGTG-5 | 23330反意链 |
| NO：71 | S071 | 5-CATGCAGAACAACTCA-3 | 23330正意链 |
| NO：72 | S072 | 3-GTACGTCTTGTTGAGT-5 | 23330反意链 |
| NO：73 | S073 | 5-CAGTTTCTTTATTACGTA-3 | 23485正意链 |
| NO：74 | S074 | 3-GTCAAAGAAATAATGCAT-5 | 23485反意链 |
| NO：75 | S075 | 5-CAGTTTCTTCATTACGT-3 | 23485正意链 |
| NO：76 | S076 | 3-GTCAAAGAAGTAATGCA-5 | 23485反意链 |
| NO：77 | S077 | 5-GCTTTTGCACACAAC-3 | 23719正意链 |
| NO：78 | S078 | 3-CGAAAACGTGTGTTG-5 | 23719反意链 |
| NO：79 | S079 | 5-GCTTTTGCAGACAACT-3 | 23719正意链 |
| NO：80 | S080 | 3-CGAAAACGTCTGTTGA-5 | 23719反意链 |
| NO：81 | S081 | 5-GTGTTCGCTCAAGTCA-3 | 23785正意链 |
| NO：82 | S082 | 3-CACAAGCGAGTTCAGT-5 | 23785反意链 |
| NO：83 | S083 | 5-GTGTTCGTTCAAGTCA-3 | 23785正意链 |
| NO：84 | S084 | 3-CACAAGCAAGTTCAGT-5 | 23785反意链 |
| NO：85 | S085 | 5-ACTTTGAAATATTTTGG-3 | 23823正意链 |
| NO：86 | S086 | 3-TGAAACTTTATAAAACC-5 | 23823反意链 |
| NO：87 | S087 | 5-ACTTTGAAAGATTTTGG-3 | 23823正意链 |
| NO：88 | S088 | 3-TGAAACTTTCTAAAACC-5 | 23823反意链 |
| NO：89 | S089 | 5-ATATGGCGAATGCCTA-3 | 23952正意链 |
| NO：90 | S090 | 3-TATACCGCTTACGGA-5 | 23952反意链 |
| NO：91 | S091 | 5-AATATGGCCAATGCC-3 | 23952正意链 |
| NO：92 | S092 | 3-TTATACCGGTTACGG-5 | 23952反意链 |
| NO：93 | S093 | 5-TTGTGTTTAATGGCAC-3 | 24730正意链 |
| NO：94 | S094 | 3-AACACAAATTACCGTG-5 | 24730反意链 |
| NO：95 | S095 | 5-TTGTGTTTAGTGGCAC-3 | 24730正意链 |
| NO：96 | S096 | 3-AACACAAATCACCGTGG-5 | 24730反意链 |
| NO：97 | S097 | 5-ACATTCAAAAAGAAATTG-3 | 24978正意链 |
| NO：98 | S098 | 3-TGTAAGTTTTTCTTTAAC-5 | 24978反意链 |
| NO：99 | S099 | 5-AACATTCAAGAAGAAATT-3 | 24978正意链 |
| NO：100 | S100 | 3-TTGGTAAGTTCTTCTTTAA-5 | 24978反意链 |
| NO：101 | S101 | 5-TGGTATTAACATTACAAA-3 | 22172正意链 |
| NO：102 | S102 | 3-ACCATAATTGTAATGTTT-5 | 22172反意链 |
| NO：103 | S103 | 5-TGGTATTAAGATTACAAA-3 | 22172正意链 |
| NO：104 | S104 | 3-ACCATAATTCTAATGTTT-5 | 22172反意链 |
| NO：105 | S105 | 5-TGGTATTAAAATTACAAA-3 | 22172正意链 |
| NO：106 | S106 | 3-ACCATAATTTTAATGTTT-5 | 22172反意链 |
| NO：107 | P1 | 5-AAGGGAGATGATGTAAG-3 | 用于检测SARS冠状病毒 |
| NO：108 | P2 | 3-TTCCCTCTACTACATTC-5 | 用于检测SARS冠状病毒 |
3.探针合成：将表1中设计好的探针序列送探针合成公司委托合成(奥科公司合成)，并进行5’端氨基和poly(T)修饰。
实施例二用于扩增s基因的引物的制备
1.引物设计：利用Primer 5.0等生物信息学软件对SARS冠状病毒的基因组进行分析，在s基因的保守区设计出用于扩增s基因的4对引物，引物序列如表2所示。
表2.用于扩增s基因的引物
| SEQ ID | 引物编号 | 引物序列 |
| NO：109 | No.1 | 5-gggtttactatcctgatga-3 |
| NO：110 | No.2 | 3-ctaaagtacccaacacag-5 |
| NO：111 | No.3 | 5-gctgctcttcaaatacct-3 |
| NO：112 | No.4 | 3-gaaacaacgtactgatcaa-5 |
| NO：113 | No.5 | 5-ccgtgatgtttctgattt-3 |
| NO：114 | No.6 | 3-ctactatactaacgacgg-5 |
| NO：115 | No.7 | 5-caagggagatgatgtaaga-3 |
| NO：116 | No.8 | 3-acaaagactaaagtgactaa-5 |
2.引物合成：将选定的引物序列送引物合成公司委托合成(奥科公司合成)，备用。
实施例三芯片的制备
1.探针溶液制备：将实施例二中制备的探针溶解于50％DMOS溶液中，使探针的终浓度达到1μg/μl。
2.芯片点样：以57.5mm×25.5mm×1mm(长×宽×高)的经过醛基化的玻片为固相载体，其上有I、II、III三个点样区(如图1所示)。利用自动生物芯片点样仪(Spotarray 72)在三个点样区内分别以图2a、2b及2c所示的9(行)×15(列)的探针排布进行点样，制成基因芯片。如图2a、2b及2c所示，Cy代表标记有荧光素Cy3的寡核苷酸，这些点用于在扫描过程中判断阵列起止位置；P1-P2代表了用于检测SARS冠状病毒的正对照探针；neg代表负对照探针；S001-S106代表用于检测不同点突变的特异探针。
实施例四SARS冠状病毒检测与分型的操作方法
在利用上述制备好的基因芯片检测与分型SARS冠状病毒的操作方法中，本发明对其操作条件和操作步骤均作了一系列的实验进行优化，如PCR循环条件，杂交温度，杂交时间等及主要试剂配方，如杂交液，洗液等(配方详见实施例)。杂交温度最终选择36℃。杂交时间最终选择16h。SARS分型检测芯片的实验流程亦为优化后结果。本实施例的操作方法基本为得到待测样品cDNA后，分别利用表2中的4对引物进行PCR扩增并进行纯化，然后利用随机引物和Klenow酶对混合后的纯化产物进行荧光标记，标记产物烘干后与杂交液混合加于基因芯片上的探针阵列固定区域，36℃杂交16h。杂交完成后，用配制好的洗液按离子强度由高到低的顺序对基因芯片进行洗涤，风干后，用生物芯片扫描仪获取荧光信号，根据每一个检测位点不同探针的荧光比值来确定核苷酸的种类进而对检测的SARS样品进行分型。
以下为利用上述制备好的基因芯片检测与分型SARS冠状病毒的较佳实施例的详细说明。
1.目标片段的扩增
取1μl SARS冠状病毒的cDNA模板，加入到PCR反应体系中，PCR反应体系见表3。
表3 PCR混合体系配方
| 成分 | 来源 | 浓度 | 加样量(μl) |
| ddH2O10×PCR bufferMg2+dNTP Mixture引物1引物2Taq酶 | 购自上海生工公司购自上海生工公司购自上海生工公司合成自北京奥科公司合成自北京奥科公司购自上海生工公司 | -10×25mM10mM10μM10μM5U/μl | 34.5552110.5 |
注：PCR体系中只有1对引物，扩增目标片段共需4对引物(即平行利用4对引物在4个PCR体系中进行扩增)
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
2.纯化扩增产物
①将PCR扩增产物转移至纯化柱内(Amicon Microcon -PCRCentrifugal Filter devices)，加水补足体积至4001μl。
②25℃，6000rpm离心15min，丢弃收集管。
③将纯化柱转移至新的1.5ml离心管上，加15μl超纯水(MQ)，37℃放置5min。
④将纯化柱倒置放在1.5ml离心管上，6000rpm离心2min，收集DNA。
⑤重复步骤③、④一次。
3.标记
①体系A：带有4个核苷酸的随机引物1μl，PCR纯化产物2μg(每种PCR产物0.5ug)，补齐超纯水(MQ)至20.5μl。
②98℃变性10min。
③立即冰浴10min。
④体系B：Klenow Buffer 2.5μl
dNTP(dATP、dTTP、dGTP各5mM，dCTP 2mM)0.5μl
Klenow fragment exo- 1μl
Cy5-dCTP 0.25μl
⑤混合体系A和B，37℃反应1小时。
⑥65℃烘干2小时至反应液体全部蒸发。
4.预杂交
①将芯片在超纯水(MQ)中清洗2min，然后在空气中风干。
②在芯片的探针点阵旁边加20μl的预杂交液(42℃预热)，轻轻地盖上盖玻片，水平置于杂交盒中(杂交盒的底部放置一块湿润的纱布)。
③将杂交盒水平放置于杂交箱中，42℃反应1小时。
④取出芯片，轻轻移去盖玻片，在超纯水(MQ)中清洗2次，每次2min。
⑤在95％乙醇中清洗1min，风干备用。
5.杂交
①取20μl杂交液(36℃预热)回溶烘干的标记物。
②98℃变性10min。
③趁热将回溶的标记物快速的加到芯片有探针的区域，轻轻盖上盖玻片(注意避免产生气泡)，水平置于杂交盒中(杂交盒的底部放置一块湿润的纱布)。
④将杂交盒水平放置于杂交箱中，36℃避光反应16小时。
⑤杂交结束后，取出杂交盒，轻轻去除盖片，依次在洗液A中洗涤3min，洗液B中洗涤3min，洗液C中洗涤1.5min，并在空气中风干。
杂交液配方：10％甲酰胺；0.1％SDS；6×SSC
洗液A：1×SSC；0.1％SDS
洗液B：0.05×SSC
洗液C：95％乙醇
6.扫描
用Genepix Personal4100A型生物芯片扫描仪(Axon公司)的绿色激光(532nm)和红色激光(653nm)扫描(PMT Gain为650，扫描分辨率为10μm)。扫描结果存为JPG，TIF格式的文件。
7.结果分析
利用GenePix Pro 6.0软件对扫描生成的文件进行分析，计算出每一个杂交位点的荧光强度，根据同一位点不同探针荧光强度的比值，就可以判断对应检测位点的核苷酸种类。
例如在图3a和3b中，对照图2中探针的排布规律以及表1中每条探针的作用，可以判断3a中的样品为具有强致病性的SARS毒株；而3b中的样品为低致病性的SARS毒株。其中，白框内为标记了荧光素Cy3(应为绿色)的寡核苷酸，由于特异探针信号较强，故荧光探针很暗。
由上述公开的技术方案可见，利用本发明的基因芯片可以达到检测SARS冠状病毒并对其进行分型的目的，具有操作简便，准确性高，重复性强，适用于实验室研究，将会对SARS的流行病学研究具有深远的指导意义。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
序列表
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>用于SARS冠状病毒检测与分型的基因芯片、方法及试剂盒
<130>5P13003-CN
<160>116
<170>PatentIn version 3.2
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<212>DNA
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<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>107
aagggagatg atgtaag 17
<210>108
<211>17
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>108
cttacatcat ctccctt 17
<210>109
<211>19
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>109
gggtttacta tcctgatga 19
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<211>18
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>110
gacacaaccc atgaaatc 18
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<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
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gctgctcttc aaatacct 18
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<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
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aactagtcat gcaacaaag 19
<210>113
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<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>113
ccgtgatgtt tctgattt 18
<210>114
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<213>SARS冠状病毒
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ggcagcaatc atatcatc 18
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<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>115
caagggagat gatgtaaga 19
<210>116
<211>20
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>116
aatcagtgaa atcagaaaca 20
Claims (9)
1.一种用于SARS冠状病毒检测与分型的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其特征是该基因芯片上的寡核苷酸探针含有从一种或多种株型的SARS冠状病毒的s基因序列中选取的含有s基因突变位点的DNA片段以及选自SARS冠状病毒s基因保守序列的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征是上述s基因突变位点在SARS冠状病毒基因组中的位置包含在以下位置中：21721、21907、22219-22222、22517-22522、22570、22874-22875、22906、22927-22928-22930、22951、23316-23317、23330、23485、23719、23785、23823、23952、24730、24978和22172。
3.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征是上述从一种或多种株型的SARS冠状病毒的s基因序列中选取的含有s基因突变位点的DNA片段选自具有SEQ ID NO：1-NO：106所示的核苷酸序列的DNA片段。
4.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征是上述选自SARS冠状病毒s基因保守序列的DNA片段具有如SEQ ID NO：107和NO：108所示的核苷酸序列。
5.一种用于SARS冠状病毒检测与分型的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)根据SARS冠状病毒s基因的保守区设计并制备出用于PCR扩增的引物；
(2)制备待测样品的cDNA；
(3)使用步骤(1)所述的引物对步骤(2)中所述的cDNA进行PCR扩增；
(4)将扩增产物与权利要求1所述的基因芯片杂交；
(5)用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。
6.根据权利要求5所述的用于SARS冠状病毒检测与分型的方法，其特征是上述步骤(1)中根据SARS冠状病毒s基因的保守区设计的引物选自具有如SEQ ID NO：109-NO：116所示的核苷酸序列的DNA片段。
7.一种用于SARS冠状病毒检测与分型的试剂盒，其特征是至少包括基因芯片，该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其中，寡核苷酸探针含有从一种或多种株型的SARS冠状病毒的s基因序列中选取的含有s基因突变位点的DNA片段以及选自SARS冠状病毒s基因保守序列的DNA片段。
8.根据权利要求7所述的检测与分型SARS冠状病毒的试剂盒，其特征是还包括PCR扩增引物，该PCR扩增引物为根据SARS冠状病毒s基因的保守区设计的选自具有如SEQ ID NO：109-NO：116所示的核苷酸序列的DNA片段。
9.根据权利要求7所述的检测与分型SARS冠状病毒的试剂盒，其特征是还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件GenePix Pro 6.0。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2005101321195A CN1982474A (zh) | 2005-12-16 | 2005-12-16 | 用于sars冠状病毒检测与分型的基因芯片、方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2005101321195A CN1982474A (zh) | 2005-12-16 | 2005-12-16 | 用于sars冠状病毒检测与分型的基因芯片、方法及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1982474A true CN1982474A (zh) | 2007-06-20 |
Family
ID=38165315
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2005101321195A Pending CN1982474A (zh) | 2005-12-16 | 2005-12-16 | 用于sars冠状病毒检测与分型的基因芯片、方法及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1982474A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111676218A (zh) * | 2020-03-12 | 2020-09-18 | 安徽省疾病预防控制中心（省健康教育所） | SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增测序方法及其引物 |
-
2005
- 2005-12-16 CN CNA2005101321195A patent/CN1982474A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111676218A (zh) * | 2020-03-12 | 2020-09-18 | 安徽省疾病预防控制中心（省健康教育所） | SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增测序方法及其引物 |
| CN111676218B (zh) * | 2020-03-12 | 2023-08-04 | 安徽省疾病预防控制中心（省健康教育所） | SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增测序方法及其引物 |
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