CN111676218B - SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增测序方法及其引物 - Google Patents

SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增测序方法及其引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种SARS‑CoV‑2病毒spike基因全长扩增测序方法及其引物，该方法针对SARS‑CoV‑2病毒spike基因保守区域设计了覆盖基因全长(开放读码框)5对共10条寡核苷酸引物序列，如SEQ ID No.1～SEQ ID No.10所示，简化了基因扩增后的测序反应步骤。同时公开了待检样本的处理、RT‑PCR反应体系及反应条件、测序反应体系和反应条件。本发明可以实现对目前流行的SARS‑CoV‑2病毒spike基因全长进行扩增测序，从而获得SARS‑CoV‑2病毒spike基因序列信息，操作简单、应用方便，为我国流行的SARS‑CoV‑2病毒病原学研究及分子进化分析提供了可行的技术方法。

Description

SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增测序方法及其引物
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种RT-PCR扩增技术，尤其涉及一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2病毒)RT-PCR全 长扩增测序的方法及其引物。
背景技术
冠状病毒在***分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜 (envelope)的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，长27-31kd，是RNA病毒中最长的RNA核酸链，具有正链RNA 特有的重要结构特征：即RNA链5’端有甲基化“帽子”，3’端有Poly A“尾巴”结构。根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科 被分为a、β、γ和δ四个属。已知感染人的冠状病毒有6种，包括a属的229E和NL63，β属的OC43和HKU1、中东呼吸 综合征相关冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome,MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(Severe acute respiratory syndromecoronavirus,SARS-CoV)。冠状病毒最先是1937年从鸡身上分离出来，病毒颗粒的直径60～200nm，平 均直径为100nm，呈球形或椭圆形，具有多形性。病毒有包膜，包膜上存在棘突，整个病毒像日冕，不同的冠状病毒的棘 突有明显的差异。
2020年1月7日，专家组从1例阳性病人样本中分离出一种新型的冠状病毒样株。在排除了流感、禽流感、腺病毒、 严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)等其他呼吸道病原体后，专家组认为， 本次不明原因肺炎病例的病原体是这种新型冠状病毒。国际病毒分类学委员会(ICTV)在生物学论文预印平台BioRxiv上发表声明，其委员会的冠状病毒小组(CSG)根据***名、分类学和惯例，正式将该病毒命名为SARS-CoV-2，全称为：严 重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe Acute RespiratorySyndrome Coronavirus 2)，并认定这种病毒是SARS冠状病毒的姊妹 病毒。目前，进一步开展新型冠状病毒(2019-nCoV)的分子流行病学调查仍是现阶段重点工作之一，这对于阐明新型冠状 病毒跨种属传播的分子机制，追溯新型冠状病毒的自然宿主具有重要意义。因此对于SARS-CoV-2病毒感染病例的治疗和 疫情的有效控制，亟需建立一套快速、敏感、准确的序列分析方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增测序方法及其引物。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增的引物，所述 SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增的引物引物为10对，具体包括：
SARS-CoV-2-S1-F21320：5’-CGCGAACAAATAGATGGTTA-3’；
SARS-CoV-2-S1-R22368：5’-CTGCAGCACCAGCTGTCCAA-3’；
SARS-CoV-2-S2-F22146：5’-AGGGAATTTGTGTTTAAGA-3’；
SARS-CoV-2-S2-R23231：5’-AACACCTGTGCCTGTTAAA-3’；
SARS-CoV-2-S3-F23002：5’-CCGGTAGCACACCTTGTAA-3’；
SARS-CoV-2-S3-R24128：5’-AATGAGGTCTCTAGCAGCA-3’；
SARS-CoV-2-S4-F23997：5’-CCAGATCCATCAAAACCAA-3’；
SARS-CoV-2-S4-R25065：5’-CTGGTGATGTATGATTCTT-3’；
SARS-CoV-2-S5-F24808：5’-CTGCTCCTGCCATTTGTCA-3’；
SARS-CoV-2-S5-R25632。5’-TTGGAGAGTGCTAGTTGCC-3’。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增测序方法，包 括：从待测样本中提取SARS-CoV-2病毒RNA，采用权利要求1所述引物进行一步法RT-PCR扩增，获得扩增产物。
优选的技术方案为：从待测样本中提取SARS-CoV-2病毒RNA，包括：取140μL待测样本，加入含有5.6μg Carrier RNA 的560μL的AVL裂解液中，按QIAamp Viral RNA MiniHandbook说明书提取病毒RNA，洗脱体积50μL。
优选的技术方案为：扩增体系为：
使用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(CATNO：210212)反应液，配置组分如下：
优选的技术方案为：扩增反应条件为：95℃，预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟,35个 循环，72℃延伸10分钟。
优选的技术方案为：对所得扩增产物进行电泳，然后根据结果进行判断；所述扩增产物分别均为使用的上下游引物位置 之差时，即获得特异性条带，则扩增得到SARS-CoV-2病毒spike基因全长序列信息。
优选的技术方案为：对所得扩增产物进行纯化和回收后，进行测序。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明所述的SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增引物及测序方法，基因扩增引物扩增的序列涵盖了该基因开放读码 框的区域，扩产物大小在800bp至1200bp之间，方便产物的纯化和回收以及测序后对序列组装的要求。本发明中涉及的 SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增引物设计参考序列来自国家生物信息中心(CNCB)/国家基因组科学数据中心(NGDC) 建设的“2019新型冠状病毒信息库”公布的新冠病毒基因组序列，已上传GISAID公共数据库的六个新型冠状病毒基因序 列(序列号分别为EPI_ISL_402119——EPI_ISL_402125)。本发明所述的测序方法能最大程度覆盖目前流行的所有 SARS-CoV-2病毒spike全长基因，并且操作简单，应用方便。
附图说明
图1为本发明实施例的检测结果；其中，a：SARS-CoV-2病毒ORF1ab和N基因CT值分别为15.2和14.7的RNA模 板；b：SARS-CoV-2病毒ORF1ab和N基因CT值分别为20.1和21.1的RNA模板；c:SARS-CoV-2病毒ORF1ab和N基因CT值分别为23.2和23.2的RNA模板；d:SARS-CoV-2病毒ORF1ab和N基因CT值分别为24.5和25.4的RNA模板；e： SARS-CoV-2病毒ORF1ab和N基因CT值分别为27.1和27.3的RNA模板；f:SARS-CoV-2病毒ORF1ab和N基因CT值分 别为30.4和31.6的RNA模板。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的 其他优点及功效。
请参阅图1。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉 此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关 系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能 涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了， 而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范 畴。
实施例1：SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增测序方法及其引物
1、SARS-CoV-2病毒spike基因全长测序引物的设计与合成
下载Global Initiative on Sharing All Influenza Data(GISAID)数据库(https://www.gisaid.org/)数据库中 SARS-CoV-2病毒全基因组序列，使用MEGA软件比对分析不同病毒各个基因序列的一致性，根据SARS-CoV-2病毒注释结果， 选择spike基因的起始和终止位点，选择相对保守区设计全基因组特异性扩增引物序列。使用oligo 7软件按照引物设计原则 进行引物设计。引物设计中允许同一变异位点允许4个及4个以下简并碱基。将所提取的备选引物满足以下要求进行筛选：① 特异性扩增序列长度在18bp至26bp之间；②Tm值在50℃至62℃之间，引物之间Tm值差值小于10℃，引物与PCR产物Tm值差值 小于20℃；③引物GC％在40％至60％之间；④polyN≤4bp；⑤Hairpin≤4bp；⑥覆盖率>90％；⑦进行BLAST筛选，特异性分数>L ×0.4；⑧引物自身形成的二聚体Delta G值不要超过4.5kcal/mol；⑨引物正确引发率在200以上，错误引发率低于200， 若错误引发率高于200，则要求错误引发位置与正确引发位置同侧，且距离大于1000bp
得到如下所示的引物序列。所有引物长度约为20bp，用于扩增不同片段的寡核苷酸片段。引物两端含有不参与目的片段 扩增的通用核苷酸序列。
引物名称 引物序列(5’-3’)
SARS-CoV-2-S1-F21320(SEQ ID No.1) CGCGAACAAATAGATGGTTA
SARS-CoV-2-S1-R22368(SEQ ID No.2) CTGCAGCACCAGCTGTCCAA
SARS-CoV-2-S2-F22146(SEQ ID No.3) AGGGAATTTGTGTTTAAGA
SARS-CoV-2-S2-R23231(SEQ ID No.4) AACACCTGTGCCTGTTAAA
SARS-CoV-2-S3-F23002(SEQ ID No.5) CCGGTAGCACACCTTGTAA
SARS-CoV-2-S3-R24128(SEQ ID No.6) AATGAGGTCTCTAGCAGCA
SARS-CoV-2-S4-F23997(SEQ ID No.7) CCAGATCCATCAAAACCAA
SARS-CoV-2-S4-R25065(SEQ ID No.8) CTGGTGATGTATGATTCTT
SARS-CoV-2-S5-F24808(SEQ ID No.9) CTGCTCCTGCCATTTGTCA
SARS-CoV-2-S5-R25632(SEQ ID No.10) TTGGAGAGTGCTAGTTGCC
以上所述的10条5对引物中，每对引物中其中一条与病毒基因的正向序列互补，另一条与病毒基因的反向序列互补。
2、检测未知病毒
(1)病毒RNA的提取：
取140μL样本(咽拭子、鼻咽拭子、血浆、血清、尿液、病毒分离培养物)，加入含有5.6μg Carrier RNA的560μL 的AVL裂解液中，按QIAamp Viral RNA Mini Handbook(Qiagen公司，catalog#52904/52906)说明书提取病毒RNA，洗脱体 积50μL。
(2)rRT-PCR反应
1)体系配置：使用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(CATNO：210212)反应液，配置组分如下：
2)rRT-PCR：将加好上述反应体系的反应管放于PCR仪进行rRT-PCR，反应程序如下：
所得扩增产物大小在800bp到1200bp之间。
(3)RT-PCR产物检测：各取4ul产物于1％Agrorose gel进行电泳观察结果。
(4)结果判断：5个反应产物均分别为使用的上下游引物位置之差时(获得特异性条带)，则扩增得到SARS-CoV-2病 毒spike全长基因片段；若所有反应无特异性条带，则扩增SARS-CoV-2病毒spike全长基因失败。若部分反应得到特异性条 带，则只能获得SARS-CoV-2病毒spike基因部分基因序列。
(5)检测评价：
灵敏度评价：选择六份人咽拭子标本，经荧光PCR检测显示SARS-CoV-2病毒核酸阳性，用本发明的5对引物对模板进行 PCR反应扩增即可得到所有阳性产物。如图1所示。当ORF1ab和N基因荧光PCR的CT值为15-27之间时，均能得到较为明亮的PCR 阳性产物，当CT值大于30时扩增效率降低，所获得的阳性产物片段可能无法测的全长基因，见图1中a、b、c、d、e、f的结 果。
通用性评价：共选取我省最近流行SARS-CoV-2病毒6份呼吸道样本，ORF1ab和N基因CT值小于27时均能获得可以 进行一代测序的阳性扩增产物。
3、回收RT-PCR产物
将经实施例2的扩增方法获得的扩增产物采用琼脂糖凝胶切割回收，具体如下：
1)将25μl RT-PCR产物于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。
2)将含有目的片段的琼脂糖凝胶进行切割，尽可能去除多余的琼脂糖凝胶,将含有目的条带的凝胶放入1.5ml的离 心管中，写好编号。
3)加入300ul至400ul QC溶液(Qiagen试剂盒，catalog#28706)，50℃水浴，每隔5min颠倒一次，直至溶胶全部 溶解。
4)将步骤3溶解得到的液体转入套有收集管的柱子中，12000rpm离心1min。
5)弃去废液，加入500ul QG溶液，12000rpm离心1min。
6)弃去废液，加入700ul PE溶液(PE溶液事先加入无水乙醇)，1300rmp离心1min。
7)弃去废液，空管离心，1300rpm离心1min，弃去废液。
8)将步骤7中的离心柱套在新的离心管中，加入30ul预热的纯水，室温放置3到5分钟，然后11000rpm离心2分 钟。即得回收产物。
4、回收产物测序方法
将经实施例3回收得到的产物进行测序，具体步骤如下：
1.在96孔板中进行测序反应体系配置(Terminator Cycle Sequencingkit,AppliedBiosystem, catalog#4336921)如下：
2.测序反应程序
3.按照每个反应加入如下试剂对测序反应产物进行纯化(XterninatorTMpurification kit catalog#4376486
用封板膜将反应板进行密封后置于混匀仪上，1800rpm混匀30分钟。混匀结束后，离心机中1000rpm离心一分钟。
4.将反应板放入Applied Biosystem DNA analyzer中，选择运行模块进行序列读取，运行结束后对序列进行拼接即可获得 SARS-CoV-2病毒spike基因全长序列。
综上所述，本发明提供了10条用扩增SARS-CoV-2病毒spike基因全长的寡核苷酸引物序列，并提供了RT-PCR的扩增基 因、RT-PCR产物回收以及回收产物测序反应。
本发明可以将RT-PCR技术应用SARS-CoV-2病毒spike基因全长的扩增中，后续测序反应只需扩增引物即可进行测序 反应，简化了基因扩增后的测序反应中引物的选择。本发明涵盖的SARS-CoV-2病毒spike基因全长的扩增引物通用性强， 能有效扩增得到该病毒的spike基因全长基因序列，为SARS-CoV-2病毒以基因序列为基础的分子进化以及病原学研究提供 了技术手段。
实施例2：SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增测序方法及其引物
一种SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增的引物，所述SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增的引物引物为10对，具 体包括：
SARS-CoV-2-S1-F21320：5’-CGCGAACAAATAGATGGTTA-3’；
SARS-CoV-2-S1-R22368：5’-CTGCAGCACCAGCTGTCCAA-3’；
SARS-CoV-2-S2-F22146：5’-AGGGAATTTGTGTTTAAGA-3’；
SARS-CoV-2-S2-R23231：5’-AACACCTGTGCCTGTTAAA-3’；
SARS-CoV-2-S3-F23002：5’-CCGGTAGCACACCTTGTAA-3’；
SARS-CoV-2-S3-R24128：5’-AATGAGGTCTCTAGCAGCA-3’；
SARS-CoV-2-S4-F23997：5’-CCAGATCCATCAAAACCAA-3’；
SARS-CoV-2-S4-R25065：5’-CTGGTGATGTATGATTCTT-3’；
SARS-CoV-2-S5-F24808：5’-CTGCTCCTGCCATTTGTCA-3’；
SARS-CoV-2-S5-R25632。5’-TTGGAGAGTGCTAGTTGCC-3’。
一种SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增测序方法，包括：从待测样本中提取SARS-CoV-2病毒RNA，采用权利要 求1所述引物进行一步法RT-PCR扩增，获得扩增产物。
从待测样本中提取SARS-CoV-2病毒RNA，包括：取140μL待测样本，加入含有5.6μgCarrier RNA的560μL的AVL 裂解液中，按QIAamp Viral RNA Mini Handbook说明书提取病毒RNA，洗脱体积50μL。
扩增体系为：
使用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(CATNO：210212)反应液，配置组分如下：
扩增反应条件为：95℃，预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟,35个循环，72℃延伸10 分钟。
对所得扩增产物进行电泳，然后根据结果进行判断；所述扩增产物分别均为使用的上下游引物位置之差时，即获得特异 性条带，则扩增得到SARS-CoV-2病毒spike基因全长序列信息。
对所得扩增产物进行纯化和回收后，进行测序。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以 在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例 中的特征可以任意相互组合。
/>
序列表
<110> 安徽省疾病预防控制中心（省健康教育所）
<120> SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增测序方法及其引物
<140> 202010168825X
<141> 2020-03-12
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgcgaacaaa tagatggtta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctgcagcacc agctgtccaa 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agggaatttg tgtttaaga 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aacacctgtg cctgttaaa 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccggtagcac accttgtaa 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aatgaggtct ctagcagca 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccagatccat caaaaccaa 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctggtgatgt atgattctt 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctgctcctgc catttgtca 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttggagagtg ctagttgcc 19

Claims (1)

1.一种SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增的引物，其特征在于：所述SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增的引物，具体包括：
SARS-CoV-2-S1-F21320：5’-CGCGAACAAATAGATGGTTA-3’；
SARS-CoV-2-S1-R22368：5’-CTGCAGCACCAGCTGTCCAA-3’；
SARS-CoV-2-S2-F22146：5’-AGGGAATTTGTGTTTAAGA-3’；
SARS-CoV-2-S2-R23231：5’-AACACCTGTGCCTGTTAAA-3’；
SARS-CoV-2-S3-F23002：5’-CCGGTAGCACACCTTGTAA-3’；
SARS-CoV-2-S3-R24128：5’-AATGAGGTCTCTAGCAGCA-3’；
SARS-CoV-2-S4-F23997：5’-CCAGATCCATCAAAACCAA-3’；
SARS-CoV-2-S4-R25065：5’-CTGGTGATGTATGATTCTT-3’；
SARS-CoV-2-S5-F24808：5’-CTGCTCCTGCCATTTGTCA-3’；
SARS-CoV-2-S5-R25632：5’-TTGGAGAGTGCTAGTTGCC-3’。
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