CN1977999A - 一种利用紫外上转换发光纳米颗粒选择性杀灭细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明利用紫外上转换颗粒实现对细胞的选择性杀灭的方法,特征是使用在红外或可见光照射下能够发射紫外光的纳米颗粒--紫外上转换纳米颗粒,通过在该纳米颗粒表面连接上能够与目标细胞实现特异性结合的抗体,利用抗体与细胞表面对应抗原选择性结合的特点,实现纳米颗粒与目标细胞选择性的结合;然后,对于在红外光照射下发射紫外光的紫外上转换发光纳米颗粒发光材料,采用红外光照射;或,对于在可见光照射下发射紫外光的紫外上转换发光纳米颗粒发光材料,则采用可见光照射;从而实现利用紫外上转换纳米颗粒发射的紫外光对被结合的细胞的杀灭。本发明方法还在一定程度上克服了紫外光穿透能力有限的不足。
Description
技术领域:
本发明属于利用紫外光杀灭细胞方法技术领域,特别涉及利用紫外上转换发光纳米颗粒选择性杀灭细胞的方法。
背景技术:
利用紫外光杀灭细胞是一种广泛使用的技术。正如复旦大学出版社2003年出版的《医学微生物学》(钱利生主编)第24页所指出的,这类技术是利用紫外光对脱氧核糖核酸结构的破坏作用实现对细胞的杀灭。在利用紫外线杀灭细胞时,紫外光对被照射范围内的细胞均有杀伤效果。但有时我们希望只杀死某些特定的细胞而不影响周围其它细胞,而现有的紫外光杀灭细胞技术不能做到这一点。另外,由于紫外光穿透能力有限,限制了紫外光在杀灭生物体内细胞方面的应用。
紫外上转换发光材料在红外或可见光的照射下能够产生紫外光。近年来人们已经能够制备纳米尺寸的这类材料。荷兰《光学通讯》(optics communications,第242期,第215页)介绍了一种制备稀土掺杂的纳米尺寸颗粒的方法,该纳米颗粒在红外或可见光的照射下能发射紫外光。但至今还未见利用这种纳米颗粒发射的紫外光来杀灭细胞的报道。
通过对纳米颗粒进行表面修饰,利用免疫学的原理,使纳米颗粒与目标细胞实现选择性的结合,这是近几年来发展成熟的一门技术。英国《自然生物技术》(nature biotechnology,第22卷,第969-976页)和荷兰《生物技术的当代观点》(Current Opinion in Biotechnology,第16卷,第63-72页)介绍了这方面的进展。但现有技术中普遍使用的是荧光纳米颗粒。至今尚未见到使紫外上转换发光纳米颗粒与目标细胞实现选择性结合方面的报道。
发明内容:
本发明提出一种利用紫外上转换纳米颗粒实现对细胞选择性杀灭的方法,并在一定程度上克服紫外光穿透能力有限而导致在杀灭细胞特别是杀灭生物体内细胞方面的不足。
本发明利用紫外上转换发光纳米颗粒选择性杀灭细胞的方法,其特征在于:使用在红外或可见光照射下能够发射紫外光的纳米颗粒——紫外上转换纳米颗粒,通过在该纳米颗粒表面连接上能够与目标细胞实现特异性结合的抗体,利用抗体与细胞表面对应抗原选择性结合的特点,实现纳米颗粒与目标细胞选择性的结合;然后,对于在红外光照射下发射紫外光的紫外上转换发光纳米颗粒发光材料,采用红外光照射;或,对于在可见光照射下发射紫外光的紫外上转换发光纳米颗粒发光材料,则采用可见光照射;从而实现利用紫外上转换纳米颗粒发射的紫外光对被结合的细胞的杀灭。
所述在红外或可见光照射下能够发射紫外光的纳米颗粒——紫外上转换纳米颗粒,为在红外或可见光照射下能够产生波长小于300纳米紫外光的所有类型的纳米颗粒,包括在基质中掺入重量浓度不超过30%的稀土离子实现紫外上转换发光的材料;所述基质包括氟化物LaF3、K2YF3或Zn0.3Al0.25Pb0.3Li0.098Yb0.1F2.354,或氧化物Y2O3、CaAl4O7或SrAl4O7,所述稀土离子包括Tm3+、Ho3+、Yb3+、pr3+或Er3+;所述紫外上转换发光纳米颗粒还包括能够实现紫外上转换发光的各种半导体量子点,包括宽禁带的半导体材料ZnS、ZnO或GaN。
所述能够与细胞实现特异性结合的抗体,是利用抗体和抗原特异性结合的特性,对于不同细胞根据它们表面不同的抗原所选择的对应抗体。
现有技术通常是直接用紫外光照射来杀灭被照射的细胞,这样一来紫外光就会杀灭照射区域内的各种被照射到的细胞,对细胞的杀灭缺乏特异选择性;而本发明方法中由于用来杀灭细胞的紫外光是由与细胞结合的紫外上转换纳米颗粒产生的,这些穿透能力有限的紫外光只对结合纳米颗粒的细胞有杀伤作用,而对其它细胞影响较小,这就达到了选择性杀灭细胞的目的。另一方面,由于紫外光穿透能力有限,现有方法只适用于杀灭物体表面或表面附近的细胞;而本发明方法中照射的是红外或者可见光,其穿透能力要优于紫外光。尤其是红外光,即使在生物组织中也有很好的穿透深度。这样就把紫外光杀灭细胞的适用范围从生物体表面拓宽到生物体内;而且红外和可见光对多数生物组织基本没有伤害作用,因而可以采用高能量密度照射,这在一定程度上克服紫外光穿透能力有限而导致在杀灭细胞特别是杀灭生物体内细胞方面的不足。
具体实施方式:
实施例1:对混合在一起的白细胞和淋巴细胞的两类细胞中,在不伤害后者的情况下杀灭前者。
具体做法如下:
首先制备紫外上转换发光纳米颗粒。方法是:用Nd:YAG脉冲激光照射浸泡在乙醇中的Zn0.3Al0.25Pb0.3Li0.098Yb0.1Tm0.002F2.354玻璃,这种玻璃是用固态反应制备的。所制备的颗粒大小取决于激光器的脉冲时间。更详细的制备信息可以参照荷兰杂志《光学通讯》(opticscommunications,第242期,第215页)。
下面是实现所制备的纳米颗粒与白细胞的选择性结合:首先将制备好的纳米颗粒加入氨水中形成悬浮液,将此悬浮液以5000转/分离心10分钟,去上清液,低温下超声振荡15分钟,然后加入戊二醛,室温搅拌20分钟,以5000转/分离心10分钟,去上清液,用pH7.6的PBS液洗涤,再用PBS分散。将鼠抗人CD45Pur PBS加入分散的纳米颗粒悬浮液中,4摄氏度低温搅拌24小时,用PBS液洗涤产物,储于4摄氏度冰箱中备用。
细胞样品的制备:取抗凝静脉血2ml于无菌管内,摇匀,加入等量的无菌Hanks液,用台式高速冷冻离心机中在1000转/分的转速下离心10分钟,取出离心管去上层清液,加5倍于血球体积的红细胞裂解液,在37摄氏度恒温箱中作用15分钟,再用适量生理盐水离心洗涤2次,每次均为1000转/分,离心10分钟(可得到的白细胞理论值为0.8~2×107个细胞/毫升,其中淋巴细胞约占20%~30%),然后再用Hanks液稀释至1×106~10×106个细胞/毫升待用。下面是抗原片的制备。取洁净的栽玻片,分别滴加一滴细胞悬液,用冷风快速吹干,4摄氏度下用纯丙酮固定10分钟,用0.1%明胶封闭10分钟,甩干切片,用滤纸吸除多余的液体,加经CD45修饰后的紫外上转换发光纳米颗粒于载玻片上,然后放入湿盒中,再将湿盒置于37摄氏度生化培养箱中恒温培育1小时,取出后用PBS溶液冲洗3次,每次5分钟。经过上述步骤,已经将紫外上转换发光纳米颗粒选择性的吸附到了白细胞上。
最后,用波长为798纳米的激光照射细胞,利用白细胞上结合的紫外上转换发光纳米颗粒发射的紫外光杀死白细胞。由于紫外线的穿透能力很有限,所以没有结合紫外上转换发光纳米颗粒的淋巴细胞不会受到伤害。
实施例2:对患肿瘤的小鼠,在不伤害正常细胞的情况下杀死肿瘤细胞。
具体做法如下:
仍使用实施例1中的紫外上转换发光纳米颗粒。对该纳米颗粒的表面处理也同例1。
将单克隆抗体J591与处理后的纳米颗粒在PH8下反应两小时,所用抗体的量为纳米颗粒的20倍(摩尔比)。然后将产物高速离心30分钟,再用PH7的PBS液分散。进过上述步骤,就制备出了表面连接有抗体J591的纳米颗粒。
将上述纳米颗粒注入患有肿瘤的小鼠的尾部静脉。一小时后,用波长为798纳米的红外光照射该小鼠。红外光在生物组织中能够穿透几厘米,所以在上述红外光的照射下,小鼠体内的紫外上转换发光纳米颗粒会产生紫外光。又因为所选用抗体能够与肿瘤细胞表面抗原选择性的结合,所以纳米颗粒只吸附在肿瘤细胞的表面,从而它们产生的紫外光只对肿瘤细胞有杀伤作用。
在实际情况中,可能需要杀灭其他类型的细胞,这只需要把吸附在紫外上转换发光纳米颗粒表面的抗体换成与想杀灭的细胞对应的抗体就可以了。选用什么样的抗体可以参看《医学免疫学》(龚非力主编,科学出版社2004年出版)。使用的照射光的波长取决于具体的紫外上转换发光材料,当然,由于本发明方法所选择的材料本身的特点,照射光的波长总是在红外和可见光的范围内的。由于红外光和可见光对细胞没有伤害,所以可以使用较高强度的光照射。
Claims (3)
1、一种利用紫外上转换发光纳米颗粒选择性杀灭细胞的方法,其特征在于:使用在红外或可见光照射下能够发射紫外光的纳米颗粒——紫外上转换纳米颗粒,通过在该纳米颗粒表面连接上能够与目标细胞实现特异性结合的抗体,利用抗体与细胞表面对应抗原选择性结合的特点,实现纳米颗粒与目标细胞选择性的结合;然后,对于在红外光照射下发射紫外光的紫外上转换发光纳米颗粒发光材料,采用红外光照射;或,对于在可见光照射下发射紫外光的紫外上转换发光纳米颗粒发光材料,则采用可见光照射;从而实现利用紫外上转换纳米颗粒发射的紫外光对被结合的细胞的杀灭。
2、如权利要求1所述利用紫外上转换发光纳米颗粒选择性杀灭细胞的方法,特征在于:所述在红外或可见光照射下能够发射紫外光的纳米颗粒——紫外上转换纳米颗粒,为在红外或可见光照射下能够产生波长小于300纳米紫外光的所有类型的纳米颗粒,包括在基质中掺入重量浓度不超过30%的稀土离子实现紫外上转换发光的材料;所述基质包括氟化物LaF3、K2YF3或Zn0.3Al0.25Pb0.3Li0.098Yb0.1F2.354,或氧化物Y2O3、CaAl4O7或SrAl4O7,所述稀土离子包括Tm3+、Ho3+、Yb3+、Pr3+或Er3+;所述紫外上转换发光纳米颗粒还包括能够实现紫外上转换发光的各种半导体量子点,包括宽禁带的半导体材料ZnS、ZnO或GaN。
3、如权利要求1所述利用紫外上转换发光纳米颗粒选择性杀灭细胞的方法,特征在于:所述能够与细胞实现特异性结合的抗体,是利用抗体和抗原特异性结合的特性,对于不同细胞根据它们表面不同的抗原所选择的对应抗体。
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