CN1975425A - 齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测试剂盒及其制备和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测试剂盒及其制备方法和检测方法，试剂盒由盒体，设在盒体内的各种用液和酶标板组装成经济实用的检测试剂盒。试剂盒的制备方法简便、快捷、安全、可靠且经济实用。样品用量少，在较短的时间内就可以完成检测，且结果易于保存，应用该检测试剂盒进行双抗夹心酶联检测的方法与其他血清学检验方法相比具有简单、快速、敏感、特异性强等特点，并具有较高的可重复性、经济实用等更多的优点，所以便于在基层单位推广应用。

Description

齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测试剂盒及其制备和检测方法

技术领域

本发明涉及检测齿兰环斑病毒的试剂盒及其制备和检测方法，特别是涉及齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测试剂盒及制备该试剂盒的方法与应用该试剂盒进行齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测的检测方法。

背景技术

齿兰环斑病毒(Odntoglossum ringspot virus，ORSV)属烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，是危害兰科植物的两种主要病毒之一，分布世界各地，主要危害齿兰、建兰等。兰花一旦感染ORSV，其叶片常产生黄化条纹或不规则褪绿色斑块，病株花部甚至出现畸形或褪色斑，红色系花朵褪色斑尤为明显，对兰花的观赏价值和经济价值造成严重影响。我国兰花资源丰富，但研究表明，无论是盆栽的地生兰花还是组培的兰花，该病毒病均相当普遍.鉴于ORSV对我国兰花产业的危害性，研究其检测技术已十分重要。

植物病毒检测常用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，酶免疫分析是将抗原抗体结合的特异性与酶的高效催化性相结合的技术，具有灵敏度高，特异性强等特点，但操作步骤多，耗时长，且需要相对昂贵的酶标抗体和96孔酶标板。

双抗夹心酶联检测是在酶联免疫吸附测定方法基础上发展起来的检测方法，适于检测大量样品的较为灵敏、可靠和操作简便的检测技术，但目前尚未见有关双抗夹心酶联用于检测齿兰环斑病毒的文献报道以及用于检测该病毒的双抗夹心酶联检测试剂盒产品。

发明内容

本发明的目的在于提供简便、快捷、安全、可靠且经济实用的齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测的试剂盒。

本发明的另一目的，在于提供制备齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测试剂盒的方法。

本发明的再一目的，在于提供利用制备的齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测试剂盒进行双抗夹心酶联检测齿兰环斑病毒的检测方法。

为实现上述目的，本发明的技术解决方案是：

齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测试剂盒，主要由盒体，设在盒体内的各种用液和酶标板组成，各种用液主要包括高效价抗血清、标记抗体、阳性样品和阴性样品，各种缓冲液和显色剂。

所述的阳性样品为纯化的齿兰环斑病毒。

所述的阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液。

所述的缓冲液包括：

包被缓冲液：20-80mmol/L pH9.6碳酸盐溶液；

封闭缓冲液：20-100mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脱脂奶粉；

洗涤缓冲液：50-200mmol/L pH7.4 PBS+0.05-0.3％Tween20；

底物缓冲液：5-20％ pH9.8二乙醇胺溶液；

终止液：1-5mol/L硫酸溶液；

所述的显色剂为0.05-0.5mg/ml pH9.8 PNP-Na溶液。

所述的齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测试剂盒的制备方法，它主要包括下列步骤：

1、齿兰环斑病毒的提取和纯化：取苋色藜病叶加0.52倍重量(g)体积(ml)的1/15M，pH7.0的PB缓冲液，同时加入1％巯基乙醇和正丁醇、三氯甲烷，在捣碎机中将病叶捣碎，过滤，将滤液分装于离心管内，6000rmp离心20分钟，上清液加入4％体积重量的PEG(MW6000)和2％体积重量的NaCL搅拌溶解，4℃过夜；6000rmp离心20分钟，沉淀加入1％TritonX-100和1/15M PB悬浮搅拌1小时，7000rmp离心20分钟；取上清，32000rmp·min(Beckman SW40)离心2小时，沉淀用1/15M PB悬浮，5000rmp·min(BeckmanJA-14)离心15分钟，上清即为粗提提纯病毒制剂。此后进行病毒的精提纯，将以上粗提纯的病毒10％-40％的蔗糖密度梯度柱上，在超速离心机上以30000rmp离心2.5小时，离心结束后将病毒带取出。

2、抗血清的制备及纯化：选用雄性白兔作免疫动物，加等量Freund氏不完全佐剂乳化的提纯病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和两次静脉注射免疫家兔。每次注射病毒的量分别是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，间隔时间为7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用琼脂双扩散法测定效价；通过辛酸沉淀法结合DEAE离子交换层析纯化抗体。用2倍体积0.1M醋酸铵调节抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合搅拌1小时，5000rpm离心30分钟，取上清，将透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5缓冲液过夜，透析除盐。取透析完全的溶液上样于离子交换柱中，用10mMTris-HCl pH8.5缓冲液5ml/min冲洗15分钟，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5缓冲液浓度梯度进行洗脱，收集洗脱峰部分，浓缩透析，获得纯化的齿兰环斑病毒多克隆抗体。

3、抗体标记：通过戊二醛二步法将碱性磷酸酶标记到纯化抗体。每1mg抗体加0.1％戊二醛0.05ml，静置1小时，置于透析袋中除去多余戊二醛。加入0.5mg碱性磷酸酶，混匀后置于4℃备用。

4、阳性、阴性样品的制备：

阳性样品为纯化的齿兰环斑病毒病毒，浓度在0.1μg-100μg/ml范围；阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液。

5、各种用液的制备：

包被缓冲液：20-80mmol/L pH9.6碳酸盐溶液；

封闭缓冲液：20-100mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脱脂奶粉；

洗涤缓冲液：50-200mmol/L pH7.4 PBS+0.05-0.3％Tween20；

底物缓冲液：5-20％ pH9.8二乙醇胺溶液；

终止液：1-5mol/L硫酸溶液；

显色剂为0.05-0.5mg/ml pH9.8 PNP-Na溶液。

所述的齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测试剂盒的检测方法为双抗夹心酶联检测法，它包括以下步骤：

1)包被：用碳酸盐包被缓冲液，将ORSV多克隆标记抗体抗体稀释至1～10ug/ul，在酶标板各反应孔中，每孔100ul，37℃，孵育2小时；

2)封闭：倾去包被液，脱脂奶粉的封闭液，每孔100ul，37℃孵育1小时，而后用洗涤缓冲液洗涤三次；

3)加样：加入待检测的样品，每孔100ul，并设立阴性、阳性和空白对照，37℃孵育1小时，而后用洗涤缓冲液洗涤三次；

4)标记示踪：加入酶标抗体，每孔100ul，37℃孵育1小时，而后用洗涤缓冲液洗涤三次；

5)显色：加入用5-20％pH9.8二乙醇胺底物缓冲液配制的显色液，每孔100ul，37℃孵育30分钟；

6)终止反应与检测判定：加入1-5mol/L硫酸的终止液，每孔50ul，在酶标仪上测定OD405值。

采用上述方案后，本发明由盒体，设在盒体内的各种用液、酶标板组装成经济实用的检测试剂盒。试剂盒的制备方法简便、快捷、安全、可靠且经济实用。样品用量少，在较短的时间内就可以完成检测，且结果易于保存，应用该检测试剂盒进行双抗夹心酶联联检测的方法与其他血清学检验方法相比具有简单、快速、敏感、特异性强等特点，并具有较高的可重复性、经济实用等更多的优点，所以便于在基层单位推广应用。

具体实施方式

本发明所用的主要试剂：齿兰环斑病毒多克隆抗体为厦门华侨亚热带植物引种园制备；PEG6000、2-巯基乙醇、Triton-100、牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司；碱性磷酸酶、PNPP-Na、DEAE离子交换填充物、IgG亲合层析填充物购自Pierce公司；试验中所使用的其他常规药品和试剂均为国产分析纯试剂。

一、试剂盒

齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测试剂盒，主要由盒体，设在盒体内的各种用液和酶标板组成，各种用液主要包括高效价抗血清、标记抗体、阳性样品和阴性样品，各种缓冲液和显色剂。

阳性样品为纯化的齿兰环斑病毒。

阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液。

缓冲液包括：

包被缓冲液：50mmol/L pH9.6碳酸盐溶液；

封闭缓冲液：50mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脱脂奶粉；

洗涤缓冲液：100mmol/L pH7.4 PBS+0.05-0.3％Tween20；

底物缓冲液：10％ pH9.8二乙醇胺溶液；

终止液：2mol/L硫酸溶液；

显色剂为0.1mg/ml pH9.8 PNP-Na溶液。

二、制备方法

本发明齿兰环斑病毒检测试剂盒的制备方法，它包括下列步骤：

1、齿兰环斑病毒的提取和纯化：取苋色藜病叶加0.52倍重量(g)体积(ml)的1/15M，pH7.0的PB缓冲液，同时加入1％巯基乙醇和正丁醇、三氯甲烷，在捣碎机中将病叶捣碎，过滤，将滤液分装于离心管内，6000rmp离心20分钟，上清液加入4％体积重量的PEG(MW6000)和2％体积重量的NaCL搅拌溶解，4℃过夜；6000rmp离心20分钟，沉淀加入1％TritonX-100和1/15M PB悬浮搅拌1小时，7000rmp离心20分钟；取上清，32000rmp·min(Beckman SW40)离心2小时，沉淀用1/15M PB悬浮，5000rmp·min(BeckmanJA-14)离心15分钟，上清即为粗提提纯病毒制剂。此后进行病毒的精提纯，将以上粗提纯的病毒10％-40％的蔗糖密度梯度柱上，在超速离心机上以30000rmp离心2.5小时，离心结束后将病毒带取出。

2、抗血清的制备及纯化：选用雄性白兔作免疫动物，加等量Freund氏不完全佐剂乳化的提纯病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和两次静脉注射免疫家兔。每次注射病毒的量分别是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，间隔时间为7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用琼脂双扩散法测定效价；通过辛酸沉淀法结合DEAE离子交换层析纯化抗体。用2倍体积0.1M醋酸铵调节抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合搅拌1小时，5000rpm离心30分钟，取上清，将透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5缓冲液过夜，透析除盐。取透析完全的溶液上样于离子交换柱中，用10mMTris-HCl pH8.5缓冲液5ml/min冲洗15分钟，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5缓冲液浓度梯度进行洗脱，收集洗脱峰部分，浓缩透析，获得纯化的齿兰环斑病毒多克隆抗体。

3、抗体标记：通过戊二醛二步法将碱性磷酸酶标记到纯化抗体。每1mg抗体加0.1％戊二醛0.05ml，静置1小时，置于透析袋中除去多余戊二醛。加入0.5mg碱性磷酸酶，混匀后置于4℃备用。

4、阳性、阴性样品的制备

阳性样品为纯化的齿兰环斑病毒病毒，浓度在100μg/ml；阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液。

5、各种用液的制备

包被缓冲液：50mmol/L pH9.6碳酸盐溶液；

封闭缓冲液：50mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脱脂奶粉；

洗涤缓冲液：100mmol/L pH7.4 PBS+0.05-0.3％Tween20；

底物缓冲液：10％ pH9.8二乙醇胺溶液；

显色剂为0.1mg/ml pH9.8 PNP-Na溶液。

终止液：2mol/L硫酸溶液。

三、检测方法实施例

齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测试剂盒的检测方法为双抗夹心酶联检测法，它包括以下步骤：

1)包被：用50mmol/L pH9.6碳酸盐包被缓冲液，将ORSV多克隆标记抗体抗体稀释至10ug/ul，在酶标板各反应孔中，每孔100ul，37℃，孵育2h；

2)封闭：倾去包被液，加入50mmol/L pH7.4 PBS+1％脱脂奶粉的封闭液，每孔100ul，37℃孵育1h，而后用100mmol/L pH7.4 PBS+0.1％Tween20的洗涤缓冲液洗涤三次；

3)加样：加入待检测的样品，每孔100ul，并设立阴性、阳性和空白对照，37℃孵育1h，而后用100mmol/L pH7.4 PBS+0.1％Tween20的洗涤缓冲液洗涤三次；

4)标记示踪：加入酶标抗体，每孔100ul，37℃孵育1h，而后用100mmol/L pH7.4 PBS+0.1％Tween20的洗涤缓冲液洗涤三次；

5)显色：加入用10％pH9.8二乙醇胺底物缓冲液配制的显色液，每孔100ul，37℃孵育30min；

6)终止反应与检测判定：加入2mol/L硫酸的终止液，每孔50ul，在酶标仪上测定OD405值。

双抗夹心酶联检测判定标准：

待测样品按OD405/阴性OD405＞2判定为阳性，OD405/阴性OD405＜2判定为阴性。

待测样品按以上标准，定性判断待测样品检测结果的阴、阳；

为检验双抗夹心酶联检测试剂盒效果，用该法检测了40份兰花样品。

检测结果如下：

	RT-PCR(+)	RT-PCR(-)	合计
				DIBA(+)DIBA(-)合计	30131	189	31940

注：“+”代表阳性；“-”代表阴性

31份由RT-PCR检测阳性的样品，DIBA检测阳性样品30份，1份阴性；

9份由RT-PCR检测阴性的样品，DIBA检测阴性样品份，阳性样品1份；

由检测结果可知：DIBA的敏感性为96.77％；特异性88.89％；检测准确性为95％。

Claims (4)

1、齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测试剂盒，主要由盒体，设在盒体内的各种用液和酶标板组成，各种用液主要包括高效价抗血清、标记抗体、阳性样品和阴性样品，各种缓冲液和显色剂，其特征在于：

所述的阳性样品为纯化的齿兰环斑病毒；

所述的阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液。

2、如权利要求1所述的齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液包括：

包被缓冲液：20-80mmol/L pH9.6碳酸盐溶液；

封闭缓冲液：20-100mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脱脂奶粉；

洗涤缓冲液：50-200mmol/L pH7.4 PBS+0.05-0.3％Tween20；

底物缓冲液：5-20％pH9.8二乙醇胺溶液；

终止液：1-5mol/L硫酸溶液；

所述的显色剂为0.05-0.5mg/ml pH9.8 PNP-Na溶液。

3、如权利要求1所述的齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的制备方法主要包括下列制备过程：

1)、齿兰环斑病毒的提取和纯化：取苋色藜病叶加0.52倍重量(g)体积(ml)的1/15M，pH7.0的PB缓冲液，同时加入1％巯基乙醇和正丁醇、三氯甲烷，在捣碎机中将病叶捣碎，过滤，将滤液分装于离心管内，6000rmp离心20分钟，上清液加入4％体积重量的PEG(MW6000)和2％体积重量的NaCL搅拌溶解，4℃过夜；6000rmp离心20分钟，沉淀加入1％TritonX-100和1/15M PB悬浮搅拌1小时，7000rmp离心20分钟；取上清，32000rmp·min(Beckman SW40)离心2小时，沉淀用1/15M PB悬浮，5000rmp·min(BeckmanJA-14)离心15分钟，上清即为粗提提纯病毒制剂，此后进行病毒的精提纯，将以上粗提纯的病毒10％-40％的蔗糖密度梯度柱上，在超速离心机上以30000rmp离心2.5小时，离心结束后将病毒带取出；

2)、抗血清的制备及纯化：选用雄性白兔作免疫动物，加等量Freund氏不完全佐剂乳化的提纯病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和两次静脉注射免疫家兔，每次注射病毒的量分别是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，间隔时间为7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用琼脂双扩散法测定效价；通过辛酸沉淀法结合DEAE离子交换层析纯化抗体，用2倍体积0.1M醋酸铵调节抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合搅拌1小时，5000rpm离心30分钟，取上清，将透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5缓冲液过夜，透析除盐，取透析完全的溶液上样于离子交换柱中，用10mMTris-HCl pH8.5缓冲液5ml/min冲洗15分钟，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5缓冲液浓度梯度进行洗脱，收集洗脱峰部分，浓缩透析，获得纯化的齿兰环斑病毒多克隆抗体；

3)、抗体标记：通过戊二醛二步法将碱性磷酸酶标记到纯化抗体，每1mg抗体加0.1％戊二醛0.05ml，静置1小时，置于透析袋中除去多余戊二醛，加入0.5mg碱性磷酸酶，混匀后置于4℃备用；

4)、阳性、阴性样品的制备：

阳性样品为纯化的齿兰环斑病毒病毒，浓度在0.1μg-100μg/ml范围；阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液；

5)、各种用液的制备：

包被缓冲液：20-80mmol/L pH9.6碳酸盐溶液；

封闭缓冲液：20-100mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脱脂奶粉；

洗涤缓冲液：50-200mmol/L pH7.4 PBS+0.05-0.3％Tween20；

底物缓冲液：5-20％pH9.8二乙醇胺溶液；

终止液：1-5mol/L硫酸溶液；

显色剂为0.1-0.5mg/ml pH9.8 PNP-Na溶液。

4、如权利要求1所述的齿兰环斑病毒双抗夹心酶联检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的检测方法为双抗夹心酶联检测法，包括以下步骤：

1)包被：用碳酸盐包被缓冲液，将ORSV多克隆标记抗体抗体稀释至1～10ug/ul，在酶标板各反应孔中，每孔100ul，37℃，孵育2小时；

2)封闭：倾去包被液，脱脂奶粉的封闭液，每孔100ul，37℃孵育1小时，而后用洗涤缓冲液洗涤三次；

3)加样：加入待检测的样品，每孔100ul，并设立阴性、阳性和空白对照，37℃孵育1小时，而后用洗涤缓冲液洗涤三次；

4)标记示踪：加入酶标抗体，每孔100ul，37℃孵育1小时，而后用洗涤缓冲液洗涤三次；

5)显色：加入用5-20％pH9.8二乙醇胺底物缓冲液配制的显色液，每孔100ul，37℃孵育30分钟；

6)终止反应与检测判定：加入1-5mol/L硫酸的终止液，每孔50ul，在酶标仪上测定OD405值。