CN1969040A - 制备适合用于再生医学的高纯度心肌细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从胚胎干细胞产生可用于再生医学中的心肌细胞系细胞的新方法。无需再通过形成胚胎样小体进行分化或在血清中进行分化。取而代之的是，将干细胞种到固体基材上，并在选择因子和形态发生蛋白的存在下进行分化。在富集了具有适宜表型的细胞后，使所述细胞聚集成高度均质性且适于治疗心脏病的心脏小体TM。

Description

制备适合用于再生医学的高纯度心肌细胞的方法
                            在先申请
本申请要求2004年3月19日提交的美国专利申请10/805,099(Geron案卷号099/004)、2004年3月26日提交的USSN 60/556,722(099/005x)以及2005年2月3日提交的USSN 60/650,194(099/030x)的优先权。
                            背景技术
再生医学(regenerative medicine)研究中主要的挑战在于开发出可有助于重建心脏功能的细胞组合物。据估计5名男性和女性中将近一人会患有某种形式的心血管疾病(《国家健康和营养检查调查III》，National Health and NutritionExamination Survey III，1988-94，疾病控制中心和美国心脏联合会，Center ofDisease Control and the American Heart Association)。普遍的病症包括冠心病(占人口的5％)、先天性心血管缺陷(0.5％)以及充血性心力衰竭(3％)。制药领域已生产出有助于限制心脏病所致损伤的小分子药物和生物化合物，但尚没有任何有助于再生受损组织的市售产品。
为了开发出能进行心脏再生的细胞群，对数种不同的前沿课题进行了研究。在数个中心中正在进行采用自体骨髓衍生细胞进行心肌梗塞后治疗的临床试验(Perin等，Circulation 107：2294，2003；Strauer等，Circulation 106：1913，2002；Zeiher等，Circulation 106：3009，2002；Tse等，Lancet 361：47，2003；Stamm等，Lancet 3661：45，2003)。推测这类细胞具有净化功能从而能改善心脏组织的血液灌注。还进行了检测采用自体骨骼肌肌原细胞进行用于心脏治疗的临床试验(Menasche等，J.Am.Coll.Cardiol.41：1078，2003；Pagani等，J.Am.Coll.Cardiol.41：879，2003；Hagege等，Lancet 361：491，2003)。然而，尚不清楚如果横纹肌细胞的收缩是否能与心律充分协调。
一种更为直接的方法是采用已经定型为功能性心肌细胞的细胞。已在动物模型中采用了同系基因型的新生或出生后心脏细胞以修复因持久性冠状动脉闭塞而引起的损伤(Reffelmann等，J.Mol.Cell Cardiol.35：607，2003；Yao等，J.Molec.Cell.Cardiol.35：607，2003)。因此，如果可将此类细胞用于人体治疗，它们可对局部缺血性心脏病进行十分有效的治疗。
国际专利公开物WO 99/49015(Zymogenetics)提出了对非粘附性多能心脏衍生人干细胞的分离。悬浮心脏细胞，进行密度梯度离心，培养并检测心脏特异性标记。经增殖和分化，所要求保护的细胞系产生了成纤维细胞、肌细胞、心肌细胞、角质化细胞、成骨细胞或软骨细胞。然而，尚不清楚是否能生产出足量的这些出版物中所例举的任何一种细胞制备物，以作为重建心脏功能的治疗组合物进行大规模市场销售。
用于治疗心脏病的再生细胞的潜在来源是各种类型的多能干细胞，尤其是胚胎干细胞。已有数个实验室报道了用小鼠ES细胞获得的结果(Wobus等，J.Mol.Cell Cardiol.29：1525，1997；Kolossov等，J.Cell Biol.143：2045，1998；Narita等，Development 122：3755，1996；L.Field，美国专利6,015,671；Klug等，J.Clin.Invest.98：216，1996；Doevendans等，J.Mol Cell Cardiol.32：839，2000；Muller等，FASEB J.14：2540，2000；Gryschenko等，Pflugers Arch.439：798，2000)。
Thomson等(Proe.Natl.Aead.Sci.USA 92：7844，1995)以恒河猴和狨猴为模型，首次从灵长动物中成功培养了胚胎干细胞。随后，他们还从人胚泡中衍生出了人胚胎干细胞(hES细胞)系(Science 282：114，1998)。人胚胎干细胞可在体外增殖而不分化；它们可保持正常的核型以及分化以产生各种成熟细胞类型的能力。
然而，在开发从灵长动物多能干(pPS)细胞获得大量富集的心肌细胞系细胞群的例子中碰到了许多障碍。某些障碍来自于：灵长动物来源的多能干细胞的相对脆弱性、培养它们的难度以及它们敏锐的敏感性和对培养环境中的各种因素的依赖性。其它障碍是了解到心脏祖细胞的终末分化需要内脏内胚层和原条(原肠胚，primitive streak)(Arai等，Dev.Dynamics 210：344，1997)。为了在体外使pPS细胞分化为心脏祖细胞，需要模拟或替代这些细胞发育成胎儿时过程中存在于天然个体发育中所发生的所有事件。
可通过通用的分化方案从hES细胞产生出搏动细胞的小斑块，目前已提出可利用这些细胞来测定小分子药物对心肌细胞跨膜电位的作用(WO04/011603；Thomson，Kamp等)。已提出可简单地通过在添加血清的培养基中进行培养来产生含有少量心脏细胞的分化细胞群，然后以某种方式分选出搏动细胞(WO 04/081205；ES Cell International)。尚不清楚如何利用心肌细胞系细胞出现频率极低的细胞群来产生纯度足以用于以商业活力方式实现治疗用途的制剂。
杰龙公司(Geron)已开发出了可使人多能干细胞在基本上不含饲养细胞的环境中连续增殖的新型组织培养环境(参见美国专利No.6,800,480；澳大利亚专利AU 751321；以及国际专利公开物WO 03/020920)。可将不含饲养细胞(Feeder-free)的pPS细胞培养物用于制备不含异种基因污染物的分化细胞群，例如肝细胞(美国专利6,458,589)、神经细胞(美国专利6,833,269)和心肌细胞(WO01/88104)。
用于改善细胞均质性和产率的扩展和分化方案的进一步发展有益于这些用于再生医学中的技术的商业化。
                         发明概述
本发明提供了一种用于将人源性多能干细胞分化为高度富含心肌细胞系细胞的分化细胞群的***，所述心肌细胞系细胞可以是终末期心肌细胞，或是能在体外增殖并能在体内或体外进一步分化为有用治疗表型的心肌前体细胞。
本发明用于从灵长动物多能干(pPS)细胞中获得富含心肌细胞系细胞群的新分化方法具有多个方面内容。其一是用直接分化方案启动该过程。将未分化的pPS细胞不经形成胚胎样小体(embryoid body)，直接接种于含有心肌细胞系细胞可粘附基材(例如明胶或纤维结合素)的固体表面上。将接种入的细胞与特定因子组合培养一段时间，从而引导细胞以高保真度进入心肌细胞(分化)途径。例子为活化素和骨形态发生蛋白，具体是BMP-4，它们通常在不含视黄酸或血清的条件下使用。然后可撒去所述因子并继续培养。所述基材和因子的存在实现了不再需要使用含有各种成分的血清或饲养细胞(即，可用于控制分化的具有不同表型和基因组的任何细胞)。然后对收集的细胞群中的心肌细胞系细胞和心脏前体细胞进行富集，并可进一步处理以提高具有心脏表型(例如，表达α-心脏肌球蛋白重链)的细胞的比例。示例性的技术包括密度梯度(例如PercollTM)分离，或用本文所述的细胞表面标记进行免疫分离。
通过形成心脏小体TM(cardiac bodyTM)可进一步提高心脏细胞的比例。它们是悬液中的心脏细胞集落，其中的许多可进行自发性收缩。在一种示例性的方法中，先制备了pPS衍生细胞群，其所含绝大部分细胞表达了心肌细胞系的特征。将所述细胞悬浮在培养基中，除去单个细胞，保留成集落的细胞。然后将成集落的细胞重悬浮并重培养在新鲜培养基中一段适宜的时间。可对这些细胞进行多轮分离、重悬浮和重新培养，直至获得该细胞集落中高达80-100％的细胞均有自发性收缩的组合物。本发明提供了从pPS细胞和混合的心肌细胞系细胞群制备心脏小体TM以及心脏小体TM本身组合物的具体方法，所述组合物任选为培养的细胞组合物形式或为适于给予哺乳动物对象的组合物形式。
本发明的一个用途是筛选对心肌细胞有作用的化合物。这涉及将该化合物与本发明的细胞群混合，然后测定由该化合物引起的任何调节作用。这可包括对细胞毒性、代谢变化、或收缩活性影响的测定。
本发明的另一用途是将心肌细胞系细胞配制成药物或将其配制于递送装置中以对人或动物体进行治疗。这使得临床医生可将所述细胞经血管***或直接进入肌肉壁而给予受损的心脏组织或其周围，从而使得心脏细胞移入、限制损伤、参与心脏肌肉***重新生长并重获心脏功能。
通过下文中的描述将会明白本发明的这些实施方式和其它实施方式。
                         附图说明
图1所示为分离的单细胞和细胞集落，对它们进行了原肌球蛋白、肌联蛋白、肌球蛋白重链(MHC)、α-辅肌动蛋白、肌纤维蛋白、心脏肌钙蛋白I(cTnI)和心脏肌钙蛋白T(cTnT)染色。单细胞和细胞集落中所有这些标记染色均为阳性。可观察到肌节结构的横纹特征，该特征与细胞所显示的收缩活性的能力相符。
图2所示为药物制剂对hES衍生心肌细胞收缩活性的影响。L型钙离子通道抑制剂地尔硫卓以剂量依赖性方式抑制了收缩活性。肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素、苯福林和克仑特罗均有变时性作用。
图3所示为对潜在亲心性因子提高细胞群中心肌细胞系细胞比例的能力的评估。在胚胎样小体形成期间引入活化素和某些生长因子(组I)；在接种到明胶上后，引入其它生长因子(组II)和5-氮杂-脱氧-胞苷；和在分化后期加入其它因子(组III)。测定了三种浓度水平组合物的作用。最有效的是低浓度生长因子与5-氮杂-脱氧-胞苷的组合。
图4(A)和4(B)所示为通过对各组因子进行独立调节而进一步细化的疏水方案。当用低水平的组I和II中的因子，然后用5-氮杂-脱氧-胞苷时，产生最多的是具有α-MHC标记特征的心肌细胞。在分化后期中采用的组III因子实际上抑制了心肌细胞的形成。在这些条件下，早期心肌细胞相关基因GATA-4的表达也有所改善。与使用任何生长因子组合均会提高的内胚层相关基因HNF3b相比，对α-MHC和GATA-4的作用是选择性的。
图5(A)所示为hES细胞直接分化而产生的细胞中心肌细胞表型的表达。使未分化的hES细胞在用FBS覆盖的明胶基材上生长成融合层，在无血清培养基中用活化素A和BMP-4诱导分化，然后在缺乏分化因子的条件下培养14天。与用常规方式在含血清培养基中由胚胎样小体产生的细胞相比，所得细胞群表达了高得多的水平的肌球蛋白重链。在去除活化素A和BMP-4后7天，出现了许多可自发搏动的区域。图5(B)所示为对细胞中作为心肌细胞系细胞的特征的心肌细胞系细胞转录因子Nkx2.5和α-肌节辅肌动蛋白进行的染色。
图6获自于直接分化制备心肌细胞之前，在成分明确的培养基中扩增hES细胞的试验。
图7所示为在由4个PercollTM组分的各组分形成的心脏小体TM中测定的cTnI表达。将未分化的hES细胞用作阴性对照。作为心脏小体TM进行培养的组分IV细胞，其αMHC或cTnI表达富集了100-500倍。
图8(A)所示为由组分IV细胞制得的心脏小体TM的一个视野(标尺≡300μm)。用箭头标记的细胞集落可进行自发性收缩。图8(B)所示为由各PercollTM组分制得的心脏小体TM经12或20天分化后的搏动细胞集落的比例。经过20天分化期得到的密度最高组分的分离物和随后培养7天的心脏小体TM的混合物产生了最高比例的能自发性收缩的细胞集落。
图9所示为体内给予本发明心肌细胞系细胞时，它们可整合并保持在心肌层中。将H&E染色(上部图)与用人特异性泛着丝点(pancentromeric)探针染色(中部图)和用人α-肌球蛋白重链特异性抗体染色(下部图)作比较，结果显示在移植区域存在hES衍生的心肌细胞。
                         发明详述
本发明提供了从灵长动物多能干细胞制备和特征鉴定心肌细胞及其前体细胞的改进方案、技术和试剂。
这一系列中的在先专利申请和出版物提供了将灵长动物多能干细胞(pPS细胞)分化为心肌细胞系细胞的方法(WO 03/006950；Xu等，Circ.Res.91：501，2002)。获得了pPS衍生的细胞群，该细胞群含有肌球蛋白重链(MHC)和心脏肌钙蛋白I(cTnI)等标记呈阳性且在组织培养中发生自发性周期收缩的细胞。
以下描述中提供的方案包括了改进心肌细胞生产方法的数个重要进展。首先，已发现心肌细胞可直接在固体表面或基质上由完全未分化的pPS细胞制得。这就无需通过制备胚胎样小体来启动分化步骤，从而改善了所得细胞的均一性。直接分化涉及在含有引导细胞成为心肌细胞系的某些亲心性因子和形态发生蛋白的条件下进行培养(实施例5)——这是通常受到胚胎或胚胎样小体中的交叉细胞信号传导(cross-cellular signaling)所控制的一种事件。还发现通过撒去这些因子并继续培养一段时间可进一步促进该过程，该方法不仅扩增了细胞群，还惊人地提高了早期心肌细胞系细胞的产率。并非暗示对该细胞群的性质或用途的任何限制，提出早期细胞的存在有助于促进这些细胞在体内的建立、适应或增殖，从而有利于增强它们再生心脏组织的能力。
另一重要方法的开发来自于观察到pPS细胞衍生的心肌细胞系细胞可在培养物中形成集落。这些细胞集落在本文中被称为心脏小体TM。已发现使得心脏小体形成，对它们进行分散，然后将该过程重复多个轮可显著提高具有所需表型的细胞的比例(实施例6和7)。该过程尤其适于商品化扩大规模。此外，这些细胞集落在存储中可更为稳定，并提供了可用于再生医学中更为有效的心肌细胞来源。
在下文中也描述了制备心肌细胞细胞群中的其它优点。按照本揭示生产的细胞具有显著的均一性和功能性特点，这就使得它们在体外研究心脏组织和在心脏病治疗中开发使心脏组织再生的新治疗方式中尤为有价值。
定义
本发明的技术和组合物涉及到由pPS衍生的心肌细胞及其前体细胞。在本文揭示的后部分章节中将提供心肌细胞的表型特征。对于心肌前体细胞没有定义具体的特征，但可在正常的个体发育中将其鉴定，未分化的pPS细胞首先分化为中胚层细胞，然后通过不同的前体细胞阶段成为功能性的(终末阶段)心肌细胞。
因此，对于本文所述的目的，将″心肌前体细胞″定义为能(不经去分化或再次程序化)产生包含成熟(终末阶段)心肌细胞的后代的细胞。常可用一种或多种选自下组的标记鉴定心肌前体细胞：GATA-4、Nkx2.5和MEF-2家族转录因子。
术语″心肌细胞系细胞″通常指心肌细胞的前体细胞和成熟的心肌细胞。在本文中所提及的心肌细胞系细胞、前体细胞或心肌细胞可等同于处于心肌细胞个体发育任何阶段的细胞，如上文所定义并无限制，除非另有说明。如下文所述，心肌细胞系细胞可具有选自下组的一种或多种标记(有时至少具有3-5种标记)：心脏肌钙蛋白I(cTnI)、心脏肌钙蛋白T(cTnT)、肌节肌球蛋白重链(MHC)、GATA-4、Nkx2.5、N-钙粘蛋白、β1-肾上腺素受体(β1-AR)、ANF、MEF-2家族转录因子、肌酸激酶MB(CK-MB)、肌红蛋白或心房钠尿因子(ANF)。
本发明的某些细胞显示出自发性周期收缩活性。这意味着当将它们培养于含有适宜Ca++浓度和电解质平衡的适宜组织培养环境中时，可观察到所述细胞在横跨该细胞的一条轴线上发生周期性收缩，然后从收缩中放松，而无需在该培养基中加入任何附加成分。
心脏小体TM(以单数或复数形式使用)这一名称是由杰龙公司创造用作代表心肌细胞集落的术语或品牌——更具体而言，是指悬浮的、pPS衍生的细胞集落，其包含人心肌细胞系细胞的2种或多种的特征。集落中大部分的细胞通过内源基因表达了cTnI、cTnT、ANF或MHC，且在Ca++和适宜的电解质的存在下，该细胞集落通常可自发性收缩。此心肌细胞集落可存在于细胞培养物、药物制剂或其它任何有用的组合物中。本文的揭示使得用户可制备出心脏小体TM的悬液，该悬液中50％以上的细胞可发生自发性收缩。
原型″灵长动物多能干细胞″(pPS细胞)是衍生自任何种类胚胎组织(胎儿或胎前组织)、且在适宜的条件下具有产生不同细胞类型后代(即衍生自所有三种胚层：内胚层、中胚层和外胚层)的能力的多能性细胞，所述能力的鉴定可按照本领域所接受的标准测试进行，例如在8-12周龄的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力或在组织培养中形成所有三种胚层的能力。
各种类型的胚胎细胞包含于pPS细胞定义中，其例子为：人胚胎干细胞(hES细胞)，见Thomson等的描述(Science 282：1145，1998)；灵长动物的胚胎干细胞，例如恒河猴干细胞(Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1995)、狨猴干细胞(Thomson等，Biol.Reprod.55：254，1996)和人胚胎生殖细胞(hEG细胞)(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)。可以建立的细胞系形式提供这些细胞类型，或直接从原代胚胎组织中获得这些细胞类型并直接用于分化。其它类型的多能细胞也包括在该术语中。包括了衍生所有三种胚层的能产生后代的灵长动物来源的任何细胞，不论它们是否衍生自胚胎组织、胎儿组织或其它来源。pPS细胞不延生于恶性来源。理想的是(但并非总是必须)所述细胞的核型是正常的。
当绝大部分干细胞和它们的衍生物在细胞群中显示出未分化细胞的形态特征时，将该pPS细胞培养物称为″未分化的″。可理解的是在该细胞群中未分化细胞的集落常被部分分化的相邻细胞所包围。
术语″胚胎样小体″是指在悬浮培养物或聚集物中的pPS细胞以非特定方式分化的而出现的包含分化和部分分化细胞的异质细胞集落。
″直接分化″是指不形成作为中间体的胚胎样小体，而使pPS细胞分化为富含特定组织类型细胞的后代的过程。当将细胞接种于固体基材上时可进行该过程，虽然如果未经明确说明，接种细胞并非是必需的。直接分化受到以下因素的影响：在含有介质成分、可溶性因子、不溶成分的悬液中或容器壁上的培养，以及实现引导细胞成为所需组织类型的其它成分。
″饲养细胞″是组织类型不同且基因组通常不同的细胞，其作用是促进与其共同培养的细胞的增殖和/或控制它们分化的作用。可将未分化的pPS细胞与使其保持未分化状态的饲养细胞共同培养，而可将正在分化的细胞与指导其分化为具体的组织类型(例如，心肌细胞)的饲养细胞共同培养。在没有任何种类饲养细胞时，可采用本文中所揭示的技术。
″生长环境″指感兴趣细胞可在其中体外增殖、分化或成熟的环境。该环境的特征包括：培养细胞的培养基、任何可能存在的生长因子或分化诱导因子、以及载体结构(例如，固体表面上的基材)，如果存在的话。
通用技术
对于实施用于本发明的通用技术的进一步细节，实施者可参考细胞生物学、组织培养、胚胎学和心脏生理学领域的标准教科书和综述。
关于组织培养和胚胎干细胞，读者可参考《畸胎瘤和胚胎干细胞：实施方法》(Teratocarcinomas and embryonic stem cell：A practical approach，E.J.Robertson编，IRL Press Ltd.1987)；《小鼠发育技术指南》(Guide to Techniquesin Mouse Development，P.M.Wasserman等编，Academic Press 1993)；《体外胚胎干细胞的分化》(Embryonic Stem Cell differentiation in Vitro，M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225：900，1993)；《胚胎干细胞的特性和用途：用于人类生物学和基因治疗的展望》(Properties and uses of embryonic stem cell：Prospects forApplication to Human Biology and Gene Therapy，P.D.Rathjen等，Reprod.Fertil.Dev.10：31，1998)。关于心脏细胞的培养，标准的参考文献包括：《培养的心脏细胞》(The Heart Cell in Culture，A.Pinson编，CRC Press 1987)、《分离的成熟心肌细胞》(Isolated Adult Cardiomyocytes，第I&II卷，Piper & Isenberg编，CRC Press 1989)、《心脏发育》(Heart Development，Harvey & Rosenthal，Academic Press 1998)、《我把我的心脏留在了旧金山》(I Left my Heart in SanFrancisco，T.Bennet，Sony Records 1990)；以及《随Wnt而去》(Gone with theWnt，M.Mitchell，Scribner 1996)。可在以下标准教科书中找到分子和细胞生物化学中的通用方法：《分子生物学中的短方案》(Short Protocols in MolecularBiology，第4版)；《免疫学方法手册》(Immunology Methods Manual，I.Lefkovits编，Academic Press 1997)；以及《细胞和组织培养：生物技术中的实验室操作》(Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures in Biotechnology，Doyle &Griffiths，John Wiley & Sons 1998).
干细胞的来源
如上所述，可采用各种类型的多能干细胞来实施本发明，尤其是衍生自胚胎组织并具有产生所有三种胚层后代能力的特征的细胞。
例子为作为现有细胞系使用的胚胎干细胞和胚胎生殖细胞，或从灵长动物物种(包括人)的原代胚胎组织建立的胚胎干细胞和胚胎生殖细胞。也可采用获自原代胚胎组织且先前尚未建立的未分化细胞系的多能细胞来实施本发明。
胚胎干细胞
可从灵长动物物种的胚泡中分离得到胚胎干细胞(美国专利5,843,780；Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1995)。可用Thomson等(美国专利6,200,806；Science 282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38：133 ff.，1998)和Reubinoff等(Nature Biotech.18：399，2000)描述的技术，从人胚泡细胞中制备人胚胎干细胞(hES细胞)。与hES细胞等价的细胞类型包括它们的多能性衍生物，例如初级外胚层样细胞(EPL细胞)，其在WO 01/51610中有描述(Bresagen)。
可从人前植入胚胎中获得人hES细胞(Thomson等，Science 282：1145，1998)。或者，也可采用体外受精(IVF)的胚胎，或可将单细胞人胚胎扩增到胚泡阶段(Bongso等，Hum Reprod 4：706，1989)。将胚胎培养到胚泡阶段，去除透明带，分离内部细胞团(例如，进行采用兔抗人脾细胞抗血清的免疫手术法)。将完整的内部细胞团接种于mEF饲养细胞(美国专利5,843,780)、人饲养细胞(US2002/0072117 A1)上或接种于不含饲养细胞但能支持未分化的hES细胞生长的适宜环境中(US-2002-0081724-A1；WO 03/020920)。将具有未分化形态的生长中的集落分离成团块并重新接种。
未分化状态的pPS细胞的增殖
采用能促进增殖同时抑制分化的培养条件，可使pPS细胞在培养中连续地繁殖。示例性的含血清ES培养基的组成如下：80％DMEM(例如Knock-OutDMEM，Gibco)、20％成分明确的胎牛血清(FBS，Hyclone)或血清替代物(US2002/0076747A1，Life Technologies Inc.)、1％非必需氨基酸、1mM L-谷胺酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇。
传统上，将ES细胞培养在一层饲养细胞上，通常为衍生自胚胎或胎儿组织的成纤维细胞(Thomson等，Science 282：1145，1998)。杰龙的科学家已发现即便无饲养细胞，也可将pPS细胞保持在未分化状态。无饲养细胞的培养环境包括适宜的培养基材，尤其是胞外基质，例如层粘连蛋白或基质胶(Matrigel，由Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞产生且含有胞外基质组分(例如层粘连蛋白)的基底膜)。以＞15,000个细胞/cm2(优选90,000-170,000/cm2)接种pPS。通常，在细胞完全分散前终止酶消化(即，用胶原蛋白酶IV处理～5分钟)。然后将含有～10到2,000个细胞的团块不经进一步分散直接种到基材上。或者，在板上铺满细胞前，可不用酶而通过在含有0.5mM EDTA的PBS溶液中孵育～5分钟收集细胞。从培养容器中洗出后，不作进一步分散将细胞接种入新的培养基中。在其它例子中，37℃下，在0.05％(重量/体积)胰蛋白酶(Gibco)和0.053mM EDTA的溶液中孵育5-15分钟，将无饲养细胞培养的铺满的hES细胞从板上移出。移出板上遗留的细胞，将细胞分散成含有单细胞和小细胞集落的悬液，然后以50,000-200,000个细胞/cm2的密度进行接种以促进存活和限制分化。
无饲养细胞的培养物用含有能促进细胞增殖而不促进分化的因子的营养培养基支持(美国专利No.6,800,480)。可通过在培养基中培养能分泌这些因子的细胞来引入这些因子，所述细胞为例如：经辐射的(～4,000辐射单位)原代小鼠胚胎成纤维细胞、端粒化的小鼠成纤维细胞或pPS细胞衍生的成纤维细胞样细胞(美国专利6,642,048)。可通过将饲养细胞接种在不含血清的培养基(例如：补充有20％血清替代物和4ng/mL bFGF的KO DMEM)中以使培养基条件化。将bFGF进一步补充到已条件化1-2天的培养基，将其用于支持培养1-2天的pPS细胞(WO 01/51616；Xu等，Nat.Biotechnol.19：971，2001)。
或者，可采用新鲜或未经条件化的培养基，该培养基已补充有能促进未分化形式细胞增殖的附加因子(例如成纤维细胞生长因子或毛喉素)。例子为基础培养基，如X-VIVOTM10(Biowhittaker)或QBSFTM-60(Quality Biological Inc.)，以40-80ng/mL的bFGF补充，并任选含有干细胞因子(15ng/mL)或Flt3配体(75ng/mL)。这些培养基制剂具有所支持的生长速率比在其它***中快2-3倍的优点(WO 03/020920)。
在显微镜下，ES细胞显示出高核/胞质比例，凸起的核仁和紧凑的集落与难于辨认的细胞连接。灵长动物ES细胞通常表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4，以及可用命名为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标记。未分化的hES细胞通常也表达转录因子Oct-3/4、Cripto、胃泌素释放肽(GRP)受体、podocalyxin样蛋白(PODXL)、以及人端粒末端转移酶的逆转录酶(hTERT)(US 2003/0224411A1)，均以RT-PCR检测。
制备心肌细胞的过程
可通过在特殊生长环境中培养或分化富含具有所需表型的细胞(通过使所需细胞生长，或通过抑制或杀死其它的细胞类型)而从未分化的干细胞获得心肌细胞系细胞。
可通过形成胚胎样小体或聚集物来启动分化：例如，使pPS细胞培养物过度生长，或将pPS细胞以悬浮状态培养于带有基材的培养容器中，其中所述基材具有低粘度的特性从而可使EB形成。通过短时胶原蛋白酶消化收集pPS细胞，将其分离成细胞集落，然后接种入无粘附细胞的培养板中(WO 01/51616；美国专利No.6,602,711)。任选地，可用藻酸盐或其它适宜的可透过营养物质的基质包裹产生EB，这有助于改善EB直径的均匀性以及所产生细胞的一致性(WO03/004626，Zandstra等)。无论该过程是否涉及EB的形成，采用含有血清或血清等价物的培养基均能促进心肌细胞系收缩细胞的聚集，培养基为例如，含～20％胎牛血清或血清添加剂(例如B27或N2)补充的适宜的生长培养基，例如RPMI。
为了促进心肌细胞表型，可将细胞与可促进心肌细胞类型细胞增殖或存活、或可抑制其它类型细胞生长的因子和因子组合物共同培养。其作用可能是对细胞本身的直接作用造成的，或者是对其它细胞类型的作用从而促进了心肌细胞的形成。例如，诱导下胚层或上胚层等价细胞的形成、或导致这些细胞产生它们自己的心脏促进元素的因子，均属于亲心性因子范畴。
能诱导pPS细胞分化为中胚层细胞、或促进其进一步分化为心肌细胞系细胞的因子包括以下因子：
●转化生长因子β相关配体(例子为：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3和下文所述的TGF-β超家族的其它成员)。结合TGF-β受体的配体能活化I型和II型丝氨酸激酶并引起Smad效应物的磷酸化。
●形态发生蛋白，如活化素A和活化素B(TGF-β超家族的成员)
●***(例如IGF I和IGF II)
●骨形态发生蛋白(TGF-β超家族的成员，例子为BMP-2和BMP-4)
●成纤维细胞生长因子(例子为bFGF、FGF-4和FGF-8)、能活化胞质激酶raf-1和促***原活化蛋白激酶(MAPK)的其它配体、以及其它促***原，例如表皮生长因子(EGF)
●影响DNA甲基化和改变心肌细胞相关基因表达的核苷酸拟似物(例如，5-氮杂-脱氧-胞苷)
●垂体激素催产素或一氧化氮(NO)
●对相同的受体具有激动活性的特异性抗体或合成化合物
尤为有效的亲心性因子组合包括：使用形态发生蛋白如活化素A和多种生长因子，例如在早期定型阶段的那些属于TGF-β和IGF家族的生长因子，任选地补充有其它亲心素(cardiotropin)，例如一种或多种成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白和血小板衍生生长因子。
在本发明的研究过程中发现在体外分化的终末阶段中略去诸如***II(IGF II)的因子和相关的分子，实际上提高了心脏基因的表达水平。在无关的研究中，发现IGF II会降低成纤维细胞中的GSK3β水平(Scalia等，J.Cell.Biochem.82：610，2001)。因此IGF II可增强培养基中存在的或由细胞分泌的Wnt蛋白的效果。Wnt蛋白通常可使胞质分子β连环蛋白稳定或引起β连环蛋白的核转运，β连环蛋白包含转录因子TCF的一部分。这将改变多种基因的转录活性。不存在Wnt时，β连环蛋白受激酶GSK3β作用而磷酸化，该激酶不仅使β连环蛋白不稳定，而且将β连环蛋白保留在胞质内。
由于Wnt活化剂如IGF II看来似乎限制了心肌细胞的分化，本发明包括在培养物中加入Wnt拮抗剂以提高pPS细胞分化为心肌细胞的程度和比例。可通过注射编码DKK-1或 Crescent(结合并灭活Wnt的分泌蛋白)的合成mRNA(Schneider等，Genes Dev.15：304，2001)，或用编码DKK-1的逆转录病毒感染(Marvin等，Genes Dev.15：316，2001)来抑制Wnt信号传导。或者，可通过提高激酶GSK3β的活性(例如将该细胞与诸如IL-6或糖皮质激素的因子共同培养)来抑制Wnt通路。
对潜在亲心性因子的评估见实施例3。当然，除非明确表明需要，无需为了在本发明的分化方案中采用亲心性因子，而了解其作用模式。可凭经验确定此类能有效富集心肌细胞产物的化合物的组合和用量，所述确定方法为：将未分化的或早期分化的hES细胞或它们的后代培养于含有这些因子的环境中，然后按照下文所列的表型标记来确定该化合物是否提高了细胞群中心肌细胞系细胞的数量。
直接分化
如前所述，pPS细胞分化的范例传统上包括形成胚胎样小体，使不同细胞类型之间相互访问(cross-talk)，认为这可促进以追溯(reminiscent)胚胎形成的方式进行的组织形成。然而，消除对形成胚胎样小体的需要常常是很有利的，这可使分化过程更到更好的控制，所得的细胞群倾向于更为均一(WO 01/51616；US 2002/0151053 A1)。本文的揭示提供了无需形成胚胎样小体且无需使用血清或血清补充物，而使hES细胞直接分化为心肌细胞的新方法。
实施例5中提供了直接分化技术的例子。首先，从扩增的pPS细胞培养物(优选无饲养细胞)中收集pPS细胞，将其接种到对未分化hES细胞有粘附性且与心肌细胞分化相容的基材或基质上。例子为：0.5％明胶、20μg/mL纤维结合素或基质胶。可将基材或基质包被在培养容器的表面；或在某些情况下，基质可以是存在于整个培养环境中的微粒或网络载体部分。采用明胶时，可通过将基质与血清一起预孵育，然后在接种细胞前洗去血清来促进细胞粘附。如果需要的话，可在启动分化前将pPS细胞安置在基材上——例如在与扩增未分化形式pPS细胞所用的类似培养基中连续培养一段适宜的时间(即，4-8天)。这通常可使得pPS细胞在新的培养环境中融合成单层。
通过将接种的细胞培养于含有本文其它部分所述的能促进心肌细胞分化的因子的培养基中以启动分化过程。例子为活化素和/或骨形态发生蛋白。TGF-β超家族蛋白活化素A和BMP-4的组合尤为有效(实施例5)。在某些条件下，可用其它形态发生蛋白，如BMP-2替代BMP-4。此阶段或其后培养步骤中所用的培养基可含有选自前文所列的添加剂。例子为***(具体为IGFI)和/或肿瘤坏死因子或其它炎症细胞因子(具体为TNF-α)。与分化因子的共同培养可进行几天到数周或更久，以引导细胞(分化)为心肌细胞系，通常为4-7天。
该技术的一个优点是无需用血清或血清替代物来启动或支持心肌细胞分化过程，而这在其它方法中是常用的。取而代之的是，可配制含有人工营养补充物的培养基以支持分化细胞(如心肌细胞或神经元)的。例子为B27补充物、N2补充物和G5补充物(Life Technologies/Gibco)。此类补充物通常包含营养素和辅助因子，如人胰岛素(500μg/L)、人转铁蛋白(5-10mg/mL)和硒(0.5μg/mL)，还可含四甲烯二胺(1.5mg/L)、生物素(1μg/L)、氢化可的松(0.4μg/L)或***(0.6μg/L)和/或低水平的促***原，如EGF或FGF(1μg/L)。为了实现商品化放大规模生产和治疗人体的目的，去除非人动物衍生的成分尤为有利。
还发现常可通过撤去TGF-β超家族的形态发生蛋白，然后在类似加有补充物的培养基中继续培养几天或多达1或2周，可提高适用于再生医学的心肌细胞系细胞的比例。在此步骤中，培养基有时可含有生长因子例如IGF，但不含BMP-2、其它BMP或其它可能延迟心肌细胞表型出现和降低产率的形态发生蛋白。
最终从培养物中收集心肌细胞系细胞(通过标记的表达或收缩活性来鉴定)。所收集的细胞群中可含有超过5％或10％的Nkx2.5阳性细胞。
然后可进一步处理分化的细胞群进行以富集具有所需特征的细胞，例如可通过机械方法分离或分选表面标记。例如，可通过密度分离将收缩细胞的百分比富集高达～20倍。实施例1和4中例举了通过等密度离心分离富集心肌细胞。可获得含有至少～5％、～20％、～60％和可能超过～90％心肌细胞系细胞的细胞群，通过MHC或其它组织特异性标记的表达对其鉴定。本文中提及的许多研究和治疗应用受益于心肌细胞比例的提高，但通常不要求完全的均质性。
心脏小体TM的形成
也已发现可通过使pPS衍生心肌细胞制备物生长成被称为心脏小体TM的细胞集落，对其进行进一步的扩增或富集。
首先，产生含有心肌细胞系细胞表型特征的细胞的细胞群，并任选地通过密度分离或其它技术对其进行富集。然后使细胞形成集落，去除悬液中的单细胞。通过使细胞集落沉降并吸出含有单细胞的上清液来完成这一步骤。在处理前，将细胞集落分开有时是有利的(例如，通过短时的胰蛋白酶消化和/或机械分散)。然后将细胞悬浮培养在低粘附性培养板中的新鲜培养基中(例子为如前所述的含有胎牛血清、血清替代物或CCT的培养基)，使其重新聚集为″次级″心脏小体TM。然后在继续进行的培养中，可按照需要定期补充心肌细胞系细胞，使其保持大小为10-5000个细胞(通常50-1000个细胞)的细胞集落。
经适宜的时间后(通常1-7天)，收集培养细胞进行特征鉴定或用于药物筛选或药物制备。如果使细胞经历多轮去除单细胞和重培养细胞集落超过8天或更久，纯化效果会提高。每轮可任选地加入如下步骤：将细胞集落分散成单细胞或较小的细胞集落，以进一步扩增。可通过聚集悬浮细胞或通过在细胞集落内增殖或采用这两种方法来形成较大的细胞集落。本发明的一个假设是在适宜的条件下心肌细胞系细胞倾向于形成这种细胞集落，而去除单细胞有助于去除其它细胞类型而提高均质性。
实施例6和7例举了该过程。将含有心肌细胞的混合细胞群置入新鲜培养基中，在15或50mL的锥形管中沉降来收集细胞集落。将其重新接种入含血清的培养基中，通过每2或3天一次的多轮细胞集落分离、接种和重新培养。在约8天后，心肌细胞标记cTnI和MHC的表达在mRNA水平上显著提高(图7)，得到了高比例的自发性收缩细胞集落(图8)。
可在分化过程中的任何时间，用心脏小体TM技术来扩增和/或富集细胞群中的心肌细胞。如下文中所示范的，可在密度分离预先富集步骤之后采用此技术。在完成本发明之前，没有预想到完成该技术具有如此好处。具体而言，当细胞培养7天后，通过实时PCR测得肌球蛋白重链表达提高了10-100倍。组合物中大部分的细胞集落显示出自发性收缩的活性，通常超过50％，当以所述的方式处理时，可能达到约80％和100％。
心肌细胞系细胞的特征鉴定
可按照许多表型标准对用本发明技术得到的细胞进行特征鉴定。pPS细胞系衍生的心肌细胞和前体细胞通常具有其它来源心肌细胞的形态学特征。它们可为纺锤形、圆形、三角形或多角形，且用免疫染色法检测可显示出肌节结构的横纹特征(图1)。它们可形成粘附于基材或漂浮在悬液中的扁平细胞层或聚集物，用电镜观察时显示典型的肌节和心房颗粒(atrial granule)。
pPS衍生的心肌细胞及其前体细胞通常具有至少一种如下的心肌细胞特异性标记：
●心脏肌钙蛋白I(cTnI)，肌钙蛋白复合物的亚单位，该复合物提供了调节横纹肌收缩的钙敏感性分子开关
●心脏肌钙蛋白T(cTnT)
●Nkx2.5，一种在小鼠早期胚胎发育中心脏中胚层表达的心脏转录因子，在发育中的心脏中仍存在
通常，该细胞还将表达至少一种(通常至少3、5或更多种)如下的标记：
●心房钠尿因子(ANF)，一种在发育的心脏中和胎儿心肌细胞中表达，但在成人中下调的激素。由于其以高度特异性的方式在心脏细胞而不在骨骼肌细胞中表达，从而被认为是心肌细胞的一种良好标记
●肌球蛋白重链(MHC)，具体为心脏特异性的β链
●肌联蛋白、原肌球蛋白、α-肌节辅肌动蛋白和肌纤维蛋白
●GATA-4，一种在心脏中胚层中高度表达且在发育的心脏中存在的转录因子。其能调节许多心脏基因并在心脏发生中起一定作用
●MEF-2A、MEF-2B、MEF-2C、MEF-2D；在心脏中胚层中表达并保留在发育的心脏中的转录因子
●N-钙粘蛋白，其能介导心脏细胞间的附着
●连接蛋白43，其能在心肌细胞间形成缝隙连接
●β1-肾上腺素受体(β1-AR)
●肌酸激酶MB(CK-MB)和肌红蛋白，心肌梗塞后它们的血清水平提高
●α-心脏肌动蛋白、早期生长应答素-I和细胞周期蛋白D2。
可用任何适宜的免疫学技术来检测组织特异性标记——例如对细胞表面标记进行流式免疫细胞计数或亲和吸附、对胞内或细胞表面标记使用免疫细胞化学法(例如，对固定的细胞或组织切片)、对细胞提取物进行蛋白质印迹分析、对细胞提取物或分泌入培养基的产物进行酶联免疫试验。可从诸如Sigma和Spectral Diagnostics供应商处购得能鉴别其它同种型的心脏标记(如cTnI和cTnT)的抗体。如果任选在固定该细胞后以及任选使用标记的二抗，在标准的免疫细胞化学或流式细胞计数试验中，可检测到明显数量的抗体与抗原结合，则说由细胞表达的抗原是可用抗体检测的。
也可在mRNA水平通过Norther印迹分析法、斑点杂交分析法或用序列特异性引物、以标准的扩增方法、用公众可获得的序列数据(GenBank)进行由逆转录酶引发的聚合酶链式反应(RT-PCR)来检测组织特异性基因产物的表达。如果蛋白质或mRNA水平上检测到组织特异性标记表达水平为对照细胞(例如未分化的pPS细胞或其它无关的细胞类型)的至少2倍，优选高于10倍或50倍以上，则认为是该表达为阳性。
一旦在细胞表面上鉴定到了具有所需表型的标记，就可将这些细胞用于免疫筛选以通过诸如免疫淘选或抗体介导的荧光活化细胞分选的技术来进一步富集该细胞群。
在适宜的条件下，pPS衍生的心肌细胞常显示出自发性周期收缩活性。这是指将这些细胞培养在具有适当Ca++浓度和电解质平衡的适宜组织培养基中时，可观察到它们沿细胞的一条轴线收缩，然后从收缩中放松，而无需在培养基中加入任何其它成分。这种收缩是周期性的，即在规律性或不规律性的基础上反复收缩，其频率为～6到200次收缩/分钟，在普通缓冲液中常为～20到～90次收缩/分钟(图2)。单个细胞自身即可显示出自发性周期收缩活性，或它们可与存在于同一组织、细胞聚集物或培养的细胞团中的相邻细胞一致的自发性周期收缩。
可按照培养条件对收缩性质和频率的影响来特征鉴定细胞的收缩活性。降低可利用的Ca++浓度或干扰Ca++跨膜转运的化合物通常会影响收缩活性。例如，L型钙离子通道阻滞剂地尔硫卓以剂量依赖性方式抑制收缩活性(图2)。另一方面，肾上腺素受体激动剂(如异丙肾上腺素和苯福林)具有正性变时性(positivechronotropic)作用。对细胞功能特性的进一步特征分析可涉及到对Na+、K+和Ca++通道的特征分析。可通过对心肌细胞样活动电位的膜片钳分析来进行电生理研究。参见Igelmund等，Pflugers Arch.437：669，1999；Wobus等，Ann.N.Y.Acad.Sci.27：752，1995；和Doevendans等，J.Mol.Cell Cardiol.32：839，2000。
功能特性提供了在体外特征鉴定细胞及其前体细胞的方法，但对本文揭示的某些用途可逆不是必需的。例如，如果将富含具有上文所述的某些标记但并不具备所有功能或电生理特性细胞的混合细胞群移植到受损的心脏组织，能够在体内获得补充心脏功能所需的功能特性，则认为这些细胞群具有有益的治疗作用。
当从已建立的pPS细胞系中产生时，可将本发明的细胞群以及分离的细胞特征鉴定为具有与产生它们的细胞系相同的基因组。这是指pPS细胞和心脏细胞之间染色体DNA将会有90％以上的相同性，如果通过正常的有丝***过程从未分化的细胞系中获得心脏细胞，则可推论出该相同性。心肌细胞系细胞衍生自亲代细胞群这一特征在多个方面是很重要的。具体而言，可用未分化的细胞群来产生具有共享基因组的其它细胞——无论是另一批心脏细胞，还是可用于治疗的另一种类型的细胞——例如可使患者对组织相容类型的心脏同种异体移植物产生预耐受性的细胞群(US 2002/0086005A1；WO 03/050251)。
分化细胞的遗传改变(genetic alteration)
可在分化前或分化后对本发明的细胞进行遗传工程改造，使其包含一种或多种遗传改变(US 2002/0168766A1)。当用任何适宜的人工操作方法将多核苷酸转入细胞中，或该细胞为先前已遗传接受了该多核苷酸而改变的细胞的后代，则说该细胞是″遗传改变的″。例如，可通过遗传性改变细胞以使其表达端粒酶逆转录酶，以提高细胞的复制能力，无论是在它们发展为发育受限的细胞系(restricted developmental lineage cell)或是终末分化细胞之前或之后(US2003/0022367 A1)。
也可遗传改变本发明的细胞以增强它们参与组织再生或将治疗基因递送到给药部位的能力。用所需基因的已知编码序列设计了载体，使其操作性连接于在分化的细胞类型中具有泛特异性或特异性活性的启动子。特别感兴趣的是经遗传改变表达一种或多种各种类型的生长因子的细胞，收缩生长因子为例如FGF，亲心性因子，例如心房钠尿因子、cripto和心脏转录调节因子，例如GATA-4，Nkx2.5和MEF2-C。在给药部位产生这些因子可使功能性表型更易被接受、增强所给予细胞的有益作用、或提高邻近治疗部位宿主细胞的增殖或活性。
心肌细胞及其前体细胞的用途
本发明提供了一种生产大量心肌细胞系细胞的方法。可将这些细胞群用于许多重要的研究、开发和商业目的。
药物筛选
可将本发明的心肌细胞用于商业化筛选能影响这些细胞和它们不同后代的因素(例如溶剂、小分子药物、肽、寡核苷酸)或环境条件(例如培养条件或操作)。
在某些应用中，将pPS细胞(未分化的或已分化的)用于筛选能促进其成熟成为后期阶段心肌前体细胞或终末分化细胞的因子，或在长期培养中能促进这些细胞增殖和保持的因子。例如，可按照进一步培养和应用这些细胞所期望的标准，通过将候选的成熟因子或生长因子加入到不同孔的细胞中，然后测定所导致的任何表型变化来检测这些候选因子。
本发明的其它筛选应用涉及到药物组合物对心脏肌肉组织的维持或修复作用的检测。可因该化合物设计为对所述细胞具有药理学作用，或因设计的化合物对其它部位有效而可能对该组织类型的细胞有副作用而进行该筛选。可利用本发明的任何前体细胞或终末分化的细胞来进行这种筛选。
一般来说，读者可参考标准教材《药学研究的体外方法》(In vitro Methodsin Pharmaceutical Research，Academic Press，1997)和美国专利5,030,015。候选药物化合物活性的评估通常包括将本发明的分化细胞与该候选化合物相混合，无论是单独混合或是与其它药物组合。研究者测定由该化合物所引起的细胞形态、表型标记或功能活性的变化(与未经处理的细胞或用惰性化合物处理的细胞比较)，然后将观察到变化与该化合物的作用相关联。
可在第一种情况下通过对细胞活力、存活、形态和某些标记和受体的表达的作用来测定细胞毒性。可测定DNA合成或修复来测定药物对染色体DNA的作用。[3H]-胸苷或BrdU掺入，尤其在细胞周期中不特定的时间中掺入，或超过细胞复制所需水平，与药物的作用相符合。不良作用还包括通过***中期散布(metaphase spread)所测定的罕见比例的姐妹染色单体交换。对于更多的细节，读者可参考A.Vickers(《药学研究的体外方法》，in In vitro Methods inPharmaceutical Research，第375-410页Academic Press，1997)。
可采用任何标准测试观察心肌细胞的表型或活性来评估对细胞功能的影响，例如可通过检测标记表达、受体结合、收缩活性或电生理——无论在细胞培养物中或在体内。也可检测候选药物对收缩活性的影响——例如它们是否提高或降低了收缩的程度或频率。当观察到有影响时，可逐步增加化合物的浓度以测定其半数有效剂量(ED50)。
动物试验
本发明还提供为了任何可觉察到的需求，例如先天性代谢功能失调、病情的影响或明显创伤的结果等，采用心肌细胞及其前体细胞促进心肌组织维持或修复。
为了确定用于治疗性给药的细胞组合物的适宜性，可先在适宜的动物模型中测试该细胞。在某一水平上，评估细胞在体内存活和保持其表型的能力。将细胞组合物给予免疫缺陷动物(例如裸鼠或用化学方法或辐射方法使其产生免疫缺陷的动物)。经过一定阶段的再生后收集组织，并评估是否仍存在pPS衍生的细胞。
这可通过给予能表达可检测标记(例如绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶)的细胞来进行；这些细胞是经预先标记的(例如，用BrdU或[3H]胸苷)，或通过后继检测组成性细胞标记(例如，利用人特异性抗体)。可使用人特异性抗体进行免疫组化或ELISA来评估所给予细胞的存在和表型，也可用能引起人多核苷酸特异性扩增的引物和杂交条件，按照公开的序列数据，通过RT-PCR分析来评估。
还可通过评估pPS衍生的心肌细胞群治疗而后使心脏恢复的程度来确定适宜性。已有许多动物模型可用于该测试。例如，可通过使预冷的铝棒接触左心室前壁表面来冻伤心脏(Murry等，J.Clin.Invest.98：2209，1996；Reinecke等，Circulation 100：193，1999；美国专利6,099,832；Reinecke等，Circ Res.，Epub Mar2004)。在较大的动物中，可通过将置于液氮中冷却的30-50mm铜盘探头放到左心室前壁上～20分钟来进行冷冻损伤(Chiu等，Ann.Thorac.Surg.60：12，1995)。可通过结扎左主冠状动脉来诱导梗塞(Li等，J.Clin.Invest.100：1991，1997)。用本发明的细胞制备物治疗受损部位，通过组织学检查心脏组织受损区域中所述细胞的存在。可通过测定如下参数来监测心功能：左心室舒张末期压、扩展压力(developed pressure)、压力升高的速度以及压力减退的速度。
对人的治疗用途
经适当测试后，可将本发明的分化细胞用于需要此类治疗的病人或其它对象中，以进行组织重建或再生。给予该细胞的方式应可使细胞能植入或迁移到预定的组织部位，并重建或再生该功能缺陷区域。可获得将能重建心脏功能的细胞直接给予心腔、心包或心肌内部所需部位的专用装置。
如果需要的话，可治疗对接受同种异体移植pPS衍生心肌细胞的患者以降低求偶对植入细胞免疫排斥反应。考虑的方法包括：给予常规的免疫抑制药物，如环孢霉素A(Dunn等，Drugs 61：1957，2001)或利用匹配的pPS衍生的细胞诱导免疫耐受(WO 02/44343；美国专利6,280,718；WO 03/050251)。另一方法是调整心肌细胞细胞群以降低植入对象后的该细胞产生的尿酸量，例如，通过用别嘌醇处理细胞。选择性地或联合地给予患者别嘌醇或能分解代谢尿酸的酶，例如尿酸盐氧化酶(PCT/US04/42917)。
适于接受本发明再生医学的患者包括各种类型的急慢性心脏病患者，例如冠心病、心肌病、心内膜炎、先天性心血管缺陷和充血性心力衰竭。可用临床接受的标准来监测治疗的效果，例如由疤痕组织占据的面积的减小或疤痕组织的血管再形成，以及心绞痛的频率和严重程度；或扩展压力、收缩压、舒张末期压、Δ压力/Δ时间、患者灵活性和生活质量。
可以药物组合物的形式提供本发明的心肌细胞，该组合物包含在充分灭菌条件下制备的用于人体给药中的等渗赋形剂。当分化过程包扩将细胞培养为心脏小体TM时，需用蛋白酶或柔和的机械操作将细胞分散成单细胞或较小细胞集落的悬液。为了降低植入时细胞死亡的风险，可在给予前用热激处理细胞或将其培养在～0.5U/mL的***中～24小时。
对于药物配制中的常用方案，读者可参考《细胞治疗：干细胞移植、基因治疗和细胞免疫治疗》(Cell Therapy：Stem Cell Transplantation，Gene Therapy，and Cellular Immunotherapy，G.Morstyn & W.Sheridan编，Cambridge UniversityPress，1996)；和《造血干细胞治疗》(Hematopoietic Stem Cell Therapy，E.D.Ball，J.Lister & P.Law，Churchill Livingstone，2000)。可按照给药所用的途径和装置调整组合物中细胞赋形剂和任何相关成分的选择。该组合物还可包含或伴有一种或多种使心肌细胞植入或功能性迁移更为容易的其它成分。适宜的成分包括：支持或促进心肌细胞粘附的基质蛋白，或补充的细胞类型，尤其是内皮细胞。
本发明还包括试剂***，其包含生产、分布或使用过程中任何时间存在的一系列细胞或细胞组合。所述细胞系列包括本文揭示中所述的两种或多种细胞群的任何组合，例子但不限于一类分化pPS衍生的细胞(心肌细胞、心肌前体细胞、心脏小体TM等)与未分化的pPS细胞或其它分化的细胞类型的组合，它们通常具有相同的基因组。可将该系列的各种细胞类型包装在一起或包装在不同容器中，装入在同一装置中或不同位置中，在相同或不同时间，由同一实体或共享工作关联的不同实体控制。
可任选地将本发明的药物组合物包装在带有对所期望目的书面说明书的适宜容器中，例如说明用于重建心肌细胞功能以改善病情或改善心肌异常。
提供以下实施例以作为对本发明具体实施方式的进一步非限制性说明。
                          实施例
实施例1：由hES细胞分化为心肌细胞
先在饲养细胞上建立的hES细胞系H1、H7、H9和H9.2(H9产生的克隆系)，然后将其保持在无饲养细胞的条件下(如WO 01/51616所述)。将hES细胞悬浮培养启动分化，以形成胚胎样小体。在悬液中培养4天后，将EB转移到用明胶包被的板上或带腔载玻片上。在分化的第15-29天用机械方法从EB生长物中分离搏动的心肌细胞，收集并洗涤。所有测试的hES细胞系均能产生搏动心肌细胞，甚至在保持超过50次传代后(～260的细胞群倍增)，虽然某些细胞系(例如，H7)比其它细胞系产生得更多。
图1所示为使用胶原蛋白酶B使细胞悬浮、重新接种，然后对表达的肌节肌球蛋白重链(MHC)、肌联蛋白、原肌球蛋白、α-肌节辅肌动蛋白、肌纤维蛋白、cTnI和心脏肌钙蛋白T(cTnT)进行免疫细胞化学染色的结果。单细胞和细胞集落中所有这些标记的染色均为阳性。着染的单个心肌细胞呈纺锤形、圆形和三角或多角形。还可观察到肌节结构的横纹特征，该特征与肌肉功能所需的收缩活性的能力是相符的。
在不连续梯度PercollTM上(含有用胶态PVP涂覆的二氧化硅的密度分离介质)上，通过密度分离进一步富集心肌细胞。如前所述产生心肌细胞，接种在明胶上15天后收集，将其用分化培养基重新悬浮。沉降5分钟，将细胞悬液加载到覆盖在58.5％PercollTM层(～1.075g/mL)之上的40.5％PercollTM层上(Pharmacia)(～1.05g/mL)。然后1500g下离心细胞30分钟。离心后，收集两层界面上的细胞，洗涤，并在分化培养基中重新悬浮，接种到带腔载玻片中。所收集细胞的26.8±4.1％显示有肌节肌球蛋白重链(MHC)染色，比起始细胞群至少高～20倍。
通过测定心肌细胞对心脏活性药物的变时性作用反应是否适当来测试hES衍生的心肌细胞的功能。
图2(分图A)所示为L型钙离子通道抑制剂地尔硫卓以剂量依赖性方式抑制搏动速率。用10-5M地尔硫卓处理细胞时，100％的搏动区域停止了收缩。该观察显示hES衍生心肌细胞具有功能性L型钙离子通道。分图B和C所示为由异丙肾上腺素(一种β-肾上腺素受体激动剂)和苯福林(一种α-肾上腺素受体激动剂)诱导的正性变时性作用。分图D和E显示了磷酸二酯酶抑制剂IBMX和β2-肾上腺素受体激动剂克仑特罗具有类似的作用。因此，hES细胞衍生的细胞对心脏活性药物的反应方式为心肌细胞系细胞的反应。
实施例2：促进心肌细胞分化的因子
在分化的第1-4、4-6或6-8天，用5-氮杂-脱氧-胞苷(一种影响DNA甲基化的胞苷类似物)处理H1或H9系产生的胚胎样小体。在第15天时收集细胞，用实时RT-PCR分析心脏MHC。在第6-8天，1-10μM的5-氮杂-脱氧-胞苷显著提高了心脏α-MHC的表达，这与培养物中搏动区域比例提高是相关的。
检验了其它试剂对诱导心肌细胞分化的能力，这些试剂包括：二甲基亚砜(DMSO)和全反式视黄酸(RA)。在第0-4天用0.5％DMSO处理的胚胎样小体产生了少于未经处理的培养物的搏动区域。用0.8％或1％DMSO处理的培养物中没有搏动细胞，而1.5％DMSO事实上对细胞是有毒性的。与未经处理的培养物相比，用DMSO处理还导致α-MHC表达的显著降低。
将剂量为10-9和10-5M的视黄酸加到分化中的hES培养物。在第0-4天时，RA对细胞具有毒性，而第4-8、8-15或4-15天时，与未经处理的培养物相比，搏动细胞没有增长。因此，5-氮杂-脱氧-胞苷提高了细胞群中的心肌细胞比例。相反，DMSO和视黄酸抑制了心肌细胞分化，虽然这些化合物能使小鼠胚胎瘤(embryonic carcinoma)或胚胎干细胞产生心肌细胞(Wobus等，J.Mol.CellCardiol.29：1525，1997；McBurney等，Nature 299：165，1982)。
实施例3：心肌细胞分化剂的有效组合
本实施例是研究所加入的生长因子影响人ES细胞分化为心肌细胞的联合作用。
其原理如下。选择在初步定型时能提供下胚层功能的因子为组I因子。选择在后继发育中与组I因子联合时可提供内胚层功能的因子为组II因子。选择延长的培养中，能使心肌细胞存活的因子为组III因子。将典型的工作浓度定义为″中″水平，将低4倍和高4倍的水平定义为″低″和″高″水平。浓度如下所示：
表2：示范性的亲心性因子
  生长因子   低浓度   中浓度   高浓度
  组I活化素ATGF IIGF II 6.25ng/mL2.5ng/mL6.25nM 25ng/mL10ng/mL25nM 100ng/mL40ng/mL100nM
  组IIBMP 4FGF 4胰岛素bFGFPDGF-BB 1.25ng/mL12.5ng/mL6.25ng/mL12.5ng/mL12.5ng/mL 5ng/mL50ng/mL25ng/mL50ng/mL50ng/mL 20ng/mL200ng/mL100ng/mL200ng/mL200ng/mL
  5-氮杂-脱氧-胞苷   10μM   10μM   10μM
  组IIIIGF IIGF IILIFEGFPDGF-BBbFGF胰岛素 6.25nM6.25nM5ng/mL6.25ng/mL0.9ng/mL2.5ng/mL6.25nM 25nM25nM20ng/mL25ng/mL3.6ng/mL10ng/mL25nM 100nM100nM80ng/mL100ng/mL14.4ng/mL40ng/mL100nM
图3(上部图)所示为施用这些因子的流程。用第48代的H1细胞产生胚胎样小体，用胶原蛋白酶对其进行处理，然后用5mL移液管将细胞从培养皿中刮下移出。将一个10cm2孔内容物中的细胞转移到低粘附性板的一个10cm2孔中，在4ml加有20％FBS的DMEM中，加入或不加入其它因子，培养4天。第4天结束时，将各胚胎样小体悬液分成2个等份，接种到用明胶包被的粘附性6孔组织培养板的两个孔中(10cm2/孔)。将粘附的胚胎样小体及其生长物培养在4mL加有20％FBS的DMEM中，加入或不加入其它因子，培养11天，然后用光镜观察各空中搏动区域的数量，收集各孔中的RNA用于后面的定量PCR分析。
第0天时(将未分化的细胞转移到悬浮培养液中以产生胚胎样小体的那天)加入组I因子，并使其连续存在直至第8天(将胚胎样小体接种到用明胶包被的孔中后的第4天)。第4天时加入组II因子(接种时)，并使其连续存在直至第8天。第8天时加入组III因子，并使其连续存在直至试验结束(第15天)。使培养物的一个亚组与5-氮杂-脱氧-胞苷接触48小时(第6-8天)。第6、8、11和13天将培养物重新接种于加有或减去因子的新鲜培养基中。
观察到：在对照培养物(保持在无补充因子/5-氮杂-脱氧-胞苷中的培养物)或无5-氮杂-脱氧-胞苷但存在有生长因子的培养物中未观察到搏动区域，在接受生长因子加5-氮杂-脱氧-胞苷组合中所有孔中都观察到了搏动区域。
图3(下部图)所示为心脏基因α肌球蛋白重链(αMHC)的表达相对于正常心脏RNA表达水平的定量PCR分析(TaqmanTM)。与生长因子(GF)加5-氮杂-脱氧-胞苷接触的细胞的表达水平显著提高。所测试的最低浓度已足以获得较高的αMHC表达(比对照中观察到的水平高30倍)。
这些结果在随后的试验中有详细说明。如前所述培养H1细胞(第38代)，除了：a)仅采用先前试验中所用的最低浓度的因子；和b)在一组样品中，省略组III的处理。然后以实时PCR测定相对于未分化细胞的标记表达水平。
图4显示了省略方案中组III使得αMHC mRNA的表达量又提高了3倍。还检测到早期心肌细胞相关基因GATA-4表达的提高。相反，在这些条件下，未能特异性地诱导内胚层相关基因HNF3b。与用任何生长因子组合但不含5-氮杂-脱氧-胞苷时均会提高的内胚层相关基因HNF3b相比，对α-MHC和GATA-4的这种作用是可选择的。
这些结果证明组I和II中的因子提高了具有心肌细胞特征的细胞比例。
实施例4：四相离心分离(Four-phase centrifugation separation)方法
通过如下方法从H7系的hES细胞产生心肌细胞：形成胚胎样小体4天，然后在用明胶包被的板上增殖17天(不用5-氮杂-脱氧-胞苷和生长因子)。然后用胶原蛋白酶B分离这些细胞，重新悬浮在分化培养基中。然后将该细胞悬液层叠放到不连续梯度的PercollTM上，1500g离心30分钟。收集到以下4个组分：I.上层界面；II.40.5％层；III.下层界面；IV.58.5％层。洗涤细胞，重新悬浮于分化培养基中。将用于免疫染色的细胞以104个细胞/孔的密度接种到带腔载玻片中，培养2或7天，然后固定和染色。
结果示于表3中。计数各组分中3个重复孔中的30个图像中的细胞，以测定MHC阳性细胞的百分比，表示为3孔细胞的平均值±标准偏差。
                       表3：PercollTM分离
组分 细胞计数 搏动细胞              MHC染色的％
  第2天   第7天
  分离前IIIIIIIV 9.0×1061.6×1064.0×1061.3×106   +±++++++   17±4.4％2.6±0.5％4.5±1.5％35.7±2.7％69.±5.0％   15±4％2.5±3.0％2.4±0.9％28.3±9.4％52.2±14.5％
在所有组分中均观察到搏动细胞，但组分III和IV中含有最高百分比。
表4所示为通过间接免疫细胞化学法测定的细胞表型。
        表4：经分离的细胞群的特征鉴定
  抗原表位   心肌细胞系   非心脏细胞
  cTn1心脏特异性α/βMHC心脏βMHC肌节MHCN-钙粘蛋白平滑肌肌动蛋白   ++++++++++++   ----±亚组
  肌细胞生成素甲胎蛋白β-微管素IIIKi67BrdUSSEA-4Tra-1-81   ---亚组亚组--   ---亚组亚组--
可通过具有cTnI和MHC染色来鉴定通过密度梯度离心分离的心肌细胞群。无肌细胞生成素、甲胎蛋白或β-微管素III的染色说明没有骨骼肌、内胚层细胞类型和神经元。缺乏SSEA-4和Tra-1-81染色证实了不存在未分化的hES细胞。
据报道α-平滑肌肌动蛋白(SMA)存在于胚胎和胎儿心肌细胞中，但不存在于成人心肌细胞(Leor等，Circulation 97：I1332，1996；Etzion等，Mol.Cell Cardiol.33：1321，2001)。事实上，获自心肌细胞分化方案的所有cTnI阳性细胞和cTnI阴性细胞一个亚组对SMA均为阳性，提示它们可能处于早期阶段并能进行增殖。
重新接种组分III和IV中的细胞，再培养2天。43±4％的MHC阳性细胞表达BrdU，这表明它们处于细胞周期的S期。在其它试验中，发现cTnI阳性细胞的一个亚组表达Ki-67。这些结果显示该细胞群中约20％或40％的心肌细胞正经历活跃增殖。
实施例5：直接分化方案
在本实施例中，通过将H7系的hES细胞接种到基材上并在含有分化因子的无血清培养基中培养来使其分化为心肌细胞系细胞。
以如下方法制备组织培养表面：用0.5％明胶包被过夜，然后在含有20％FBS的培养基中孵育2-4小时，在接种hES细胞前去除FBS。或者，用人纤维结合素(20μg/mL)或生长因子-弱化的(reduced)基质胶包被塑料，随后不与含血清的培养基一起孵育。
在示范性试验中，测试了TGFβ相关因子诱导中胚层或早期心肌细胞特征性基因表达的能力。将H7系衍生的未分化hES细胞接种如用明胶包被的24孔板中。作为未分化细胞在用mEF条件培养基中生长1周后，将培养基换成RPMI+B27补充物、含有或不含50ng/mL活化素A、50ng/mLBMP-4或同时含这两种因子。4天后，通过更换培养基去除生长因子，然后将细胞再培养于只有RPMI+B27的培养基中14天。作为对比，还按前述的胚胎样小体方案使hES细胞分化(在含有20％FBS的培养基中悬浮培养4天，然后培养于用0.5％明胶包被的表面上，在培养的第12-20天时收集细胞)。
用基因特异性引物，通过实时PCR分析测定分化细胞中的α-肌球蛋白重链表达。用Applied Biosystems Data的18s rRNA特异性试验，将多次反应的数据标准化。
图5(A)显示了结果。与在含血清培养基中从胚胎样小体产生的细胞相比，在直接分化方法中用明胶包被的板上的活化素A和BMP-4的组合产生的细胞所表达的MHC水平明显提高。明显产生了许多自发性搏动区域，形成了球状体，该球状体稍后会呈现更扁平的外观，撒去活化素A和BMP-4后7天开始搏动。培养时无活化素A和BMP-4的孔中未见这种搏动区域。
在独立的试验中，使细胞以相同的方式在多孔带腔载玻片上分化。在用活化素A和BMP-4的培养孔中见到多个自发性搏动区域，它们显示出组织化、功能性肌节的迹象，而无这种因子组合的培养孔中不存在搏动区域。用2％多聚甲醛固定载玻片，用乙醇进行透化处理，然后对标记表达进行染色。
图5(B)显示了结果。细胞显示出心脏转录因子Nkx2.5的核定位强表达和α-肌节辅肌动蛋白的胞质表达。观察到细胞集落有两种标记的染色。分别呈阳性染色的细胞已组织起呈横纹状的α-辅肌动蛋白，这与功能性肌节是一致的。使用H1系的hES细胞也获得了类似的结果。
在另一试验中，用事先在新鲜(未调节的)培养基中以未分化的形式扩增的H7系的hES细胞来产生心肌细胞。该已知成分培养基是用购自XVIVO-10TM(BioWhittaker)的培养基制备的，如US 2005/0037492A1中所述，补充有2mM L-谷胺酰胺、0.1mM 2-巯基乙醇、0.1mM非必需氨基酸(invitrogen)、80ng/mL bFGF和0.5ng/mL TGFβ1。
第一步是将hES细胞接种到适于产生心肌细胞的基质上。将保持在已知成分培养基中的H7 hES细胞与胶原蛋白酶IV(200U/mL)，在37℃下一起孵育5分钟，用PBS洗涤，收集小细胞集落，接种到用明胶包被的带腔载玻片或24孔板上(用0.5％明胶包被过夜，然后与含有FBS的培养基一起孵育过夜)。将细胞培养在该新基质上2天，培养基中含有20％FBS、1mM L-谷胺酰胺、0.1mM 2-巯基乙醇和0.1mM非必需氨基酸，然后培养于XVIVO-10TM培养基中，然后在含有8或80mg/mL bFGF的XVIVO-10TM中培养4天，在含有0.5ng/mL TGFβ1的培养基中培养6天；或在补充XVIVO-10TM培养基中培养6天。
为了使其分化为心肌细胞，随后将接种的细胞培养在补充有B27、50ng/mLBMP-4和50ng/mL活化素A的RPMI培养基中。4天后用补充有B27但缺乏生长因子的RPMI培养基替换该培养基。
收集分化第18天的细胞用于免疫细胞化学分析。用含有2％多聚甲醛的PBS对其进行固定，用乙醇进行透化，以10％正常山羊血清封闭，然后与抗Nkx2.5的抗体(Santa Cruz Biotech)或抗α-肌节辅肌动蛋白(Sigma)共同孵育，然后用标记的二抗处理。
图6显示了结果。通过核中表达的Nkx2.5和胞质中表达α-肌节辅肌动蛋白的表达来鉴定心脏系细胞。有些细胞核中表达了Nkx2.5，但α-辅肌动蛋白表达为阴性，则认为其代表了心肌前体细胞。存在以不同大小的细胞集落形式存在的双阳性细胞和Nkx2.5阳性/α-辅肌动蛋白阴性细胞。
直接分化方法产生了大量适合于体外研究和移植的搏动细胞。此***产生心肌细胞的惊人效力和易行性暗示了心肌细胞后代的高比例，这对于商业化大规模生产心肌细胞的某些方面以及这些细胞在药物筛选和治疗中的应用中颇具价值。
实施例6：通过制备心脏小体TM富集收缩细胞
本实施例说明后继将心肌细胞集落培养为心脏小体TM以富集可用于治疗或具有其它目的所需特性的细胞。
如前所述，用3个225cm2培养瓶中的未分化H7系hES细胞来产生胚胎样小体。将各培养瓶的EB重新悬浮在75mL培养基中，转移到3块低粘附性的6孔板中(4mL细胞悬液/孔)，总共获得9块板的EB悬浮液。悬浮中培养1天后，将新形成的EB转移入50mL锥形管(1板/管)重新加液，室温不搅动，使EB沉降10-20分钟，然后去除培养基，用新鲜培养基替换(25mL/管)。
将EB移回到原先的低粘附性板中，在含20％FBS的培养基中保持悬浮状态再培养3天，然后转移到总共3个用明胶包被的225cm2组织培养培养瓶中。转移到用明胶包被的培养瓶中2天后，去除培养基在各培养瓶中加入75mL含20％FBS的培养基再培养。在第8、11、13、15和18天时进行类似的重新换液。第20天时，用BlendzymeTM分离分化的培养物，如前所述用不连续PercollTM梯度进行组分分离。回收组分IV(密度最高的组分)细胞并计数，得到～3.7×106个单细胞和小细胞集落。
将组分IV的细胞重新悬浮于～6.5mL含20％FBS的培养基中，转移到15mL锥形管中，室温不搅动，沉降10分钟。去除培养基(含2.8×106个细胞，大部分为单细胞)，用新鲜培养基替换。将细胞悬液转移到单个低粘附性6孔板中(～4mL细胞悬浮液/孔)。每48小时以类似的方式对CB重新更换培养基(转移入50mL管中，沉降10分钟，去除培养基并替换)。
图7所示为用实时PCR(TaqmanTM)测定的肌节基因αMHC和心脏肌钙蛋白I的表达。相对于培养于明胶上20天后的表达，用PercollTM分离组分IV中的细胞的表达提高了2-5倍。去除单细胞后收集的细胞集落使表达提高了5-20倍。将细胞培养为心脏小体TM8天后，其表达比未经分离的细胞高100-500倍。
将CB重新接种到明胶或基质胶(由Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞产生的含有胞外基质成分如层粘连蛋白的分离的基底膜)，细胞集落发生粘附，扁平化，产生大的自发性收缩细胞斑块。用于动物测试时，可直接植入心脏小体TM或将其分散成单细胞悬液。
实施例7：培养条件的比较
在本实施例中，在PercollTM分离和心脏小体TM形成之前，进行了不同阶段的心肌细胞分化培养。
用7个225cm2培养瓶中的未分化hES细胞来产生EB，总共得到21板悬浮的EB。如前所述，将EB培养于含20％胎牛血清的培养基中，于第4天接种到明胶上，此后每2或3天用新鲜培养基换液。第12天时，通过如前所述的密度梯度离心分离4个培养瓶中的分化细胞，在第20天时，对剩余的3个培养瓶中的细胞进行处理。将4个PercollTM组分中各自的集落细胞分散成单细胞悬液。然后悬浮培养这些细胞中生长以形成心脏小体TM，第2、5和6天时更换新鲜培养基。第7天时，收集细胞在显微镜下观察。
图8(A)所示为由组分IV细胞制备的心脏小体TM的一个视野(标尺≡300μm)。箭头标出的细胞集落可进行自发性收缩。图8(B)所示为通过计数各制备物中收缩性细胞集落而获得的定量数据。组分IV显示有最高比例的自发性收缩细胞，在起始细胞群分化20天时该比例更高。用类似的方案，获得了大部分细胞集落均有搏动的悬液。
发现通过如下方法可提高心脏小体TM中的心脏细胞百分比：用PercollTM梯度分离并去除组分IV细胞集落中的单细胞后，用胰蛋白酶消化细胞集落将其分散成单细胞悬液，重新悬浮在培养基(含20％FBS的培养基或优选含血清替代物或CCT的无血清培养基)中。将该悬液转移到低粘附性6孔板(4mL/孔)中，每2-3天换液培养。与最初形成的细胞集落相比(14.1％)，由此形成的″次级″心脏小体TM显示出更高的心肌细胞百分比(45.9％，用流式细胞计量术测定cTNT阳性细胞)。
在其后的试验中，分析了心脏小体TM的表型标记，结果如下。
          表4：心脏小体TM的特征鉴定
  抗原表位   心肌细胞系   非心脏细胞
  cTnIcTnTα-辅肌动蛋白肌节MHCCD56泛细胞角蛋白   ++++++++++-   ----亚组亚组
可将直接分化技术和心脏小体TM形成技术联用以优化心肌细胞系细胞的纯度和产率。例子为如下步骤。
将未分化hES细胞接种于已用基质胶、人纤维结合素或0.5％明胶预处理并用FBS预孵育的组织培养板上或培养瓶中。用mEF条件培养基或补充有100ng/mL bFGF和0.5ng/mL TGFβ1的XVIVO-10TM培养基扩增细胞。1周后，用加有诸如B27的补充物以及各50ng/mL的活化素A和BMP-4的RPMI替换培养基。4天后，用加有补充物但无活化素或BMP的RPMI替换培养基。每2或3天用相同的培养基更换后培养，直至收集细胞(通常为去除活化素和BMP4后～14天)。
收集细胞，以BlendzymeTM消化、通过不连续PercollTM梯度离心纯化。将组分IV的细胞以相应于约1-5百万个细胞/mL的密度重新悬浮转移入锥形管中。室温不搅动，将细胞悬液孵育10分钟。轻轻吸弃漂浮细胞，用PBS洗涤剩余的细胞集落1次，然后用0.025％胰蛋白酶/EDTA将其分散成单细胞。将细胞以约4mL/5百万个起始组分IV细胞重新悬浮在含20％FBS的培养基中。将细胞悬液转移入低粘附性组织培养板，每2-4天用轻柔离心换液或在更换培养基前使心脏小体TM室温沉降换液。悬浮培养1-2周后，将心脏小体TM用作富含hES衍生的心肌细胞的来源，或在收集前将其用于又一轮心脏小体TM形成。
实施例8：将心脏小体TM移植代完整的心肌层中
为了评估心脏小体在体内的存活能力，将H7衍生的细胞移植入成年裸大鼠未受伤害的心脏中。用H7hES细胞在含20％FBS的培养基中产生胚胎样小体；将胚胎样小体悬浮培养4天，然后使其粘附在用明胶包被的培养瓶上，再培养2周。如上所述制备心脏小体TM，将其悬浮保持在含20％FBS的培养基中1周，每2-3天换液。
按照与希龙公司的研究赞助协议，Charles Murry和Michael Laflamme博士在华盛顿州立大学(西雅图)完成了移植试验。移植前24小时，将心脏小体TM在43℃下进行30分钟的热激以提高其存活。移植当天，将心脏小体TM注射入未受损的裸大鼠左心室的心肌层中。一周后，处死大鼠，固定心脏，切片，检查心肌层中人细胞的存在。
图9显示了结果。按照用人特异性泛着丝点探针进行原位杂交试验，在3只小鼠中的2只中鉴定到了人细胞(中部图)。通过用针对β-肌球蛋白重链且对人ortholog特异性的抗体进行标记进一步鉴定该人细胞为心肌细胞(下部图)。
这些数据证明本发明的hES衍生的心肌细胞系细胞适于移植入心肌层，在心肌层中它们可存活并整合入宿主心肌层组织中。
本领域的技术人员可对本说明书所提供的组合物和方法进行有效的改进，但这不脱离由所附权利要求书具体化的本发明范围。

Claims (28)

1.一种从灵长动物多能干细胞(pPS细胞)中获得心肌细胞系细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将人胚泡pPS细胞系的未分化细胞不经形成胚胎样小体，直接接种到固体表面上，其中所述表面具有供心肌细胞系细胞粘附的基材；
b)使接种的pPS细胞建立在所述基材上；
c)在无血清或饲养细胞，但存在活化素和骨形态发生蛋白的条件下，培养所述建立的细胞；
d)在无活化素或骨形态发生蛋白的存在下，任选地培养获自d)的细胞；
e)收集培养物中的所述细胞；以及
f)富集所收集的细胞群中表达α-心脏肌球蛋白重链(MHC)的细胞。
2.如前述权利要求所述的方法，其特征在于，步骤a)中的所述pPS细胞是已建立的人胚胎干细胞系。
3.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，将所述细胞接种到用明胶或纤维结合素包被的基材上。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，通过将未分化pPS细胞培养在所述基材上4天或4天以上建立所述细胞。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤d)中，将所述细胞与活化素A和BMP-4共同培养4天或4天以上。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤e)中，将所述细胞在无活化素或骨形态发生蛋白的条件下培养1周或1周以上。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤d)和e)中，在无BMP-2但存在培养基补充物的条件下培养所述细胞，其中所述补充物中含有胰岛素、转铁蛋白和硒。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在富集步骤g)中包括按照所收获细胞的密度将它们分离为诸组分；然后收集由内源基因表达MHC的组分。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括：
a)从富集的细胞群中，将以单细胞形式存在的细胞从以细胞集落形式存在的细胞中分离；
b)将所述以细胞集落形式存在的细胞重新悬浮在营养培养基中；
c)将所述重新悬浮的细胞重新培养于所述营养培养基中；和
d)收集并洗涤所述重新培养的细胞；
由此产生至少50％的集落发生自发性收缩的细胞集落。
10.一种从pPS细胞获得心肌细胞系细胞的方法，所述方法包括使人胚泡pPS细胞系细胞分化成含有至少20％MHC阳性细胞的细胞群，然后对所述分化的细胞实施以下步骤：
a)将以单细胞形式存在的细胞从以细胞集落形式存在的细胞中分离；
b)将所述以细胞集落形式存在的细胞重新悬浮在营养培养基中；
c)将所述重新悬浮的细胞重新培养于所述营养培养基中；和
d)收集并洗涤所述重新培养的细胞；
由此产生至少50％的集落发生自发性收缩的细胞集落。
11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，通过使成集落的细胞从悬液中沉降将所述单细胞从集落细胞中分离，并去除悬液中的其余细胞。
12.如权利要求9-11所述的方法，其特征在于，所述用于培养重新悬浮细胞的营养培养基含有约20％的血清或血清替代物。
13.如权利要求9-12所述的方法，所述方法包括将所述细胞分离、重新悬浮和重新培养3次或3次以上。
14.如权利要求9-13所述的方法，其特征在于，重新培养后，所述集落的至少80％发生自发性收缩。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，将所述细胞集落接种到用明胶或基质胶包被的表面上。
16.如权利要求9-15中任一项所述的方法，其还包括将心脏小体分散成单细胞和/或较小细胞集落的悬液。
17.在从人胚泡细胞产生心肌细胞系细胞过程中培养的多种细胞群，所述细胞群包括：
a)由pPS细胞系产生的未分化细胞；和
b)按照前述任何一项权利要求所述的方法从所述pPS细胞系分化产生的心肌细胞系细胞群。
18.一种按照权利要求9-16中任一项所述获得的心脏小体组合物，其中将心脏小体定义为发生自发性收缩的细胞集落，且所述心脏小体所含的大部分细胞通过内源基因表达心脏肌钙蛋白I(cTnI)、心脏肌钙蛋白T(cTnT)或心房钠尿因子(ANF)或α-心脏肌球蛋白重链(MHC)。
19.如权利要求17或18所述的心肌细胞系细胞或心脏小体，将其配制到赋形剂中，从而将该组合物给予哺乳动物对象使得来自心脏小体的细胞在该对象中存活并植入。
20.如权利要求17-19所述的组合物，包装所述组合物并附上关于所述组合物在治疗心脏病中的应用的资料。
21.按照权利要求1-16中任一项所述的方法得到的组合物在制备用于治疗心脏病的药物中的用途。
22.一种用于治疗心脏病的产品，所述产品包含安置在装置中的按照权利要求1-16中任一项所述获得的组合物，所述装置适于将所述细胞群给入心脏肌肉***中或给到心脏肌肉***的周围。
23.一种重建或补充心脏组织收缩活性的方法，所述方法包括将所述组织与按照权利要求1-16中任一项所述获得的组合物接触。
24.一种筛选对心肌细胞有作用的化合物的方法，所述方法包括将按照权利要求1-16中任一项所述获得的细胞与含有所述化合物的培养基混合，并测定所述化合物对所述细胞的影响。
25.如权利要求24所述的方法，所述方法包括测定所述化合物对所述细胞是否具有毒性。
26.如权利要求24或25所述的方法，所述方法包括测定所述化合物是否提高或降低了所述细胞的搏动率。
27.如权利要求17-20中任一项所述的组合物，所述组合物基本上如参考任何一个实施例的上下文所述。
28.如权利要求1-16或21-26中任一项所述的方法或用途，所述方法或用途基本上如任何一个的参考实施例的上下文所述。
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