CN113801846A - 一种从人诱导多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种从人诱导多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法，包含如下步骤，步骤一：采用人诱导多能干细胞分化形成具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞；步骤二:所述具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞经内皮‑血液转化，形成具有CD34‑CD45+表达的NK祖细胞；步骤三：NK祖细胞进一步分化为具有CD56+CD3‑表达的NK细胞。本发明提供的方案所产生NK细胞高表达NKG2D受体，具有更强的细胞因子分泌能力和肿瘤杀伤能力。

Description

一种从人诱导多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及人诱导多能干细胞(iPSC)向免疫细胞分化的关键技术，尤其是一种从人诱导多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法。
背景技术
人类自然杀伤细胞(NK)是人体固有免疫***的重要组成部分，是人体对抗感染和杀伤肿瘤细胞的第一道防线。NK细胞可通过其细胞表面的细胞毒性受体(NKp46、NKp44、NKp30)、NKG2D和DNAM-1(CD226)等识别肿瘤抗原，并通过自然杀伤(通过穿孔素、颗粒酶裂解肿瘤细胞)、分泌细胞因子，以及抗体依赖的ADCC途径杀伤和抑制肿瘤细胞。
NK细胞对于机体防御和对抗肿瘤非常关键，但肿瘤病人体内的NK通常是功能受损的，因此，通过外源输入功能正常或经过基因改造的功能加强的NK细胞对肿瘤细胞进行杀伤，即NK细胞过继治疗，是目前癌症治疗的前沿和热点。NK细胞过继治疗需要解决的瓶颈之一即NK细胞的来源问题。虽然NK细胞可以从病人自身或健康供者的血液中提取，但存在着个体差异大，扩增倍数有限，细胞质量难以控制，基因改造难度大等问题。
诱导多能干细胞(iPSC)是日本科学家山中伸弥2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型，具有在体外无限增殖并分化为多种类型的人体功能细胞的能力。iPSC制备技术的建立，为解决免疫细胞治疗中种子细胞来源受限，供者间配型成功率低，细胞体外扩增能力有限等诸多技术瓶颈带来了创新性的解决途径。
现有技术中也有如采用在无血清培养基中培养多能干细胞，聚集未分化干细胞以形成胚状体，其被培养以产生造血前体细胞，并将前体细胞培养以产生NK细胞。但其存在的技术问题是：1)使用了Spin EB的方法形成拟胚体，操作复杂且难以扩大规模；2)过程中使用了动物源性成分(Matrigel、Gelatin等)；3)使用了feeder细胞(OP9、K562)。
术语释义：
Figure BDA0003273501920000021
发明内容
本申请提供一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，所产生NK细胞高表达NKG2D受体，具有更强的细胞因子分泌能力和肿瘤杀伤能力。
为实现上述技术目的，本申请采取的技术方案为一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，包含如下步骤：
步骤一：采用人诱导多能干细胞分化形成具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞；
步骤二：所述具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞经内皮-血液转化，形成具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞；
步骤三：所述具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞进一步分化为具有CD56+CD3-表达的NK细胞。
在一些实施方案中，所述步骤一中分化所依赖的培养体系为在生物反应器或细胞工厂中接种人诱导多能干细胞。
在一些实施方案中，所述步骤一分化依赖于培养基Ⅰ，所述培养基Ⅰ成份含有细胞因子I；所述细胞因子Ⅰ包括细胞因子组合A与细胞因子组合B；
所述细胞因子组合A为VEGF，bFGF，Activin-A中的至少两种的组合；
所述细胞因子组合B为BMP-4，SCF，IL-3，IL-6，TPO，FLT3L中的至少一种或多种的组合；
所述培养基中各细胞因子Ⅰ的用量VEGF 1-100ng/ml，bFGF 0.25-50ng/ml，Activin-A 0.1-20ng/ml，BMP-4 0.3-60ng/ml，SCF 1-200ng/ml，IL-3 0.1-20ng/ml，IL-60.1-20ng/ml，TPO 0.1-100ng/ml,FLT3L 0.1-30ng/ml。
在一些实施方案中，所述培养基Ⅰ还含有基础培养基I；所述基础培养基Ⅰ为AIM-V，X-Vivo-10，X-Vivo-15，Optimizer，PRIME-XV和KBM581中的一种或多种按照任意比例的混合。
在一些实施方案中，所述步骤二中分化所依赖的培养体系为在生物反应器或细胞工厂中接种具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞。
在一些实施方案中，所述步骤二分化依赖于培养基II；所述培养基II包括细胞因子II；所述细胞因子II包含细胞因子组合C与细胞因子组合D；
所述细胞因子组合C包含SCF、TPO、FLT3L、IL3或IL6中的一种或多种的组合；
所述细胞因子组合D包含IL7、IL15、IL12、IL18、IL21中的一种或多种的组合；
各细胞因子II的用量为SCF 1-200ng/ml，TPO 1-100ng/ml，FLT3L 1-200ng/ml，IL3 1-200ng/ml，IL6 1-100ng/ml，IL7 1-100ng/ml，IL15 1-100ng/ml，IL12 1-100ng/ml，IL18 1-100ng/ml，IL21 1-100ng/ml。
在一些实施方案中，所述培养基II还包括基础培养基II；所述基础培养基II为AIM-V，X-Vivo-10，X-Vivo-15，Optimizer，PRIME-XV和KBM581中的一种或多种按照不同比例的混合。
在一些实施方案中，所述步骤三分化所依赖的培养体系为细胞工厂或生物反应器中接种具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞。
在一些实施方案中，所述步骤三中的分化培养依赖培养基Ⅲ实现；所述培养基Ⅲ的成份包括细胞因子Ⅲ；
所述细胞因子Ⅲ包括SCF，TPO，FLT3L，IL3，IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15，IL21中的一种或多种的组合；
所述培养基Ⅲ中的细胞因子Ⅲ的用量SCF 1-200ng/ml，TPO 1-100ng/ml，FLT3L1-200ng/ml，IL3 1-200ng/ml，IL6 1-100ng/ml，IL7 1-100ng/ml，IL11 1-100ng/ml，IL121-100ng/ml，IL18 1-100ng/ml，IL15 1-100ng/ml，IL21 1-100ng/ml。
在一些实施方案中，所述培养基Ⅲ的成份还包括基础培养基Ⅲ；所述基础培养基Ⅲ包括AIM-V，X-Vivo-10，X-Vivo-15，Optimizer，PRIME-XV和KBM581中的一种或多种按照任意质量比例的混合。
在一些实施方案中，所述培养基Ⅲ的成份还包括营养添加物；所述营养添加物为Human Serum Albumin，human AB serum，Human Platelet Lysate，Serum ReplacementXeno Free中的一种或几种不同比例的组合。
有益效果
本申请提供一种从人诱导多能干细胞(iPSC)分化自然杀伤细胞(NK细胞)的方法。本申请的技术方案从工艺上，直接通过iPSC分化具有特定表达的内皮祖细胞，通过内皮祖细胞进一步分化为具有特定表达的NK祖细胞，进而获得设定目标表达的NK细胞，使得KDR+CD73+内皮祖细胞在无需WNT信号通路抑制剂或其它小分子抑制剂作用的情况下，经由primitive EHT转化而获得CD34-CD45+NK祖细胞，并进而分化为NKG2D受体高表达的NK细胞。由此种路径分化得到的NK细胞具有更强的细胞因子分泌能力和细胞杀伤能力。
另外，本申请的NK细胞提供的培养体系基于生物反应器和细胞工厂，且无需添加血清、feeder细胞、基质蛋白及小分子抑制剂，适合于NK细胞的规模化扩增、工业化生产及临床应用。
进一步的，本发明提供的方案所产生NK细胞高表达NKG2D受体，具有更强的细胞因子分泌能力和肿瘤杀伤能力。
附图说明
图1绘示本申请从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法的流程图；
图2显示培养基Ⅰ的验证检测图。
图3显示培养基II的验证检测图。
图4显示培养基Ⅲ的验证检测图。
图5NKG2D表达的验证图。
图6杀伤性能的验证图。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。一般来说，本文所使用的术语是公知的并且常规使用于本领域。
本发明所使用的主要术语定义如下：替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。
在发育过程中，NK细胞来源于共同淋巴祖细胞(common lymphoid progenitors，CLP)。在小鼠和人体的胚胎发育过程中，NK细胞及其祖细胞均被发现存在于妊娠中期的胎肝中，但其具体的发育路径仍然不明确(Boiersetal.,2013)。已有报道表明，小鼠和人体中的血液发育过程中均存在着前后两次内皮-血液转化(endothelial to hematopoietictransition，EHT)。第一次内皮-血液转化称为primitive EHT，第二次内皮-血液转化称为definitive EHT。Carissa Dege等发现无论是小鼠体内还是人体内，经由primitive EHT转化而来的NK细胞均具有更强的杀伤能力(DevCell.2020Apr20；53(2):229-239)。iPSC分化获得NK细胞的过程模拟了胚胎发育的过程。本申请提供了一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，使得KDR+CD73+内皮祖细胞在无需WNT信号通路抑制剂或其它小分子抑制剂作用的情况下经由primitive EHT转化而获得CD34-CD45+NK祖细胞，并进而分化为NKG2D受体高表达的NK细胞。由此种路径分化得到的NK细胞具有更强的细胞因子分泌能力和细胞杀伤能力。
本申请提供了一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，包含如下步骤：
步骤一：采用人诱导多能干细胞分化形成具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞；
步骤二:所述具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞经内皮-血液转化，形成具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞；
步骤三：NK祖细胞进一步分化为具有CD56+CD3-表达的NK细胞。
可用于人诱导多能干细胞，可以包括本领域技术人员已知的各种常见来源的人诱导多能干细胞，例如：赛贝生物(Cellapy)所提供的人诱导多能干细胞(hiPSC)。
在一些实施方案中，步骤一、步骤二与步骤三中每次更换培养基时，在移除旧培养基之后，可以进行冲洗。可用于本发明的洗涤液通常为PBS或DPBS，冲洗次数没有特别限制，可以是1次、2次、3次或者更多次。
在本发明中，将人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法中，可采用第一培养体系培养。所述第一培养体系包括拟胚体的分化方法或者贴壁培养的方法。
通过拟胚体的分化方法：
1)将人诱导多能干细胞接种至波浪式生物反应器中，在波浪式生物反应器中加NK分化培养基I。其中，人诱导多能干细胞的接种密度选择为:0.1x106/ml-2x106/ml。例如0.1x106/ml、0.3x106/ml、0.5x106/ml、0.8x106/ml、1.0x106/ml、1.1x106/ml、1.3x106/ml、1.5x106/ml、1.8x106/ml和2.0x106/ml等，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的加入量范围。其他相似条件下的本发明的人诱导多能干细胞接种可以根据实际情况进行调整。
2)设置波浪式生物反应器的参数为：转速10-100rpm，角度0-20度。优选地，转速20-50rpm，角度5-10度，目的是保证培养基中能够充分溶氧，以促使细胞能加快代谢，促进细胞扩增。
3)细胞培养16小时后，于显微镜下拍照，确认形成拟胚体，并确认大部分拟胚体直径在30-300um左右。
4)继续培养4-12天，流式细胞术检测细胞表面标志物KDR和CD73的表达，以确认形成KDR+CD73+内皮祖细胞。
此处，波浪式生物反应器可以采用搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、鼓泡塔生物反应器、膜生物反应器、动物生物反应器等替换。
通过贴壁培养的方法：
1)将人诱导多能干细胞接种至细胞工厂中，同时加NK分化培养基I。其中，人诱导多能干细胞的接种密度选择为：0.1x105/cm2-1x105/cm2。例如，0.1x105/cm2、0.2x105/cm2、0.3x105/cm2、0.4x105/cm2、0.5x105/cm2、0.6x105/cm2、0.7x105/cm2、0.8x105/cm2、0.9x105/cm2和1.0x105/cm2等，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的加入量范围。
2)细胞培养16小时后，于显微镜下拍照，确认细胞生长状态良好，并确认细胞汇合度在50％－80％。
3)继续培养4-12天，流式细胞术检测细胞表面标志物KDR和CD73的表达，确认形成了KDR+CD73+内皮祖细胞。
同样的，步骤二:所述具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞经内皮-血液转化，形成具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞；与步骤三：NK祖细胞进一步分化为具有CD56+CD3-表达的NK细胞，均可采用细胞工厂或生物反应器进行细胞的培养。
本环节的分化选用的外界环境为生物反应器或细胞工厂。生物反应器与细胞工厂的培养体系相较于孔板，具有较大的接种面积，在细胞分化时具有更高的细胞分化量，同时分化的细胞具有高的纯度，能够很好的满足具有设定表征的NK细胞的培养，以保证所培养的NK细胞具有更好的定向杀伤效果。其能应用的场合为满足NK细胞的工业化生产。尤其是生物反应器，在细胞培养过程中会增加溶氧量能够有效促进细胞扩增。
当在本发明的培养基Ⅰ(应用于步骤一)中使用时，细胞因子Ⅰ包括细胞因子组合A与细胞因子组合B；所述细胞因子组合A为VEGF，bFGF，Activin-A中的至少两种的组合；所述细胞因子组合B为BMP-4，SCF，IL-3，IL-6，TPO，FLT3L中的至少一种或多种的组合。例如：
细胞因子Ⅰ选择方式一有：VEGF和bFGF，与BMP-4、SCF、IL-3、IL-6、TPO或FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式二有：bFGF和Activin-A，与BMP-4、SCF、IL-3、IL-6、TPO或FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式三有：VEGF和Activin-A，与BMP-4、SCF、IL-3、IL-6、TPO或FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式四有：VEGF，bFGF和Activin-A，与BMP-4、SCF、IL-3、IL-6、TPO或FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式五有：VEGF和bFGF，与BMP-4和SCF、BMP-4和IL-3、BMP-4和IL-6、BMP-4和TPO或BMP-4和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式六有：bFGF和Activin-A，与BMP-4和SCF、BMP-4和IL-3、BMP-4和IL-6、BMP-4和TPO或BMP-4和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式七有：VEGF和Activin-A，与BMP-4和SCF、BMP-4和IL-3、BMP-4和IL-6、BMP-4和TPO或BMP-4和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式八有：VEGF，bFGF和Activin-A，与BMP-4和SCF、BMP-4和IL-3、BMP-4和IL-6、BMP-4和TPO或BMP-4和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式九有：VEGF和bFGF，分别与BMP-4、SCF和IL-3，BMP-4、SCF和IL-6，BMP-4、SCF和TPO，BMP-4、SCF和FLT3L，BMP-4、IL-3和IL-6，BMP-4、IL-3和TPO，BMP-4、IL-3和FLT3L，BMP-4、IL-6和TPO，BMP-4、IL-6和FLT3L，BMP-4、TPO和FLT3L，SCF、IL-3和IL-6，SCF、IL-3和TPO，SCF、IL-3和FLT3L，SCF、IL-6和TPO，SCF、IL-6和FLT3L，SCF、TPO和FLT3L，IL-3、IL-6和TPO，IL-3、IL-6和FLT3L，IL-3、TPO和FLT3L，IL-6、TPO和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式十有：bFGF和Activin-A，分别与BMP-4、SCF和IL-3，BMP-4、SCF和IL-6，BMP-4、SCF和TPO，BMP-4、SCF和FLT3L，BMP-4、IL-3和IL-6，BMP-4、IL-3和TPO，BMP-4、IL-3和FLT3L，BMP-4、IL-6和TPO，BMP-4、IL-6和FLT3L，BMP-4、TPO和FLT3L，SCF、IL-3和IL-6，SCF、IL-3和TPO，SCF、IL-3和FLT3L，SCF、IL-6和TPO，SCF、IL-6和FLT3L，SCF、TPO和FLT3L，IL-3、IL-6和TPO，IL-3、IL-6和FLT3L，IL-3、TPO和FLT3L，IL-6、TPO和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式十一有：VEGF和Activin-A，分别与BMP-4、SCF和IL-3，BMP-4、SCF和IL-6，BMP-4、SCF和TPO，BMP-4、SCF和FLT3L，BMP-4、IL-3和IL-6，BMP-4、IL-3和TPO，BMP-4、IL-3和FLT3L，BMP-4、IL-6和TPO，BMP-4、IL-6和FLT3L，BMP-4、TPO和FLT3L，SCF、IL-3和IL-6，SCF、IL-3和TPO，SCF、IL-3和FLT3L，SCF、IL-6和TPO，SCF、IL-6和FLT3L，SCF、TPO和FLT3L，IL-3、IL-6和TPO，IL-3、IL-6和FLT3L，IL-3、TPO和FLT3L，IL-6、TPO和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式十二有：VEGF，bFGF和Activin-A，分别与BMP-4、SCF和IL-3，BMP-4、SCF和IL-6，BMP-4、SCF和TPO，BMP-4、SCF和FLT3L，BMP-4、IL-3和IL-6，BMP-4、IL-3和TPO，BMP-4、IL-3和FLT3L，BMP-4、IL-6和TPO，BMP-4、IL-6和FLT3L，BMP-4、TPO和FLT3L，SCF、IL-3和IL-6，SCF、IL-3和TPO，SCF、IL-3和FLT3L，SCF、IL-6和TPO，SCF、IL-6和FLT3L，SCF、TPO和FLT3L，IL-3、IL-6和TPO，IL-3、IL-6和FLT3L，IL-3、TPO和FLT3L，IL-6、TPO和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式十三有：VEGF和bFGF，分别与BMP-4、SCF、IL-3和IL-6，BMP-4、SCF、IL-3和TPO，BMP-4、SCF、IL-3和FLT3L，BMP-4、IL-3、IL-6和TPO，BMP-4、IL-3、IL-6和FLT3L，BMP-4、IL-6、TPO和FLT3L，SCF、IL-3、IL-6和TPO，SCF、IL-3、IL-6和FLT3L，SCF、IL-3、TPO和FLT3L，SCF、IL-6、TPO和FLT3L，IL-3、IL-6、TPO和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式十四有：VEGF和Activin-A，分别与BMP-4、SCF、IL-3和IL-6，BMP-4、SCF、IL-3和TPO，BMP-4、SCF、IL-3和FLT3L，BMP-4、IL-3、IL-6和TPO，BMP-4、IL-3、IL-6和FLT3L，BMP-4、IL-6、TPO和FLT3L，SCF、IL-3、IL-6和TPO，SCF、IL-3、IL-6和FLT3L，SCF、IL-3、TPO和FLT3L，SCF、IL-6、TPO和FLT3L，IL-3、IL-6、TPO和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式十五有bFGF和Activin-A，分别与BMP-4、SCF、IL-3和IL-6，BMP-4、SCF、IL-3和TPO，BMP-4、SCF、IL-3和FLT3L，BMP-4、IL-3、IL-6和TPO，BMP-4、IL-3、IL-6和FLT3L，BMP-4、IL-6、TPO和FLT3L，SCF、IL-3、IL-6和TPO，SCF、IL-3、IL-6和FLT3L，SCF、IL-3、TPO和FLT3L，SCF、IL-6、TPO和FLT3L，IL-3、IL-6、TPO和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式十六有VEGF、bFGF和Activin-A，分别与BMP-4、SCF、IL-3和IL-6，BMP-4、SCF、IL-3和TPO，BMP-4、SCF、IL-3和FLT3L，BMP-4、IL-3、IL-6和TPO，BMP-4、IL-3、IL-6和FLT3L，BMP-4、IL-6、TPO和FLT3L，SCF、IL-3、IL-6和TPO，SCF、IL-3、IL-6和FLT3L，SCF、IL-3、TPO和FLT3L，SCF、IL-6、TPO和FLT3L，IL-3、IL-6、TPO和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式十七有：VEGF和bFGF，分别与BMP-4、SCF、IL-3、IL-6和TPO，BMP-4、SCF、IL-3、IL-6和FLT3L，BMP-4、IL-3、IL-6、TPO和FLT3L，BMP-4、SCF、IL-6、TPO和FLT3L，BMP-4、SCF、IL-3、TPO和FLT3L，SCF、IL-3、IL-6、TPO和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式十八有：VEGF和Activin-A，分别与BMP-4、SCF、IL-3、IL-6和TPO，BMP-4、SCF、IL-3、IL-6和FLT3L，BMP-4、IL-3、IL-6、TPO和FLT3L，BMP-4、SCF、IL-6、TPO和FLT3L，BMP-4、SCF、IL-3、TPO和FLT3L，SCF、IL-3、IL-6、TPO和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式十九有bFGF和Activin-A，分别与BMP-4、SCF、IL-3、IL-6和TPO，BMP-4、SCF、IL-3、IL-6和FLT3L，BMP-4、IL-3、IL-6、TPO和FLT3L，BMP-4、SCF、IL-6、TPO和FLT3L，BMP-4、SCF、IL-3、TPO和FLT3L，SCF、IL-3、IL-6、TPO和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式十六有VEGF、bFGF和Activin-A，分别与BMP-4、SCF、IL-3、IL-6和TPO，BMP-4、SCF、IL-3、IL-6和FLT3L，BMP-4、IL-3、IL-6、TPO和FLT3L，BMP-4、SCF、IL-6、TPO和FLT3L，BMP-4、SCF、IL-3、TPO和FLT3L，SCF、IL-3、IL-6、TPO和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式十七有VEGF和bFGF，与BMP-4、SCF、IL-3、L-6、TPO和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式十八有VEGF和Activin-A，与BMP-4、SCF、IL-3、L-6、TPO和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式十九有bFGF和Activin-A，与BMP-4、SCF、IL-3、L-6、TPO和FLT3L的组合。
细胞因子Ⅰ选择方式二十有VEGF、bFGF和Activin-A，与BMP-4、SCF、IL-3、L-6、TPO和FLT3L的组合。
当在本发明培养基Ⅰ进行应用时，VEGF的含量范围为1-100ng/ml，例如1、2、5、8、10、12、15、18、20、22、25、28、30、32、35、38、40、42、45、50、52、55、58、60、62、65、68、70、72、75、78、80、82、85、88、90、92、95、98和100ng/ml，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围，例如但不限于1-10ng/ml、1-20ng/ml、1-50ng/ml、5-55ng/ml、10-60ng/ml、20-90ng/ml和25-100ng/ml等。在一些实施方案中，VEGF的含量范围为1-50ng/ml，优选为10-30ng/ml，更优选为15-25ng/ml。在一些实施方案中，VEGF的含量范围为25-100ng/ml，优选为50-80ng/ml，更优选为55-75ng/ml。
当在本发明培养基Ⅰ进行应用时，bFGF的含量范围为0.25-50ng/ml，例如0.25、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75、6.0、6.25、6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75、8.0、……、42、42.25、42.5、42.75、43、43.25、43.5、43.75、44、44.25、44.5、44.75、45、45.25、45.5、45.75、46、46.25、46.5、46.75、47、47.25、47.5、47.75、48、48.25、48.5、48.75、49、49.25、49.5、49.75和50ng/ml，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。在一些实施方案中，bFGF的使用范围为0.25-30ng/ml，优选为的5-25ng/ml，更优选的是10-20ng/ml。
当在本发明培养基Ⅰ进行应用时，Activin-A的含量范围为0.1-20ng/ml，例如0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6、0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5和20ng/ml，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。在一些实施方案中，Activin-A的使用范围为0.1-15.5ng/ml，优选地为5.0-10.0ng/ml。在另一些实施方案中，Activin-A的使用范围为15.5-20ng/ml，优选地为16-18ng/ml。
当在本发明培养基Ⅰ进行应用时，BMP-4的使用量范围0.3-60ng/ml，例如，0.3、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、……、51.0、51.5、52.0、52.5、53.0、53.5、54.0、54.5、55.0、55.5、56.0、56.5、57.0、57.5、58.0、58.5、59.0、59.5和60.0ng/ml。以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。在一些实施方案中，BMP-4的使用量优选为：0.3-40ng/ml，更优选地是20-30ng/ml。在另一些实施方案中，BMP-4的使用量优选为：40-60ng/ml。
当在本发明培养基Ⅰ进行应用时，SCF的用量范围1-200ng/ml。例如1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195和200ng/ml，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。在一些实施方案中，优选的是1-100ng/ml；进一步优选地是，20-50ng/ml。
当在本发明培养基Ⅰ进行应用时，IL-3的用量范围是0.1-20ng/ml。例如，0.1、0.6、1.0、1.3、1.6、2.0、2.3、2.6、3.0、3.3、3.6、4.0、4.3、4.6、5.0、5.3、5.6、6.0、6.3、6.6、……、18.0、18.3、18.6、19.0、19.3、19.6和20.0ng/ml等，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。在一些实施方案中，IL-3的用量范围优选地为0.1-15ng/ml，更优选地是5-10ng/ml。
当在本发明培养基Ⅰ进行应用时，IL-6的用量范围是0.1-20ng/ml。例如，0.1、0.6、1.0、1.3、1.6、2.0、2.3、2.6、3.0、3.3、3.6、4.0、4.3、4.6、5.0、5.3、5.6、6.0、6.3、6.6、7.0、7.3、7.6、……、15.0、15.3、15.6、16.0、16.3、16.6、17.0、17.3、17.6、18.0、18.3、18.6、19.0、19.3、19.6和20.0ng/ml等，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。在一些实施方案中，IL-6的用量范围优选地为0.1-15ng/ml，更优选地是5-10ng/ml。在另一些实施方案中，IL-6的用量范围优选地为15-20ng/ml，更优选地是16-18ng/ml。
当在本发明培养基Ⅰ进行应用时，TPO的用量范围是0.1-100ng/ml。例如0.1、0.8、1.0、1.2、1.8、2.0、2.2、2.8、3.0、3.2、3.8、4.0、……、38.0、38.2、38.8、39.0、39.2、39.8、40.0、……、99.0、99.2、99.8、100ng/ml等，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。在一些实施方案中，优选地是0.1-17.8ng/ml，更优选地是4.8-15.8ng/ml。在另一些实施方案中，优选地是17.8-40ng/ml，优选地是，22.8-36.8ng/ml。
当在本发明培养基Ⅰ进行应用时，FLT3L的使用量为0.1-30ng/ml，例如0.1、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、24.0、25.0、26.0、27.0、28.0、29.0和30.0ng/ml等，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。在一些实施方案中优选为5-15ng/ml；在另一些实施方案中优选为10-25ng/ml。
当在本发明的培养基Ⅰ中使用时，基础培养基I；所述基础培养基Ⅰ为AIM-V，X-Vivo-10，X-Vivo-15，Optimizer，PRIME-XV，KBM581中的一种或多种按照任意比例的混合。
本发明中培养基Ⅰ具有1.促使人诱导多能干细胞分化形成具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞；2.无需添加血清、feeder细胞、基质蛋白及小分子抑制剂，适合于促进KDR+CD73+细胞群体的产生和维持、扩增；3.本发明的培养基Ⅰ与培养基II以及培养基Ⅲ能够依次作用，最后获得的具有CD56+CD3-表达的NK细胞具有更强的细胞因子分泌能力和肿瘤杀伤能力。所述具有CD56+CD3-表达的NK细胞分泌的细胞因子包括高表达NKG2D受体。
当在培养基II(应用于步骤二)中使用时，所述培养基II包括细胞因子II；所述细胞因子II包含细胞因子组合C与细胞因子组合D。
细胞因子组合C的选择方式有SCF，TPO，FLT3L，IL3，IL6，SCF和TPO，SCF和FLT3L，SCF和IL3，SCF和IL6，TPO和FLT3L，TPO和IL3，TPO和IL6，FLT3L和IL3，FLT3L和IL6，SCF、TPO和FLT3L，SCF、TPO和IL3，SCF、TPO和IL6，SCF、FLT3L和IL3，SCF、FLT3L和IL6，SCF、IL3和IL6，TPO、FLT3L和IL3，TPO、FLT3L和IL6，TPO、FLT3L和IL6，TPO、IL3和IL6，FLT3L、IL3和IL6，SCF、TPO、FLT3L和IL3，SCF、TPO、FLT3L和IL6，SCF、TPO、IL3和IL6，SCF、FLT3L、IL3和IL6，TPO、FLT3L、IL3和IL6，或SCF、TPO、FLT3L、IL3和IL6。
细胞因子组合D的选择方式有IL7，IL15，IL12，IL18，IL21，IL7和IL15，IL7和IL12，IL7和IL18，IL7和IL21，IL15和IL12，IL15和IL18，IL15和IL21，IL12和IL18，IL12和IL21，IL18和IL21，IL7、IL15和IL12，IL7、IL15和IL18，IL7、IL15和IL21，IL7、IL12和IL18，IL7、IL12和IL21，IL7、IL18和IL21，IL15、IL12和IL18，IL15、IL12和IL21，IL15、IL18和IL21，IL12、IL18和IL21，IL7、IL15、IL12和IL18，IL7、IL15、IL12和IL21，IL7、IL15、IL18和IL21，IL7、IL12、IL18和IL21，IL15、IL12、IL18和IL21，或IL7、IL15、IL12、IL18和IL21。
细胞因子II中细胞因子组合C与细胞因子组合D之间的组合方式同前述细胞因子Ⅰ中细胞因子组合A与细胞因子组合B之间的组合方式。
当在培养基II中使用时，SCF、FLT3L或IL3的使用量均为1-200ng/ml，例如1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195和200ng/ml等，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。
当在培养基II中使用时，TPO的使用量为1-100ng/ml，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、……、98、99和100ng/ml等，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。本文中“……”仅是为了节省文本进行重复逻辑的内容省略，并不代表本部分参数示例的省略。
当在培养基II中使用时，IL6、IL7、IL15、IL12、IL18或IL21的使用量均为1-100ng/ml，例如1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和100ng/ml等，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。
当在培养基II中使用时，所述基础培养基II为AIM-V，X-Vivo-10，X-Vivo-15，Optimizer，PRIME-XV和KBM581中的一种或多种按照不同比例的混合。
在本发明中，培养基II具有1.促使具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞分化形成具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞；2.无需添加血清、feeder细胞、基质蛋白及小分子抑制剂，适合于促进CD34-CD45+细胞群体的产生和维持、扩增；3.本发明的培养基II与培养基Ⅰ以及培养基Ⅲ能够依次作用，最后获得的具有CD56+CD3-表达的NK细胞具有更强的细胞因子分泌能力和肿瘤杀伤能力。所述具有CD56+CD3-表达的NK细胞分泌的细胞因子包括高表达NKG2D受体。
当在培养基Ⅲ(应用于步骤三)中使用时，所述细胞因子Ⅲ的使用方式包括SCF，TPO，FLT3L，IL3，IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15，IL21中的一种或多种的组合。例如：方式一SCF，TPO，FLT3L，IL3，IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15或IL21。
方式二SCF，TPO，FLT3L，IL3，IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15或IL21中任意两种的组合，例如：SCF和TPO，FLT3L，IL3，IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15或IL21的组合；TPO和FLT3L，IL3，IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15或IL21的组合；FLT3L和IL3，IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15或IL21的组合；IL3和IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15或IL21的组合；IL6和IL7，IL11，IL12，IL18，IL15或IL21的组合；IL7和IL11，IL12，IL18，IL15或IL21的组合；IL11和IL12，IL18，IL15或IL21的组合；IL12和IL18，IL15或IL21的组合；IL18和IL15或IL21的组合；IL15和IL21的组合。
方式三：SCF，TPO，FLT3L，IL3，IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15或IL21中任意三种的组合，例如：SCF和TPO，与FLT3L，IL3，IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15或IL21的组合；SCF和FLT3L，与IL3，IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15或IL21的组合；SCF和IL3，与IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15或IL21的组合；SCF和IL6，与IL7，IL11，IL12，IL18，IL15或IL21的组合；SCF和IL7，与IL11，IL12，IL18，IL15或IL21的组合；SCF和IL11，与IL12，IL18，IL15或IL21的组合；SCF和IL12，与IL18，IL15或IL21的组合；SCF和IL18，与IL15或IL21的组合；SCF、IL15与IL21的组合；同理，TPO，FLT3L，IL3，IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15或IL21中任意三个进行自由组合，文本中为了简化表述不再一一列举。
方式四：SCF，TPO，FLT3L，IL3，IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15或IL21中任意四种的组合，本实施例中不再详细列举。
在培养基Ⅲ中应用时，SCF、FLT3L或IL3的用量范围1-200ng/ml。例如1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195和200ng/ml，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。在一些实施方案中，优选的是1-100ng/ml；进一步优选地是，20-50ng/ml。在另一些实施方案中，优选地是，100-200ng/ml；进一步优选地是，120-150ng/ml。
在培养基Ⅲ中应用时，TPO的使用量为1-100ng/ml。例如，0.1、0.6、1.0、1.3、1.6、2.0、2.3、2.6、3.0、3.3、3.6、4.0、4.3、4.6、5.0、5.3、5.6、6.0、6.3、6.6、……、99.0、99.3、99.6和100.0ng/ml等，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。包括但不限制于，在一些实施方案中，优选为5-9ng/ml。
在培养基Ⅲ中应用时，IL6、IL7、IL11、IL12、IL18、IL15或IL21的用量均为1-100ng/ml。例如1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和100ng/ml等，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围，例如10-50ng/ml，30-40ng/ml等。在一些实施方案中，优选地是20-60ng/ml。
在培养基Ⅲ中应用时，所述基础培养基Ⅲ包括AIM-V，X-Vivo-10，X-Vivo-15，Optimizer，PRIME-XV和KBM581中的一种或多种按照任意质量比例的混合。
在培养基Ⅲ中应用时，所述营养添加物为Human Serum Albumin，human ABserum，Human Platelet Lysate，Serum Replacement Xeno Free中的一种或几种不同比例的组合。例如：Human Serum Albumin，human AB serum，Human Platelet Lysate，SerumReplacement Xeno Free；Human Serum Albumin和human AB serum、Human Serum Albumin和Human Platelet Lysate或Human Serum Albumin和Serum Replacement Xeno Free；human AB serum和Human Platelet Lysate，human AB serum和Serum Replacement XenoFree，Human Platelet Lysate和Serum Replacement Xeno Free；Human Serum Albumin、human AB serum和Human Platelet Lysate，Human Serum Albumin、human AB serum和Serum Replacement Xeno Free，Human Serum Albumin、Human Platelet Lysate和SerumReplacement Xeno Free，human AB serum、Human Platelet Lysate和Serum ReplacementXeno Free，Human Serum Albumin、human AB serum、Human Platelet Lysate和SerumReplacement Xeno Free等。
所述培养基Ⅲ中营养添加物的含量0.5％-20％，例如0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10.0％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％和20％，以及上述百分含量中任意两个值为端点构成的含量范围，例如不限于1.5％-5.5％，6.0％-10.0％，4.5％-15.5％。
在本发明中，培养基Ⅲ具有1.促使具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞分化形成具有CD56+CD3-表达的NK细胞；2.无需添加血清、feeder细胞、基质蛋白及小分子抑制剂，适合于促进CD3-CD56+细胞群体的产生和维持、扩增，获得的NK细胞易于规模化扩增、工业化生产及临床应用；3.本发明的培养基Ⅲ与培养基Ⅰ以及培养基II能够依次作用，最后获得的具有CD56+CD3-表达的NK细胞具有更强的细胞因子分泌能力和肿瘤杀伤能力。所述具有CD56+CD3-表达的NK细胞分泌的细胞因子包括高表达NKG2D受体。
实施例
在下文中，将参照实施例进一步详细地描述本发明。然后，应当明白的是，这些实施例仅用于说明目的，而并不是解释为限制本发明的范围。
步骤一、人诱导多能干细胞分化为具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞
Stp1.1按照标准程序培养诱导多能干细胞(iPSC)，当细胞密度达到80-90％时，开始NK细胞分化。在进行NK细胞分化前，控制细胞密度，能够保证在分化过程中细胞的分化效率以及避免细胞的大量死亡。
Stp1.2在生物安全柜内吸弃6孔板中旧的培养基，每孔各加2ml已复温的DPBS洗一次，吸弃上清。向孔中按1ml/孔加入Accutase(细胞消化液)，放入二氧化碳培养箱中消化10分钟，将iPSC消化为单细胞悬液；轻轻拍打至80％-90％细胞脱落，在生物安全柜内用5ml移液管轻柔吹打30次，注意将移液器的吸力调至最小。将孔中液体全部转移至50ml离心管中，用40ml DMEM/F12重悬细胞，150g离心5分钟。
Stp1.3离心结束后，在生物安全柜内吸弃上清，用5ml DMEM/F12重悬细胞，取样进行细胞计数，单孔细胞数应为3.00×106-5.00×106cells(细胞)。
Stp1.4计数后的细胞，加入DMEM/F12补齐至20ml，150g离心5分钟。
Stp1.5用NK分化的培养基I重悬细胞沉淀。其中，NK分化的培养基I的成分为：基础培养基I+细胞因子I的组合。
Stp1.6将上述细胞和培养基的混合物加入第一培养体系中培养4-12天，每隔三天更换新鲜培液。
本实施例中，为了保证细胞的活性与分化效率，优选为：控制为在Day-1至Day4完成上述操作步骤一，并于Day4-16进行细胞培养。
步骤二中，所述具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞经内皮-血液转化，形成具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞
Stp2.1 KDR+CD73+内皮祖细胞的分化培养，同时确认KDR+CD73+内皮祖细胞最佳接种密度。
Stp2.2经第一培养体系获得具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞，于Day4更换为NK分化的培养基II继续培养12-24天，每隔三天更换新鲜培液。具体为所有具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞重悬于NK分化培养基II中，然后按照0.1-1x105/cm2接种于细胞工厂中继续培养12-24天，每隔三天更换新鲜培液。通过控制培养基的更换时间，保证在培养基II的培养体系下具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞具有足够的营养和合适的诱导条件，经由primitive EHT转化而获得CD34-CD45+NK祖细胞，并保证获得的CD34-CD45+NK祖细胞具有最佳的细胞状态，以进行后续的细胞分化。
Stp2.3对于stp21中获得的细胞群体，流式细胞术检测表面标志物CD34和CD45，确认形成了CD34－CD45+的NK祖细胞。
优选的是，步骤二控制在Day4至Day24完成如下操作步骤，以保证细胞的分化效率与活率在最佳。
步骤三、NK祖细胞分化为NK细胞
stp3.1在Day36天-Day40天中的任意一天将步骤二中获得的细胞，更换为NK分化的培养基Ⅲ继续培养。NK分化的培养基Ⅲ的成分为基础培养基Ⅲ+营养添加物Ⅲ+细胞因子Ⅲ的组合。
stp3.2将上述细胞和培养基的混合物在第三培养体系中继续培养12-20天，每隔三天更换新鲜培液。其中第三培养体系的培养容器为细胞工厂。进一步地，接种范围0.1-2x106/ml。
stp3.3收获stp3.2培养体系中的所有悬浮细胞，流式细胞术检测表面标志物CD3和CD56，确认形成了CD3-CD56+的NK细胞。
stp3.4收获stp3.2培养体系中的所有悬浮细胞，流式细胞术检测表面标志物NKG2D，确认所获得的NK细胞高表达NKG2D。
stp3.5收获stp3.2培养体系中的所有悬浮细胞，ELISA方法检测IFN-γ的分泌，确认所获得的NK细胞具有良好的细胞因子分泌能力。
stp3.6收获stp3.2培养体系中的所有悬浮细胞，进行体外杀伤能力验证，确认所获得的NK细胞具有良好的肿瘤细胞杀伤能力。
优选地是，步骤三控制在Day36至Day45完成，以保证最佳的细胞分化效果。
综上，本发明的关键创新点在于：本发明提供的分化培养体系基于生物反应器和细胞工厂，且无需添加血清、feeder细胞、基质蛋白及小分子抑制剂，适合于NK细胞的规模化扩增、工业化生产及临床应用。进一步的，本发明提供的方案所产生NK细胞高表达NKG2D受体，具有更强的细胞因子分泌能力和肿瘤杀伤能力。
实施例1培养基I的验证
控制其他参数不变，仅调整培养基I的成分，选择基础培养基AIM-V，调整细胞因子Ⅰ，如表1，流式检测结果见表2，检测图见图2。
其中，培养基II的成分AIM-V、SCF 30ng/ml、TPO 10ng/m、FLT3L 10ng/ml、IL1520ng/ml。
培养基Ⅲ的成分为PRIME-XV、SCF 10ng/ml，IL7 10ng/ml，Human Serum Albumin20％，human AB serum 15％。
表1培养基Ⅰ的验证
Figure BDA0003273501920000181
Figure BDA0003273501920000191
表2 D39流式结果
Figure BDA0003273501920000192
实施例2培养基II的验证
控制其他参数不变，仅调整培养基II的成分，选择基础培养基AIM-V，调整细胞因子II，如表3，流式检测结果见表4，检测图见图3。
培养基I的成分：AIM-V，VEGF 40ng/ml，bFGF 20ng/ml，SCF 50ng/ml，IL-3 10ng/ml。
培养基Ⅲ的成分为PRIME-XV、SCF 10ng/ml，IL7 10ng/ml，Human Serum Albumin20％，human AB serum 15％。
表3培养基II的验证
成分 SCF(ng/ml) FLT3L(ng/ml) IL12(ng/ml) IL18(ng/ml) IL21(ng/ml)
培液II-1 \ \ 10 50 15
培液II-2 20 25 \ \ \
培液II-3 0 25 10 50 15
培液II-4 20 25 0 50 15
培液II-5 20 200 10 50 15
培液II-6 1 35 25 1 200
培液II-7 20 25 10 50 15
培液II-8 30 45 35 45 55
表4培养基II的流式检测结果
Figure BDA0003273501920000193
Figure BDA0003273501920000201
实施例3培养基Ⅲ的验证
控制其他参数不变，仅调整培养基Ⅲ的成分，选择基础培养基AIM-V，调整细胞因子II，如表5，流式检测结果见表6，检测图见图4。
培养基I的成分：AIM-V，VEGF 40ng/ml，bFGF 20ng/ml，SCF 50ng/ml，IL-3 10ng/ml。
培养基II的成分：Optimizer，SCF 30ng/ml，FLT3L 30ng/ml，IL12 10ng/ml，IL1810ng/ml，IL21 10ng/ml。
表5培养基Ⅲ的验证
Figure BDA0003273501920000202
表6流式检测结果
Figure BDA0003273501920000203
实施例4杀伤检测
控制其他的条件参数不变，仅调整培养基I、培养基II和培养基Ⅲ的组分，流式检测NKG2D受体。
验证培养基成分如下：
对照组1：
培养基I：PRIME-XV、SCF 20ng/ml；
培养基II：X-Vivo-10、IL15 20ng/ml、IL12 20ng/ml；
培养基Ⅲ：X-Vivo-10、TPO 5ng/ml、IL21 20ng/ml、human AB serum 5％(质量百分比)。
对照组2：
培养基I：AIM-V、VEGF 20ng/ml，Activin-A 10ng/ml；
培养基II：X-Vivo-10、SCF 20ng/ml、FLT3L 20ng/ml；
培养基Ⅲ：X-Vivo-10、TPO 5ng/ml、IL21 20ng/ml、human AB serum 5％(质量百分比)。
对照组3：
培养基I：AIM-V、VEGF 20ng/ml、bFGF 5ng/ml、SCF 5ng/ml、IL-3 2ng/ml。
培养基II：Optimizer、SCF 20ng/ml、IL7 20ng/ml。
培养基Ⅲ：X-Vivo-10、TPO 5ng/ml、IL21 20ng/ml。
本发明的第一种组合：
培养基I：AIM-V、VEGF 20ng/ml、bFGF 5ng/ml、SCF 5ng/ml、IL-3 2ng/ml。
培养基II：X-Vivo-10、IL15 20ng/ml、IL12 20ng/ml、SCF 20ng/ml、FLT3L 20ng/ml。
培养基Ⅲ：X-Vivo-10、TPO 5ng/ml、IL21 20ng/ml、human AB serum 5％(质量百分比)。
本发明的第二种组合：
培养基I：AIM-V、VEGF 25ng/ml、bFGF 15ng/ml、SCF 15ng/ml、IL-3 2ng/ml。
培养基II：X-Vivo-10、IL12 20ng/ml、SCF 20ng/ml、FLT3L 20ng/ml。
培养基Ⅲ：X-Vivo-10、TPO 5ng/ml、IL21 20ng/ml、human AB serum 5％(质量百分比)。
本发明的第三种组合：
培养基I：Activin-A、VEGF 25ng/ml、bFGF 15ng/ml、SCF 25ng/ml、IL-3 8ng/ml。
培养基II：Optimizer，IL3 30ng/ml，IL6 20ng/ml，IL7 15ng/ml，IL15 10ng/ml。
培养基Ⅲ：X-Vivo-10、SCF 30ng/ml、TPO 9ng/ml、FLT3L 30ng/ml、SerumReplacement Xeno Free 5％(质量百分比)。
通过上述方法制备6个样品，同时检测NK细胞的NKG2D表达，见表7与图5。
表7 NKG2D表达结果
CD56+ NKG2D+
对照组1 96.01％ 63.46％
对照组2 97.48％ 50.08％
对照组3 98.26％ 58.41％
第一种组合 99.57％ 83.56％
第二种组合 100％ 95.79％
第三种组合 100％ 99.44％
杀伤检测-流式法，基本操作步骤：
一、准备：
1.培养基准备：
标记所需培养基：RPMI1640+1％FBS
共孵育所需培养基：RPMI1640+10％FBS
2. 2mM CFSE标记液配制：
在避光条件下，向10mg的CFSE粉末中加入9mL DMSO溶液，充分混匀，配制成2mMCFSE标记液母液，分装，避光存储于-20℃冰箱中。
打开流式细胞仪，备用。
二：靶细胞悬液配制
取1M靶细胞(K562细胞系)，300g，5min离心，去上清；用含1％FBS的1640培养基重悬，得到1M/mL的细胞悬液。用2mM CFSE溶液标记上述靶细胞悬液，使得标记物溶液的终浓度为2uM，37℃孵育20min。用9mL含10％FBS的1640培养基终止标记，混匀，37℃孵育5min后，300g，5min离心，去上清，10％FBS的1640培养基重悬得到1M/mL的细胞悬液(若靶细胞含GFP，则省去此步)。
使用10％FBS的1640培养基将靶细胞密度调整至合适密度，达到每100ul培养基含实验所需每孔细胞数量。
三、效应细胞悬液配制
收集效应细胞(分化获得的iPSC-NK)，400g，5min离心，去上清，使用10％FBS的1640培养基重悬并计数，调整细胞密度，达到每100ul体积含实验所需每孔细胞数量。
四、加板
1.将密度调整后的效应细胞按每孔100ul加至96孔圆底板，每个样品种6孔，其中三孔与靶细胞共孵育，另外三孔作为只含效应细胞的对照孔，对照孔需用10％FBS的1640培养基补至总体积为200ul。
2.将靶细胞按每孔100ul加至需要共孵育的孔，另外单独设置6孔为对照，各加100ul 10％FBS的1640培养基补至总体积为200ul。
五、孵育
将96孔板封上封口膜，120g，2min离心，除去封口膜，放置细胞培养箱，培养4h。
六、检测
1.取出96孔板，每孔混匀转移至对应EP管。
2.除其中3个靶细胞的对照孔，其余每个样品均加入终浓度为5nM的SYTOX染色液，混匀，4℃避光孵育15min，上机检测，见图5，对靶细胞的杀伤百分率：32.41％、59.06％、62.48％、70.74％、82.64％与91.81％，见图6。
实施例5 ELISA检测IFN-γ
试剂盒：ELISA MAX Deluxe Set Human IFN-γ
一、试剂准备：
Wash Buffer：PBS+0.05％Tween-20
表8相关试剂稀释比列
Materials Dilute with
2.4mL of Coating Buffer A(5X) 9.6mL of Deionized Water
60L of Capture Antibody(200X) 12mL of 1X Coating Buffer A
12mL of Assay Diluent A(5X) 48mL of PBS
60L of Detection Antibody(200X) 12mL of 1X Assay Diluent A
12L of Avidin-HRP(1,000X) 12mL of 1X Assay Diluent A
二、基本步骤：
使用1X Capture Antibody包被实验板，每孔加100uL，4℃过夜放置16-18h。
实验前，取出所有试剂平衡至室温。
实验板包被完成后，350uL Wash Buffer洗板4次(每次洗板后都尽可能甩干残余液体)。
每孔加入200uL 1X Assay Diluent A，在摇床上室温孵育1h。
孵育完成后，相同方式洗板4次。
根据实验设计，每孔相应地加入100uL标准品和样品(iPSC-NK在无血清培养基中培养24小时的上清液)，在摇床上孵育2h。
孵育完成后，相同方式洗板4次。
每孔加入100uL diluted Detection Antibody solution，在摇床上孵育1h。
孵育完成后，相同方式洗板4次。
每孔加入100uL diluted Avidin-HRP solution，在摇床上孵育30min。
孵育完成后，相同方式洗板5次。
每孔加入100uL现配的mixed TMB Substrate Solution，避光孵育20min。
每孔加入100uL终止液。
15min以内上机，在OD值为450nm波长下读数。
结果见表9：
表9杀伤力验证结果
Figure BDA0003273501920000241

Claims (11)

1.一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，其特征在于，包含如下步骤：
步骤一：采用人诱导多能干细胞分化形成具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞；
步骤二：所述具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞经内皮-血液转化，形成具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞；
步骤三：所述具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞进一步分化为具有CD56+CD3-表达的NK细胞。
2.根据权利要求1所述的一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述步骤一中分化所依赖的培养体系为在生物反应器或细胞工厂中接种人诱导多能干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述步骤一分化依赖于培养基Ⅰ，所述培养基Ⅰ成份含有细胞因子I；所述细胞因子Ⅰ包括细胞因子组合A与细胞因子组合B；
所述细胞因子组合A为VEGF，bFGF，Activin-A中的至少两种的组合；
所述细胞因子组合B为BMP-4，SCF，IL-3，IL-6，TPO，FLT3L中的至少一种或多种的组合；
所述培养基中各细胞因子Ⅰ的用量VEGF 1-100ng/ml，bFGF 0.25-50ng/ml，Activin-A0.1-20ng/ml，BMP-4 0.3-60ng/ml，SCF 1-200ng/ml，IL-3 0.1-20ng/ml，IL-6 0.1-20ng/ml，TPO 0.1-100ng/ml,FLT3L 0.1-30ng/ml。
4.根据权利要求1或2所述的一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述培养基Ⅰ还含有基础培养基I；所述基础培养基Ⅰ为AIM-V，X-Vivo-10，X-Vivo-15，Optimizer，PRIME-XV，KBM581中的一种或多种按照任意比例的混合。
5.根据权利要求1所述的一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述步骤二中分化所依赖的培养体系为在生物反应器或细胞工厂中接种具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞。
6.根据权利要求1或5所述的一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述步骤二分化依赖于培养基Ⅱ；所述培养基Ⅱ包括细胞因子Ⅱ；所述细胞因子Ⅱ包含细胞因子组合C与细胞因子组合D；
所述细胞因子组合C包含SCF、TPO、FLT3L、IL3或IL6中的一种或多种的组合；
所述细胞因子组合D包含IL7、IL15、IL12、IL18、IL21中的一种或多种的组合；
各细胞因子Ⅱ的用量为SCF 1-200ng/ml，TPO 1-100ng/ml，FLT3L 1-200ng/ml，IL3 1-200ng/ml，IL6 1-100ng/ml，IL7 1-100ng/ml，IL15 1-100ng/ml，IL12 1-100ng/ml，IL181-100ng/ml，IL21 1-100ng/ml。
7.根据权利要求1或5所述的一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述培养基Ⅱ还包括基础培养基Ⅱ；所述基础培养基Ⅱ为AIM-V，X-Vivo-10，X-Vivo-15，Optimizer，PRIME-XV和KBM581中的一种或多种按照不同比例的混合。
8.根据权利要求1所述的一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述步骤三分化所依赖的培养体系为细胞工厂或生物反应器中接种具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞。
9.根据权利要求1或8所述的一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述步骤三中的分化培养依赖培养基Ⅲ实现；所述培养基Ⅲ的成份包括细胞因子Ⅲ；
所述细胞因子Ⅲ包括SCF，TPO，FLT3L，IL3，IL6，IL7，IL11，IL12，IL18，IL15，IL21中的一种或多种的组合；
所述培养基Ⅲ中的细胞因子Ⅲ的用量SCF 1-200ng/ml，TPO 1-100ng/ml，FLT3L 1-200ng/ml，IL3 1-200ng/ml，IL6 1-100ng/ml，IL7 1-100ng/ml，IL11 1-100ng/ml，IL12 1-100ng/ml，IL18 1-100ng/ml，IL15 1-100ng/ml，IL21 1-100ng/ml。
10.根据权利要求1或8所述的一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述培养基Ⅲ的成份还包括基础培养基Ⅲ；所述基础培养基Ⅲ包括AIM-V，X-Vivo-10，X-Vivo-15，Optimizer，PRIME-XV和KBM581中的一种或多种按照任意质量比例的混合。
11.根据权利要求1或8所述的一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述培养基Ⅲ的成份还包括营养添加物；所述营养添加物为Human SerumAlbumin，human AB serum，Human Platelet Lysate，Serum Replacement Xeno Free中的一种或几种不同比例的组合。
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