CN101633690B

CN101633690B - 一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101633690B
Application number: CN200810116974A
Authority: CN
Inventors: 邢新会; 赵洪新; 马堃; 卢元; 张翀; 王立言; 杨程; 来奇恒
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University; Wuxi Research Institute of Applied Technologies of Tsinghua University
Priority date: 2008-07-22
Filing date: 2008-07-22
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2028-07-22
Also published as: CN101633690A

Abstract

本发明公开了一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的产氢相关蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与产氢相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明还通过灭活产气肠杆菌中的所述蛋白的编码基因，得到了一株工程菌，具有生长速度快、环境适应性强的优点，并且葡萄糖利用能力大幅提高，产氢能力大大加强，可应用于生物制氢，具有巨大的指导意义。

Description

一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

十八世纪世界工业革命以来建立的化石能源体系如今正面临着两大挑战：1)化石能源储量日益减小，面临着枯竭的危险；2)化石燃料的燃烧产生了大量污染物质，特别是CO₂等温室气体的排放引起的温室效应，给人类赖以生存的环境带来巨大的威胁。因此，开发可持续发展的可再生清洁能源，逐步替代化石能源是关系国家能源安全、环境安全及社会稳定和平发展的重要战略课题。

氢能作为极具潜力的未来替代清洁能源之一，是高效的能源载体，具有能量密度高、清洁、可再生、燃烧产物为水和无污染等特点，是十分理想的可再生能源。目前，氢气主要来自化石燃料的重整转化(占氢气来源的96％)和电解水制氢(占4％)，未能摆脱对原有的化石能源的依赖。因此，如何利用可再生资源持续地获取氢气受到人们的广泛的关注。生物制氢是解决这一问题的重要途径之一。生物制氢具有常温常压反应、条件温和、对环境友好、可利用废弃生物物质为底物等优点，可以和环境污染治理、减少污染排放相联系，是十分理想的制氢方法。

现代生物制氢的研究始于20世纪70年代的能源危机，90年代以来，随着人们对温室效应的进一步认识，生物制氢作为可持续发展的制氢方法更加引起了人们的广泛重视。生物制氢技术包括光驱动过程和厌氧发酵两种路线。前者利用光合细菌或藻类直接将太阳能转化为氢气，是一个非常理想的过程，但是由于光利用效率很低，光反应器设计困难等因素，近期内很难推向应用。后者采用的是产氢菌厌氧发酵，它的优点是产氢速度快、反应器设计简单、且能够和废弃生物的利用相结合，相对于前者更容易在近期内实现工业应用。

发酵法制氢始于六十年代中期，九十年代受到重视，但进展并不大。九十年代末到本世纪初，人们意识到发酵制氢更容易在近期内实现产业化，大大增加了暗发酵制氢方面的科研投入，产生了一批有关培养工艺的基础性研究结果。近年来与废弃生物质处理相结合的制氢过程的研究大为增加，其中一些达到了中试水平，但主要集中在反应器类型设计、工艺研究上，且混合培养产氢效率低于纯培养，总的转化率都不高，这也正是发酵制氢的瓶颈所在。解决发酵制氢瓶颈的关键，是实现技术突破，提高氢气得率。研究表明，仅从工艺的角度，无法从根本上突破产氢效率低的问题，必须注重高效产氢菌种的研究与开发。

多年以来，暗发酵制氢中应用的产氢菌种主要包括肠杆菌属(Enterobacter)、梭菌属(Clostridium)、埃希氏菌属(Escherichia)和芽孢杆菌属(Bacillus)，其中尤以肠杆菌属和梭菌属的相关研究最多。梭菌属产氢率最高可达到2.36mol/mol葡萄糖，产气肠杆菌属产氢率最高可达3mol/mol葡萄糖(即6mol/mol蔗糖)[Kumar，N.and Das，D.Bioprocess Engineering 23，205-208(2000)]，[Kumar，N.and Das，D.ProcessBiochemistry 35，589-593(2000)]。以梭菌(Clostridium sp)为代表的专性厌氧菌发酵产氢的机理为：葡萄糖酵解后生成丙酮酸，在形成醋酸过程中，一部分电子通过铁氧还蛋白在氢酶作用下形成氢气。1摩尔的葡萄糖可形成4摩尔氢气和2分子醋酸。因此，专性厌氧菌发酵产氢的同时，必然伴随醋酸等有机酸的形成。兼性厌氧产氢菌E.aerogenes通过糖解途径和三羧酸循环(TCA)途径产生NADH和ATP，氢酶通过NADH将质子转换为氢气，产氢理论转换率为1摩尔葡萄糖形成12mol氢气，远远大于专性厌氧菌的氢得率。因此，E.aerogenes是开发高效发酵制氢工艺的重要菌种。

随着生物技术的飞速发展，单纯的菌种筛选和培养工艺的优化已不能满足提高产氢效率的需求。发酵制氢的研究需要进入细胞内部，通过对氢酶及其代谢网络的改造来强化产氢过程。目前在基因库上已经可以获得超过100种的氢酶基因序列[PauletteM.Vignais，Bernard Billoud，Jacques Meyer.FEMS Microbiology Reviews 25，455-501(2001)]，但仍有大量已知产氢菌株的氢酶基因尚未被克隆，寻找更多的氢酶基因是生物制氢研究的重要方向[Kalia，V.C.，Lal，S.，Ghai，R.，Mandal，M.andChauhan，A.Trends in Biotechnology 21，152-156(2003)]。不同的氢酶具有不同的功能，和其它酶系相比，人们对氢酶的认识还十分有限。

目前，研究的比较清楚的是大肠杆菌的氢酶I、II、III和IV的基因，它们都属于Ni-Fe氢酶，其中氢酶III和IV和产氢有关[Andrews，S.C.，Berks，B.C.，Mcclay，J.，Ambler，A.，Quail，M.A.，Golby，P.and Guest，J.R.Microbiology 143，3633-3647(1997)]，而I、II和吸氢过程相关。梭菌属的氢酶都属于铁氢酶，三梭菌的铁氢酶已有测序结果，但是关于其附属基因、调控机制还不清楚。已经克隆到梭菌的铁氢酶基因，并在光合细菌内获得了异源表达，强化了光合菌的产氢过程。梭菌的铁氢酶基因在大肠杆菌中的表达却没有成功，可能是由于梭菌和大肠杆菌对于铁氢酶表达的附属基因***不相同造成的[Yasuo Asada，Yoji Koike，Jorg Schnackenberg，MasatoMiyake，Ieaki Uemura，Jun Miyake.Biochimica et Biophysica Acta 1490，269-278(2000)]。最近，Mishra J.等通过铁氢酶保守序列设计的方法从E.cloacae IIT-BT08中克隆出450bp左右的铁氢酶，并在不产氢的大肠杆菌中异源表达，验证了其功能，结果显示这个氢酶位于细胞质内[Mishra，J.，Kumar，N.，Ghosh，A.K.and Das，D.International Journal of Hydrogen Energy 27，1475-1479(2002)]，[Mishra，J.，Khurana，S.，Kumar，N.，Ghosh，A.K.and Das，D.Biochemical and BiophysicalResearch Communications 324，679-685(2004)]。产气肠杆菌E.aerogenes的前期研究表明，在其细胞膜上，氢酶与细胞内产生的NADH作用生成氢气[Nakashimada，Y.，Rachman，M.A.，Kakizono，T.and Nishio，N.International Journal of HydrogenEnergy 27，1399-1405(2002)]。因此研究该菌属的氢酶特性、基因及其功能解析，对于实现提高产气肠杆菌产氢得率的技术突破具有重要意义。

NADH脱氢酶又称NADH-泛醌氧化还原酶，是细胞呼吸电子传递链中的一个重要的蛋白复合物，催化NADH的两个电子转移给泛醌(辅酶Q)。进化分析表明其与DNAH(尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸)相关的氢酶是同一起源进化而来，因此，研究其功能对理解产气肠杆菌的产氢过程，具有重要意义。

NADH脱氢酶分为三种：参与质子转运的I型NADH脱氢酶(NDH-1)、无能量耦合位点的II型NADH脱氢酶(NDH-2)和钠离子转运型NADH-泛醌氧化还原酶[NantapongN，Otofuji A，Migita CT，et al.Electron transfer ability from NADH tomenaquinone and from NADPH to oxygen of type IINADH dehydrogenase ofCorynebacterium glutamicum[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2005，69(1)：149-159.]。细菌的NDH-1与真核生物线粒体中的复合物I同源，由13-14个不同亚基构成，含FMN和若干铁-硫簇作为辅基。该酶能够把质子从细胞质泵到周质空间中。而NDH-2是一个单亚基的酶，它含有核黄素但是不含铁-硫簇[Yagi T，Seo B.B，Di Bernardo S，et al.NADH dehydrogenases：from basic science tobiomedicine[J].J.Bioenerg.Biomembr.，2005，33：233-242.]。细菌的呼吸链中含有NDH-1和/或NDH-2。E.coli含有NDH-1和NDH-2[Matsushita，K，Ohnishi，T，andKaback，R.NADH-ubiquinone oxidoreductase of the Escherichia coli aerobicrespiratory chain[J].Biochemistry，1987，26：7732-7737.]，分别由nuo和ndh基因编码，但Paracoccus denitrificans只有NDH-1，而Bacillus subtilis只有NDH-2[Bergsma J，Strijker R，Alkema J Y，et al.NADH dehydrogenase and NADHoxidation in membrane vesicle from Bacillus subtilis[J].Eur.J.Biochem.，1981，120：599-606.]。

在E.coli中，NDH-1由13个亚基组成，分别称为NuoA至NuoN，此外还含有一个FMN和9个铁-硫(Fe/S)簇作为辅基。Flemming等人对细菌NDH-1模型进行了归纳，从***发生学的角度揭示了NDH-1模型从3个用于电子传递和质子转移的主要模型发展而来，它们分别构成了NDH-1模型的NADH脱氢酶模块、氢酶模块和转运体模块[Flemming D，Stolpe S，Schneider D，Hellwig P，Friedrich T，et al.A possiblerole for iron-sulfur cluster N2 in proton translocation by the NADH：ubiquinoneoxidoreductase(complex I)[J].J Mol Microbiol Biotechnol.2005，10：208-222.]。NADH脱氢酶模块表征了电子的入口，它由亚基NuoE、NuoF和NuoG组成，并包含NADH结合位点、FMN、双核Fe/S簇N1a和N1b以及四核Fe/S簇N3、N4、N5和N7。由于还原反应提供的自由能不足以驱动质子转移，NADH脱氢酶模块很可能包含电子转移而不耦合质子转运过程。两性分子的氢酶模块包括了亲水性亚基NuoB、NuoC、NuoD和NuoI以及疏水性亚基NuoH和NuoL，并含有Fe/S簇N2、N6a和N6b。该模块包含了一个能量耦合位点，其中亚基NuoB、NuoD、NuoH和NuoL被认为参与到泛醌的结合过程中。剩余的疏水性亚基NuoA、NuoJ、NuoK、NuoM和NuoN被称为所谓的转运体模块，它包含氢离子和其它阳离子的反向转运体亚基的同源物，目前该模块没有发现辅基。底物通过反向转运体构象变化被跨膜输送，因此转运体模块很可能以构象变化驱动的质子泵形式成为NDH-1的另一个能量耦合位点。

产气肠杆菌是兼性厌氧菌，生长速度快，在厌氧条件下可以产生氢气，且具有利用底物范围广，生长适应性强等优点，是具有优良工业性状的菌株。已有许多关于产气肠杆菌产氢的报道，但多是在工艺及培养方面[E.Palazzi，B.Fabiano，P.Perego.Bioprocess Eng.22：205-213(2000).]，有关产氢相关的基因还没有任何报道。研究表明，产气肠杆菌具有和大肠杆菌相似的利用甲酸产氢的能力[Tatsuo，K.，Shigeharu，T.Mar Biotechnol.7：112-118(2005).]，而且其具有吸氢过程，即有吸氢酶的存在[Y.L Ren.，X.H.Xing.，C.Zhang.，and Z.X.Gou.Biotechnol Lett.27(14)：1029-1033(2005).]。

发明内容

本发明的目的是提供一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的产氢相关蛋白，名称为NuoB，来源于产气肠杆菌E.aerogenesIAM1183，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与产氢相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述产氢相关蛋白(NuoB)的编码基因(nuob)也属于本发明的保护范围。

所述蛋白的编码基因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明还保护一株产氢工程菌，是灭活E.aerogenes IAM1183中所述基因(nuob)得到的。

所述灭活是通过同源重组实现的。

所述同源重组具体可将DNA片段P导入所述E.aerogenes IAM1183实现；

所述DNA片段P自上游至下游依次为同源臂T₁、DNA片段M、同源臂T₂；所述同源臂T₁和同源臂T₂能与所述基因发生同源重组，灭活所述基因；所述DNA片段M为抗生素抗性片段。

所述基因是由序列表中序列2所示的核苷酸序列组成的DNA片段；所述同源臂T₁是由序列表中序列4所示的核苷酸序列组成的DNA片段；所述同源臂T₂是由序列表中序列5所示的核苷酸序列组成的DNA片段；所述DNA片段M为四环素抗性片段；所述DNA片段P的核苷酸序列优选序列表中的序列3。

本发明还保护DNA片段P，自上游至下游依次为同源臂T₁、DNA片段M、同源臂T₂；所述同源臂T₁和同源臂T₂能与E.aerogenes IAM1183的所述基因发生同源重组，灭活所述基因；所述DNA片段P的核苷酸序列优选序列表中的序列3。

含有所述DNA片段P的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

使用DNA片段P构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它启动子结合使用；此外，使用本发明的DNA片段P构建表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因菌株进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可在菌株中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因等。

所述工程菌可应用于生物制氢中。

本发明通过分子生物学手段从产气肠杆菌中获得了新的产氢相关蛋白及其编码基因，并通过灭活基因获得了一株工程菌。本发明得到的工程菌的葡萄糖利用能力大幅提高，产氢能力大大加强，可应用于生物制氢，具有巨大的指导意义。

本发明获得的工程菌具有以下优点：

1)出发菌株E.aerogenes IAM1183是兼性厌氧菌，在好氧、厌氧条件下均能快速生长，对环境适应性强；利用其进行生物制氢具有利用底物范围广、利用底物能力强和产氢较高的优点，是具有潜在应用于工业化生物制氢的优良菌株。

2)本发明获得的工程菌，除了具有原始菌1)的优点外，还具有底物利用能力更强，产氢能力进一步提高的特点。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

图1为E.aerogenes IAM1183-B的抗性筛选图

图2为E.aerogenes IAM1183-B的PCR鉴定

图3为E.aerogenes IAM1183-B的生长曲线OD₆₀₀

图4为发酵罐培养E.aerogenes IAM1183-B的产氢(H₂)情况

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用到的引物如下：

nuoB-fw：ATGGATTATACGCTCACCCGCATAG；

nuoB-rv：TTAAATCTCGTCCGGTGTCCGCA。

nuoB-tet-fw：

ATGGATTATACGCTCACCCGCATAGATCCTAACGGTGAGATTTGGTGACTGCGCTCCTC；

nuoB-tet-rv：

TTAAATCTCGTCCGGTGTCCGCAGATTGGTCACTGCAATGTGTTGTTGCTCAGGTCGCA；

以下实施例中所涉及的培养基配方及用途如下：

(1)LB培养基(L^-1)：蛋白胨10g、酵母浸粉5g、NaCl 10g、琼脂粉15g(固体培养基时添加)；用于菌种短期保藏和活化培养。

(2)葡萄糖培养基(L^-1)：葡萄糖15g、蛋白胨5g、K₂HPO₄·3H₂O 14g、KH₂PO₄ 6g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O 0.2g；用于发酵制氢。

实施例1、nuob基因的克隆

对NCBI中的肠杆菌NADH脱氢酶基因序列进行序列分析，设计一对引物nuoB-fw和nuoB-rv，以产气肠杆菌(E.aerogenes IAM1183)(购自日本东京大学应用微生物研究所(IAM)菌种库)的DNA为模板进行PCR。

结果表明，得到了分子量为675bp的条带。将该PCR产物4℃保存，送上海Invitrogen Corporation测序，测序结果表明，扩增到的核苷酸序列见序列表的序列2，编码氨基酸序列是序列表的序列1的蛋白质。将序列1所示蛋白命名为NuoB，将序列2所示核苷酸命名为nuob。

经过网上比对分析，nuob与Klebsiella pneumoniae subsp的NADH dehydrogenasesubunit B具有最高同源性，同源性达89％，因此确定其为NADH脱氢酶的亚基B。

实施例2、产气肠杆菌E.aerogenes IAM1183-B突变体的获得

通过序列分析，设计一对引物nuoB-tet-fw和nuoB-tet-rv，引物中的带划线的序列为产气肠杆菌(E.aerogenes IAM1183)ΔnuoB的同源臂。

通过电转化的方式将pYM-red质粒(于梅，周建光，陈伟，李山虎，黄翠芬，一种可转移的重组工程***pYM-Red的建立.生物化学与生物物理进展.2005，32(4).)电击到产气肠杆菌(E.aerogenes IAM1183)中，进行氯霉素(24mg/mL)抗性筛选，从阳性菌株中提取pYM-red质粒进行鉴定，获得了含有pYM-red重组质粒的产气肠杆菌(E.aerogenes IAM1183)。

以pACYC184质粒(南京圣比澳生物科技有限公司，70905-3)(Chang，A.C.，andS.N.Cohen.1978.Construction and characterization of amplifiable multicopyDNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid.J.Bacteriol.134：1141-1156.)DNA为模板，用引物nuoB-tet-fw、nuoB-tet-rv进行PCR扩增，获得了含有四环素标记的线性DNA(序列表的序列3)，将该线性DNA作为打靶载体。通过电转化的方式，将打靶载体导入含有pYM-red重组质粒的产气肠杆菌(E.aerogenes IAM1183)。将转化后的菌涂布于含有四环素(4ug/ml)的单抗LB平板上，30℃培养培养1天；然后将长出的菌转接入含有四环素(4ug/ml)和氯霉素(24ug/ml)的双抗LB平板上，30℃培养培养1天。单抗和双抗筛选的结果见图1，图1中左图为单抗筛选的图，右图为双抗筛选的图。

随机挑取几个在双抗培养基上生长的克隆，提取基因组DNA，通过PCR的方法鉴定打靶载体是否与染色体上的目标位点发生了同源重组，PCR反应所用的一对引物为nuoB-fw、nuoB-rv。

结果见图2。图2中，1：E.aerogenes IAM1183的扩增产物；2：DNA 2000bp Marker；3：阳性克隆的扩增产物。由图可见，E.aerogenes IAM1183的扩增产物为675bp：阳性克隆的扩增产物为1913bp，与预期的结果一致。结果表明，获得的阳性克隆中，打靶载体与染色体上的目标位点发生了同源重组，获得了发生了同源重组的突变型菌株，将其命名为E.aerogenes IAM1183-B。

实施例3、E.aerogenes IAM1183-B工程菌生长和产氢情况

在70mL血清瓶中，加入20mL葡萄糖培养基，将活化后的工程菌E.aerogenesIAM1183-nuoB进行摇瓶培养；同时将活化后的野生菌E.aerogenes IAM1183进行同样条件的摇瓶培养，作为对照。具体操作步骤如下：

(1)种子培养：采用15ml离心管，加入5ml LB培养基，从固体平板接种，培养温度37℃，空气浴摇床转速170rpm，过夜培养。

(2)厌氧摇瓶培养：采用70ml血清瓶厌氧培养瓶，葡萄糖培养基装液量20ml(预先用氮气置换培养瓶顶部及培养基中的空气)；种子菌的接种量2.5％(v/v)，培养温度37℃，空气浴摇床转速170rpm。培养24小时。

试验设三次重复，所有结果均为三次重复的平均值，用平均值±标准差表示。

利用分光光度计(UV-1206，SHIMADZU公司(日本))测定菌体的生长情况。工程菌E.aerogenes IAM1183-ΔnuoB和野生菌的OD₆₀₀的变化见图3。

产气肠杆菌具有两条产氢途径，甲酸途径和NADH途径(Tanisho，S.，N.Kamiya，and N.Wakao.1989.Hydrogen evolution of Enterobacter aerogenes depending onculture pH：mechanism of hydrogen evolution from NADH by means ofmembrane-bound hydrogenase.Biochim Biophys Acta 9731：1-6.；Tatsuo，K.，andT.Shigeharu.2005.Effects of Formate on Fermentative Hydrogen Production byEnterobacter aerogenes.Mar Biotechnol.7：112-118.)。对氢气来源分析，可以测定突变株的哪条途径得到加强。工程菌E.aerogenes IAM1183-ΔnuoB和野生菌摇瓶批式培养的产氢得率比较见表2。通过已知的两条产氢途径的氢气得率发生了一定的变化，工程菌甲酸途径的氢气得率高于野生菌，而通过NADH途径产生的氢气与野生菌相等。说明工程菌的甲酸途径得到有效加强，对提供发酵底物的设计提供了参考。

表2摇瓶批式培养的产氢得率

实施例4、E.aerogenes IAM1183-ΔnuoB工程菌的代谢流分析

为确定nuob基因灭活对菌株带来的变化，分别检测野生菌和工程菌细胞内各代谢通量的分布，具体步骤如下：

(1)种子培养：采用15ml离心管(装有5ml LB培养基)，从固体平板接种菌，温度37℃，空气浴摇床转速170rpm，过夜培养。

(2)厌氧摇瓶培养：采用70ml血清瓶厌氧培养瓶(装有20ml葡萄糖培养基)，预先用氮气置换培养瓶顶部及培养基中的空气；种子菌的接种量2.5％(v/v)，温度37℃、空气浴摇床转速170rpm，培养16小时。

(3)16h后对代谢产物进行检测。将发酵物离心取上清后，过滤。利用高压液相色谱测定代谢物的产量和组成。高压液相气谱为(HPLC-10A，SHIMADZU公司(日本)。试验设三次重复，所有结果均为三次重复的平均值，用平均值±标准差表示。结果如表3所示。

表3工程菌与原始菌的代谢流比较分析(n＝3)

工程菌的代谢发生了显著的变化，产物除了乳酸以外的浓度都高于野生菌。结果表明，nuob基因灭活对代谢的影响较大，显著提高了菌的底物的利用率和产氢量。

实施例5、发酵罐培养E.aerogenes IAM1183-B工程菌

使用血清瓶进行发酵时，工程菌的应用性状优于原始菌，为进一步测试工程菌的应用价值，采用发酵罐培养工程菌。同时将野生菌进行同样条件的发酵培养，作为对照。

1)制备种子液

将活化好的E.aerogenes IAM1183-ΔnuoB菌种，接种到50mL三角瓶(盛有30mL的LB培养基)中，过夜培养，作为种子液。

2)发酵

用氮气置换发酵罐内气体30min以保证初始厌氧条件。采用5L发酵罐(装有3L葡萄糖培养基)，接种60mL步骤1)制备的种子液。密闭培养，培养温度为37℃，搅拌速率为200rpm。用倒置于10mM NaOH溶液(用于吸收CO₂)的量筒收集产生的气体，测量气体的体积。发酵过程中，检测菌体的生长情况。

结果如图4所示，与血清瓶培养相似。工程菌的生长比野生菌滞后，但菌浓度高于野生菌。而氢气的总生成量是原始菌的2倍。

所以无论代谢分析与生长特性均与血清瓶实验相似。以上小瓶发酵和发酵罐发酵数据分析，可以看出，工程菌株E.aerogenes IAM1183-B的发酵制取氢气的生物性状远远好野生菌，是极具潜力制氢菌种。

序列表

<110>清华大学

<120>一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用

<130>CGGNARY81497

<160>5

<210>1

<211>224

<212>PRT

<213>产气肠杆菌(E.aerogenes)

<400>1

Met Asp Tyr Thr Leu Thr Arg Ile Asp Pro Asn Gly Glu Asn Asp Arg

1 5 10 15

His Pro Leu Gln Lys Gln Glu Ile Val Thr Asp Pro Leu Glu Gln Glu

20 25 30

Val Asn Lys Ser Val Tyr Met Gly Lys Leu Glu His Ala Leu His Asp

35 40 45

Met Val Asn Trp Gly Arg Lys Asn Ser Ile Trp Pro Cys Asn Phe Gly

50 55 60

Leu Ser Cys Cys Tyr Ala Glu Met Val Thr Ser Phe Thr Ala Val His

65 70 75 80

Asp Val Ala Arg Phe Gly Ala Glu Val Leu Arg Ala Ser Pro Arg Gln

85 90 95

Ala Asp Leu Met Val Val Ala Gly Thr Cys Phe Thr Lys Met Ala Pro

100 105 110

Val Ile Gln Arg Leu Tyr Asp Gln Met Leu Glu Pro Lys Trp Val Ile

115 120 125

Ser Met Gly Ala Cys Ala Asn Ser Gly Gly Met Tyr Asp Ile Tyr Ser

130 135 140

Val Val Gln Gly Val Asp Lys Phe Ile Pro Val Asp Val Tyr Ile Pro

145 150 155 160

Gly Cys Pro Pro Arg Pro Glu Ala Tyr Met Gln Ala Leu Met Leu Leu

165 170 175

Gln Glu Ser Ile Gly Lys Glu Arg Arg Pro Leu Ser Trp Val Val Gly

180 185 190

Asp Gln Gly Val Tyr Arg Ala Asn Met Gln Ser Glu Arg Glu Arg Lys

195 200 205

Arg Gly Glu Arg Ile Ala Val Thr Asn Leu Arg Thr Pro Asp Glu Ile

210 215 220

<210>2

<211>675

<212>DNA

<213>产气肠杆菌(E.aerogenes)

<400>2

atggattata cgctcacccg catagatcct aacggtgaga acgaccgtca ccccctgcag 60

aaacaggaga tcgtaaccga ccccctggag caagaagtca ataaaagcgt gtatatgggg 120

aaactcgaac atgcgctgca tgacatggtg aactggggcc gcaagaactc aatctggccc 180

tgcaacttcg gcctgtcatg ctgctacgct gaaatggtga cgtcattcac tgcggtgcat 240

gacgttgcgc gttttggcgc cgaggtactg cgtgcttctc ctcgtcaggc ggacctgatg 300

gtggtcgccg gcacctgctt caccaaaatg gcgccggtca ttcagcgtct gtatgaccag 360

atgctggagc ctaagtgggt tatctccatg ggcgcctgcg ccaactccgg cgggatgtac 420

gatatttatt ctgtcgtcca gggcgtggac aagtttattc cggttgatgt ttacatcccg 480

ggctgtccgc cgcgtccgga agcttatatg caggcgctga tgctgctgca ggagtccatt 540

ggtaaagaac gtcgcccgct ctcatgggtg gttggcgatc agggcgtgta ccgcgccaac 600

atgcagtcgg aacgcgagcg taaacgtggt gaacgcattg cagtgaccaa tctgcggaca 660

ccggacgaga tttaa 675

<210>3

<211>1913

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atggattata cgctcacccg catagatcct aacggtgaga tttggtgact gcgctcctcc 60

aagccagtta cctcggttca aagagttggt agctcagaga accttcgaaa aaccgccctg 120

caaggcggtt ttttcgtttt cagagcaaga gattacgcgc agaccaaaac gatctcaaga 180

agatcatctt attaatcaga taaaatattt ctagatttca gtgcaattta tctcttcaaa 240

tgtagcacct gaagtcagcc ccatacgata taagttgtaa ttctcatgtt tgacagctta 300

tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa ttgctaacgc agtcaggcac 360

cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg caccgtcacc ctggatgctg 420

taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt gcgggatatc gtccattccg 480

acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata tgcgttgatg caatttctat 540

gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg ccgcccagtc ctgctcgctt 600

cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac cacacccgtc ctgtggatcc 660

tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac aggtgcggtt gctggcgcct 720

atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca cttcgggctc atgagcgctt 780

gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg actgttgggc gccatctcct 840

tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct caacctacta ctgggctgct 900

tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat gcccttgaga gccttcaacc 960

cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt cgccgcactt atgactgtct 1020

tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct ctgggtcatt ttcggcgagg 1080

accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct tgcggtattc ggaatcttgc 1140

acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa acgtttcggc gagaagcagg 1200

ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt cttgctggcg ttcgcgacgc 1260

gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc cggcggcatc gggatgcccg 1320

cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca tcagggacag cttcaaggat 1380

cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc gctgatcgtc acggcgattt 1440

atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat tgtaggcgcc gccctatacc 1500

ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg ggccacctcg acctgaatgg 1560

aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga attggagcca atcaattctt 1620

gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac atatccatcg cgtccgccat 1680

ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg tcctggccac gggtgcgcat 1740

gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg ggttgcctta ctggttagca 1800

gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc tgctgcaaaa cgtctgcgac 1860

ctgagcaaca acacattgca gtgaccaatc tgcggacacc ggacgagatt taa 1913

<210>4

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

atggattata cgctcacccg catagatcct aacggtgaga 40

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cattgcagtg accaatctgc ggacaccgga cgagatttaa 40

Claims

1.一种蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述蛋白编码基因为编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒或重组表达载体或转基因细胞系或重组菌。

5.一株产氢工程菌，是灭活E.aerogenes IAM1183中权利要求2所述基因得到的工程菌。

6.如权利要求5所述的工程菌，其特征在于：所述灭活是通过同源重组实现的；所述同源重组是将DNA片段P导入所述E.aerogenes IAM1183实现的；

7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于：所述基因是由序列表中序列2所示的核苷酸序列组成的DNA片段；所述同源臂T₁是由序列表中序列4所示的核苷酸序列组成的DNA片段；所述同源臂T₂是由序列表中序列5所示的核苷酸序列组成的DNA片段；所述DNA片段M为四环素抗性片段。

8.如权利要求7所述的工程菌，其特征在于：所述DNA片段P的核苷酸序列为序列表中的序列3。

9.权利要求5至8中任一所述工程菌在产氢中的应用。