CN1934276A - 通过加入消泡剂来提高无细胞蛋白质合成***的蛋白质表达率 - Google Patents
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Abstract
提供了在含有消泡剂的反应混合物中体外合成生物分子的组合物和方法。所述含有消泡剂的反应混合物可以是放大规模的反应，例如其反应体积大于至少约15微升。所述反应可以在各种反应器中进行，如本领域所知，包括搅拌式反应器、鼓泡式柱反应器等。
Description
发明背景
蛋白质合成是一种基础生物过程，是开发多肽治疗、诊断和催化剂的基础。随着重组DNA(rDNA)技术的出现，可以利用细胞的催化机制来产生所需的蛋白质。这可利用衍生自细胞的提取物在细胞环境内或体外实现。
在过去十年，无细胞***的生产力提高了两个数量级，从约5微克/毫升-小时提高到约500微克/毫升-小时。这一成就使得体外蛋白质合成以成为实验室规模研究的实用技术并为高通量蛋白质表达提供了一种技术平台。也已开始提出利用无细胞技术的可行性作为体内大规模制造蛋白质药物的一种替代方法。
无细胞蛋白质合成的一些优点优于常规体内蛋白质表达方法。无细胞***可使大多数(如果不是所有的)细胞代谢原料用于专门产生一种蛋白质。此外，在体外没有细胞壁也具有优点，因为这能更好地控制合成环境。例如，可改变tRNA水平来反映待表达基因惯用的密码子。由于无需考虑细胞的培养或存活，改变氧化还原潜能、pH或离子强度也可能比体内更加易行。此外，可以容易地实现直接回收纯化的、适当折叠的蛋白质。
认为体外翻译还能够掺入非天然的及同位素标记的氨基酸，和能够产生在体内不稳定、不溶或有细胞毒性的蛋白质。此外，无细胞蛋白质合成对改革蛋白质工程和蛋白质组筛选技术可能起作用。无细胞方法绕过克隆和转化细胞以在体内表达新基因产物所需的艰苦费力过程，成为该领域的技术平台。
尽管无细胞蛋白质合成具有所有前途良好的特征，但一些障碍限制了它的实际应用和大规模实施。其中最重要的是反应时间短和蛋白质产率低，这导致蛋白质合成产率低和试剂费用过高。Spirin等(1988)
Science 242：1162-1164的开拓性研究最初通过开发连续流动***来绕过反应时间短。许多实验室重复并改进了这种研究，但他们主要采用的方法都是将物质恒定加入反应室。与分批***相比，这种方法增加了翻译反应的持续时间和蛋白质产率。然而，这种方法所用试剂昂贵，通常产生的是稀释的产品而不能显著提高产率，因此效率不佳。
常规的分批***的一些优点优于这种连续和半连续方法，包括易于放大、可再现、蛋白质产率提高、方便、适用于多种高通量表达模式、以及能更有效地利用物质。这些优点改进了产业化利用无细胞蛋白质合成至关重要的分批***的生产力。然而，当放大反应时，采用目前的方法效率低。在需要氧进行氧化磷酸化的***中特定蛋白质产率的降低尤其严重。为满足这种需要必需提高较大反应的产率。
相关文献
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发明概述
本发明提供了在含有消泡剂的反应混合物中体外合成生物分子的组合物和方法。在无细胞合成反应中加入消泡剂提高了无细胞***蛋白质的特定产量。在本发明的一个实施方式中，所述含有消泡剂的反应混合物可以是放大规模的反应，例如反应体积大于至少约15微升。反应可以在各种反应器中进行，如本领域所知的包括鼓泡式柱反应器。
附图简述
图1描述了在含有不同消泡剂的反应中的蛋白质产量。
图2是鼓泡式反应器(bubble reactor)的示意图。
图3描述了与15微升反应相比，在总反应体积为1500微升的鼓泡柱(bubblecolumn)中GMCSF-scFv蛋白的产量。
图4描述了与200微升薄膜反应和15微升离心管反应相比，反应体积为2000微升的鼓泡柱的产量。加入消泡剂时，各***的特定产量相当。
实施方式详述
提供了在含有消泡剂的反应混合物中体外合成生物分子以提高无细胞***合成蛋白质的总产量、可溶性蛋白质产量和活性蛋白质产量的组合物和方法。加入消泡剂能提高小规模反应的产量，但发现其对较大规模的反应，尤其是需氧条件的反应特别有益。
体外合成在本文中指在含有生物提取物和/或所述试剂的反应混合物中无细胞合成生物大分子。所述反应混合物含有产生大分子如DNA、mRNA等的模板；待合成大分子的单体，如氨基酸、核苷酸等；以及辅因子、酶和合成必需的其它试剂，如核糖体、tRNA、聚合酶、转录因子等。这种合成反应***是本领域熟知的，在文献中已有描述。多肽合成反应的许多化学物质可用于本发明的方法。例如，2002年1月8日出版的美国专利第6,337,191号以及2001年1月2日出版的美国专利第6,168,931号中描述的反应化学物质，此二专利纳入本文作为参考。
在本发明的一个实施方式中，反应化学物质如待批专利申请US 10/643,683中所描述，该申请纳入本文作为参考。氧化磷酸化的激活可增加(蛋白质)产量并提高能源的利用。将以下因素联合能提高产量，包括采用衍生自培养在含葡萄糖培养基上的细菌的生物提取物；缺乏聚乙二醇；和优化镁浓度。这样提供了一种即使缺乏次级能源也能发生合成的内稳***。
本领域熟知，生物反应器的性能可能随规模(大小)而显著变化。难以维持大***的均一性、面积体积比的变化以及由于时间增加反应本身的变化。除了这些问题，激活氧化磷酸化的体外蛋白质合成反应需要增加氧气(供应)以优化其性能，随着反应体积的增加氧气输送将变得更加困难。
最常见的反应器类型包括但不限于：搅拌釜反应器；依赖于气体鼓泡进行搅拌的鼓泡柱反应器和气升式反应器；等等。鼓泡柱反应器为Cytomim反应条件所优选。
工业发酵中经常遇到的问题是产生气泡，出于各种原因，其中包括污染的细胞会进入发酵罐，这是不利的。已经通过加入表面活性化学试剂来控制细胞培养物中产生的气泡，但这种消泡剂的KLa值通常较低，会降低反应器提供氧气和其它气体的能力，并且还可能抑制细胞生长。对于体外合成，由于催化剂和细胞内的新生产物不会像例如用常规重组表达方法在体内表达蛋白质那样受到保护，预计消泡剂的疏水组分可能会干扰蛋白质的合成和折叠。因此本文提供的结果是令人意想不到的。
消泡剂
本发明的体外蛋白质合成反应物中包括了消泡剂。按重量计，消泡剂的存在浓度至少约0.00007％，可以至少约0.0001％，不超过约0.001％，通常不超过约0.007％。可采用不同的控制方法，包括固定等份(fixed aliquot)，请求式控制，按比例、积分和/或微分控制，或是它们的组合，来调节连续补料反应中消泡剂的流速。消泡剂添加的最佳量取决于反应条件、消泡剂类型等变量。消泡剂添加的最佳量以及两次添加之间合适的时间间隔可在试验运行中根据经验确定。
消泡剂在本文中指一种加入到反应混合物中能促进气泡破裂和气体释放以及能消除因混合、喷射或搅拌所产生的泡沫的表面活性化学物质。消泡剂可以预防、消除和/或减少泡沫。消泡剂还可赋予有利的辅助表面特性，如润湿、分散、乳化、增溶、助流和匀化、粘附以及赋予光泽。
许多化合物可用作消泡剂，包括但不限于烷基聚氧化乙烯亚烷基乙二醇醚(alkylpolyoxyalkylene glycol ether)；酯、醇、硅氧烷、聚硅氧烷、亚硫酸盐、磺酸盐、脂肪酸及其衍生物等。已知有多种此类试剂可通过商业从例如Sigma Chemicals、J.T.Baker等购得。在本发明的一些实施方式中，消泡剂不是去污剂。
感兴趣的消泡剂有嵌段共聚物，它们可在泡沫的空气/水界面上形成不溶性单层从而提供抗泡/消泡作用。嵌段共聚物的消泡活性是该共聚物的浊点和所用温度的函数。为选择有效的消泡剂，应选择浊点低于预期使用温度的嵌段共聚物。具有低氧化乙烯含量的嵌段共聚物是最有效的消泡剂。PLURONIC表面活性剂已广泛用作消泡剂。反向结构的PLURONICR表面活性剂也可有效用于消泡。其它感兴趣的消泡剂包括硅氧烷聚合物、有机非聚硅氧烷聚丙烯基聚醚分散体混合物、有机脂肪酸酯型消泡剂等。
反应的化学物质
无细胞蛋白质合成的模板可以是mRNA或DNA。稳定的mRNA翻译或者转录和翻译的组合可将其储存的信息转变成蛋白质。通常用于大肠杆菌***的这种组合***是从含有可识别启动子的DNA模板连续产生mRNA。无论采用内源性RNA聚合酶还是采用外源性噬菌体RNA聚合酶，通常是在反应混合物中直接加入T7或SP6。或者，可将信使***QB复制酶(一种依赖于RNA的RNA聚合酶)的模板中以连续扩增mRNA。纯化的mRNA在加入反应混合物之前通常要通过化学修饰才能稳定。可除去提取物中的核酸酶以帮助稳定mRNA水平。模板可编码任何感兴趣的特定基因。
也可加入其它的盐，尤其是那些生物学相关的盐，如锰盐。钾盐的加入量通常为50-250mM，铵盐为0-100mM。反应的pH通常在pH 6-9之间。反应的温度通常在20-40℃之间。可以超出这些范围。
可在反应混合物中加入不需要的酶活性的代谢抑制剂。或者可直接除去提取物中负责不需要活性的酶或因子。第三，可灭活或从染色体中删除编码不需要的酶的基因。
也可在该***中加入从宿主生物纯化的载体或合成载体。可利用它们来增强蛋白质的合成和折叠。这种cytomim技术已显示可激活利用含有负责活化氧化磷酸化呼吸链组分的膜载体的过程。本发明的方法可用于无细胞表达以激活其它组的膜蛋白。
感兴趣的合成***包括DNA的复制，可包括扩增DNA、从DNA或RNA模板转录RNA、将RNA翻译成多肽以及从单糖合成为复合糖。
这类反应可以是大规模、小规模、或者可以是多元的以同时进行多种合成。可加入添加剂来延长活跃合成的时间。合成产物通常累积在反应器中，然后在该***操作完成后按照蛋白质纯化的常用方法分离和纯化。
特别感兴趣的是翻译mRNA而产生蛋白质，此种翻译可与从DNA模板体外合成mRNA结合。这种无细胞***将含有mRNA翻译所需的全部因子，如核糖体、氨基酸、tRNA、氨酰基合成酶、延伸因子和起动因子。本领域已知的无细胞***包括大肠杆菌提取物等，可用合适的核酶处理以除去内源活性mRNA。
除了上述无细胞提取物、遗传模板和氨基酸等组分外，也可将蛋白质合成所特别需要的物质加入此反应。这些物质包括盐、聚合化合物、环状AMP、蛋白质或核酸降解酶的抑制剂、蛋白质合成的抑制剂或调节剂、氧化/还原调节剂、非变性表面活性剂、缓冲组分、精胺、亚精胺等。
优选的盐包括乙酸和硫酸的钾盐、镁盐、铵盐和锰盐，其中一些可含有氨基酸作为抗衡阴离子。聚合物可以是聚乙二醇、葡聚糖、二乙基氨基乙基葡聚糖、季铵基乙基葡萄糖和氨基乙基葡萄糖等。氧化/还原调节剂可以是二硫苏糖醇、抗坏血酸、谷胱甘肽和/或它们的氧化物。也可采用非变性表面活性剂如Triton X-100，浓度为0-0.5M。可采用精胺和亚精胺以提高蛋白质合成能力，并可用cAMP作为基因表达调节剂。
当反应介质的某特定组分浓度变化时，其它组分也应相应变化。例如，核苷酸和能源化合物之类组分的浓度可根据其它组分浓度的变化同时控制。反应器中诸组分的浓度水平也可随时间而改变。
优选将该反应维持在pH 5-10和温度20-50℃的范围内，更优选维持在pH 6-9和温度25-40℃的范围内。
可用各种方式测定翻译反应中所产生的蛋白质量。一种方法依靠可利用的测定翻译的特定蛋白质活性的试验。测定蛋白质活性的试验的例子有萤光素酶测定***和氯霉素乙酰转移酶测定***。这些试验可测定翻译反应所产生的功能活性蛋白质的量。活性试验不测定由于蛋白质错误折叠或者缺乏蛋白质活性必需的其它翻译后修饰而失活的全长蛋白质。
另一种测定体外转录和翻译组合反应中所产生的蛋白质量的方法是，用已知量的放射性同位素标记的氨基酸如35S-甲硫氨酸或14C-亮氨酸进行反应，然后测定掺入到新翻译蛋白质中的放射性同位素标记氨基酸的量。掺入试验将测定体外翻译反应所产生的所有蛋白质，包括截短的蛋白质产物中放射性同位素标记氨基酸的量。还可进一步在蛋白质凝胶上分离放射性同位素标记的蛋白质，并通过放射自显影证实产物大小合适且没有产生次级蛋白质产物。
反应的体积和几何学
虽然这些反应可以是任何体积，但该方法对于放大反应特别有利，此时的反应体积至少为约15微升，通常至少约50微升，更经常至少约100微升，可以是500微升，1000微升，5000微升或更多。许多例子中，尽管可平行运行多个反应，但各反应将不超过约10毫升。然而，还考虑本发明能够放大到很大体积，如采用市售的生物反应器，其体积可以是1升、10升、100升、1000升或更大。尽管反应混合物中可包含脂质，例如反向载体(inverted vesicle)，但脂双层通常不会结合在表面上。
术语“小规模”在本文中指反应体积约为或小于约15微升。如上所述，本发明的方法如上所述能够“放大”反应而维持相当于小规模反应的基本上一致的产量。产量可通过任何常规方法计算，只要该方法可在各反应之间相一致地使用，例如，合成的总蛋白质/毫升反应混合物；合成的可溶性蛋白质/毫升反应混合物；合成的生物活性蛋白质/毫升反应混合物等。与相当的小规模反应(即包含有同反应物仅体积不同的反应)相比，放大反应的产量通常是其产量的至少约90％，更通常至少约95％；可以是至少约99％。一些情况下，已观察到本发明放大反应混合物的产量实际上提高了。
该***可在有氧和无氧条件下运行，优选在有氧条件下运行。为防止反应物干燥，顶部空间可充满湿气，通常在工作温度下至少约80％饱和，更通常在工作温度下至少约90％饱和湿度。在实验室条件下，这通常足以密闭反应室的顶部空间。可在反应室的顶部空间充入氧气，或者将氧气注入反应混合物中。氧气可连续供给，或者，当反应时间较长时可在蛋白质表达阶段在反应室的顶部空间重新充入氧气。除氧气外，也可为已经诱导了合适呼吸途径的细胞提取物提供其它电子受体，如硝酸盐。
可为鼓泡柱涉及提供充气反应条件。在鼓泡柱中，气体被鼓入或喷射入装有液体的容器中。可在例如鼓泡柱内的液相中喷射气体以使气体分散成气泡。气体，例如氧气或含有氧气的混合气，可通过覆盖鼓泡柱以及气升式反应器所有区域的分布板分散成气泡，其中，空气通过设计成能赋予整个容器以某种类型整体循环模式的环管或导流管而限制在通道中。本领域已知有许多柱式构造，其大小、塔板、顶部空间等可以不同。例如可见《鼓泡柱反应》(Bubble Column Reactions)，第一版；Wolf-Dieter Deckwer(Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH，Braunschweig，德国)ISBN：0471918113；Oldshue(1983)Biotechnol Adv.1(1)：17-30；Poulsen和Iversen(1999)Biotechnol Bioeng.64(4)：452-8；Poulsen和Iversen(1998)Biotechnol Bioeng.58(6)：633-41；等等；在此纳入本文作为参考。
应理解，本发明不限于上述具体的方法、方案、细胞系、动物的种或属、构建物和试剂，这些当然都可以改变。还应该理解，本文所用的术语只是为了描述具体的实施方式而非限制本发明的范围，本发明的范围由附加的权利要求限制。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可采用与本文所述相似或等价的任何方法、装置和材料来实施或测试本发明，当本发明所述的是优选的方法、装置和材料。
本文述及的所有出版物为了描述和公开的目的而纳入本文作为参考，例如出版物中所述可能与本文所述发明联合使用的细胞系、构建物和方法。提供以上和本文中述及的出版物仅是因为它们的公开早于本申请的提交日期。本文没有什么可认为是由于在先发明而使本发明人不具先于这些公开的资格。
提供以下实施例是为向本领域的普通技术人员完全公开并描述如何制造和使用本发明，而非要限制本发明的范围。我们努力保证使用数值(例如，量、温度、浓度等)的精确性，但应该允许有一些实验失误和偏差。除非另有指出，部分是以重量计的部分，分子量是平均分子量、温度是摄氏度、压力是大气压或接近大气压。
实施例
实施例1
测试了在无细胞蛋白质合成***中加入消泡剂(的作用)。在PANOx(Kim和Swartz2001 Biotechnol.Bioengineer.74：309-316)无细胞***中加入5种不同的消泡剂，发现这5种消泡剂能够提高总的、可溶性和活性大肠杆菌氯霉素乙酰转移酶(CAT)的产量(图1)。图2显示了鼓泡式反应器的基本轮廓。图3和4比较了大规模鼓泡式反应器和小规模离心管内的GMCSF-VL-VH哺乳动物蛋白质构建物和CAT的产量。试剂列于表1，反应组分列于表2和3。
对于cytomim***，以标示浓度(Jewett和Swartz，待批申请10/643,683)混合表2所列的组分。对于PANOx***，按Swartz和Kim(“无细胞蛋白质合成从糖酵解中间产物再生腺苷三磷酸”(Regeneration of Adenosine Triphosphate from GlycolyticIntermediates for Cell-Free Protein Synthesis”，Biotechnology and Bioengineering，74(4)，2001/8/20)所述浓度混合物表3所列组分。
为表达CAT蛋白，该***中用作模板的DNA是含有T7启动子和之后的大肠杆菌氯霉素乙酰转移酶蛋白编码基因的pK7-CAT环状质粒。该结构基因之后是T7终止子。
为表达GMCSF-scFv蛋白，该***中用作模板的DNA是pK7-GMCSF-VL-VH环状质粒，它含有T7启动子和之后的GMCSF蛋白(Mi-Hua Tao，1993)编码基因，并通过一个5氨基酸接头(甘氨酸4-丝氨酸)融合于鼠淋巴瘤抗体38C13(Hakim，1996)scFv片段的编码基因。该结构基因之后是T7终止子。
按照Pratt(1984)的方法制备了大肠杆菌K12(A19菌株)的S30细胞提取物。匀浆后在细胞溶解产物中不加入DL-二硫苏糖醇。按照Davanloo等(1984)的方法制备了大肠杆菌菌株BL21(pAR1219)培养物中的T7 RNA聚合酶。
为表达GMCSF-VL-VH，用以下添加物修饰该表达***以增强蛋白质折叠和二硫键形成。无细胞提取物在室温用0.85mM碘乙酰胺(IAM)预处理30分钟然后再加入反应混合物中。大肠杆菌DsbC以50微克/毫升的浓度加入。在反应混合物中加入浓度分别为4mm和1mm的氧化和还原的谷胱甘肽。
大肠杆菌DsbC通过过度表达菌株BL21(DE3)(pETDsbC)制备，并用钴IMAC柱纯化。选择的组分用含有5mMDTT的S30缓冲液(Pratt，1984)透析以还原DsbC的活性位点。
消泡剂购自上述厂商，按标示量加入。一些情况下，消泡剂用水稀释，如在每15微升无细胞反应物中加入1微升消泡剂/水混合物。
对于离心管法，用移液管将适量混合物加到离心管底部。37℃培育试管试管适当时间(PANOx培育3小时，Cytomim***培育6小时)。
表1
| 消泡剂名称 | 制造商 |
| Antifoam 204 | Sigma |
| Antifoam B | J.T.Baker |
| Antifoam O-30 | Sigma |
| Triton X-705 | Sigma |
| Antifoam SE-15 | Sigma |
表2Cytomim无细胞蛋白质合成***的试剂构成和浓度
| 试剂 | 浓度 |
| 谷氨酸镁 | 8mM |
| 谷氨酸铵 | 10mM |
| 谷氨酸钾 | 130mM |
| ATP | 1.20mM |
| GTP | 0.86mM |
| UTP | 0.86mM |
| CTP | 0.86mM |
| 亚叶酸 | 34微克/毫升 |
| tRNA | 170.6微克/毫升 |
| 20种氨基酸 | 2mM |
| 半胱氨酸 | 9mM |
| 丙酮酸盐 | 30mM |
| NAD | 3.3mM |
| CoA | 2.7mM |
| 草酸 | 4mM |
| 亚精胺 | 1.5mM |
| 腐胺 | 1mM |
| T7 RNA聚合酶 | 0.10毫克/毫升 |
| 质粒 | 0.0133毫克/毫升 |
| S30提取物* | 6/25总反应体积 |
表3PANOx无细胞蛋白质合成***的试剂构成和浓度
| 试剂 | 浓度 |
| 谷氨酸镁 | 20mM |
| 谷氨酸铵 | 10mM |
| 谷氨酸钾 | 170mM |
| ATP | 1.2mM |
| GTP | 0.86mM |
| UTP | 0.86mM |
| CTP | 0.86mM |
| 亚叶酸 | 34微克/毫升 |
| tRNA | 170.6微克/毫升 |
| 20种氨基酸 | 2.0mM |
| 磷酸烯醇丙酮酸 | 30mM |
| NAD | 0.33mM |
| CoA | 0.27mM |
| 草酸 | 2.70mM |
| 腐胺 | 1.00mM |
| 亚精胺 | 1.50mM |
| T7 RNA聚合酶 | 0.1毫克/毫升 |
| 质粒模板 | 0.0133毫克/毫升 |
| S30提取物* | 3.6微升/15微升RxN |
鼓泡柱反应器由内径1厘米、高5厘米的圆柱构成。用移液管将无细胞反应混合物(表1和2)加入该柱中(图2)。通过柱底部与压缩空气罐相连的小喷嘴(直径小于1毫米)鼓入气体气泡。
对于Cytomim***(如Jewett和Swartz的待批申请10/643,683所述)，使用纯氧气体，37℃持续反应最多4小时。对于PANOx反应，使用氩气，37℃进行反应3小时。气泡直径约为0.5厘米，鼓泡速度约为每秒1个气泡。不加入消泡剂时，无细胞蛋白质合成反应的泡沫立即溢出该柱反应器顶部。加入消泡剂(Sigma 204，1/1000-1/10000消泡剂体积/反应体积)，蛋白质合成反应能以产生最小气泡进行约3.5-4小时，产生的蛋白质量与15微升离心管反应的相当(见图3和4)。
通过用液体闪烁计数器(LS3801，Beckman Coulter，Inc.)测量TCA沉淀物的放射性估计出合成的蛋白质量。4℃以15,000 RCF离心样品15分钟后取出上清，用于TCA沉淀和闪烁计数测量可溶性蛋白质的产量。该过程先前已有详细描述(Kim等，1996b)。
显示了CAT和GM-CSF-scFv融合蛋白的结果。整个反应以分批模式进行，反应开始后不再加入试剂。
这些数据证明，对于不同规模、不同反应体积和不同的蛋白质，加入消泡剂能提高体外蛋白质的合成。具体地说，消泡剂能提高用鼓泡柱放大的反应的产量。
Claims (10)
1.一种增强生物大分子体外合成的方法，所述方法包括：在含有消泡剂的反应混合物中合成所述生物大分子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物大分子的合成包括翻译mRNA以产生多肽。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述合成还包括从DNA模板转录mRNA。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应混合物的体积大于约15微升。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应混合物的体积大于约100微升。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述反应的产率至少相当于相应的小规模反应产率的90％。
7.一种体外合成生物大分子的反应混合物，其改进之处在于，所述反应混合物含有消泡剂。
8.如权利要求7所述的反应混合物，其特征在于，所述反应混合物的体积大于约15微升。
9.如权利要求7所述的反应混合物，其特征在于，所述反应混合物的体积大于约100微升。
10.如权利要求7所述的反应混合物，其特征在于，所述反应的产率至少相当于相应的小规模反应产率的90％。
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